modern doping-the future of sport

SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

MEDICINSKI FAKULTET

Josip Zekić

Novi oblici dopinga – budućnost elitnog sporta

DIPLOMSKI RAD

Zagreb, 2012.

1

Ovaj diplomski rad izrađen je na Medicinskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu, Školi

narodnog zdravlja 'Andrija Štampar', na Katedri za zdravstvenu ekologiju i medicinu

rada pod vodstvom dr.sc. Milana Miloševića, dr.med. i predan je na ocjenu u

akademskoj godini 2011/2012.

2

POPIS KRATICA KORIŠTENIH U RADU

AAV8 – Adeno- asocirani virus 8

ACE - Angiotensin.converting enzim, Enzim za konverziju angiotenzina

ACTN 3 - Alpha-actinin – 3, Alfa aktinin 3

ADA-SCID – Adenozin deaminaza povezana teška kombinirana imunodeficijencija

ADRB 2 - Beta-2 adrenergic receptor, Beta – 2 adrenergički receptor

AICAR - 5-amino-1-β-D-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide

AIDS - Acquired immune deficiency syndrome, Sindrom stečene imunodeficijencije

AMPD 1 - Adenosine monophosphate deaminase 1, Adenozin monofosfat

deaminaza 1

AR – Adrenergički receptor

BDNF - Brain.derived neurotrophic factor, Faktor rasta I razvoja neurona sintetiziran

u mozgu

BMD – Bone mineral density , Mineralna gustoća kostiju

CERA - Continuous Erythropoiesis Receptor Activator,

CFTR - Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, Transmembranski

regulator provođenja kod cistične fibroze

CHRM 2 - Cholinergic receptor muscarinic 2, Muskarinski kolinergički receptor 2

CK-MM - Creatin kinase muscle, Mišićna keratin kinaza

COL1A1 - Collagen type 1 alpha 1, Kolagen tipa 1 alfa 1

COL5A1 - Collagen type 5 alpha 1, Kolagen tipa 5 alfa 1

3

CREB – C AMP response element – binding protein, Stanični transkripcijski faktor

koji se veže na C AMP element odgovora

EPAS 1 - Endothelial PAS domain-containing protein 1, Endotelni protein 1 s PAS

domenom

EPO – Eritropoetin

FDA – Food and drug administration, Savezni ured za hranu i lijekove

FFM – Fat free mass, Nemasna tjelesna masa

GH – Growth hormone, Hormon rasta

GW1516 – PPAR delta antagonist

GWADS - Genome-wide allelic differentiation scan, Skeniranje alelske diferencijacije

cijelog genoma

GYS 1- Glycogen synthase, glikogen sintetaza

HIF 1- Hipoxia-inducible factor, Hipoksijom aktiviran faktor 1

IGF 1 - Insulin-like growth factor 1, Inzulinu sličan faktor rasta

LMO 2 - LIM domain only 2 (rhombotin-like 1) je protoonkogen i transkripcijski je

faktor potreban za razvoj svih hematopoietskih linija

MHC - Major histocompatibility complex, Glavni kompleks tkivne podudarnosti

MLCK - Myosin ligt-chain kinase, Miozinska kinaza lakog lanca

MSTN – Miostatin

MV – Mišićni volumen

NRF 2 ili NFE2L2 - Nuclear respiratory factor, Jezgreni faktor staničnog disanja

PGC 1 ili PPARGC1A - Peroxisome proliferator-activated receptor gamma

coactivator 1-alpha, Receptor aktivacije proliferacije peroksisoma gamma koaktivator

1 alfa

4

PPAR delta - Peroxisome proliferator-activated receptor delta, Receptor aktivacije

proliferacije peroksisoma delte

PSSM - Polysaccharide Storage Myopathy, Miopatija povezana s pohranom

polisaharida

RSV - Human respiratory syncytial virus, Respiratorni sincicijski virus

SNP - Single nucleotide polymorphism, Jednostavni nukleotidni polimorfizam

ST – Trening snage

TNC - Tenascin C

UCP 2 - Mitochondrial uncoupling protein 2, Mitohondrijski protein razdvajanja 2

VEGF - Vascular endothelial growth factor, Krvožilni endotelni faktor rasta

WADA – World anti-doping agency, Svjetska antidopinška agencija

X-SCID – X vezana teška kombinirana imunodeficijencija

5

1. SADRŽAJ

SAŽETAK................................................................................................................................7

SUMMARY.................................................................................................................. 8

1. UVOD...................................................................................................................... 9

2. GENSKA TERAPIJA...........................................................................................12

2.1 BIOLOŠKI ILI VIRUSNI VEKTORI....................................................................15

2.2 Gola DNK.........................................................................................................16

2.3 Rezultati istraživanja prema metodama genske terapije..................................17

3. GENSKI DOPING; POTENCIJALNI GENI I CILJEVI..........................................21

3.1 Kandidati prema kapacitetu izdržljivosti............................................................23

3.2 Kandidati prema mišićnoj izvedbi.....................................................................41

3.3 Kandidati prema psihološkoj sposobnosti.........................................................50

4. NUSPOJAVE GENSKOG DOPINGA................................................................51

5. DETEKCIJA GENSKOG DOPINGA..................................................................52

6. BIOETIČKO GLEDIŠTE.....................................................................................53

7. ZAKLJUČCI.........................................................................................................55

8. ZAHVALE............................................................................................................56

9. LITERATURA......................................................................................................57

10. ŽIVOTOPIS.........................................................................................................75

7

SAŽETAK

Naslov: Novi oblici dopinga - budućnost elitnog sporta

Autor: Josip Zekić

Kažu da pojam i aktivnosti dopinga sežu sve do samih početaka sporta i sportskih

aktivnosti. Razvitkom sporta, doping je u sportu postao sveprisutniji, pa je 1999.

godine bilo prijeko potrebno osnivanje Svjetske antidopinške agencije. Novi oblici

dopinga podrazumjevaju genski doping koji kao izdanak genske terapije napreduje

usporedno s napretkom same medicine. Genska terapija u medicini smatra se

budućnosti liječenja mnogobrojnih trenutno neizlječivih bolesti, što je razlog

mnogobrojnih istraživanja provedenih, započetih i tek zamišljenih u sferama genske

terapije.

Ovaj pregledni rad obuhvaća metode genske terapije, odnosno genskog dopinga, te

cijeli niz genskih kandidata u genskom dopingu podijeljenih prema kapacitetu

izdržljivosti, mišićnoj izvedbi i psihološkoj sposobnosti. Rezultati najnovijih

istraživanja svakog od gena kandidata govore nam o mogućnostima i potencijalnim

ciljevima genskog dopinga. Rad je obuhvatio područje negativnih, ali i pozitivnih

nuspojava genskog dopinga, tehnike detekcije i njihov razvoj, te na samom kraju

bioetičko gledište na cjelokupnu temu, što je svakako jedan od presudnih segmenata

u razvoju genskog dopinga. Najviše rezultata brojimo prema kapacitetu izdržljivosti,

gdje se već veliki broj genskih kandidata koristi kao doping u sportu, što nam

svakako potvrđuje da je genski doping itekako moguć i da ga od titule budućnosti

elitnog sporta dijele detaljnija saznanja o minimalnim zdravstvenim rizicima, te

komercijalizacija korištenja takvih sredstava, tj.dostupnost.

Ključne riječi: moderni doping, genska terapija, geni kandidati u genskom dopingu,

nuspojave genskog dopinga, bioetičko gledište.

8

SUMMARY

Title: Modern doping - the future of sport

Author: Josip Zekić

The concept of doping activities goes back to the beginning of sports and

recreational activities. During development of sport, doping in sport has become

ubiquitous, and foundation of World Anti-doping Agency was necessary in 1999.

Modern doping involves gene doping, which as an offshoot of gene therapy

progresses in parallel with the progress of medicine. Gene therapy in medicine is

considered to be the future treatment of many currently incurable diseases, which is

why many studies are conducted, initiated and conceived in the areas of gene

therapy.

This review encompassing methods of gene therapy and gene doping, and a number

of candidate genes in gene doping according to endurance capacity, muscle

performance and psychological abilities. Recent research results of each of the

candidate genes tell us about the possibilities and potential targets of gene doping.

We covered an area of positive and negative side effects of gene doping, then

detection techniques and their development, as well as the bioethical perspective on

the whole subject, which is certainly one of the crucial segments in the development

of gene doping. Most of the results counting towards endurance capacity, as already

a large number of gene candidates used as doping in sport, certainly confirms that

gene doping is quite possible and that for the title of the future of elite sport detailed

information on the minimum health risks is needed, as commercialization and

avaliability of use of such resources.

Keywords: modern doping, gene therapy, candidate genes for gene doping, gene

doping effects, bioethical perspective

9

1. UVOD

Korištenje određenih sredstava ili postupaka s ciljem poboljšanja sposobnosti i

postizanja boljih rezultata u sportu staro je koliko i sam sport. Gdje god se

susrećemo s pojmom pobjede, natjecatelji će tražiti sredstvo, bilo dozvoljeno ili ono

nedozvoljeno, koje će ih voditi ka pobjedi. Karakteristično je to za kompetitivna

društva, upravo kakvo je i naše današnje, pa upravo iz tog razloga nije nimalo

neobična rasprostranjenost tih sredstava u današnjem sportu. Prve zabilješke o

korištenju takvih sredstava, ili dopingu, vode nas još u antičku Grčku. O detaljnom

korištenju sredstava iz tog vremena, malo se zna. Poznato je da su Grci, natjecatelji,

podvrgavani posebnim dijetama, te su im spravljani posebni napitci nepoznatih

recepata koji su poboljšavali njihove sposobnosti.

Riječ doping (Muller 1993) se prema nekim navodima, prvi put pojavila u jednom

engleskom rječniku označavajući određenu mješavinu opijuma i narkotika. U pogledu

korijena riječi postoje različita mišljenja. Prema jednom, riječ vuče korijen iz jednog

dijalekta koji se govori u jugoistočnoj Africi, a označava alkoholno piće s vrlo visokim

postotkom alkohola koje se koristilo kao stimulans prilikom obavljanja ritualnih

obreda. Prema drugom mišljenju, riječ potječe iz nizozemskog jezika, gdje je riječ

“doop” označavala gustu tekućinu koja se koristila u cilju povećanja postignuća.

Do vremena modernih Olimpijskih igara 1896. godine, cijeli je niz doping sredstava

već bio u uporabi; prednjačili su biciklisti koji su najviše koristili strihnin, kofein, kokain

i alkohol. Prvi dokumentirani zabilježeni slučaj dopinga u novijoj povijesti dogodio se

1865. godine kada su nizozemski plivači koristili stimulanse – od kofeina do strihnina.

Strihnin je vrlo stabilan alkaloid, jedan od najpoznatijih otrova i jedna od najgorčih

prirodnih supstanci, koji se dobro čuva i može se dokazati u truplima nakon trovanja.

U velikim količinama izaziva grčevito kočenje mišića, a u malim se upotrebljava kao

analeptik (sredstvo za jačanje i okrepljenje). Upravo kada je u dozama manjim od

10

smrtonosnih vrlo je moćan stimulans. Na Olimpijskim igrama 1904. godine,

maratonac Thomas Hicks, koji je pobjedio na tadašnjoj utrci, morao je biti reanimiran

od strane liječničke ekipe, jer je popio konjak pomiješan s kokainom i strihninom. Već

1932. godine kod sprintera atletičara pojavljuje se eksperimentiranje s

nitroglicerinom. Nitroglicerin danas služi kao lijek za srčane bolesti, na primjer

pr.angina pectoris, te kao plastifikator za neka čvrsta goriva. Nekada su ga koristili

kako bi im se proširile koronarne arterije, a kasnije su uzimali i Benzedrin. Benzedrin

se u početku koristio za proširivanje nazalnih i bronhijalnih puteva, a otkrićem

stimulirajućeg efekta koristi se i kod letargičnih pacijenata, u liječenju narkolepsije, a

korišten je čak i u studijama o poremećajima u ponašanju kod djece, te kao stimulans

vojnih snaga u 2. svjetskom ratu i Vijetnamu.

Ipak, prava era dopinga započela je pojavljivanjem testosterona u injekciji 1935.

godine. Sintezu tesosterona te godine objavila su dva kemičara, Adolf Butenandt i

Leopold Ruzicka, te su oboje za svoja postignuća dobili 1939. godine Nobelovu

nagradu za kemiju. Kada je testosteron prvi puta izoliran pojavljuje se i u sintetičkom

obliku, a to se dostignuće smatra i početkom zlatnog doba steroidne kemije. Za

vrijeme II. svjetskog rata njemački su znanstvenici prvi sintetizirali anaboličke

steroide. Vjeruje se da su ih testirali na na ljudima, poglavito zatvorenicima. Rezultati

tih eksperimenata zauvijek su izgubljeni jer nikada nisu bili objavljeni. Neka osobna

ratna iskustva preživjelih vojnika govore o tome kako su Njemci svojim vojnim

snagama davali anabolike kako bi pojačali njihovu snagu i agresivnost. Da je sam

Hitler uzimao steroide, dokazano stoji u bilješkama njegovog liječnika, a danas se

vjeruje da su steroidi samo pospješili osnaživanje njegove već agresivne ličnosti.

(Muller 1993)

Tridesetih godina 20. stoljeća postaje već jasno da je potrebno uspostaviti zabranu

korištenja određenih sredstava u sportu. Godinama su pojedine sportske organizacije

i federacije raznih sportova uvodile prve doping kontrole, međutim tek 1967. godine

Međunarodni olimpijski odbor osniva Zdravstvenu komisiju i utvrđuje prvu listu

zabranjenih suspstanci. Prve službene doping kontrole izvode se 1968. godine na

Zimskim olimpijskim igrama u Grenobleu.

Od tada pa do danas doping kontrole i sustav koji brine o njima mnogo su

napredovali, posebno nakon osnivanja Svjetska Antidopinške agencije. Svjetska

11

antidopinška agencija (WADA) međunarodna je organizacija stvorena 1999. radi

promicanja, koordinacije i praćenja borbe protiv dopinga u sportu u svim njegovim

oblicima. Od 1999. godine već se puno govori o napretku suzbijanja dopinga,

međutim tijekom istih godina dogodio se i veliki napredak i razvitak samog dopinga.

U prvoj polovici 20. stoljeća bio je to razvoj s farmakološkog i fiziološkog aspekta,

međutim novije doba donosi vezu izmedju dopinga i molekularne biologije. U ovom

radu prikazati će se pregled trenutnih mogućnosti genskog dopinga, njegov razvoj,

kao i neke od tehnike detekcije, te bioetički aspekt.

12

2. GENSKA TERAPIJA

Genski doping je izmjena genetskog sastava pojedinca u određenu svrhu poboljšanja

sportske izvedbe. Genski doping izdanak je genske terapije i uključuje upotrebu

modificiranog genetskog materijala. Genska terapija zasniva se na dodavanju ili

mijenjanju gena u mišićnoj stanici, gdje on postaje dio organizma, te je vrlo teško

više razlikovati sintetički gen od izvornog. Sintetički geni usporavaju distrofiju mišića,

ubrzavaju metabolizam, povećavaju mišićnu masu, te općenito značajno povećavaju

fizičke sposobnosti. To su pokazali laboratorijski testovi na miševima u kojih je

postignuto dvostruko brže pokretanje uslijed primjene genske terapije - ciljanim

unosom aktivnog oblika peroxisom proliferator aktivnog receptora δ direktno u

mišiće, što dovodi do formiranja povećanog broja mišićnih vlakana tipa 1. (Wang i

sur., 2004). Iako se genetski inženjering tih takozvanih "Maraton miševa" potencijalno

može iskoristiti kako bi se poboljšala atletska izvedba osobitno kod trkača i plivača

na duge staze, znanstvenik Evans (Wang i sur. 2004) kao razlog za nastavak

istraživanja vidio je u terapeutskoj vrijednosti. Vježbe izdržljivosti mogu promovirati

adaptivnu transformaciju mišićnih vlakana i povećanje mitohondrijske biogeneze,

aktiviranjem skriptiranih promjena u ekspresiji gena. Međutim faktor prijepisa koji bi

direktno usmjeravao taj proces još uvijek nije identificiran. Terapeutska vrijednost

odnosi se na pretilost i šećernu bolest tipa 2. Naime, studije su već pokazivale da

mnogi pacijenti koji boluju od pretilosti i dijabetesa imaju manje mišićnih vlakana tipa

1. Evans i njegov tim na taj način utvrđuju da povećanje PPAR-δ izrazito učinkovito

povećava broj mišićnih vlakana tipa 1, štoviše da ova genetski generirana vlakna

daju otpornost na pretilost s poboljšanjem metaboličkog profila, čak i u odsutnosti

vježbe. Navedeni rezultati dokaz su da se složene fiziološke osobine, kao što su

umor, izdržljivost i kapacitet trčanja mogu analizirati, ali da se njima može i

manipulirati na molekularnoj razini. Istraživački tim koji se bavio istraživanjima

Duchenove mišićne distrofije utvrdio je da umetanje gena koji je kodiran proteinom

IGF-1 u mišićne stanice stvara učinak da mišićne stanice rastu. Isto se događa kada

je protein u interakciji sa stanicama na vanjskoj strani mišičnih vlakana - mišične

stanice opet rastu. Sva ova istraživanja provedena su na miševima.

13

Genska terapija prvi je put konceptualizirana 1972. godine , pozivajući autore na

veliki oprez prije početka studija i primjenjivanja genske terapije na ljudima

(Friedmann 1972.). Prvi eksperiment genske terapije odobren od FOOD and DRUG

ADMINISTRATION (FDA), dogodio se u SAD-u 1990.godine, kada je Ashanti

DeSilva bila tretirana za ADA-SCID (Sheridan 2011.).

Od tada je provedeno više od 1700 kliničkih ispitivanja koristeći niz tehnika za

gensku terapiju.

Prijenos terapeutskog gena obavlja se na više načina;

- transplatacijom gena kod genske delecije*

* Genska delecija - mutacija u kojoj nedostaje ili dio kromosoma ili dio DNK; najčešće

uzrokovana greškama prilikom kromosomskog crossovera za vrijeme mejoze.

- korekcijom gena ili ispravljanjem mutacije

- povećanjem ekspresije*

*Genska ekspresija - proces prilikom kojeg se informacija iz gena koristi u

sintezi funkcionalnog genskog produkta ciljnog gena.

- ciljanim uništenjem pojedinih stanica unosom gena ubojice

- ciljanom inhibicijom genske ekspresije

Dva su tipa genske terapije:

a) in vivo

Izraz posuđen iz latinskog jezika; u doslovnom značenju unutar živog organizma.

Kod in vivo metode genetički materijal unosi se direktno u tijelo pacijenta. Mala je

mogućnost kontrole procesa, te se smatra poprilično nasumičnim procesom, ali je

isto tako jedina mogućnost za tkiva koja se ne mogu uzgajati in vitro.

14

b) ex vivo

Kod ex vivo metode genetički materijal unosi se najprije u stanice u kulturi.

Prisutna je selekcija stanica s transgenom, što ovu metodu čini kontroliranim

procesom. Stanice su kod ove metode obično autologne; uzimaju se iz pacijenta i

modificirane vraćaju natrag u pacijenta.

Problemi s kojima se nosi genska terapija su kratkotrajnost u smislu da je vrlo teško

postići dugotrajan učinak bez integracije u genom, iako čak i tada dugotrajnost

učinka ostaje upitna. Imuni odgovor sljedeći je problem jer reducira učinkovitost i

onemogućava opetovanu terapiju. Kod bioloških ili virusnih vektora javljaju se

toksičnost, imuni i upalni odgovor, te mogućnost povratka sposobnosti za izazivanje

bolesti. Kod višegenskih bolesti problem je teško liječenje zbog kombiniranog učinka

više gena.

TABLICA 1. Bolesti kod kojih je primjenjiva genska terapija

BOLEST UZROK / DEFEKT CILJNA STANICA Teška kombinirana imunodeficijencija

Adenozin deaminaza 4

Stanice koštane srži, T-limfociti

Hemofilija Faktor VIII, IX Jetra, mišić, fibroblastiCistična fibroza Gubitak gena CFTR Zračni jastučići- plućaRak Više uzroka Više tipova stanicaNeurološke bolesti Alzheimer, Parkinson Izravno u mozakKardio vaskularne bolesti Ateroskleroza Endotel krvnih žilaAutoimune bolesti Dijabetes MHC, beta2-mikroglobulinInfektivne bolesti AIDS, Hepatitis B T-limfociti, makrofagi

Način na koji će se unjeti genetski materijal ovisi o namjeni genske terapije.

15

2.1 BIOLOŠKI ILI VIRUSNI VEKTORI

Kod zamjene gena visoko učinkoviti su biološki ili virusni vektori koji će se koristiti

kod monogenskih bolesti kao što su na primjer cistična fibroza, hemofilija i teška

kombinirana imunodeficijencija. Cistična fibroza je autosomatska genetska bolest

koja pogađa u najvećoj mjeri pluća, ali i gušteraču, jetru i crijeva. Karakterizira ju

abnormalan transport klorida i natrija preko epitela, što dovodi do vrlo debelog i

viskoznog sekreta. Danas se otkriva i prije rođenja djeteta; bolest je koja najčešće

pogađa bijelce, a najkritičniji slučajevi podliježu transplantaciji pluća. Hemofilija

pripada skupini nasljednih bolesti kod kojih tijelo nema pravu mogućnost zgrušavanja

krvi (koagulacije), koja služi zaustavljanju krvarenja prilikom oštećenja krvnih žila.

Virusni vektori spadaju u in vivo tip genske terapije. Virusi su razvili specijalizirane

molekularne mehanizme za učinkovito transportiranje svojih genoma unutar stanica

koje oni nastanjuju. Unos gena virusnim vektorima naziva se transdukcija, a stanice

izložene virusima transducirane stanice. Tipovi virusnih vektora su retro virusi, lenti

virusi, adeno virusi, adeno-asocirani virusi i herpes simplex virusi.

Retro virusi su jedan od glavnih oslonaca i uspješnica trenutnih metoda genske

terapije. Imaju sposobnost stabilnog integriranja i najčešće se koriste u kliničkim

eksperimentima, pa je tako FDA odobrila već niz kliničkih istraživanja vezanih uz

teško kombiniranu imunodeficijenciju. (Cavazzano – Calvo 2000. ) U retro viruse

pripadaju virus HIV-a, mišji virus leukemije (MoMuLV), te RSV (RSV; virus koji inficira

dišne puteve).

Lenti virusi su podvrsta retro virusa, a njihova vektorska sposobnost prepoznata je u

novijem dobu, zahvaljujući sposobnosti da se integriraju u genom ne dijeljive stanice.

Korišteni su u istraživanjima genske terapije na HIV-u.

Adeno virusi su virusi s kojima ljudi najčešće dolaze u dodir. Uzrokuju respiratorne i

gastrointestinalne infekcije, te infekcije očiju. Problem koji se javlja kod ovog tipa

virusa je brzi imuni odgovor s mogućim opasnim posljedicama, zbog čega

znanstvenici i istražuju adeno viruse na koje ljudi ne stvaraju imunitet.

Adeno-asocirani virusi su vrlo mali virusi koji pogađaju ljude i neke druge primate. Ne

izazivaju nikakvu bolest, i kod njih se pojavljuje vrlo blag imuni odgovor. Virusi su to

16

koji se mogu ugraditi na specifično mjesto unutar kromosoma 19. Upravo iz

navedenih razloga adeno-asocirani virusi vrlo su popularni kao sredstvo u

istraživanjima genske terapije.

Herpes simplex virusi su virusi koji napadaju specifične tipove stanica, primjerice

neurone. Uzročnici su čireva i svih vrsta herpesa kod ljudi.

2.2 Gola DNK

Drugi način unosa genetskog materijala upravo je unos gole DNK. Unos je moguć

jednostavnom iglom i špricom, što se primjenjuje kod tumorskih tkiva, genskim

pištoljem; biolistika. Biolistika ili metoda genskog pištolja je uređaj za ubrizgavanje

stanica s genetskom informacijom koji je izvorno dizajniran za biljne transformacije.

Potencijalna mu je uporaba kod životinja i ljudi. Radi na principu tlaka helija ili

visokog napona pri čemu se plazmidna DNK taloži na čestice zlata ili volframa

promjera 1-3 mikrometra. Kod ljudi je takav način tek potencijalno primjenjiv. Češći je

unos liposomima. Liposomi su sitne lipidne čestice izgrađene od jednog ili više

lipidnih dvosloja koje nastaju spontanom agregacijom lipidnih molekula u vodenom

okružju. Kationski liposomi vežu negativno nabijenu DNK, te je tako omotana DNK

zaštićena od razgradnje. Dopremanje do ciljnog tkiva odvija se intravaskularnim,

intratrahealnim, intraperitonealnim i intrakolonskim putem.

Ovakav unos genetskog materijala jednostavniji je i jeftiniji, međutim nije univerzalan.

Kod infektivnih bolesti i raka koristit će se metode DNK vakcina, kod mišićne distrofije

biolistika, dok će metoda liposomima najviše odgovarati cističnoj fibrozi.

17

2.3 Rezultati istraživanja prema metodama genske terapije

Svaki od načina ili metoda genske terapije ima svojih prednosti i mana. Razvitkom

medicine i svakim novim istraživanjem, rezultati su konkretniji i učinkovitiji.

Francuska udruga mišićnih distrofičara 5. lipnja 2003. godine objavila je rezultate

kliničkih ispitivanja genske terapije Duchennove i Beckerove mišićne distrofije

(Vlahoviček 2011):

9 miševa podijeljeno je u 3 skupine:

- jedna injekcija- 200 mikrograma plazmida s genom za distrofin

- jedna injekcija- 600 mikrograma plazmida s genom za distrofin

- dvije injekcije- 2 x 600 mikrograma plazmida s genom za distrofin

Ispitani uzorci mišića pokazali su da je za prvu i drugu skupinu ekspresija distrofina

bila prisutna u 1-10% mišićnih vlakana, dok je u trećoj skupini ekspresija bila

potpuna. Vrlo je važno naglasiti da nije bilo imunog odgovora i nikakvih popratnih

učinaka.

U siječnju 1995. godine provedena su klinička ispitivanja na preko 900 pacijenata sa

cističnom fibrozom (Hodson 1995). Tretman liposomima internazalnim sprejom

rezultirao je privremenim olakšanjima kod 28% pacijenata koji su bili tretirani

jedanput dnevno i kod 37% pacijenata tretiranih dvaput dnevno. Nije bilo imunološke

reakcije. Na ove rezultate se 2000. godine nadovezalo novo istraživanje gdje su

pacijentima omogućene mjesečne doze, koje su rezultirale izraženijim poboljšanjima

i kontinuiranim rezultatima.

U pariškoj bolnici Necker, 2000. godine izvedena je klinička studija na 11 pacijenata

sa X- SCID ,X - vezana kombinirana imunodeficijencija; genetski poremećaj na x-

kromosomu (Vlahoviček 2011) Izolirano je 40 milijuna matičnih stanica koštane srži

koje su inficirane retro virusom i vraćene. Zaista ih je bilo inficirano virusom ukupno 5

milijuna, a samo 50 000 pokazalo je dugoročnu genetsku promjenu (približno 1%).

Ova genska terapija donjela je niz pozitivnih rezultata; sva djeca koja su primila

18

terapiju mogu živjeti normalan život, a ne više u sterilnim uvjetima; imaju normalan

broj T- limfocita; pokazala su odgovor na imunizacije protiv dječjih bolesti, uključujući

difteriju, tetanus i polio-virus, proizvode T- stanice i specifična protutijela; proizvodnja

protutijela je dovoljno dobra, te nema potrebe za periodičkim infuzijama

imunoglobulina. Na žalost genska terapija X-SCID-a donjela je i negativne rezultate;

trojica dječaka razvila su leukemiju zbog insercije korektivnog gena pored gena lmo2.

Lmo2 je protoonkogen i transkripcijski je faktor potreban za razvoj svih

hematopoietskih linija; sudjeluje u kontroli staničnog ciklusa i može potaknuti razvoj

raka ako se eksprimira u krivo vrijeme. Zbog negativnih nuspojava FDA je u SAD-u

zabranila 27 genskih terapija. Mjere opreza koje su markirane za buduća istraživanja

su smanjenje broja korigiranih matičnih stanica koje se unose u tijelo, te dobra

provjera mjesta ugradnje korektivnog gena.

Fakultet u Pennsylvanii, 1999. godine pokrenuo je kliničku studiju na bolesti

izazvanoj poremećajem urea ciklusa (OTCD - Ornithine Transcarbamylase

Deficiency). Poremećaj urea ciklusa je rijedak metabolički poremećaj koji se

pojavljuje na jednom od 80 000 slučajeva rođenih, posljedica je genetskog

poremećaja koji rezultira mutiranim i neučinkovitim oblikom enzima ornitin

transkarbimalaze. Nedostatak enzima dovodi do nakupljanja amonijaka u krvi, a

toksičnost amonijaka navodi na povraćanje, nemogučnost uzimanja mesa, što sve

dovodi do progresivne letargije i kome. Statistički, polovica djece oboljele od ove

teške bolesti umire u prvom mjesecu života, druga polovica umire do pete godine

života, ovisno o obliku bolesti. Jesse Gelsinger, osamnaestogodišnji mladić bolovao

je od lakšeg oblika bolesti, te je dotad regulirao bolest posebnim dijetama i terapijom

koja je uključivala 32 tablete dnevno. Jesse je primio adenovirusni vektor sa OTC

genom u portalnu venu jetre. Znanstvenici su vjerovali da najteže posljedice mogu

biti teško oštećenje jetre, međutim zbog vrlo jakog imunog odgovora na virus, došlo

je do višestrukog otkazivanja organa, i uslijedila je smrt mladića 4 dana nakon unosa

adenovirusa.

Najnovija istraživanja i rezultati genske terapije unutar zadnje dvije godine pokazuju

sljedeće:

1. U Great Ormond Street Hospital u Londonu, imamo uspješne rezultate u

liječenju CGD (Chronic Granulomatous Disease), CGD je kronični

19

granulamatozni poremećaj; nedostatak proizvodnje fagocita, stanica koje se

bore protiv bakterija i gljivica. Studija datira krajem veljače 2012.godine , te još

uvijek nije službeno izdana kao znanstveni članak, međutim uživa potporu

Ministarstva zdravstva Ujedinjenog Kraljevstva. Jedina dosadašnja terapija

ove bolesti bila je transplantacija koštane srži. Genska terapija provedena je

na šesnaestogodišnjaku koji boluje od CGD-a. Znanstvenici su izolirali

matične stanice iz koštane srži, te ih transficirali s vektorom koji je sadržavao

nedostajući gen. Matične stanice su mu vraćene i omogućile su proizvodnju

fagocita. Veliki napredak postignut je u usavršavanju vektora koji su u

prijašnjim pokušajima težili aktivaciji proonkogena, te su u ovom slučaju

korišteni poboljšani vektori koji ne bi trebali izazvati rak. Dječak se oporavio,

riješena je gljivična infekcija pluća, te je nastavio sa školovanjem.

2. U St. Jude Children's Research Hospital u suradnji sa London University

College došli su do revolucionarnih rezultata u liječenju hemofilije B.

Hemofilija B je genetska greška prilikom koje je onemogućena proizvodnja

proteina zvanog FAKTOR IX koji je ključan u zgrušavanju krvi; greška je na

kromosomu x, pa je ova bolest gotovo isključivo bolest muškaraca (Natwani

Amit C. 2011). Znanstvenici su potražili trajnije rješenje uzevši vrstu virusa

koja inače zarazi čovjeka bez vidljjivih siptoma. Modificirali su ga i zarazili

jetrene stanice s genetskim materijalom za proizvodnju faktora IX. Radi se o

adeno asociranom virusu 8 – AAV8, koji ciljno djeluje na jetru, međutim ne

prenosi bolest na čovjeka, niti se integrira u čovjekovu DNK. Faktor IX kod

pacijenata koji boluju od hemofilije niži je od 1%. Nakon unošenja virusa

vrijednost je porasla na 2 do 12%, a kod nekih se vrijednost iznad 2%

zadržala dulje od 16 mjeseci. Pacijent koji je primio najvišu koncentraciju

virusa zadržao je razinu faktora između 8 i 12% kroz 20 tjedana. Postizanje

vrijednosti faktora IX iznad 12% ne traži nikakvo dodatno liječenje bolesti osim

u slučaju teških trauma.

3. Sa Sveučilišta u Pennsylvaniji dolaze nam odlične vijesti o genskoj terapiji u

liječenju leukemije (Porter i sur. 2011) . Terapija je primjenjena na samo 3

pacijenta sa dijagnozom uznapredovale kronične limfocitne leukemije.

Znanstvenici su prijenosnicima dostavili nove gene T stanicama koje im daju

naredbu da uništavaju stanice raka, ali i da se razmnožavaju. Stvorena je

20

svojevrsna vojska stanica 'ubojica' koje su otkrivale tumorske stanice, razarale

ih i nastavljale uništavati sve nove koje su se pojavile. Pacijentima je uzeta

krv, izolirane su i modificirane T stanice, te kroz tri infuzije vraćene u

organizam pacijenata. Pacijenti su bili bez promjena dva tjedna, nakon čega

su se pojavile vručice i mučnina, što su simptomi masovnog odumiranja

stanica raka. Terapija je djelovala, i pacijenti su bili dobro. Problem ove

terapije je što ona u vrijeme kad se daju infuzije, uništava i neke druge stanice

koje se bore protiv zaraza.

Postignuća, pomaka, poboljšanja, zaključaka ima još mnogo. Znanstvenici

svakodnevno pokušavaju pronaći nove načine i oblike terapija raznih bolesti. Genska

terapija sasvim sigurno ima veliku budućnost, što pokazuju veliki napretci i

nadogradnje iz studije u studiju. Za razliku od nje genski doping mnogo je delikatnija

tema koja koristi njezine metode ali s različitim ciljem.

21

3. GENSKI DOPING; POTENCIJALNI GENI I CILJEVI

Tablica 2. Kandidati za sudjelovanje u genskom dopingu

Kapacitet izdržljivosti PPARdelta Receptor aktivacije

proliferacije peroksisoma delte

Agonist: GW 501516

NRF 2 ili NFE2L2 Jezgreni faktor staničnog disanja

Antioksidantni enzim

PGC 1 ili PPARGC1A Receptor aktivacije proliferacije peroksisoma gamma koaktivator 1 alfa

Aktivira se vježbanjem

HIF 1 Hipoksijom aktiviran faktor 1

Transkripcijski faktor koji reagira na promjene dostupnog kisika unutar stanice

EPAS 1 Endotelni protein 1 s PAS domenom

Uključen u indukciju gena reguliranih kisikom

HEMOGLOBIN Hemoglobin U krvi prenosi kisik iz dišnih organa na ostatak tijela, gdje se ispušta kisik, radi spaljivanja hranjivih tvari što daje energiju za funkcije organizma

GYS 1 Glikogen sintetaza Pretvorba glukoze u glikogen

ADRB 2 Beta-2 adrenergički receptor

Agonist: albuterol, clenbuterol ....

CHRM 2 Muskarinski kolinergički receptor 2

Receptori smješteni u srcu, normaliziraju bilo srca

VEGF Krvožilni endotelni faktor rasta

Vraća opskrbljivanje kisikom u tkivo kada je cirkulacija neadekvatna

Mišićna izvedbaCK-MM Mišićna kreatin kinaza Katalizira pretvorbu

kreatina, pretvara ATP u ADP, stvara phospocreatin – energetske rezervoare

ACTN 3 Alfa aktinin 3 Izrazen u specifičnim mišićnim vlaknima

22

MLCK Miozinska kinaza lakog lanca

Važni u mehanizmu kontrakcije mišića

ACE Enzim pretvorbe angiotenzina

Sudjeluje u regulaciji krvnog tlaka i tekučina

AMPD 1 Adenozin monofosfat deaminaza 1

Dio metaboličkog procesa koji pretvara šečere, masti i proteine u staničnu energiju

IGF 1 Inzulinu sličan faktor rasta 1

Anabolički efekti kod odraslih, na molekularnoj razini sličan inzulinu

TENDON APPARATUS Tendon apparatus Tendon – tkivo koje spaja mišiće i kosti

ABO blood group ABO sustav krvne grupe Najvažniji krvni sustav u ljudskoj transfuziji krvi

COL1A1 i COL5A1 Kolagen tipa 1 alfa 1, Kolagen tipa 5 alfa 1

Sastavni dio većine vezivnih tkiva, ukljućujući hrskavicu

TNC Tenascin C U interakciji s fibronectinom koji ima glavnu ulogu u adheziji stanice, rastu, zacijeljivanju rana i sl....

Psihološka sposobnostSerotonin transport gene Serotonin transporter Sastavni dio mnogih

lijekova antidepresivaBDNF Faktor rasta i razvoja

neuronaPovezanost sa masnoćom tijela

UCP 2 Mitohondrijski protein razdvajanja 2

Najizraženiji u skeletnim mišičima

Tablica sastavljena prema BRITISH MEDICAL BULLETIN 2010; 93:27-47, DOI:10.1093/BMB/LPD007

23

3.1 Kandidati prema kapacitetu izdržljivosti

3.1.1. PPAR delta

PPAR je nuklearni hormonalni receptor koji povezuje peroksisom proliferatore i

kontrolira broj i veličinu peroksisoma proizvedenih od stanice. PPAR posreduje niz

bioloških procesa, a može biti uključen u razvoj više kroničnih bolesti, kao što su

dijabetes, pretilost, ateroskleroza i rak. PPAR delta ili NR1C2 (nuklearni receptor,

subfamily 1, group C, member 2) je nuklearni receptor kodiran PPARdelta genom.

Visoko je izražen u debelom i tankom crijevu, jetri i keratinocitima. Ovaj protein

povezan je sa diferencijacijom, akumulacijom lipida, polarizacijom i migracijom

keratinocita (Schmuth i sur. 2004). Razvijeno je i nekoliko visoko afinitetnih liganda

kao što su GW 501516 i GW 0742, koji imaju vrlo značajnu ulogu u istraživanjima, pa

je tako otkriveno i kako aktivacija PPAR delta agonista mijenja gorivo tijela iz glukoze

u lipide (Brunmair i sur. 2006). Trening izdržljivosti može promovirati adaptivnu

transformaciju mišićnih vlakana i povećanje mitohondrijske biogeneze pokretanjem

skriptiranih promjena u ekspresiji gena. Opisat ću inžinjering miša sposobnog da

kontinuirano trči i do dva puta duže od svog divljeg srodnika. To je postignuto

ciljanom ekspresijom aktivnog oblika PPAR delta u mišićima, što uzrokuje prekidač

za formiranje povećanog broja mišićnih vlakana tipa 1. Tretman na divljim miševima, i

to agonistima PPAR delte izaziva sličan profil ekspresije gena mišićnih vlakana tipa

1. Štoviše, ova genetski generirana vlakna stvaraju otpornost na pretilost sa

poboljšanim metaboličkim profilom, čak i u odsutnosti vježbe. Svi ovi rezultati dokaz

su da se složena fiziološka svojstva kao što su umor, izdržljivost i sposobnost trčanja

mogu molekularno analizirati i da se njima može manipulirati (Wang i sur. 2004).

24

3.1.1.1. PPAR delta i AMPK

Vježbanje aktivira mnoge transkripcijske regulatore i serin/treoninske kinaze u

mišićima što pridonosi metaboličkom re-programiranju (Bassel- Duby 2006). PPAR

delta ima ključnu ulogu u transkripcijskoj regulaciji mišićnog metabolizma, što je

dokazano mnogobrojnim studijama od 2003.godine do danas. Pojačana ekspresija

konstitutivno aktivnog PPAR delte (VP16 – PPAR delta) u mišićima transgenskog

miša preprogramira povećanje u oksidativnim mišičnim vlaknima, povečavajući

izdržljivost trčanja do približno 100% u neaktivnih odraslih miševa (Wang i sur. 2004).

Jedan od najproučavanijih serin/treoninskih kinaza je aktivirana proteinska kinaza

(AMPK), glavni regulator staničnog i organskog metabolizma čija je funkcija

konzervirana u svim eukariotima (Hardie 2007). U sisavaca se pokazalo da AMPK

doprinosi homeostazi glukoze, apetitu i fiziološkim vježbama (Kubota i sur. 2007).

Ova zapažanja otvorila su sasvim nova pitanja, da li sintetički PPAR delta i AMPK

agonisti mogu reprogramirati uspostavljenu specifikaciju vlakana u odraslom mišiću

prema očiglednoj izdržljivosti fenotipa. Otkriveno je da PPAR delta agonist GW 1516,

koji je bioaktivan kod ljudi (Sprecher i sur. 2007), omogućuje miševima da trče 65 –

70% duže i dalje od netretiranih miševa, ali samo u kombinaciji sa vježbanjem. Ovaj

'super izdržljivi' fenotip povezan je sa nekom vrstom transkripcijskog akceleratora

pod utjecajem vježbom aktiviranog AMPK, rezultirajući iznimnom izdržljivošću u

genskom potpisu. Još važnija uloga AMPK u spomenutom fenotipu je neočekivani

nalaz da je oralno aktivni AMPK agonist AICAR dovoljan kao samostalan agent da

poboljša izdržljivost trčanja do približno 45% u neaktivnih miševa. Svi ovi rezultati

svakako otvaraju novi uvid u farmakološku fleksibilnost i raznolikost mišične izvedbe.

25

3.1.1.2. GW1516 i AICAR

AMP mimetički AICAR može povećati izdržljivost kod neaktivnih miševa genetskim

reprogramiranjem mišićnog metabolizma ovisno o PPAR delti. Također je poznato da

GW1516 kao agonist PPAR delte u kombinaciji s vježbanjem sinergistički izaziva na

umor rezistentno reprogramiranje vlakana tipa 1 i mitohondrijsku biogenezu u

konačnici povećavajući fizičku izvedbu. Te su promjene u korelaciji s neočekivanom

ali vrlo zanimljivom uspostavom genskog potpisa mišićne izdržljivosti koji je

jedinstven za model liječenje uz vježbu. Takav genski potpis rezultat je molekularnog

preslušavanja, a možda i fizičkog združivanja vježbom aktiviranog AMPK i PPAR

delte. Ova dostignuća identificiraju nove farmakološke strategije za reprogramiranje

mišićne izdržljivosti ciljajući na AMPK-PPARdelta signalizacijsku os sa oralno

aktivnim ligandima.

AMPK aktivator AICAR povećava potrošnju kisika i izdržljivost u netreniranih odraslih

miševa stimulirajući PPAR delta dijelom ovisne oksidativne gene. Unatoč iskazanoj

ulozi PPAR delte u izdržljivosti, petotjedni tretman najjačim i selektivnim agonistima

nije uspio promjeniti ni sastav ni izdržljivost vlakana, otkrivajući da je izravna i

farmakološka aktivacija PPAR delte nedovoljna kako bi se poboljšala učinkovitost

trčanja.

Ideja da AMPK aktiviran vježbom međusobno djeluje sa PPAR deltom u regulirajućoj

genskoj ekspresiji podržana je demonstracijom u kojoj AMPK i PPAR delta

dramatično povećavaju transkripciju preko receptora ovisnu o ligandima, kao i

bazalno ovisnu. Unatoč fizičkoj interakciji, AMPK ipak ne izaziva PPAR delta

fosforilaciju u studijama metaboličkog označavanja. Fosforilacija je dodavanje

fosfatne PO4 grupe na protein ili neku drugu organsku molekulu, a odvija se

mitohondrijima. Fiziološka validacija AMPK – PPAR delta interakcije dolazi iz tvrdnje

da GW 1516 i AICAR sinergistički potiču izdržljivost nekoliko povezanih gena kod

divljeg tipa. Tretiranje životinja s AICARom i GW1516 stvara genski potpis u mišićima

koji replicira do 40% genskih učinaka kombiniranog vježbanja i tretmana s GW1516.

Značajno je da su zajednički geni između dva profila povezani s oksidativnim

metabolizmom, angiogenezom ili neovaskularizacijom, što je formiranje krvnih žila,

umjerenosti glukozom, putevima koji su izravno relevantni za mišićnu izvedbu.

26

Dokazano je i da molekularno partnerstvo AMPK i PPAR delte u reprogramiranju

mišićnog transkriptoma i izdržljivosti može biti lagano iskorišteno oralno aktivnim

AMPK lijekovima u zamjenu za vježbanje.

Kod ljudi vježbe izdržljivosti dovode do fizioloških adaptacija u kardio – plućnom,

endokrinom i neuromuskularnom sustavu (Lucia i sur. 2001, Jones i sur. 2000).

AMPK i vježbanje mogu pridonjeti povećanoj izdržljivosti. Iako se potencijali ekstra

mišićne prilagodbe PPAR delte i AMPK agonista još istražuju, otkriveno je da

tretman lijekovima može smanjiti masno tkivo u miševa, a možda stekne i dodatne

sustavne prednosti. Važno je napomenuti da je PPAR delta važan za normalnu

srčanu kontraktilnost, kao i za endokrinu funkciju masnog tkiva (Wang i sur. 2003,

Cheng i sur. 2004). Aktivacija AMPK metforminom posreduje sposobnost na niže

razine glukoze u krvi (Shaw i sur. 2005). Metformin je oralni antidijabetski lijek koji se

koristi u liječenju dijabetesa tipa 2 . Osim povećanja sportskih sposobnosti, vježbanje

ima korisan učinak u širokom rasponu pato-fizioloških stanja, kao što su

respiratorne bolesti, kardiovaskularne abnormalnosti, dijabetes tipa 2 i rizik od

razvoja raka. Razumijevanje učinaka vježbanja na normalnu fiziologiju, kao i

identificiranje farmaceutskih ciljanih puteva koji mogu potaknuti te učinke je

presudno. Kroz dosadašnje studije je pokazano da sintetički PPAR delta i vježbanje,

ili sama aktivacija AMPK daju značajan transkripcijski znak koji reprogramira mišićni

genom i dramatično poboljšava izdržljivost. Strategija unaprijed reorganiziranog

genskog pečata mišića, kao i drugih tkiva, koristeći aktivne mimetičke lijekove, ima

terapijski potencijal u liječenju mnogih mišićnih bolesti, kao što su mišićno

propadanje, slabost, pretilost, gdje je dobro poznato koliko je aktivno vježbanje

korisno.

27

3.1.2. Eritropoetin (EPO)

Dobra opskrba kisikom do skeletnih i srčanog mišića potrebna je za normalno

funkcioniranje, dok je povećana prokrvljenost potrebna za izdržljivost i akcije koje se

vežu za izdržljivost. Eritropoetin (EPO) je glikoprotein koji se proizvodi u bubrezima

kao odgovor na nisku koncentraciju kisika. Ekspresija eritropoetina dovodi do

povećanja proizvodnje crvenih krvnih zrnaca, tako i do povećanja kapaciteta

prijenosa kisika u krvi. Molekulska masa mu je oko 36 kDa, a 40% molekula čine

ugljikohidrati. Sastoji se od 3 N-vezane i 1 O-vezane šečerne jedinice. Prema

posljednjim saznanjima, smatra se da O-vezani ugljikohidratni ostatak nema

esencijalnu ulogu u (in vivo i in vitro) biološkoj aktivnosti eritropoetina. S druge

strane, pokazano je da ukljanjanje N-vezanog šećera, iako ima neznatni utjecaj na in

vitro aktivnost, u potpunosti eliminira aktivnost in vivo. Prisutnost šećernih

komponenti utječe na fizičkokemijske karakteristike, primjerice topljivost, kao i na

metabolizam eritropoetina. Proces glikozilacije smatra se jednom od najvažnijih post

translacijskih modifikacija. Glikozilacija je enzimski proces koji dodaje glikane na

proteine, lipide, ili druge organske molekule. Glikozilacija eritopoetina je tkivno i

vrsno specifična, a rekombinantni proteini pokazuju različite razine post translacijskih

modifikacija u odnosu na endogene proteine. Nepotpuna N-glikozilacija dovodi do

smanjene aktivnosti in vivo zahvaljujući bržem klirensu preko jetre (t 1/2 je 2 min za

razliku od nativnog EPO gdje je t ½ - 4-6h). Korištenje rekombinantnog proteina

(rhEPO) povećava maksimalni tjelesni kapacitet potrošnje kisika, a time i povećanje

izdržljivosti i fizičke kondicije. To je dovelo do zlouporabe rhEPO u sportu (Gaudard i

sur. 2003). Međunarodni Olimpijski odbor zabranio je korištenje EPO u sportu

1990.godine. Na tržištu je danas dostupno sve više i više različitih vrsta EPO, što

postavlja veliki izazov u detekciji. Najčešće korišteni rekombinantni EPO i njegovi

analogni izdanci u sportu su: rhEPO, Darbepoetin alpha i CERA. Darbepoetin alpha i

CERA pripadaju drugoj i trećoj generaciji eritropoetin stimulirajućih agensa, i imaju

više nego zadovoljavajuće rezultate u kliničkim studijama u kojima su korišteni.

Otkrivanje zlouporabe EPO u sportu otežano je zbog vremena uzimanja uzoraka i

dostupnosti specijaliziranih laboratorija s potrebnom infrastrukturom, što je jedan od

najvećih ograničavajućih faktora detektiranja EPO. Drugi razlog je što je vrlo teško

razlikovati endogeni EPO i rekombinantni egzogeni hormon. Vrlo je kratak život EPO

28

u serumu, 8,5+/- 2,4h - intravenski ili 19,4+/- 10,7h – potkožno, ovisno o načinu

unosa u organizam, (Fukuda i sur. 1989). EPO je nemoguće detektirati nakon 3-4

dana od injektiranja u organizam. Sve su to razlozi zašto je uporaba EPO poprilično

raširena u sportu. Najčešće je detektiran kod trkača u atletici i kod biciklista; afere na

Tour de France bile su najmnogobrojnije i najviše medijski popraćene. Iz istih

razloga, doping testovi u tim sportovima zahtjevaju najrazvijenije tehnike detekcije.

Opasnosti korištenja EPO su velike. Prva opasnost je povećana viskoznost krvi.

Povećanjem broja crvenih krvnih zrnaca krv postaje gušća. Iznad određene razine

postoji rizik za začepljenjem kapilara. Ukoliko se to dogodi u mozgu, posljedice su

moždani udar, u srcu, srčani udar. EPO je posebice opasan za sportaše koji

vježbaju kroz duži period. Sportaši u dobroj formi otporniji su na dehidraciju od svojih

sjedećih oponenata. Nekoliko je metoda kako tijelo to postiže, cirkulacija krvi jedna je

od njih, pa zato i može služiti kao 'rezervoar za vodu' koju organizam treba. Tijekom

izrazite tjelovježbe, voda se gubi iz krvnog sustava i krv se počinje zgušnjavati.

Ukoliko pojedinac počinje s umjetno izazvanim brojem crvenih krvnih zrnaca i

gušćom krvi, veći je rizik za začepljenjem o kojem sam već govorio. Dodatne

opasnosti EPO uključuju i iznenadne smrti sportaša tijekom noći, kada se cijeli srčani

sustav usporava, pa je rizik od bilo kakvih začepljenja veći. Postoje indicije da

sportaši koji koriste EPO često vježbaju i tijekom noći kako bi potaknuli cirkulaciju i

smanjili rizik. U posljednjih petnaest godina iznenadna smrt pogodila je osamnaestak

biciklista. Kao moguća opasnost navodi se i proizvodnja antitijela usmjerenih na

EPO. U takvim okolnostima pojedinac razvija anemiju kao posljedicu reakcije tijela na

ponovljene EPO injekcije.

3.1.3. PGC 1 alfa

PGC 1 alpha je transkripcijski koaktivator, regulator gena koji sudjeluju u

energetskom metabolizmu. Ovaj protein može djelovati zajedno s oblicima PPAR-a,

a može djelovati i regulirati CREB (c AMP response element-binding protein) , te

NRF (nuclear respitory factor). Pruža izravnu vezu između vanjskih fizioloških

podražaja i uređenja mitohondrijske biogeneze, te je glavni čimbenik koji regulira

određivanje mišićnih vlakana. Vježbe izdržljivosti aktiviraju gen za PGC1 alpha u

ljudskim mišićima (Pilegaard i sur. 2003). PGC1 alpha pokazao je povezanost sa

29

kontrolom krvnog tlaka, regulacijom homeostaze staničnog kolesterola, kao i

razvitkom gojaznosti, što ga uvrštava u jedne od vrlo atraktivnih predmeta budućih

istraživanja.

PGC1 alpha identificiran je kao nuklearni faktor presudan u koordinaciji aktivacije

gena presudnih u mitohondrijskoj biogenezi u kulturi stanica i mišićima glodavaca.

Kako bi se utvrdilo je li transkripcija PGC1 alphe regulirana akutnom vježbom i

vježbom osposobljavanja ljudskih mišića, uzeto je sedam muških ispitanika na 4

tjedna, podvrgnutih treningu vježbanjem ekstenzora koljena jedne noge. Na kraju

treninga, ispitanici su izvršili 3 sata vježbanja ekstenzora koljena obje noge. Biopsija

je izvođena na mišićima vastus lateralis i trenirane i ne trenirane noge prije vježbanja

i nakon 0, 2, 6 i 24 sata oporavka. Vrijeme do iscrpljenosti (2 min maksimalni otpor ),

kao i heksokinaza 2 (HK2), citrat sintaza i još neke vrijednosti bile su veće u

treniranih nego ne treniranih nogu prije vježbanja. Vježbanje je izazvalo značajno

prolazno povećanje (P<0.05) u transkripciji PGC1 alphe (10 do > 40 puta) i mRNK

sadržaja (7 do 10 puta ) unutar 2 sata nakon vježbanja. Aktivacija PGC1alphe bila je

veća u treniranoj nozi, bez obzira na niže vrijednosti relativne radne sposobnosti.

Vježba nije utjecala na NRF1 m RNK, gen pokrenut PGC1 alphom u kulturi stanica.

HK2, mitohondrijski transkripcijski faktor A i još neke vrijednosti povišene su (2 do 6

puta, P<0.05) na 6 sati nakon vježbanja u netreniranoj nozi, ali nisu se promjenile u

treniranoj. Svi navedeni podaci pokazuju da vježbanje uzrokuje dramatični porast u

transkripciji PGC1alpha i sadržaju m RNK u ljudskih mišića. U skladu sa svojom

ulogom transkripcijskog koaktivatora, rezultati pokazuju i da PGC1alpha može

uskladiti aktivaciju metaboličkih gena u mišićima kao odgovor na aktivno vježbanje.

Trening vježbama izdržljivosti povećava oksidativni kapacitet i učinkovitost

metabolizma mišića (Saltin i sur. 1983). Ovaj adaptivni odgovor dijelom se može

pripisati povećanju ekspresije proteina izazvanim treningom koje je uključeno u

transport i oksidaciju metaboličkih supstrata i ukupnom povećanju mitohondrijskog

sadržaja (Booth i sur. 1996., Williams i sur. 1996). Temeljni proces odgovoran za ove

stanične prilagodbe dolazi barem djelom od kumulativnih učinaka prolazne promjene

u ekspresiji gena koje se javljaju kao odgovor na svaku vježbu (Hood 2001).

PGC1 alpha identificira se i kao regulatorni faktor uključen u koordinaciju aktiviranja

nuklearnih gena koji kodiraju proteine mitohondrija u nekoliko tkiva, ukljućujući mišić

30

(Scarpulla 2002). PGC1 alpha ne veže se za sam DNK, već u interakciji s odabranim

transkripcijskim faktorima već vezanim na promotorske regije ciljnih gena. Pozitivni

učinci PGC1 alpha na transkripciju posredovani su njezinom sposobnosti da se veže

na specifične transkripcijske faktore (NRF1 i MEF2c – myocyte enhancer factor 2c),

zaposli dodatne koaktivatore koji imaju unutarnju aktivnost histon acetil- transferaze,

veže RNK polimeraze 2, i razne čimbenike razdvajanja i na taj način poboljšava

ukupnu učinkovitost transkripcijskih mehanizama (Puigserver i sur. 1998, Knutti i sur.

2001). Pojačana ekspresija PGC1alphe potiče mitohondrijsku biogenezu u skeletnih

miocita uzgojenih u kulturi, i u srčanog mišića transgenskih miševa (Wu i sur. 1999,

Lehman i sur. 2000), te je povezana s dramatičnim indukcijama NRF 1 i NRF2alpha.

Kod miševa, prisilno izazvana ekspresija PGC1 alpha uzrokuje u mišićima izrazitiju

crvenu boju, povećava izraz sporog troponina 1 i mioglobin gena (dva gena izražena

u niskim razinama vlakana tipa 2) , te povećava ekspresiju nekoliko gena uključenih

u mitohondrijski oksidativni metabolizam (Lin i sur. 2002). Zajedno svi ovi nalazi

dokazuju da je povećana ekspresija endogenog PGC1alpha gena vrlo važna za

aktiviranje gena koji su uključeni u oksidativni metabolizam u mišićima.

Zaključno, rezultat svih podataka kojima raspolažemo pokazuje da vježbanje

uzrokuje dramatično prolazno povećanje transkripcije PGC1 alpha gena u ljudskim

mišićima tijekom oporavka od vježbanja. Aktivacija PGC1 alphe pojačana je s

treningom i javlja se u nedostatku promjena ekspresije m RNK signalnih proteina za

opću regulaciju primitka kalcija ili regulaciju drugih ciljnih faktora transkripcije (NRF1

ili NRF2 alpha). Sposobnost PGC1alphe da transformira većinski glikolitski mišić u

oksidativni fenotip kada je selektivno izražen u mišiću transgenskih miševa (Lin i sur.

2002), otvara uzbudljivu mogućnost da prolazna indukcija PGC1 alphe kao odgovor

na vježbanje može biti uključena u koordinaciju naknadnih promjena u ekspresiji

gena koji temelje adaptivne odgovore na izdržljivost vježbanja u mišićima čovjeka.

31

3.1.4. HIF 1

Heterodimerički transkripcijski faktor HIF1 ključni je regulator urođenog imunološkog

odgovora (Acosta- Iborra i sur. 2009), preživljavanja stanica (Walmsley i sur. 2005),

angiogeneze (Maxwell i sur. 1997) i metabolizma glukoze (Mason i sur. 2004). Niska

O2 napetost između stanica glavna je pokretačka snaga za sve aktivnosti HIF1,

ukljućujući i stabilizaciju i povećanu transkripciju njegove kontrolirane podjedinice HIF

1alpha (Jiang i sur. 1996, Huang i sur. 1998). Svi učinci, zajedno sa svojim propisima

od strane O2 napetosti formirali su ideju da je HIF1 alpha idealan za dirigiranje

promjenama ekpresije gena, što na kraju dovodi do prilagodbe uzrokovane vježbom

(Gustafsson i sur. 1999).

Mnoge studije istraživale su sudjelovanje HIF1 alpha kao odgovor na vježbanje u

mišićima in vivo (Gustafsson i sur. 2002, Vogt i sur. 2001) i in vitro (Milkiewicz i sur.

2007, Silva i sur. 2005). Većina in vivo studija nije pronašla značajne promjene u

HIF1 alpha m RNK ili HIF1 alpha ekspresiji proteina u vježbanju mišića pod

normoksičnim uvjetima (Birot i sur. 2003, Kivela i sur. 2007, Malm i sur. 2004), iako

fiziološki pad O2 napetosti u stanici radnog mišića očekivano je dovoljno visok za

stabiliziranje HIF1 alpha. In vitro studije samo su potvrdile i učvrstile koncept da su

ekspresija HIF1alpha m RNK i HIF1alpha proteina prvi važan korak koji vodi do

metaboličke i vaskularne prilagodbe radnog mišića (Lima i sur. 2009).

Nedavne analize mikro čipom usmjerene na gene upalnog odgovora otkrile su fazu

spola i menstrualnu fazu u zavisnosti na regulaciju ekspresije gena upalnog

odgovora kao reakciju na aerobno vježbanje (Northoff i sur. 2008), ali nisu uspjele

pokazati sudjelovanje HIF1 alphe.

Sve je veći broj studija i podataka upravo o utjecaju HIF 1 faktora na cijeli niz bolesti ,

kao i unapređenju mišića. Na novim je studijama u sferama imunologije, kao i

fiziologije da utvrđuju šira djelovanja HIF1, HIF1alphe i njihovih podjedinica.

32

3.1.5. GYS 1

Glikogen sintetaza je enzim koji u stanicama katalizira reakciju povezivanja molekula

glukoze u glikogen. Drugim riječima, ovaj enzim pretvara višak ostataka glukoze

jedan po jedan u polimerni lanac za pohranu kao glikogen. Kod čovjeka postoje dva

izoenzima: glikogen sintetaza 1 (mišićni enzim) i glikogen sintetaza 2 (jetreni enzim).

GYS1 gen je lociran na 19.kromosomu. Njegova prisutnost u krvi najviša je između

30 i 60 minuta nakon intenzivne vježbe. On je ključni enzim u glikogenozi.

Opisat ću dobiti funkcije mutacije GYS1 u mišićima, koji je odgovoran za miopatiju, i

široko je raspostranjen u više pasmina konja, jer je nastao mnogo prije pojave

mnogih modernih pasmina. Konji su pripitomljavani tisućama godina, a moderne

pasmine nastale su selekcijom raznih sportskih, fizičkih osobina, kao i osobina

ponašanja. U konja, kao i drugih životinjskih vrsta, uzgojne linije u propagandi

poželjnih osobina, slučajno prenesu i štetne osobine. Jedno takvo nepoželjno

svojstvo je PSSM – Polysaccharide Storage Myopathy (Valberg i sur. 1999), što je

glikogenoza u konja izražena abnormalnom akumulacijom glikogena u mišičima, i

oštećenjima mišića naporom. Za razliku od bolesti pohranom glikogena koje

proizlaze iz poznatih nedostataka u glikogenolize, glikolize i sinteze glikogena koje su

opisane u čovjeka i domaćih životinja. GYS1 je identificiran kodiranjem glikogen

sintetaze mišića, kao genski kandidat za PSSM. Analiza DNK sekvenci otkrila je

mutaciju nastalu u supstituciji arginina u histidin u visoko konzerviranom dijelu

glikogen sintetaze. Funkcionalna analiza pokazala je povišenu aktivnost glikogen

sintetaze u konja oboljelih od PSSM-a. Analiza haplotipa i procjena dobi alela

pokazale su da je porijeklo mutacije identično među svim konjskim pasminama. Prvo

je to izvješće o dobiti funkcije mutacije GYS1 s rezultatom glikogenoze (McCue i sur.

2008).

Niti jedan drugi prirodni prirast funkcije mutacije u GYS1 nije pokazao uzrokovanje

bolesti pohrane glikogena kod bilo koje vrste sisavaca. Srodni gen GYS2, izražen u

jetri, ima nekoliko poznatih mutacija koje smanjuju aktivnost enzima glikogen

sintetaze i sadržaja glikogena, što dovodi do brze hipoglikemije (DiMauro i sur.

2004). U nedavnim studijama opisane su mutacije u ljudskom genu GYS1 koje su

33

rezultirale stop kodonom na egzonu 11, recesivno nasljednjim gubitkom glikogena

kod srčanog i skeletnih mišića, hipertrofijskom kardiomiopatijom, i smanjenom

tolerancijom vježbanja (Kolberg 2007). Međutim, dominantno nasljedna PSSM

GYS1 mutacija rezultira povećanom aktivnosti glikogen sintetaze u mišićima, što je

novi oblik bolesti pohrane glikogena. Bilo bi korisno ispitati GYS1 kao genskog

kandidata za značajan dio miopatije pohrane glikogena kod ljudi sa još neutvrđenim

molekularnim osnovama (DiMauro i sur. 1995).

Konji su osobito korisni za proučavanje metaboličkih miopatija jer su vrhunski

sportski uzgojeni za brzinu ili izdržljivost, a poremećaji bilo da se radi o energetskom

metabolizmu, ili mišičnoj funkciji su vidljivi, jer im se ne pruža mogućnost da budu

neaktivni. Daljnje razumjevanje mehanizma odgovornog za promjenjenim

metabolizmom glikogena i glukoze u GYS1 i ne GYS1 oblicima PSSM-a, može pružiti

sasvim nove uvide u normalnu i promjenjenu regulaciju metabolizma mišičnog

glikogena i razvoj rabdomiolize. Rabdomioliza je potencijalno vitalno ugrožavajuće

oboljenje, čija je patofiziološka osnova u oslobađanju intracelularnog sadržaja

skeletnih mišića, što u krajnjem može rezultirati akutnom bubrežnom insuficijencijom.

Vodeći, a najmanje prepoznat uzročnik rabdomiolize je ekstenzivan fizički napor u

sklopu vežbanja kod zdrave populcije (“overtraining” sindrom – kumulativni efekat

mišićne lezije bez dovoljnog odmora).

34

3.1.6. ADRB 2

Sportaši pokušavaju poboljšati performanse lijekovima koji djeluju na Beta

adrenergički sustav izravno ili neizravno. Od tri Beta adrenoceptor (AR) podtipova,

Beta 2 adrenoceptor je glavni cilj u sportu, ima bronhodilatatorno i anaboličko

djelovanje, i unapređuje anti upalno djelovanje kortikosteroida. Iako dokazivo u

pokusima na životinjama, čak i ljudima, malo je dokaza da ta svojstva mogu značajno

poboljšati performanse u obučenih sportaša. Njihove aktivnosti također mogu biti

ugrožene receptorom desenzitizacije i zajedničkim prirodnim receptornim mutacijama

(polimorfizmima) koji mogu utjecati na signalizaciju receptora i desenzitizaciju

osobine kod ljudi. Indirektno djelujući agenti utječu na oslobađanje i povrat

noradrenalina i adrenalina, čime utječu na sve AR podtipove, uključujući i 3 Beta AR.

Ovi agenti mogu imati snažne psihostimulativne učinke koji pružaju efekt boljih

performansi, što se obično ne provede u poboljšanje u praksi. Amfetamini i kokain

također imaju znatan potencijal za oštećenje srca. Beta AR antagonisti (Beta

blokatori) koriste se u sportovima u kojima se zahtjevaju stabilnost i točnost, kao što

su streličarstvo i streljaštvo, gdje njihova sposobnost da se smanji broj otkucaja srca i

tremor mišića može poboljšati performanse. Oni imaju štetan učinak na sportove

izdržljivosti jer smanjuju fizičku izvedbu i maksimum opterećenje vježbanja. Nedavne

studije utvrdile su da mnogi Beta AR antagonisti ne samo da blokiraju aktivnosti

agonista, već uključuju druge (mitogen aktivirane- PK) signalne puteve koji utječu na

rast stanica i sudbinu istih. Koncept da mnogi spojevi prethodno smatrani

'blokatorima' mogu izraziti svoj spektar farmakoloških svojstava, potencijalno ima

dalekosežne posljedice za korištenje lijekova, i terapeutski i nezakonito.

Beta 2 AR agonisti : ergogenski učinci

Beta 2 AR agonisti se koriste terapeutski za liječenje astme zbog njihove moćne

bronhodilatatorne aktivnosti. Međutim korištenje Beta 2 AR agonista sportašima je

zabranjeno od strane Svjetske antidopinške agencije, s iznimkom formoterola,

salbutamola, salmeterola i terbutalina, kada se primjenjuje inhaliranjem, ako je

sportašu odobren izuzetak u terapijske svrhe. Akcije i potencijalne radnje Beta AR

35

agonista koje bi mogle dovesti do poboljšanja performansi u sportu su

bronhodilatacija, kao i anaboličko i protuupalno djelovanje.

Beta 2 AR agonisti: bronhodilatatorne akcije

Brojne studije istraživale su učinke inhalacijskih Beta 2 AR agonista kod ne

astmatičnih sportaša. Iako su sve pokazale bronhodilatatorne akcije (Morton i sur.

1992, Norris i sur. 1996, Larsson i sur. 1997, Goubault i sur. 2001), različiti su učinci

na fizičke performanse. Nakon udisanja terapijske doze salbutamola, ograničen broj

studija pokazao je povećanje u izvedbi vježbe (Bedi i sur. 1988, Signorile i sur. 1992,

Van Baak i sur. 2004), dok većina studija nije pokazala ergogenski učinak. Nadalje,

iako je zabilježeno malo povećanje izdržljivosti kod biciklističkih performansi nakon

inhalacije doze od 800 mikrograma salbutamola, slična doza nije imala učinka na

izdržljivost izvedbe u ne astmatičnih triatlonaca. Nekoliko studija koje su ispitivale

učinak ostalih inhalacijskih Beta 2 AR agonista, također nisu pokazale utjecaj na

performanse, unatoč poboljšanju plućne funkcije (Carlsen i sur. 2001, Riiser i sur.

2006). Sve u svemu, akutno korištenje postojećih inhalacijskih Beta 2 AR agonista,

lijekova protiv astme, i to od strane ne astmatičnih i astmatičnih sportaša ne daju

nikakvo poboljšanje u perfomansama, osim što osiguravaju kontrolu njihovog stanja.

Od većeg interesa je prikladnost testova za dobivanje izuzetaka u terapijske svrhe,

koji mogu biti neprikladni za dijagnosticiranje nekih oblika astme pod uvjetima na

samom natjecanju (Naranjo Orellana i sur. 2006).

Jedna je situacija u kojoj je poboljšana funkcija pluća omogućena inhalacijskim Beta

2 AR agonistima bila od koristi, a to je administracija tih lijekova plivačima

neposredno prije utrke, kada povećanje unosa kisika može povećati vrijeme izlaska

na površinu nakon zaranjanja, spremajući tako frakcije sekundi tokom utrke

(Verroken 2005). Međutim, metoda je naišla na protivljenje upravnih tijela koji

zahtjevaju od sportaša udaljavanje iz natjecateljskog područja tokom liječenja, i

dobivanje vremena za oporavak prije samog natjecanja.

36

Beta 2 AR agonisti : anti upalne aktivnosti

Veliko je zanimanje za protuupalna djelovanja Beta 2 AR agonista, zbog široke

uporabe u liječenju astme, većinom smatrane upalnom bolesti dišnih puteva. Ranije

su in vitro studije predlagale da su Beta 2 AR agonisti, ukljućujući salbutamol,

salmeterol i formoterol, sposobni za sprečavanje upalnih posrednika puštenih iz

mastocita (Broadley 2006). In vivo istraživanja manje su uvjerljiva i mnoge učinke

objašnjavaju bronhodilatatorni efekti Beta 2 AR agonista. Iako salmeterol posebice

utječe na staničnu adheziju i kemotaksiju, na oslobađanje upalnih posrednika ne

utječe. Beta 2 AR agonisti nemaju direktno anti upalno svojstvo, međutim postoje

uvjerljivi dokazi iz osnovnih i kliničkih studija da Beta 2 AR agonisti u kombinaciji sa

inhalacijskim steroidima omogućuju kontrolu astme, mnogo bolje nego sami agenti,

sugerirajući sinergiju (Nelson 2005). U nedavnoj studiji ljudske bronhijalne epitelne

stanične linije, Beta2 AR agonisti su izazvali poboljšanje razine transkripcije

glukokortikoida ovisne o elementu odgovora i to putem kortikosteroida, za 2-3 puta

više nego samim kortikosteroidima (Kaur i sur. 2008). Takvu klasnu akciju Beta 2 AR

agonista sa sličnim efektima, razvijaju i salbutamol, salmeterol i formeterol u

kombinaciji sa deksametazonom, budezonidom ili flutikazonom. U kliničkom liječenju

astme, najčešće korišteni glukokortikoidi su budezonid, flutikazon, mometazon,

triamcinolon i flunizolid, a izabrani su zbog visoke razine prvog prolaza metabolizma,

kako bi se smanjili sustavni učinci. Međutim, sustavni učinci poput suzbijanja rasta,

smanjenja gustoće kostiju, promjene u metabolizmu, i suzbijanja hipofizno-adrenalne

osi nisu rijetkost, osobito u djece (Topliss i sur. 2003, Nieto i sur. 2007).

Minimalizirani su dakako prilagodbom doze kortikosteroida u terapijske svrhe.

Opasnost od sustavnih učinaka opet je prisutna ukoliko su doze kombiniranih

dugodjelujućih Beta 2 AR agonista sa kortikosteroidima veće od normalnih terapijskih

doza, što kod primjene u sportaša nije rijetkost.

37

Beta 2 AR agonisti: anabolički učinci

Iako je malo dokaza da inhaliranjem terapijskih doza Beta 2 AR agonista

poboljšavamo performanse, inhaliranjem velikih doza ili nekim drugim načinom

primjene mogu se primjetiti anabolički učinci na mišićima. Posebno su proučavani

anabolički učinci za klenbuterol, dugodjelujući Beta 2 AR agonist licenciran za

liječenje od astme u ograničenom broju zemalja. Zanimljivo je da je klenbuterol

izvorno razvijen kao ne steroidni anabolički agent, za poboljšanje stope pretvorbe ili

učinkovitost pretvaranja hrane u tjelesnu masu kod životinja. Anabolički učinci oralnih

Beta 2 AR agonista vrlo su dobro dokumentirani kod životinja (Zeman i sur. 1988,

Moore i sur. 1994, Ryall i sur. 2006), a povezani su sa povećanjem mišićnog

proteina, uglavnom zbog inhibicije razgradnje proteina (Reeds i sur. 1986, Yang i sur.

1989, Maltin i sur. 1993). Osim povećanje mišićne mase, Beta 2 AR agonisti

smanjuju tjelesne masnoće. Povećanje mišićne mase povezano je sa proizvodnjom

mišićne snage (Dodd i sur. 1996).

Drugi Beta 2 AR agonist koji se nalazi na WADA listi zabranjenih suspstanci je

zilpaterol. Izvorno je predstavljen kao promotor rasta u goveda, i korišten je u Južnoj

Africi i Meksiku. Informacije o njemu nešto su ograničenijeg pristupa, međutim

sličnog je farmakološkog profila kao i klenbuterol, možda nešto manje moćan, i bilježi

neke kemijske sličnosti sa izoprenalinom, salbutamolom, formoterolom i

klenbuterolom, koji su svi feniletanolamini (Verhoeckx i sur. 2005). Iako je malo

znanstvenih radova provedeno o djelovanju zilpaterola kod ljudi, prema širokoj

prisutnosti na bodybuilding forumima, pretpostavlja se njegovo korištenje sa

anaboličkim učincima u sličnim granama sporta.

Iako fizičke performanse nisu zabilježile povećanje kod inhaliranja salbutamola,

oralnim uzimanjem istog dobivamo sasvim drugačije rezultate i pozitivne učinke

(Moore i sur. 1994, Caruso i sur. 1995, Van Baak i sur. 2000). Jedna oralna doza

salbutamola, povećala je izokinetičku mišićnu snagu i izdržljivost performansi u

zdravih muških dobrovoljaca. Ti ergogenski učinci nisu bili vidljivi samo kod 4

kandidata od sveukupnih 16, koji su doživjeli negativne nuspojave, ukljućujući

mučninu, vrtoglavicu i nervozu. Anabolička aktivnost Beta 2 AR agonista ovisi o

gustoći receptora pojedinih mišića (Beermann 2002).

38

Dodatna skupina agenata koji imaju potencijal pridodavanja fizičkim performansama

u sportu i na natjecanjima, a nalaze se također na WADA listi zabranjenih supstanci

jesu indirektno djelujući simpatomimetički agenti i noradrenalin povratni blokatori

(Smith i sur. 1992) . WADA klasificira ove agente kao stimulanse, a zabranjeni agenti

uključuju amfetamin, kokain, dimetilamfetamin, efedrin, mefenteramin,

metamfetamin, metilendioksimetamfetamin, metilefedrin i metilfenidat. Potencijalne

središnje psihostimulirajuće koristi ovih agenata ukljućuju smanjenje umora,

povećanje koncentracije i budnosti, dok potencijalne periferne fiziološke prednosti

uključuju neizravnu aktivaciju Beta AR , stimuliranje kardiovaskularne funkcije i

metaboličke aktivnosti. Ergogenski učinci ovih stimulansa stalno su prisutni, međutim

nedovoljno dokazani kroz studije.

Kao zaključak, glavni cilj mnogih nezakonitih korištenja lijekova u sportu, upravo je

Beta 2 AR koji se nalazi u srcu, plućima i skeletnom mišiću, gdje kontrolira brzinu i

snagu, opušta ton i stimulira rast. Beta 2 AR agonisti su snažni bronhodilatatori,

anabolici, a u kombinaciji sa kortikosteroidima snažno poboljšavaju svoje anti-upalne

aktivnosti. Bez obzira na atraktivnost lijekova, oni su također i najosjetljiviji na

regulaciju. Djelovanje je očekivano prolazne naravi i u mnogim izvještajima javlja se

gubitak učinkovitosti nakon nekoliko tjedana, a prisutne su i genetske varijacije kod

receptora koje utječu na učinkovitost i regulaciju izloženosti Beta2 AR agonistima.

39

3.1.7.EPAS 1

EPAS1 je gen koji je uključen u kompleksna istraživanja kisika. Gen koji kodira pola

transkripcijskog faktora uključenog u indukciju gena reguliranog kisikom, što se

nameće kao pad razine kisika. EPAS1 izražava se u mikrovaskularnim endotelnim

stanicama, plućnim epitelnim stanicama, srčanim miocitima i mozgu (Tian i sur.

1997). EPAS1 uključen je u razvoj srca embrija i izražava se u endotelnim stanicama

koje čine zid krvnih žila u pupkovini. Bitan je u održavanju homeostaze kateholamina,

i zaštite srca tijekom ranog embrionalnog razvoja. Također postoje dokazi da

određene varijante ovog gena pružaju zaštitu za ljude koji žive na visokoj nadmorskoj

visini (Beall i sur. 2010).

Studija u Australiji provedena je usporedbom izdržljivosti elitnih sportaša podijeljenih

u dvije skupine prema modelu snage vremena intenziteta izvedbe: Maksimalno

vrijeme snage (PT-MAX, N = 242, događaj traje 50 s do 10 min) i vrijeme snage –

ravnotežno stanje (PT-SS, N = 151, događaj traje ~ 2-10 h), s kontrolnom skupinom

(N=444) koristeći 12 SNP-a diljem EPAS 1 gena. Redna regresijska analiza

učestalosti alela otkrila je značajne razlike na SNP-u 2 i 3 (P=0.01). Haplotip analiza

otkrila je prisutnost haplotipova ukljućujući SNP-ove 2-5 koji su značajno diferencirali

(P<0,05) grupe temeljene po rednoj liniji koristeći klasifikaciju vremena snage. Ti isti

haplotipovi razlikuju PT-MAX skupinu kod koje je zabilježeno smanjenje u haplotipu

(F: GCCG; OR = 0,57, P = 0,02, 95% CI 0.36-0.92) i povećanje u drugom haplotipu

(F: GCCG; OR = 0,57, P = 0,02, 95% CI 0.36-0.92) u odnosu na kontrole. PT-SS

skupina razlikuje se od PT-MAX skupine po trećem haplotipu (H: ATGA; OR = 0,46,

P = 0,04, 95% CI 0.22-0.96). EPAS 1 ima ulogu senzora sposobnog za integriranje

kardiovaskularne funkcije, energijskog zahtjeva, aktivnosti mišića i dostupnosti kisika

u fiziološkoj adaptaciji, pa tako varijante DNK u EPAS 1 genu utječu na relativni

doprinos aerobnog i anaerobnog metabolizma, a time i najveću održivu snagu

metabolizma za trajanja konkretnog događaja (Henderson i sur. 2005).

EPAS1 gen popularno zovu gen za super sportaše. Upravo prisutnost EPAS1 gena

jedan je od vrlo važnih faktora zašto Tibetanci preživljavaju na tako velikim

nadmorskim visinama.

40

Do narušavanja funkcija i opstanka, visoko smanjenje dostupnosti kisika povezano

sa okruženjem velikih visina djelovati će kao agent prirodne selekcije. U potrazi za

dokazima takvog genetskog odabira korišteni su genomski pristup i pristup genskog

kandidata. Prvo, skeniranjem alelske diferencijacije cijelog genoma (GWADS)

uspoređujući autohtone stanovnike Tibetanske visoravni na ( 3,200-3,500m) sa usko

povezanim nizinskim Han Kinezima, otkriven je značajan raskorak preko cijelog

genoma na čak osam SNP-a u neposrednoj blizini EPAS 1. EPAS1 kodira

transkripcijski faktor HIF2alpha, koji stimulira proizvodnju crvenih krvnih stanica, a

time povećava koncentraciju hemoglobina u krvi. Drugo, u zasebnoj skupini

Tibetanaca koji žive na 4,200m, identificirano je 31 EPAS1 SNP-ova u visokoj

neuravnoteženosti povezanosti alela u genomu, koji su korelirali sa koncentracijom

hemoglobina. Spolno prilagođena koncentracija hemoglobina je u prosjeku 0,8g/dL

niža u glavnoj aleli homozigota, u usporedbi sa heterozigotima. Ovi rezultati su

replicirani na treću skupinu Tibetanaca koji žive na 4,300m. Alele povezane sa nižim

koncentracijama hemoglobina korelirale su sa signalom iz GWADS studije i

zabilježene su na znatno višim frekvencijama kod Tibetanskih skupina u usporedbi

sa Han Kinezima. Visoke koncentracije hemoglobina kardinalna su značajka

kronične planinske bolesti i nude jedan uvjerljivi mehanizam selekcije. S obzirom da

je EPAS1 plejotropan u svojim učincima, selekcija bi se mogla odvijati na nekom

drugom aspektu fenotipa. Bez obzira na razinu točnosti ovo dvoje objašnjenja,

dokaz genetske selekcije na EPAS1 lokusu GWADS studije podržan je od strane

repliciranih studija povezanih funkcija sa alelskim varijantama.

Prema znanstvenim podacima dvije populacije Tibetanaca i Han Kineza razdvojile su

se prije otprilike 3000 godina. Rasmus Nielsen, profesor biologije na Sveučilištu u

Kaliforniji, koji je vodio statističku analizu studije utvrdio je da je upravo ovo najbrža

genetska promjena ikad promatrana kod ljudi. Dosada je najbrži oblik evolucije bilo

širenje tolerancije na laktozu, sposobnost da se probavlja mlijeko u odrasloj dobi, i to

kod sjevernih Europljana prije 7500 godina.

EPAS1 svakako će biti predmet mnogih istraživanja i studija u budućnosti, upravo iz

neposredno navedenih razloga, kako u području genske terapije, tako i njezinog

izdanka genskog dopinga.

41

3.2 Kandidati prema mišićnoj izvedbi

3.2.1 Hormon rasta ( GH )

Hormon rasta (GH) ima višestruk učinak na tijelo povezan sa rastom. Naziva se još i

somatotropin i hormon je prednjeg režnja hipofize. Hormon rasta djeluje u stanicama

na procese koji rezultiraju povećanom sintezom proteina, te smanjenom razgradnjom

proteina. Učinak povećane sinteze bjelančevina odnosi se na sva tkiva u tijelu, a

najviše je izražen na rastu kostiju i hrskavica. Hormon rasta djeluje i na pojačano

iskorištavanje masti za dobivanje energije, povećanjem oslobađanja masnih kiselina,

te na smanjenje iskorištavanja glukoze i pojačanu sintezu glikogena u stanicama.

Hormon rasta ima nadražajni utjecaj na metabolizam ugljikohidrata i masnih kiselina i

mogući anabolički utjecaj na mišićne bjelančevine ili proteine. Australski znanstvenici

na Garvan Institutu u Sydneyu po prvi puta su prikazali učinke hormona rasta na

sportske performanse (Meinhardt i sur. 2010). Demonstriran je učinak hormona rasta

na povećanu sposobnost sportaša prilikom sprinta na biciklu. Sprinterski kapacitet

se gotovo udvostručio u muškaraca koji su primali testosteronske injekcije zajedno s

hormonom rasta u suplementarnom obliku. Istraživanje je provedeno na 103 zdrava

rekreativna sportaša, u dobi od 18 do 40 godina koji su u regularan atletski trening

bili uključeni najmanje godinu dana. Bilo je to dvostruko slijepo i placebo istraživanje,

jer ni istraživači, a ni ispitanici nisu znali tko prima doping a tko placebo – slanu vodu.

Sportaši kojima je dan hormon rasta popravili su svoj sprinterski kapacitet za 4-5%.

Nisu povečali svoju mišićnu masu, ali su zadržali tjelesne tekućine i iskusili oticanje i

bolove u zglobovima za razliku od onih koji su primali injekcije slane vode. Korištene

su manje doze hormona rasta od onih za koje se neslužbeno zna da koriste sportaši i

radi se o kraćem periodu uzimanja, tako da se samo može nagađati kakav bi utjecaj

na performanse bio upotrebom većih doza. Naravno u tom slučaju ostaje nagađanje i

kakve bi posljedice isto imalo na tijelo. U svakom slučaju ovo je prvo istraživanje koje

je uspjelo dokazati da hormon rasta utječe na tjelesne performanse sa selektivnog

stajališta.

42

Vježbe otpornosti i izdržljivosti potiču oslobađanje GH. Što je veći intenzitet vježbe,

veća je i magnituda vrha GH pulsa (Gibney i sur. 2007). Kronično vježbanje dovodi

do povećane razine GH u serumu, a sportaši imaju tendenciju da imaju više

vrijednosti od opće populacije, što upućuje na ulogu GH kod vježbi prilagodbe (Healy

i sur. 2005). Upravo ova zapažanja uz ulogu GH na postnatalni rast tijela dovela su

do tvrdnje da tretman GH-om anabolički djeluje na mišiće. Korištenje GH zabranjeno

je od strane WADA-e zbog načela fair-playa u natjecateljskom sportu, ali i zbog

nepovoljnih učinaka na zdravlje u prekomjernim dozama. Dodajmo da iako je rhGH

(rekombinantni GH) na raspolaganju od 1985.godine, GH izvađen iz hipofize ljudskih

leševa još uvijek je dostupan u nekim zemljama. Upravo ovaj izvor nosi značajan

izvor infekcije od prenosivih bolesti mozga, kao što je i Creutzfeldt- Jakobova bolest.

Creutzfeldt-Jakobova bolest je rijetka, degenarativna bolest mozga. Pretpostavlja se

da je izazvana proteinskim infektivnim česticama zvanim prioni. Prioni su čestice

sitnije od virusa, a izgrađeni od vrlo otpornih bjelančevina. U goveda je to bolest

kravljeg ludila.

Uporaba hormona rasta vrlo je raširena u profesionalnom i amaterskom sportu.

Atrakcija zlouporebe GH iz više je razloga (Rennie 2003, Rigamonti i sur. 2005,

Saugy i sur. 2006). Prvo, GH je lipolitički, iako ta prednost ne treba uvijek biti vidljiva

kod dobro istreniranih sportaša sa niskom razinom masnog tkiva (Deyssig i sur.

1993). Drugo, GH ima poznat učinak na promet kolagena i kostiju, te se

suprafiziološkim dozama može ojačati vezivno tkivo i paralelno povećati snaga

dovedena vježbom (ili drugim mjerama kao što su anabolički steroidi), čime se

smanjuje i rizik od ozljeda na tim tkivima. Treće, GH ima nuspojave kao što su

poboljšanje tena kože, vida i vremena oporavka od ozljeda, što se sve može smatrati

korisno za sportaša koji prolazi naporan trening. Četvrto, prilikom većih doza koje

koriste sportaši, GH može biti učinkovitiji od doza koje su odobrene za istraživanja, a

ona su ograničena zbog komplikacija prilikom primjene GH. Zadržavanje tekučine

koja se javlja sa GH, obično se dobro podnosi i večina ispitanika su sretni ako

ostanu na tretmanu GH-om. Primjena GH dovodi do povlačenja subjekata kod

istraživanja artralgije (bolest zglobova) , sindroma karpalnog tunela što je najčešći

kanalikularni sindrom koji nastaje pritiskom na središnji živac (lat. nervus medianus)

u području karpalnog kanala (lat. canalis carpi), a očituje se smanjenjem osjeta, boli,

parestezijama (trnci, peckanje) i mišićnom slabošću u području šake i podlaktice),

43

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Parestezije&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/wiki/Bol_(osje%C4%87aj)

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Karpalni_kanal&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/wiki/Latinski

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Sredi%C5%A1nji_%C5%BEivac&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/wiki/Bjelan%C4%8Devine

http://hr.wikipedia.org/wiki/Virusi

http://hr.wikipedia.org/wiki/Prioni

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=%C4%8Cestice&action=edit&redlink=1

http://hr.wikipedia.org/wiki/Proteini

http://hr.wikipedia.org/wiki/Mozak

http://hr.wikipedia.org/w/index.php?title=Degenarativna_bolest&action=edit&redlink=1

edema i atrijske fibrilacije što je poremećaj srčanog ritma a može biti uzrokovan

raznim oboljenjima srca ili nastati kao posljedica povišenog krvnog tlaka ili

povećanog rada štitne žlijezde.

Sastav tijela i metabolička adaptacija mogu biti odgovorni za povećanje fizičkih

performansi, više nego povećanje mišićne mase. Utjecaj na metabolizam goriva,

VO2max i anaerobni prag mogu biti posljedica sportašima u potrazi poboljšanja

izdržljivosti (Woodhouse i sur. 2006). Kombinacija testosterona i GH dovela je do

poboljšanja sastava tijela i VO2max u starijih muškaraca, što sugerira da GH ima

učinak poboljšanja performansi (Giannoulis i sur. 2006). GH također poboljšava

aerobne performanse kod onih koji imaju povijest uzimanja androgeno anaboličkih

steroida (Graham i sur. 2007).

Mehanizmi prilagodbe mišića na preopterećenje nisu posve razjašnjeni, kao niti oni

koji reguliraju razvoj i održavanje mišićne mase. Jasno je da GH igra ulogu u pre- i

post- natalnom razvoju mišića, ali još je mnogo prostora pred novim istraživanjima da

ispituju potencijale i granice ovog hormona.

3.2.2 Miostatin

Miostatin je protein koji djeluje kao negativni regulator mišićne mase. Proizveden je

od strane samog mišića, i djelovanje mu je autokrino i parakrino. Miševi kod kojih je

miostatin gen inaktiviran pokazali su označenu mišićnu hipertrofiju (McPherron i sur.

1997). Mišićna hipertrofija javlja se i kod djeteta koje nosi mutacije u obje kopije

miostatin gena (Schuelke i sur. 2004). Obje studije, kao i mnoge druge na temu

miostatina i njegovog djelovanja dovode do zaključka kako blokada djelovanja

miostatina ima potencijal za brzo povećanje mišićne mase kod sportaša. Miostatin je

otkriven 1997.godine, a 1999.godine započinje era znanstvenih istraživanja

miostatina, nakon slučaja djeteta u Njemačkoj sa mutiranim genom za miostatin.

Mutirani gen blokirao je miostatin da vrši svoju ulogu, da ograničava rast mišića, koji

su zato kod dječaka bili tri puta razvijeniji nego u njegovih vršnjaka. Istraživanja u

ljudskim populacijama pokazuju da su genski polimorfizmi miostatina povezani sa

vršnom koštanom mineralnom gustoćom (Zhang i sur. 2008), kao i pojačanom

transgenskom ekspresijom miostatin propeptida, koji inhibira signalizaciju miostatina

44

in vivo, povećava BMD (mineralna gustoća kostiju) kod miševa (Mitchell i sur. 2007).

Povećanje gustoće prisutno je u većini anatomskih regija, uključujući udove,

kralježnicu i čeljust. Miostatin ima izravan učinak na proliferaciju i diferencijaciju

mezenhimalnih matičnih stanica (Guo i sur. 2008, Rebbapragada i sur. 2003). Isto

tako ekspresiju miostatina i njegovih receptora primjetit ćemo kod koštane

regeneracije (Nagamine i sur. 1998). Još jedno pronađeno djelovanje miostatina je

inhibiranje stanične proliferacije u mišićnim stanicama in vitro, te izazivanje apoptoze.

Apoptoza je aktivacija endogenog genskog programa samouništenja stanice,

programirana smrt stanice (Taylor i sur. 2001, Chelh i sur. 2009). Miostatin je tako

vrlo moćan anti genski čimbenik, koji može djelovati u sprečavanju širenja ili

proliferacije, a možda i opstanku osteo i kondroprogenitora. Pronađena mu je i

izravna uloga u reguliranju kostiju i osteogenezi. Svako novo istraživanje miostatina

razjasni neku od mnogobrojnih uloga i učinaka, međutim otvori i nova pitanja i prostor

novim istraživanjima. Mišićni rast, tj.blokada istog najznačajnije je djelovanje

miostatina, također i najviše istraženo.

Mišići se sastoje od više vrsta vlakana koji se razlikuju u svojim kontraktilnim i

metaboličkim svojstvima. Spora vlakna ili vlakna tipa 1, bogata su mitohondrijima,

oslanjaju se prvenstveno na oksidativni metabolizam, te imaju visoku otpornost na

umor. Brza vlakna ili vlakna tipa 2 su mnogo osjetljivija na umor, dolaze u nekoliko

podtipova (2a, 2x, 2b), a podtipovi se mogu razlikovati ne samo po njihovim

kontraktilnim proteinskim izoformama, već i s obzirom na njihova metabolička

svojstva, koja se kreću od mješovitog oksidativno/glikolitičkog do pretežno

glikolitičkog ili anaerobnog metabolizma. Relativni omjeri različitih vrsta vlakana u

određenom mišiću utječu na ukupna funkcionalna svojstva, poput snage, brzine,

izdržljivosti, a disfunkcija pojedinih tipova vlakana može pratiti različite bolesti,

uključujući dijabetes tipa 2 i gubitak mišićne mase s godinama, ili sarkopeniju.

Upravo iz tih razloga logičan je snažan interes za razvoj strategije i agenata koji

poboljšavaju funkcije pojedinih vrsta miofibrila.

Jedan od glavnih fokusa nastojanja da se razviju lijekovi sposobni za promicanje

rasta mišića za kliničke aplikacije je signalni put reguliran miostatinom (MSTN), koji je

transformirajući ćimbenik rasta Beta (TGF-Beta), koji inače djeluje limitirajući mišićnu

masu (McPherron i sur. 1997). Pokazalo se da će genetski gubitak MSTN-a rezultirati

dramatičnim povećanjem mišićne mase na više vrsta, uključujući i ljude, a inhibicija

45

aktivnosti miostatina u miševa dokazano značajno povećava rast mišića i mišićne

snage (Lee 2004). Mnogobrojne studije su pokazale da miostatin obično igra dvije

uloge u ograničavanju mišićne mase. Jedna uloga je reguliranje broja mišićnih

vlakana nastalih tijekom razvoja, a studije su pokazale da povećanja broja vlakana

kod miševa rezultiraju povećanjem vlakana tipa 2x i 2b (Amthor i sur. 2007,

Girgenrath i sur. 2005, McPherron i sur. 2009). Druga uloga miostatina je reguliranje

posnatalnog rasta mišićnih vlakana, a hipetrofija vlakana tipa 2 izražena je kod

miševa tretiranih miostatin inhibitorima. Kombinacija povećanog broja i veličine

vlakana tipa 2, u velikoj je mjeri odgovorna za jedan od primjera funkcionalnih

posljedica gubitka miostatina , a to je poboljšanje vrhunskih trkaćih performansi

trkaćih pasa (Mosher i sur. 2007). Iako su glavne posljedice blokiranja aktivnosti

miostatina u hipertrofiji vlakana tipa 2, djelovanje na vlakna tipa 1 također je poznato

nakon virusne isporuke genske ekspresije konstruirane za miostatin propeptid, koji je

inhibitor signalizacije miostatina (Foster i sur. 2009, Matsakas i sur. 2009).

Blokada se može ostvariti na različitim razinama, kao što su povećanje ekpresije

folistatina, koji je prirodni antagonist miostatina, ili pak blokiranjem aktivnosti

miostatina pomoću humaniziranog monoklonskog antitijela, kao što je Wyethov

MYO-29. MYO-29 (Stamulumab) je eksperimentalni lijek za blokadu myostatina

razvijen u Wyeth Pharmaceuticals u Pennsylvanii za liječenje mišićne distrofije.

MYO-29 je rekombinantno ljudsko antitijelo osmišljeno da veže i inhibira aktivnost

myostatina. MYO-29 je G1 imunoglobulin antitijelo koje se veže na myostatin i

sprečava vezanje na svoju ciljnu stanicu, čime se sprečava djelovanje myostatina na

mišićno tkivo, tj. sprečavanje rasta. U novijim studijama koristi se biološki nazvan

ACE-031, što je verzija topljivog oblika aktivin tip 2B receptora (ACVR2B), i provodi

se sistemska primjena ACE-031 na razinu mišićnih vlakana. Zabilježen je rast

vlakana, u oba tipa, vlaknima tipa 2, ali i dosad ne toliko istraženim vlaknima tipa 1

(Cadena i sur. 2010). Iz perspektive mišića kao kontraktilnog organa, ovi rezultati

otkrivaju nam kako blokiranje ovog signalnog puta može dovesti do jačanja ne samo

funkcionalnih parametara kao što su snaga i brzina, već i one koje se odnose na

umor mišića i njihovu izdržljivost. Rezultati imaju potencijalne implikacije za korištenje

inhibitora miostatina u bolesti, kao što je sarkopenija, gdje je izražen gubitak vlakana

tipa 2. Konkretno, nalazi pokazuju da inhibicija miostatina nije samo korisna kod

46

anaboličkog stimulansa zaostalih mišićnih vlakana tipa 2, već i promicanju funkcija

vlakana tipa 1 koji su relativno pošteđeni u starenju mišića.

Iz perspektive mišića kao metaboličkog tkiva, rezultati podižu dodatna pitanja u vezi

metaboličkih učinaka kada se signalizacijski sustav manipulira. Ranije studije

pokazale su da genetski gubitak MSTN može smanjiti nakupljanje masnoća i

poboljšati metabolizam glukoze u mišjim modelima pretilosti i dijabetesa tipa 2

(McPherron i sur. 2002). Kasnije studije dokumentiraju vrlo slične metaboličke učinke

pomoću farmakoloških metoda za blokiranje aktivnosti miostatina (LeBrasseur i sur.

2009). Većina tih učinaka proizlaze iz gubitka direktne signalizacije miostatina na

mišiće, što je vrlo važno za razumjevanje u kojoj mjeri izmjenjena signalizacija u

različitim vrstama vlakana pridonosi ovim sveukupnim fiziološkim učincima.

Upravo slijedom svega navedenog nekoliko je velikih biotehnoloških i farmaceutskih

kompanija pokrenulo kliničke studije sa miostatin inhibitorima, prvenstveno radi

napredaka u liječenju bolesti. Najnovije studije govore i o ulozi miostatina u razvitku

tetiva i ligamenata, što je sasvim novo područje za znanstvena istraživanja.

Vraćajući se ponovno na aspekt sporta, istraživanja miostatina pod posebnim su

povećalom bodybuildinga, gdje bi rezultati imali najveći učinak.

3.2.3 IGF 1

IGF 1 je protein koji stimulira staničnu proliferaciju, somatski rast i diferencijaciju.

Postoji u različitim izoformama, uključujući jetreni oblik koji sustavno cirkulira, te

specifične mišićne oblike. Molekularna struktura mu je vrlo slična inzulinu, od kud i

sami naziv. IGF 1 se u istraživanjima često pokazao kao možda najjači posrednik

mišićnog rasta. Iako temeljni mehanizmi povezanosti starenja i gubitka mišića nisu u

potpunosti objašnjeni, znanstvenici su u studijama pokušali ublažiti gubitak

povećanjem regenerativne sposobnosti mišića, i to injekcijom rekombinantnog adeno

asociranog virusa vođenog pojačanom ekspresijom IGF 1 u diferencirana mišićna

vlakna. (Barton-Davis i sur. 1998) Uspješno je demonstrirano da ekspresija IGF 1

potiče prosječno povećanje mišićne mase od 15%, te povećanje snage od 14% kod

mladih odraslih miševa, te isto tako značajno sprečava mišićno starenje kod starih

odraslih miševa, i to povećanjem snage za 27% u usporedbi sa miševima kojima nisu

47

dane injekcije. Razina mišične mase i tip mišićnog vlakna ostali su na sličnim

razinama kao i u mladih miševa. Studija o kojoj govorimo u svakom slučaju ima

potencijal promijeniti način na koji starimo. Većina studija koje su koristile IGF 1 kao

posrednika, za rezultat imale su povećanje ili u veličini ili snazi. Najčešće su to bili

unosi čistog IGF 1, dok se korištenje virusa kao genskog posrednika pokazalo kao

vrlo učinkovito sa dugotrajnim efektom. Upravo unos dodatne DNK mišićima da

proizvode svoj IGF 1, ključ je u postizanju anaboličkih učinaka i učinaka

pomlađivanja u mišićima. Također vrijedno otkriće studije jest mišićno povećanje kod

mladih miševa za 15%, uz vrlo važnu napomenu da injekcije nisu bile kombinirane sa

vježbanjem, te da se sav mišićni rast dogodio bez dodatnih mehaničkih stimulansa.

IGF1 i njegovi učinci pokazuju da direktno stimulira procese kao što su sinteza

proteina i satelitna proliferacija stanice, što rezultira hipertrofijom mišića. (Adams i

sur. 1998)

Ljudska snaga mišića smanjuje se po stopi od 12 do 14 % po desetljeću nakon dobi

od 50 godina (Lindle i sur. 1998, Lynch i sur. 1999). Taj gubitak snage javlja se s

godinama zbog mnogo faktora, ali je prije svega pripisan gubitku mišićne mase

(Frontera i sur. 1991, Reed i sur. 1991), ili sarkopeniji. S obzirom da se sarkopenija

odnosi na gubitak funkcionalnih sposobnosti (Rantanen i sur. 1997), povećan rizik

od pada i fraktura (Aniansson i sur. 1984, Lord i sur. 1994), i smanjenu mineralne

gustoće kostiju (Sinaki i sur. 1986), ima negativne posljedice na zdravstveno stanje i

funkcionalne sposobnosti starije osobe. Za prevenciju i liječenje sarkopenije ipak je

najučinkovitiji trening snage (ST) uz najmanje negativnih nuspojava (Hurley i sur.

1995). Veliko povećanje snage i mišićne mase može nastupiti u vrlo kratkom periodu

sa ST, no te su promjene unutar populacije vrlo nestabilne (Ivey i sur. 2000).

Primjerice u studiji o ST-u, muškarci i žene između 65 -70 godina varirali su u

povećanju snage 5- 59%, a mišičnog volumena (MV) od 1 – 20% (Lemmer i sur.

2000.). Ovakve varijacije u mišićnoj adaptaciji na trening predlažu snažan genetički

utjecaj. Daljnje genetičke asocijacije potvrđene su činjenicom da je >50% varijacija u

temeljnoj snazi i mišićnoj masi nasljedno (Calvo i sur. 2002, Forbes i sur. 1995,

Nguyen i sur. 1998, Seeman i sur. 1996). Također se pokazalo da je adaptacija

mišića na ST visoko nasljedno izražena (Thibault i sur. 1986, Thomis i sur. 1998).

48

Cirkulacijske razine IGF1 proteina padaju u poodmaklim godinama (iza 50.godine), a

IGF1 se uzročno odnosi na gubitak mišićne snage i mase koja se javlja s dobi

(Grounds 2002, Toogood i sur. 1998). Egzogeni hormon rasta povećava cirkulacijske

razine IGF1, što je pokazalo da povećava mišićnu masu i moguću snagu (Cuneo i

sur. 1990, Salomon i sur. 1989). Mnogo važnije od cirkulacijskih razina IGF1 su

izoforme IGF1 proizvedene u mišićima koje djeluju autokrino i parakrino (Adams i

sur. 1999, Bamman i sur. 2003, Goldspink 1999). Studije na transgenskim miševima

pokazale su izravan autokrino/parakrini učinak povećane razine IGF1 ekspresije

povećavajući mišićnu masu (Fiorotto i sur. 2003). Ta ista transgenska linija miševa, u

usporedbi sa kontrolnom skupinom, pokazuje smanjenje dobnih gubitaka mišićnih

motoneurona i vlakana tipa 2B (Messi i sur. 2003). Ovo očuvanje motoneurona i

brzih mišićnih vlakana, očuvat će i snagu u starenju mišića. Studijom je utvrđen

porast snage mišića u starijih žena nakon primjene rekombinantnog ljudskog IGF1

(Boonen i sur. 2002).

Izvješća novijih studija pokazale su povezanost između IGF1 genskog markera i

osnovne nemasne tjelesne mase (FFM) (Chagnon i sur. 2001). Nadalje, taj isti

marker pokazao je da se veže i povezuje sa FFM uslijed treninga (Sun i sur. 1999).

Područje u blizini IGF1 genskog lokusa upleteno je u utjecaj na FFM, i osnovnu i kao

odgovor na trening, čime se IGF1 potvrđuje kao jak kandidat za mišićnu masu, kao i

snagu.

Polimorfizam IGF1 promotora ispitan je u mnogim kontekstima (Frayling i sur. 2002.,

Kim i sur. 2002, Rietveld i sur. 2003, Rosen i sur. 1998). Genotipizacijom pomoću

mikrosatelita dobivamo obično tri skupine: 192 homozigota, 192 heterozigota i oni

koji nisu nositelji 192 polimorfizma. Alela 192 je najčešća alela u istraživanih

populacija do danas. Postoje dokazi da u životinja i ljudi citozin adenin dinukleotid

ponavljajući polimorfizmi pronađeni u regijama gena promotora mogu utjecati na

gensku ekspresiju (Agarwal i sur. 2000, Rothenburg i sur. 2001). Upravo ti

ponavljajući polimorfizmi djeluju kao evolucijski okidači za fino podešavanje gena s

minimalnim štetnim posljedicama (King i sur. 1997).

Kao krajnji zaključak, u odgovoru na ST, nositelji alela imat će veći porast snage i

MV, u usporedbi s onima koji nisu nositelji. Svi ovi navedeni rezultati, u kombinaciji s

budućim studijama, nastavit će pridonositi razumjevanju uloge genskih polimorfizama

49

na odgovore na vježbanje. IGF1 predmet je velikog broja istraživanja u genskoj

terapiji, zbog rezultata o njegovom direktnom i indirektnom vrlo širokom djelovanju, a

vrlo izraženo posredništvo u mišićnom rastu čini ga vrlo atraktivnim istraživačkim

predmetom genskog dopinga.

3.2.4 ACTN 3

Zajednički polimorfizam R577X u ACTN3 genu rezultira potpunim nedostatkom alfa-

aktinin 3 proteina u približno 16 % ljudi u svijetu. Prisutnost alfa-aktinin 3 proteina je

povezana je sa poboljšanom snagom sprinta u sportaša , ali i opće populacije.

Unatoč tome, postoje dokazi da je nulti genotip XX djelovao pozitivnom selekcijom,

vjerojatno zbog presudne uloge u regulaciji metabolizma mišića. Nedostatak alfa-

aktinin 3 proteina smanjuje aktivnost glikogen fosforilaze i rezultira temeljnim

pomakom prema više oksidativnim putevima energije.

Nedostatak alfa-aktinin 3 proteina u općoj populaciji je česta pojava zbog polimorfne

nulte alele u ACTN3 genu. Brojne nezavisne studije ustvrdile su da je nedostatak

štetan za sprint i snagu sportaša, ali i opće populacije (Agbulut i sur. 2003,

Druhzeskaya i sur. 2008, Niemi i sur. 2005, Roth i sur. 2008). Alfa-aktinini u

sarkomeri odavno se smatraju prvenstveno strukturnim bjelančevinama, međutim

noviji rezultati dokazuju kako alfa-aktinin 3 igra značajnu ulogu u regulaciji

metabolizma mišića. Nedostatak alfa-aktinin 3 dovodi do promjene u

karakteristikama brzih glikolitskih mišićnih vlakana prema sporim mišićnim vlaknima

sa oksidativnim metabolizmom (MacArthur i sur. 2007, Quinlan i sur. 2010).

Više od milijarde ljudi na svijetu manjkavi su alfa-aktininom 3, a sve je više dokaza

koji sugeriraju da je ACTN3 genotip vrlo važna genetska varijanta koja utječe na

metaboličke funkcije ljudskih mišića. Nedostatak alfa-aktinin 3 dovodi do temeljne

promjene u metabolizmu daleko od anaerobnih puteva prema oksidativnim putevima

u metabolizmu mišića, što pruža objašnjenje za povezanost nedostatka alfa-aktinina

3, slabijih sprint performansi i snage, i poboljšanih performansi izdržljivosti.

Povećanje metaboličke učinkovitosti mišića sa nedostatkom alfa-aktinin 3 može

također dati objašnjenje za adaptivnu korist 577X alele tijekom nedavne ljudske

evolucije. Ono što svakako slijedi u istraživanjima ovog područja je seciranje

50

molekularnih mehanizama na kojima se temelji ovaj metabolički fenotip i istraživanje

da li ACTN3 genotip utječe na homeostazu glukoze i adaptivne odgovore na

prehranu u modernom svijetu.

3.3 Kandidati prema psihološkoj sposobnosti

3.3.1. BDNF

Dobro je dokumentirano da fizička aktivnost može izazvati niz različitih podražaja koji

su u mogućnosti poboljšanja snage i izdržljivosti performanse mišića (Holloszy 1976,

Booth i sur. 2010, Holloszy 1967, Holloszy 2008). Osim toga, redovita fizička

aktivnost može očuvati ili odgoditi pojavu nekoliko metaboličkih poremećaja u

ljudskom tijelu. Tjelovježba je također poznata u poboljšanju raspoloženja i

kognitivne funkcije aktivnih ljudi (Kramer i sur. 1999, Colcombe i sur. 2003, Berchtold

i sur. 2010), iako fiziološke pozadine tih učinaka ostaju nejasne. U novije vrijeme,

kako su pionirske studije u prošlosti pokazale da tjelesna aktivnost povećava

ekspresiju BDNF-a u mozgu štakora, poduzete su brojne studije kako bi se

uspostavila veza između tog neurotrofina i post-aktivnog poboljšanja raspoloženja te

kognitivnih funkcija kod ljudi (Cotman i sur. 2005). Nedavno je pokazano da

tjelovježba može povećati koncentraciju BDNF plasme ili seruma kod ljudi. Također

se zna da tjelovježba ili električna stimulacija može povećati ekspresiju BDNF-a u

mišićima. Saznanja je mnogo, ali i potrebno je još mnogo istraživanja na ovom

području, primjerice djelovanje fizičke aktivnosti na tri izoforme BDNF-a, osobito s

obzirom na mentalno stanje i kognitivne performanse kod ljudi.

51

4. NUSPOJAVE GENSKOG DOPINGA

Od 2001.godine, kada se o poboljšanju sposobnosti sportaša koji koriste principe

genske terapije raspravljalo po prvi put, doping je bio predmet mnogih rasprava i

polemika što se tiče njegove zabrane. Kako je genska terapija novi oblik medicine, i

do nedavno je testirana samo kod bolesnika sa terminalnim bolestima, njene

dugoročne posljedice nisu poznate. Upravo iz tog razloga još je mnogo pitanja

otvorenih u traženju odgovora o genetskoj manipulaciji u kontekstu sporta. Možda

najveće pitanje odnosi se na teoretsku mogućnost korištenja transgena u genskom

dopingu i njihovog nehotičnog utjecaja na zametne stanice, stvarajući tako trajne

promjene koje se mogu prenjeti na buduće generacije (Haisma i sur. 2006). Trenutno

ne postoje definitivni odgovori na to pitanje.

Neki od negativnih učinaka genskog dopinga neće biti specifični za genetsku

manipulaciju, već za prirodu genetskog proizvoda tako izraženog. U tom smislu rizici

genskog dopinga mogu se analizirati s obzirom na znanja o konvencionalnoj uporabi

proizvoda. Primjerice, iako ne postoje opisi posljedica genskog dopinga na

reproduktivne parametre in vivo i in vitro, studije su pokazale da EPO stimulira

steroidogenezu u Leydigovim stanicama, što izaziva povećanje proizvodnje

testosterona, što dovodi do negativne povratne informacije kod oslobađanja spolnih

hormona, a time smanjenja spermatogeneze i potencijala spermija koji mogu izazvati

neplodnost (Yamazaki i sur. 2004).

S druge strane, kao kontrast, neke studije su pokazale pozitivne nuspojave

izražavanja proizvoda dopinga genskih kandidata, kao što je smanjenje

adipogeneze, i to utjecajem miostatin antagonista (Tsuchida 2006), ili neuroprotektna

svojstva koja pruža tretman na bazi EPO-a (Ehrenreich i sur. 2004, Chatagner i sur.

2010). Ipak potrebno je saznati više o složenoj fiziologiji svakog transgenskog

proizvoda, prije nego što će biti sigurno i prihvatljivo sankcionirati takve uporabe.

52

5. DETEKCIJA GENSKOG DOPINGA

Otkrivanje genskog dopinga vrlo je teško, iako bi se moglo postići uz više

raspoloživih pristupa, uključujući izravne i neizravne metode (Mansour i sur. 2009).

Direktne metode uključuju otkrivanje rekombinantnih proteina, i gensko umetanje

vektora, kao što su virusi i plazmidi. Neizravne metode ovise o otkrivanju potpisnih

promjena povezanih sa genskim dopingom, primjerice promjena u imunološkom

sustavu nakon prijenosa gena, ili promjena u transkriptomu ili proteomu određene

vrste stanica. U genskoj terapiji, transgenske zamjene za neispravan gen, a time i

genska ekspresija, otkrit će se gdje je ranije nedostajala. Međutim u genskom

dopingu, očekivani učinak bit će povećana koncentracija genskog proizvoda

prethodno izraženog na normalnoj razini, što čini otkrivanje teže (Baoutina i sur.

2008). Jedna studija pokazala je neke strukturalne razlike između endogenog i

rekombinantnog EPO, preko njihovih izoelektričnih ponašanja (Lasne i sur. 2004).

Druga mogućnost za izravno otkrivanje temelji se na upotrebi molekularnih testova

koji razlikuju genomsku DNK od komplementarne DNK (c DNK). Slijed c DNK ne

sadrži introne, pa se može razlikovati tehnikama kao što su lančana reakcija

polimeraze (PCR) ili Southern blot analize (Baoutina i sur. 2010).

Otkrivanje umetanja vektora u krvnoj plazmi predstavlja velik problem, s obzirom na

iznimno kratko vrijeme poluraspada cirkulirajućih plazmida, adenovirusa i adeno-

asociranih virusa . Jedini način za otkrivanje unosa vektora u tjelesne tekućine bio bi

kroz primjenu molekularnih testova s relativno kratkim vremenskim razmacima, uz

potrebu da se stvori režim redovitog testiranja (Beiter i sur. 2011). Neizravne metode

zasnivaju se na istraživanjima učinaka genskog dopinga na stanice, tkiva ili cijeli

organizam. Ova strategija uključuje i ispitivanje za potencijalni imunološki odgovor na

umetanje vektora ili peptida kodiranih uvedenom nukleinskom kiselinom. Nedavno je

korištenje trankriptoma, koji se sastoji od analize tkiva mRNK transkripata, postala

obečavajuća metoda otkrivanja genskog dopinga. Količina i sastav tkiva

transkriptoma odraz je njegovih metaboličkih aktivnosti. Nekim tkivima može se vrlo

lako pristupiti u izgradnji uzorka gena. Na taj način moguće je procjeniti neke

promjene u svakom uzorku ekspresije, podržavajući razvoj tehnika za otkrivanje

dopinga (Rupert 2009)

53

6. BIOETIČKO GLEDIŠTE

Dva su glavna argumenta korištena od WADA-e kako bi se opravdala zabrana

genskog dopinga. Zabrinutost zbog mogućih zdravstvenih rizika kod umetanja gena

ili uporaba tvari koje ometaju ekspresiju gena. Takve promjene u ekspresiji gena

mogu donjeti nepoznate rizike za zdravlje sportaša i ako egzogene sekvence na bilo

koji način utječu na zametne stanice, promjene bi se mogle prenositi na buduće

naraštaje. Drugi argument WADA-e je pitanje pravednosti. Genetska manipulacija u

svrhu povećavanja sportskih performansi vidi se kao kršenje sportskog duha, dajući

nepoštene fizičke prednosti onima koji imaju pristup traženoj tehnologiji (Haisma i

sur. 2006).

Postoje dva načina analize etičkog statusa genskog dopinga (Miah 2006). Prvi

smatra da je sportska etika podređena medicinskoj etici, što bi podrazumjevalo da

ako je korištenje genske terapije za medicinu dopušteno, svako povećanje

performansi bi trebalo biti prihvatljivo. Na taj način sportski bi liječnik mogao propisati

tvari za potencijalno pojačavanje performansi , ili gensku terapiju sportašima kako bi

se ublažilo zdravstveno stanje. Međutim na nametnuto pitanje nije lagano odgovoriti;

kako najbolje liječiti sportaša pacijenta, više kao sportaša ili više kao pacijenta?! Isto

tako neki pacijenti mogu imati više interesa za primanje tretmana koji će im činiti

dobro u smislu sportskih performansi, nego s druge strane životu.

Drugi način je podrazumjevanje sportske etike kao zasebne cjeline iz medicinske

etike. Drugim riječima, sport se gleda kao moralna praksa, koja sve dok ne zahtjeva

odbacivanje pojmova medicinske etike, ovisi više o sportskom kontekstu, nego

medicinskom (Miah 2003, Artioli i sur. 2007).

Stavovi o liberalizaciji povoljnog korištenja agenata za poboljšanje performansi,

podržani su od neki etičara, ali ipak manjine (Kious 2008). Osnovni argument je ako

se od sportaša očekuje legitimno zalaganje poboljšanja performansi (korištenjem

metode treninga, metode prehrane i psihološkog uvjetovanja), ne postoje očiti razlozi

za isključenje agenata za poboljšanje performansi, primjerice anaboličkih steroida, iz

skupa metoda koje se mogu koristiti za poboljšanje atletskih performansi. Iako se

može činiti da će to dati nepravednu prednost sportašima kojima su takva sredstva

dostupna, može se reći i da je napredno treniranje, napredna prehrana i psihološko

54

praćenje vrlo skupo, kao i spomenuti agenti, te nedostupno svim sportašima. Iz

prethodno navedenog zaključuje se da izvedbu poboljšanu agentima ne treba

izdvojiti za zabranu na osnovu nedostatka pravednosti. Vrlo slično je sa zdravstvenim

rizicima, koji su prisutni u mnogim oblicima sportskog treninga. Logično je da bi se

svaka zabrana trebala temeljiti na objektivnoj procjeni rizika koji bi procjenjivali

agente i metode treninga na ravnopravnoj osnovi, za razliku od zabrane samo na

osnovu preporuke.

Ovakvi pro argumenti, ukoliko bi bili prihvaćeni u odnosu konvencionalnih agenata za

poboljšanje performansi, kao takvi odnosili bi se i na genski doping. Kako trenutno

stvari stoje, rizici ljudskog genskog liječenja nedovoljno su shvaćeni u kontekstu

primjene kod zdravih pojedinaca, ali ako bi metoda genetske manipulacije mogla biti

prikazana kao nositelj minimalnih zdravstvenih rizika, ne bi bilo ni logičkih razloga za

zabranu. Budući da je genska terapija na čelu medicinske znanosti, njegova

upotreba u poboljšanju sportskih performansi bila bi vrlo skupa, i na taj način

ograničena na financijski bolje stojeće sportaše, što ponovo postavlja pitanje

pravednosti. Međutim ekonomsko je pravilo da tehnologijama recimo strmoglavo

padaju cijene sa širim korištenjem, pa bi se to pravilo također moglo primjeniti i na

tehnologiju genetske manipulacije. Dakle, moguće je da će jeftiniji komercijalni setovi

genske terapije postati dostupni u budućnosti. Time bi i genski doping postao

dostupan svim sportašima bez obzira na njihovu financijsku pozadinu.

Oni koji odbacuju konvencionalan doping na etičkoj osnovi, također će odbaciti i

genski doping. Međutim prihvaćanje konvencionalnog dopinga, kao što je to

zagovarano od manjine bioetičara, racionalno bi omogućilo puno korištenje

tehnologije genetskih manipulacija u sportu. Kada bi se to dogodilo, nema sumnje da

bi dosadašnji svjetski sportski rezultati, prešli dosadašnje granice i dosegnuli dosad

neviđenu razinu.

55

7. ZAKLJUČCI

Genski doping posjeduje jednu vrlo kontroverznu karizmu, biti budućnost medicine i

medicinskih istraživanja, a ujedno biti pod konstantnim pritiskom limitiranja zakonom i

bioetičkim gledištem. Pozitivni učinci i budućnost genske terapije ne mogu se

osporiti, sljedom čega zaključujemo i podjednak napredak u genskom dopingu, uz

otvoreno pitanje legalnosti ili s druge strane javnosti učinaka.

Genski doping bilježi rapidni razvitak, i svakom novom studijom svjedoci smo novih,

značajnijih uloga i svojstava genskih kandidata. Svakom spomenutom genskom

kandidatu u ovom preglednom radu dokazano je neko od djelovanja ili bar utjecaj na

poboljšanje izdržljivosti, mišićnu izvedbu i možda najmanje istraženu psihološku

sposobnost, što otvara velik interes farmacije, biokemije i raznih grana medicine za

daljnja istraživanja.

Korištenje u sportu neslužbeno je sasvim sigurno mnogo prisutnije nego što to

pokazuju službeni podaci. Dokaz tome stalni su napori Svjetske Antidopinške

agencije u razvijanju tehnika detekcije koje zasad sasvim sigurno kaskaju za

razvojem genskog dopinga. Medicinski gledano, pozitivnost ili negativnost

nuspojava veliko je pitanje, koje također traži još konkretnih odgovora.

Kao krajnji zaključak, kroz sferu bioetike, regulatorna tijela, sportaši, ali i društvo

općenito morati će odlučiti jesu li spremni otvoriti ta 'velika' vrata u novi svijet

genskog dopinga.

56

8. ZAHVALE

Zahvaljujem se ovom prilikom kao vjernik najprije dragom Bogu što mi je dao priliku

živjeti i upoznavati svijet da ga promatrajući mogu iz dana u dan otkrivati i

spoznavati. Sve dublja i dalja saznanja, a na osobit način ova iz genetike otkrivaju

nam koliko malo i površno poznajemo svijet i sami sebe, te koliko je tajna života

daleko od naših mogućnosti i granica našeg znanja.

Zahvaljujem također i ljudima koji me prate kroz život i ovu potragu u životu čine

smislenom i lijepom, jer ništa samo po sebi nema vrijednost ako to ne činimo zbog

onih koji su oko nas.

Zahvaljujem se svojemu mentoru Milanu Miloševiću i ostalim profesorima koji su ovih

šest godina prenosili svoje znanje, ulagali dobru volju i bili dostupni te tako ugradili

dio sebe u moj život i ovaj rad.

Posebno se zahvaljujem Nevenu Iviću koji mi je pomogao prikupiti i izanalizirati

brojne i obilne materijale koji su bili potrebni za iščitavanje zaključaka i sumiranje

prikupljenih činjenica koje ovaj rad donosi.

Zahvaljujem se i svojim kolegama među kojima ću istaknut Marinu Vuksanović i

Marjana Urlića koji su mi svojim materijalima i dobrom voljom pomogli da ovaj studij

dovršim s lakoćom i osmijehom na licu.

Zahvaljujem se i svojoj obitelji koja me uporno tolerirala i pratila u studentskom

životu.

Nadam se da se trud svih isplatio.

57

9. LITERATURA

1. Adams GR., McCue Samuel A.; Department of Physiology and Biophysics,

University of California, Irvine, CA; Localized infusion of IGF 1 results in

skeletal muscle hypertrophy in rats; Journal of Applied Physiology 84(5):

1716-1722, 1998

2. Adams GR, Haddad F, and Baldwin KM. Time course of changes in markers

of myogenesis in overloaded rat skeletal muscles. J Appl Physiol 87: 1705–

1712, 1999

3. Agarwal AK, Giacchetti G, Lavery G, Nikkila H, Palermo M, Ricketts M,

McTernan C, Bianchi G, Manunta P, Strazzullo P, Mantero F, White PC, and

Stewart PM. CA-Repeat polymorphism in intron 1 of HSD11B2: effects on

gene expression and salt sensitivity. Hypertension 36: 187–194, 2000

4. Agbulut O, Noirez P, Beaumont F, Butler-Browne G Myosin heavy chain

isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol Cell 95: 399–406,

2003

5. Amthor H, Macharia R, Navarrete R, Schuelke M, Brown SC, Otto A, Voit T,

Muntoni F, Vrbova G, Partridge T, Zammit P, Bunger L, Patel. Lack of

myostatin results in excessive muscle growth but impaired force generation.

Proc Natl Acad Sci U S A 104: 1835–1840, 2007

6. Aniansson A, Zetterberg C, Hadberg M, and Henriksson K. Impaired muscle

function with aging. A background factor in the incidence of fractures of the

proximal end of the femur. Clin Orthop 191: 193–200, 1984

7. Artioli GG, Hirata RDC, Lancha Junior AH. Terapia gênica, doping genético e

esporte: fundamentação e implicações para o futuro. Rev Bras Med Esporte

2007; 13: 349-354

8. Bamman MM, Hill VJ, Adams GR, Haddad F, Wetzstein CJ, Gower BA,

Ahmed A, and Hunter GR. Gender differences in resistance-training-induced

myofiber hypertrophy among older adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 58:

108–116, 2003

9. Baoutina A, Alexander IE, Rasko JE, Emslie KR. Developing strategies for

detection of gene doping. J Gene Med 2008; 10: 3-20

58

10.Baoutina A, Coldham T, Bains GS, Emslie KR. Gene doping detection:

evaluation of approach for direct detection of gene transfer using

erythropoietin as a model system. Gene Ther 2010; 17: 1022-1032

11.Barton – Davis Elisabeth, Daria I.Shoturma, Antonio Musaro, Nadia

Rosenthal, and H.Lee Sweeney; Department of Physiology, University of

Pennsylvania Scool of Medicine, Philadelphia, PA and Cardiovascular

Reasearch Center, Massachusetts General Hospital, Charlestown, MA; Viral

mediated expression of insulin like growth factor 1 blocks the aging – related

loss of skeletal muscle function;Proc Natl Acad Sci USA 1998 Dec 22; 95 (26):

15603-7

12.Bassel-Duby R, Olson EN. Signaling pathways in skeletal muscle remodeling.

Annu. Rev. Biochem. 2006;75:19–37

13.Beall CM, Cavalleri GL, Deng L, Elston RC, Gao Y, Knight J, Li C, Li JC, Liang

Y, McCormack M, Montgomery HE, Pan H, Robbins PA, Shianna KV, Tam

SC, Tsering N, Veeramah KR, Wang W, Wangdui P, Weale ME, Xu Y, Xu Z,

Yang L, Zaman MJ, Zeng C, Zhang L, Zhang X, Zhaxi P, Zheng YT (June

2010). "Natural selection on EPAS1 (HIF2alpha) associated with low

hemoglobin concentration in Tibetan highlanders". Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 107 (25): 11459–64

14.Bedi JF, Gong H, Jr, Horvath SM. Enhancement of exercise performance with

inhaled albuterol. Can J Sport Sci. 1988;13:144–148

15.Beermann DH. β-Adrenergic receptor agonist modulation of skeletal muscle

growth. J Anim Sci. 2002;80E Suppl 1:E18–E23

16.Beiter T, Zimmermann M, Fragasso A, Hudemann J, Niess AM, Bitzer M, et al.

Direct and long-term detection of gene doping in conventional blood samples.

Gene Ther 2011; 18: 225-231

17.Berchtold NC, Castello N, Cotman CW. Exercise and timedependent benefits

tolearning and memory. Neuroscience 2010; 167: 588-597

18.Blackman MR, Sorkin JD, Munzer T, Bellantoni MF, Busey-Whitehead J,

Stevens TE, Jayme J, O'Connor KG, Christmas C, Tobin JD, Stewart KJ,

Cottrell E, St. Clair C, Pabst KM and Harman SM. Growth hormone and sex

steroid administration in healthy aged women and men. A randomized

controlled trial

59

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=2895075

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pmcentrez&artid=2895075

19.Boonen S, Rosen C, Bouillon R, Sommer A, McKay M, Rosen D, Adams S,

Broos P, Lenaerts J, Raus J, Vanderschueren D, and Geusens P.

Musculoskeletal effects of the recombinant human IGF-I/IGF binding protein-3

complex in osteoporotic patients with proximal femoral fracture: a double-

blind, placebo-controlled pilot study. J Clin Endocrinol Metab 87: 1593–1599,

2002

20.Booth FW, Baldwin KM (1996) in The Handbook of Physiology. Exercise:

Regulation and Integration of Multiple Systems, Muscle plasticity: energy

demand and supply processes, eds Rowell LB, Shepherd JT (American

Physiological Society, Bethesda), pp 1075–1123

21.Booth FW, Laye MJ. The future: genes, physical activity and health. Acta

Physiol (Oxf) 2010; 199: 549-556

22.Broadley KJ. β-Adrenoceptor responses of the airways: for better or worse.

Eur J Pharmacol. 2006;533:15-27

23.Brunmair B, Staniek K, Dörig J, Szöcs Z, Stadlbauer K, Marian V, Gras F,

Anderwald C, Nohl H, Waldhäusl W, Fürnsinn C (November 2006). "Activation

of PPAR-δ in isolated rat skeletal muscle switches fuel preference from

glucose to fatty acids". Diabetologia 49 (11): 2713–22

24.Cadena SM, Tomkinson KN, Monnell TE, Spaits MS, Kumar R, Underwood

KW, Pearsall RS, Lachey J. Administration of a soluble activin type IIB

receptor promotes skeletal muscle growth independent of fiber type. J Appl

Physiol, May 13, 2010

25.Calvo M, Rodas G, Vallejo M, Estruch A, Arcas A, Javierre C, Viscor G, and

Ventura JL. Heritability of explosive power and anaerobic capacity in humans.

Eur J Appl Physiol 86: 218–225, 2002

26.Carlsen KH, Hem E, Stensrud T, Held T, Herland K, Mowinckel P. Can asthma

treatment in sports be doping? The effect of the rapid onset, long-acting

inhaled β2-agonist formoterol upon endurance performance in healthy well-

trained athletes. Respir Med. 2001;95:571–576

27.Caruso JF, Signorile JF, Perry AC, Leblanc B, Williams R, Clark M, et al. The

effects of albuterol and isokinetic exercise on the quadriceps muscle group.

Med Sci Sports Exerc. 1995;27:1471–1476

28.Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G, Gross F, Yvon E,

Nusbaum P, Selz F, Hue C, Certain S, Casanova JL, Bousso P, Deist FL,

60

Fischer A (2000). "Gene therapy of human severe combined

immunodeficiency (SCID)-X1 disease". Science 288 (5466): 669–72

29.Chagnon YC, Rice T, Perusse L, Borecki IB, Ho-Kim MA, Lacaille M, Pare C,

Bouchard L, Gagnon J, Leon AS, Skinner JS, Wilmore JH, Rao DC, and

Bouchard C. Genomic scan for genes affecting body composition before and

after training in Caucasians from HERITAGE. J Appl Physiol 90: 1777–1787,

2001

30.Chatagner A, Huppi PS, Ha-Vinh LR, Sizonenko S. [Erythropoietin and

neuroprotection]. Arch Pediatr 2010; 17 (Suppl 3): S78-S84

31.Chelh I, Meunier B, Picard B, Reecy MJ, Chevalier C, Hocquette JF, et al.

Molecular profiles of Quadriceps muscle in myostatin-null mice reveal PI3K

and apoptotic pathways as myostatin targets. BMC Genomics 2009;10:196

32.Cheng L, Ding G, Qin Q, Huang Y, Lewis W, He N, Evans RM, Schneider MD,

Brako FA, Xiao Y, Chen YE, Yang Q. Cardiomyocyte-restricted peroxisome

proliferator-activated receptor-delta deletion perturbs myocardial fatty acid

oxidation and leads to cardiomyopathy. Nat. Med. 2004;10:1245–50

33.Colcombe S, Kramer AF. Fitness effects on the cognitive function of older

adults: a meta-analytic study. Psychol Sci 2003; 14: 125-130

34.Cotman CW, Berchtold NC, Adlard PA, Perreau VM. Exercise and the brain.

In: Molecural and Cellular Exercise Physiology. FC Mooren, K Völker (eds).

Campaign, USA, Human Kinetics, 2005, pp. 331-341

35.Cuneo RC, Salmon F, Wiles CM, and Sonksen PH. Skeletal muscle

performance in aults with growth hormone deficiency. Horm Res 33: 55–60,

1990

36.Deyssig R, Frisch H, Blum WF, Waldhor T (1993). Effect of growth hormone

treatment on hormonal parameters, body composition and strength in athletes.

Acta Endocrinol (Copenh) 128: 313–318

37.DiMauro S, Hayes AP, Tsujino S. Nonlysosmal Glycogenoses. In: Engel AG,

Franzini-Armstrong C, editors. Myology. McGraw-Hill; New York: 2004. pp.

1535–1558

38.DiMauro S, Tsujino S, Shanske S, Rowland LP. Biochemistry and molecular

genetics of human glycogenoses: an overview. Muscle Nerve. 1995;3:S10–

S17

61

39.Dodd SL, Powers SK, Vrabas IS, Criswell D, Stetson S, Hussain R. Effects of

clenbuterol on contractile and biochemical properties of skeletal muscle. Med

Sci Sports Exerc. 1996;28:669–676

40.Druzhevskaya AM, Ahmetov II., Astratenkova IV., Rogozkin VA. Association of

the ACTN3 R577X polymorphism with power athlete status in Russians. Eur J

Appl Physiol 103: 631–634, 2008

41.Ehrenreich H, Degner D, Meller J, Brines M, Behe M, Hasselblatt M, et al.

Erythropoietin: a candidate compound for neuroprotection in schizophrenia.

Mol Psychiatry 2004; 9: 42-54

42.Elashry MI, Otto A, Matsakas A, El-Morsy SE, Patel . Morphology and

myofiber composition of skeletal musculature of the forelimb in young and

aged wild type and myostatin null mice. Rejuvenation Res 12: 269–281, 2009

43.Filipp F. Is science killing sport? Gene therapy and its possible abuse in

doping. EMBO Rep 2007; 8: 433-435

44.Fiorotto ML, Schwartz RJ, and Delaughter MC. Persistent IGF-I

overexpression in skeletal muscle transiently enhances DNA accretion and

growth. FASEB J 17: 59–60, 2003

45.Forbes GB, Sauer EP, and Weitkamp LR. Lean body mass in twins.

Metabolism 44: 1442–1446, 1995

46.Foster K, Graham IR, Otto A, Foster H, Trollet C, Yaworsky PJ, Walsh FS,

Bickham D, Curtin NA, Kawar SL, Patel K, Dickson . Adeno-associated virus-

8-mediated intravenous transfer of myostatin propeptide leads to systemic

functional improvements of slow but not fast muscle. Rejuvenation Res 12:

85–94, 2009

47.Frayling TM, Hattersley AT, McCarthy A, Holly J, Mitchell SMS, Gloyn AL,

Owen K, Davies D, Smith GD, and Ben Shlomo Y. A putative functional

polymorphism in the IGF-I gene. Association studies with type 2 diabetes,

adult height, glucose tolerance, and fetal growth in UK populations. Diabetes

51: 2313–2316, 2002

48.Friedmann, T.; Roblin, R. (1972). "Gene Therapy for Human Genetic

Disease?". Science 175 (4025): 949

49.Frontera WR, Hughes VA, Lutz KJ, and Evans WJ. A cross-sectional study of

muscle strength and mass in 45- to 78-yr-old men and women. J Appl Physiol

71: 644–650, 1991

62

50.Fukuda MN, Sasaki H, Lopez L, Fukuda M. Survival of recombinant

erythropoietin in the circulation: The role of carbohydrates. Blood. 1989;73:84–

9

51.Gaudard A, Varlet-Marie E, Bressolle F, Audran M. Drugs for increasing

oxygen and their potential use in doping: A review. Sports Med. 2003;33:187–

212

52.Giannoulis MG, Sonksen PH, Umpleby M, Breen L, Pentecost C, Whyte M et

al. (2006). The effects of growth hormone and/or testosterone in healthy

elderly men: a randomized controlled trial. J Clin Endocrinol Metab 91: 477–

484

53.Gibney J, Healy ML, Sonksen PH (2007). The growth hormone/insulin-like

growth factor-I axis in exercise and sport. Endocr Rev 28: 603–624

54.Girgenrath S, Song K, Whittemore LA. Loss of myostatin expression alters

fiber-type distribution and expression of myosin heavy chain isoforms in slow-

and fast-type skeletal muscle. Muscle Nerve 31: 34–40, 2005

55.Goldspink G. Changes in muscle mass and phenotype and the expression of

autocrine and systemic growth factors by muscle in response to stretch and

overload. J Anat 194: 323–334, 1999

56.Goubault C, Perault MC, Leleu E, Bouquet S, Legros P, Vandel B, et al.

Effects of inhaled salbutamol in exercising non-asthmatic athletes. Thorax.

2001;56:675–679

57.Graham MR, Baker JS, Evans P, Kicman A, Cowan D, Hullin D et al. (2007).

Short-term recombinant human growth hormone administration improves

respiratory function in abstinent anabolic-androgenic steroid users. Growth

Horm IGF Res 17: 328–335

58.Grounds MD. Reasons for the degeneration of ageing skeletal muscle: a

central role for IGF-1 signaling. Biogerontology 3: 19–24, 2002

59.Guo W, Flanagan J, Jasuja R, Kirkland J, Jiang L, Bhasin S. The effects of

myostatin on adipogenic differentiation of human bone marrow-derived

mesenchymal stem cells are mediated through cross communication between

Smad3 and Wnt/beta-catenin signaling pathways. J Biol Chem

2008;283:9136-45

60.Haisma HJ, de Hon O. Gene doping. Int J Sports Med 2006; 27: 257-266

63

61.Hardie DG. ,Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Oct;8(10):774-85.

AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy.

Division of Molecular Physiology, College of Life Sciences, University of

Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH, Scotland, UK.

[email protected]

62.Healy ML, Dall R, Gibney J, Bassett E, Ehrnborg C, Pentecost C et al. (2005).

Toward the development of a test for growth hormone (GH) abuse: a study of

extreme physiological ranges of GH-dependent markers in 813 elite athletes in

the postcompetition setting. J Clin Endocrinol Metab 90: 641–649

63.Henderson J, Withford-Cave JM, Duffy DL, Cole SJ, Sawyer NA, Gulbin JP,

Hahn A, Trent RJ, Yu B. ; Hum Genet. 2005 Dec;118(3-4):416-23. Epub 2005

Oct 6. The EPAS1 gene influences the aerobic-anaerobic contribution in elite

endurance athletes. Source Department of Molecular & Clinical Genetics,

Royal Prince Alfred Hospital and Central Clinical School, The University of

Sydney (K25), Camperdown, 2050, Australia.

64.Hodson M.E, P.L. Shah. ©ERS Journals Ltd 1995, DNase trials in cystic

fibrosis

65.Holloszy JO, Booth FW. Biochemical adaptations to endurance exercise in

muscle. Annu Rev Physiol 1976; 38:273-291

66.Holloszy JO. Biochemical adaptations in muscle. Effects of exercise on

mitochondrial oxygen uptake and respiratory enzyme activity in skeletal

muscle. J Biol Chem 1967; 242: 2278-2282

67.Holloszy JO. Regulation by exercise of skeletal muscle content of

mitochondria and GLUT4. J Physiol Pharmacol 2008; 59(Suppl 7): 5-18

68.Hood DA (2001) Contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in

skeletal muscle. J Appl Physiol 90:1137–1157

69.Hurley B, Redmond R, Pratley R, Trueth M, Rogers M, and Goldberg A.

Effects of strength training on muscle hypertrophy and muscle cell disruption

in older men. Int J Sports Med 16: 380–386, 1995

70. Ivey FM, Roth SM, Ferrell RE, Tracy BL, Lemmer JT, Hurlbut DE, Martel GF,

Siegel EL, Fozard JL, Jeffrey ME, Fleg JL, and Hurley BF. Effects of age,

gender, and myostatin genotype on the hypertrophic response to heavy

resistance strength training. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 55: 641–648, 2000

64

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=epas1%20in%20sports

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yu%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Trent%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hahn%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gulbin%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sawyer%20NA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cole%20SJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Duffy%20DL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Withford-Cave%20JM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Henderson%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17712357

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hardie%20DG%22%5BAuthor%5D

71.Jones AM, Carter H. The effect of endurance training on parameters of

aerobic fitness. Sports. Med. 2000;29:373–86

72.Kaur M, Chivers JE, Giembycz MA, Newton R. Long-acting β2-adrenoceptor

agonists synergistically enhance glucocorticoid-dependent transcription in

human airway epithelial and smooth muscle cells. Mol Pharmacol.

2008;73:203–214

73.Kim JG, Roh KR, and Lee JY. The relationship among serum insulin-like

growth factor-I, insulin-like growth factor-I gene polymorphism, and bone

mineral density in postmenopausal women in Korea. Am J Obstet Gynecol

186: 345–350, 2002

74.King DG, Soller M, and Kashi Y. Evolutionary tuning knobs. Endeavour 21:

36–40, 1997

75.Kious BM. Philosophy on steroids: why the anti-doping position could use a

little enhancement. Theor Med Bioeth 2008; 29: 213-234

76.Knutti D, Kralli A (2001) PGC-1, a versatile coactivator. Trends Endocrinol

Metab 12:360–365

77.Kollberg G, et al. Cardiomyopathy and exercise intolerance in muscle

glycogen storage disease 0. N Engl J Med. 2007;357:1507–1514

78.Kramer AF, Hahn S, Cohen NJ, et al. Ageing, fitness and neurocognitive

function. Nature 1999; 400: 418-419

79.Kubota N, Yano W, Kubota T, Yamauchi T, Itoh S, Kumagai H, Kozono H,

Takamoto I, Okamoto S, Shiuchi T, Suzuki R, Satoh H, Tsuchida A, Moroi M,

Sugi K, Noda T, Ebinuma H, Ueta Y, Kondo T, Araki E, Ezaki O, Nagai R,

Tobe K, Terauchi Y, Ueki K, Minokoshi Y, Kadowaki T. Adiponectin stimulates

AMP-activated protein kinase in the hypothalamus and increases food intake.

Cell. Metab. 2007;6:55–68

80.Larsson K, Gavhed D, Larsson L, Holmer I, Jorfelt L, Ohlsen P. Influence of a

β2-agonist on physical performance at low temperature in elite athletes. Med

Sci Sports Exerc. 1997;29:1631–1636

81.Lasne F, Martin L, de Ceaurriz J, Larcher T, Moullier P, Chenuaud P. "Genetic

Doping" with erythropoietin cDNA in primate muscle is detectable. Mol Ther

2004; 10: 409-410

82.LeBrasseur NK, Schelhorn TM, Bernardo BL, Cosgrove PG, Loria PM, Brown

TA. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and

65

metabolic outcomes in aged mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 64: 940–948,

2009

83.Lee SJ. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol 20:

61–86, 2004

84.Lehman JJ, Barger PM, Kovacs A, Saffitz JE, Medeiros DM, Kelly DP (2000)

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 promotes

cardiac mitochondrial biogenesis. J Clin Invest 106:847–856

85.Lemmer JT, Hurlbut DE, Martel GF, Tracy BL, Ivey FM, and Metter EJ. Age

and gender responses to strength training and detraining. Med Sci Sports

Exerc 32: 1505–1512, 2000

86.Lima GA, Anhê GF, Giannocco G, Nunes MT, Correa-Giannella ML, Machado

UF. Contractile activity per se induces transcriptional activation of SLC2A4

gene in soleus muscle: involvement of MEF2D, HIF-1a, and TRalpha

transcriptional factors. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2009, 296:E132-8

87.Lin J, Wu H, Tarr PT, Zhang CY, Wu Z, Boss O, Michael LF, Puigserver P,

Isotani E, Olson EN, Lowell BB, Bassel-Duby R, Spiegelman BM.

Transcriptional co-activator PGC-1alpha drives the formation of slow-twitch

muscle fibres. Nature. 2002;418:797–801

88.Lin J, Wu H, Tarr PT, Zhang CY, Wu Z, Boss O, Michael LF, Puigserver P,

Isotani E, Olson EN, Lowell BB, Bassel-Duby R, Spiegelman BM.

Transcriptional co-activator PGC-1alpha drives the formation of slow-twitch

muscle fibres. Nature. 2002;418:797–801

89.Lindle R, Metter E, Lynch N, Fleg J, Fozard J, Tobin J, Roy T, and Hurley B.

Age and gender comparisons of muscle strength in 654 women and me aged

20–93. J Appl Physiol 83: 1581–1587, 1997

90.Lord SR, Ward JA, Williams P, and Anstey K. Physiological factors associated

with falls in older community-dwelling women. J Am Geriatr Soc 42: 1110–

1117, 1994

91.Lucia A, Hoyos J, Chicharro JL. Physiology of professional road cycling.

Sports. Med. 2001;31:325–37.

92.Lynch NA, Metter EJ, Lindle RS, Fozard JL, Tobin JD, Roy TA, Fleg JL, and

Hurley BF. Muscle quality I: age-associated differences in arm vs. leg muscle

groups. J Appl Physiol 86: 188–194, 1999

66

93.MacArthur DG, Seto JT, Raftery JM, Quinlan KG, Huttley GA, Hook JW,

Lemckert FA, Kee AJ, Edwards MR, Berman Y, Hardeman EC, Gunning PW,

Easteal S, Yang N, North KN. Loss of ACTN3 gene function alters mouse

muscle metabolism and shows evidence of positive selection in humans. Nat

Genet 39: 1261–1265, 2007

94.Malm C, Sjödin TL, Sjöberg B, Lenkei R, Renström P, Lundberg IE, Ekblom B.

Leukocytes, cytokines, growth factors and hormones in human skeletal muscle

and blood after uphill or downhill running. J Physiol. 2004, 556:983-1000

95.Maltin CA, Jones P, Mantle D. Effect of protease inhibitors and clenbuterol on

the in vitro degradation of dystrophin by endogenuous proteases in human

skeletal muscle. Biosci Rep. 1993;13:159–167

96.Mansour MM, Azzazy HM. The hunt for gene dopers. Drug Test Anal 2009; 1:

311-322

97.Matsakas A, Foster K, Otto A, Macharia R, Elashry MI, Feist S, Graham I,

Foster H, Yaworsky P, Walsh F, Dickson G, Patel K. Molecular, cellular and

physiological investigation of myostatin propeptide-mediated muscle growth in

adult mice. Neuromuscul Disord 19: 489–499, 2009

98.McCue M.,a Stephanie J Valberg,a Michael B Miller,b Claire Wade,c Salvatore

DiMauro,d Hasan O Akman,d and James R Mickelsone Glycogen synthase

(GYS1) mutation causes a novel skeletal muscle glycogenosis a Department of

Veterinary Population Medicine, College of Veterinary Medicine, University of

Minnesota Department of Epidemiology, School of Public Health, University of

Minnesota Center for Human Genetic Research, Massachusetts General

Hospital, Colombia University Medical Center H. Houston Merritt Clinical

Research Center, Department of Neurology, Colombia University Medical

Center Department of Veterinary Biosciences, University of Minnesota College

of Veterinary Medicine Genomics. 2008 May; 91(5): 458–466.

99.McPherron AC, Huynh TV, Lee SJ. Redundancy of myostatin and

growth/differentiation factor 11. BMC Dev Biol 9: 24–32, 2009

100. McPherron AC, Lawler AM, Lee S Regulation of skeletal muscle mass in mice

by a new TGF-β superfamily member. Nature 387: 83–90, 1997

101. McPherron AC, Lawler AM, Lee SJ. Regulation of skeletal muscle mass in

mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature. 1997;387:83–90

67

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&retmode=ref&cmd=prlinks&id=18358695

102. McPherron AC, Lee SJ. Suppression of body fat accumulation in myostatin-

deficient mice. J Clin Invest 109: 595–601, 2002

103. Meinhardt Udo, Anne E.Nelson, Jennifer L.Hansen, Vita Birzniece, David

Clifford, Kin – Chuen Leung, Kenneth Graham, and Ken K.Y. Ho Ann Intern

Med May 4, 2010, 152:568-577, The Effects of growth hormone on body

composition and physical performance in recreational athletes: A randomized

trial

104. Messi ML and Delbono O. Target-derived trophic effect on skeletal muscle

innervation in senescent mice. J Neurosci 23: 1351–1359, 2003

105. Miah A. Gene-doping: sport, values & bioethics. In: Glasa J (Editor), The

ethics of human genetics. Strasburg: Council of Europe; 2003. p 171-180

106. Miah A. Rethinking enhancement in sport. Ann NY Acad Sci 2006; 1093: 301-

320

107. Mitchell AD, Wall RJ. In vivo evaluation of changes in body composition of

transgenic mice expressing the myostatin pro domain using dual energy X-ray

absorptiometry. Growth Dev Aging 2007;70:25-37

108. Moore NG, Pegg GG, Sillence MN. Anabolic effects of the β2-adrenoceptor

agonist salmeterol are dependent on route of administration. Am J Physiol.

1994;267:E475–E484

109. Moore NG, Pegg GG, Sillence MN. Anabolic effects of the β2-adrenoceptor

agonist salmeterol are dependent on route of administration. Am J Physiol.

1994;267:E475–E484

110. Morton AR, Fitch KD. Asthmatic drugs and competitive sport. An update.

Sports Med. 1992;14:228–242

111. Mosher DS, Quignon P, Bustamante CD, Sutter NB, Mellersh CS, Parker HG,

Ostrander EA. A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and

enhances racing performance in heterozygote dogs. PLoS Genetics 3: 779–

786, 2007

112. Muller,Anis. Doping im Sport als Strafbare Gesundheitbeschadigung, Nomos

Verlagsgesellschaft, Baden-Baden, 1993

113. Nagamine T, Imamura T, Ishidou Y, Kato M, Murata F, ten Dijke P, et al.

Immunohistochemical detection of activin A, follistatin, and activin receptors

during fracture healing in the rat. J Orthop Res 1998;16:314-21

68

114. Naranjo Orellana J, Centeno Prada R, Carranza Márquez M. Use of β2-

agonists in sport: are the present criteria right. Br J Sports Med. 2006;40:363–

366

115. Natwani Amit C., M.B.,Ch.B., Ph.D., Edward G.D.Tuddenham, M.B., B.S.,

M.D., Savita Rangarajan, M.B., B.S., Cecilia Rosales, Ph.D., Jenny Mcintosh,

Ph.D., David C.Linch, M.B., B.Chir, Pratima Chowdary, M.B, B.S., Anne

Riddell, B.Sc., Arnulfo Jaquilmac Pie, B.S.N., Chris Harrington, B.S.N., James

O'Beirne, M.B., B.S.,M.D., Keith Smith, M.Sc., John Pasi, M.D., Bertil Glader,

M.D., Ph.D., Pradip Rustagi, M.D., Catherine Y.C. Ng, M.S., Mark A. Kay,

M.D., Ph.D., Junfang Zhou, M.D., Yunyu Spence, Ph.D., Christopher L.

Morton, B.S., James Allay, Ph.D., John Coleman, M.S., Susan Sleep, Ph.D.,

John M.Cunningham, M.D., Deokumar Srivastava, Ph.D., Etiena Basner-

Tschakarjan, M.D., Federico Mingozzi, Ph.D., Katherine A.High, M.D., John T.

Gray, Ph.D., Ulrike M. Reiss, M.D., Arthur W.Nienhuis, M.D., and Andrew M.

Davidoff, M.D. ; N Engl J Med 2011; 365:2357-2365. Adenovirus – associated

virus vector – Mediated gene transfer in Hemophilia B

116. Nelson HS. Combination therapy of long-acting beta agonists and inhaled

corticosteroids in the management of chronic asthma. Curr Allergy Asthma

Rep. 2005;5:123–129

117. Nguyen TV, Howard GM, Kelly PJ, and Eisman JA. Bone mass, lean mass,

and fat mass: same genes or same environments? Am J Epidemiol 147: 3–16,

1998

118. Niemi AK, Majamaa K. Mitochondrial DNA and ACTN3 genotypes in Finnish

elite endurance and sprint athletes. Eur J Hum Genet 13: 965–969, 2005

119. Nieto A, Mazon A, Pamies R, Linana JJ, Lanuza A, Jimenez FO, et al.

Adverse effects of inhaled corticosteroids in funded and nonfunded studies.

Arch Intern Med. 2007;167:2047–2053

120. Norris SR, Petersen SR, Jones RL. The effect of salbutamol on performance

in endurance cyclists. Eur J Appl Physiol Occup Physiol. 1996;73:364–368

121. Northoff H, Symons S, Zieker D, Schaible EV, Schäfer K, Thoma S, Löffler M,

Abbasi A, Simon P, Niess AM, Fehrenbach E. Gender- and menstrual phase

dependent regulation of inflammatory gene expression in response to aerobic

exercise. Exerc Immunol Rev. 2008,14:86-103

69

122. Pilegaard H, Saltin B, Neufer PD (2003). "Exercise induces transient

transcriptional activation of the PGC-1alpha gene in human skeletal muscle".

JOURNAL OF PHYSIOLOGY 546 (Pt 3): 851–858. PMID 12563009

123. Porter D.L., M.D.,Bruce L.Levine Ph.D., Michael Kalos, Ph.D., Adam Bagg,

M.D., and Carl H. June, M.D. N Engl J Med 2011; 365:725-733, 2011

124. Chimeric Antigen Receptor – Modified T-cells in chronic lymphoid Leukemia

125. Puigserver P, Wu Z, Park CW, Graves R, Wright M, Spiegelman BM (1998) A

cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive

thermogenesis. Cell 92:829–839

126. Quinlan KG, Seto JT, Turner N, Vandebrouck A, Floetenmeyer M, Macarthur

DG, Raftery JM, Yang N, Parton RG, Cooney GJ, North KN. Alpha-actinin-3

deficiency results in reduced glycogen phosphorylase activity and altered

calcium handling in skeletal muscle. Hum Mol Genet 19: 1335–1346, 2010

127. Rantanen T, Era P, and Heikkinen E. Physical activity and the changes in

maximal isometric strength in men and women from the age of 75 to 80 years.

J Am Geriatr Soc 45: 1439–1445, 1997

128. Rebbapragada A, Benchabane H, Wrana JL, Celeste AJ, Attisano L. Myostatin

signals through a transforming growth factor beta-like signaling pathway to

block adipogenesis. Mol Cell Biol 2003;23:7230-42

129. Reed R, Pearlmutter L, Yochum K, Meredith K, and Mooradian A. The

relationship between muscle mass and muscle strength in the elderly. J Am

Geriatr Soc 39: 555–561, 1991

130. Reeds PJ, Hay SM, Dorwood PM, Palmer RM. Stimulation of muscle growth

by clenbuterol: lack of effect on muscle protein biosynthesis. Br J Nutr.

1986;56:249–258

131. Rennie MJ (2003). Claims for the anabolic effects of growth hormone: a case

of the emperor's new clothes? Br J Sports Med 37: 100–105

132. Rietveld I, Janssen JA, Hofman A, Pols HA, van Duijn CM, and Lamberts SW.

A polymorphism in the IGF-I gene influences the age-related decline in

circulating total IGF-I levels. Eur J Endocrinol 148: 171–175, 2003

133. Rigamonti AE, Cella SG, Marazzi N, Di Luigi L, Sartorio A, Muller EE (2005).

Growth hormone abuse: methods of detection. Trends Endocrinol Metab 16:

160–166

70


http://en.wikipedia.org/wiki/PubMed_Identifier

http://jp.physoc.org/content/546/3/851.long

http://jp.physoc.org/content/546/3/851.long

134. Riiser A, Tjorhom A, Carlsen K. The effect of formoterol inhalation on

endurance performance in hypobaric conditions. Med Sci Sports Exerc.

2006;38:2132–2137

135. Rosen CJ, Kurland ES, Vereault D, Adler RA, Rackoff PJ, Craig WY, Witte S,

Rogers J, and Bilezikian JP. Association between serum insulin growth factor-I

(IGF-I) and a simple sequence repeat in IGF-I gene: implications for genetic

studies of bone mineral density. J Clin Endocrinol Metab 83: 2286–2290, 1998

136. Roth SM, Walsh S, Liu D, Metter EJ, Ferrucci L, Hurley BF The ACTN3 R577X

nonsense allele is under-represented in elite-level strength athletes. Eur J

Hum Genet 16: 391–394, 2008

137. Rothenburg S, Koch-Nolte F, Rich A, and Haag F. A polymorphic dinucleotide

repeat in the rat nucleolin gene forms Z-DNA and inhibits promoter activity.

Proc Natl Acad Sci USA 98: 8985–8990, 2001

138. Rupert JL. Transcriptional profiling: a potential anti-doping strategy. Scand J

Med Sci Sports 2009; 19: 753-763

139. Ryall JG, Sillence MN, Lynch GS. Systemic administration of β2-adrenoceptor

agonists, formoterol and salmeterol, elicit skeletal muscle hypertrophy in rats

at micromolar doses. Br J Pharmacol. 2006;147:587–595

140. Salomon F, Cuneo RC, Hesp R, and Sonksen PH. The effects of treatment

with recombinant human growth hormone on body composition and

metabolism in adults with growth hormone deficiency. N Engl J Med 321:

1797–1803, 1989

141. Saltin B, Gollnick PD (1983) in The Handbook of Physiology. Skeletal Muscle,

Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance,

eds Peachey LD, Adrian RH, Geiger SR (Williams & Wilkins, Baltimore, USA),

pp 555–631

142. Santiago C, Gonzalez-Freire M, Serratosa L, Morate FJ, Meyer T, Gomez-

Gallego F, Lucia A. ACTN3 genotype in professional soccer players. Br J

Sports Med 42: 71–73, 2008

143. Saugy M, Robinson N, Saudan C, Baume N, Avois L, Mangin P (2006).

Human growth hormone doping in sport. Br J Sports Med 40 (Suppl 1): i35–i39

144. Scarpulla RC (2002) Nuclear activators and coactivators in mammalian

mitochondrial biogenesis. Biochim Biophys Acta 1576:1–14

71

145. Schaible E, Boehringer A, Callau D, Nies A Perikles S; Exercise and

menstrual cycle dependent expression of a truncated alternative splice variant

of HIF1α in Leukocytes, Johannes Gutenberg-University Mainz, Germany,

2010

146. Schmuth M, Haqq CM, Cairns WJ, Holder JC, Dorsam S, Chang S, Lau P,

Fowler AJ, Chuang G, Moser AH, Brown BE, Mao-Qiang M, Uchida Y,

Schoonjans K, Auwerx J, Chambon P, Willson TM, Elias PM, Feingold KR

(April 2004). "Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-beta/delta

stimulates differentiation and lipid accumulation in keratinocytes". J. Invest.

Dermatol. 122 (4): 971–83

147. Schuelke M, Wagner KR, Stolz LE, Hübner C, Riebel T, Kömen W, et al.

Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child. N

Engl J Med. 2004;350:2682–2688.

148. Seeman E, Hopper JL, Young NR, Formica C, Goss P, and Tsalamandris C.

Do genetic factors explain associations between muscle strength, lean mass,

and bone density? A twin study. Am J Physiol Endocrinol Metab 270: E320–

E327, 1996

149. Shaw RJ, Lamia KA, Vasquez D, Koo SH, Bardeesy N, Depinho RA,

Montminy M, Cantley LC. The kinase LKB1 mediates glucose homeostasis in

liver and therapeutic effects of metformin. Science. 2005;310:1642–6

150. Sheridan, C. (2011). Gene therapy finds its niche. Nature Publishing Group,

29(2), 121–128

151. Signorile JF, Kaplan TA, Applegate B, Perry AC. Effects of acute inhalation of

the bronchodilator, albuterol, on power output. Med Sci Sports Exerc.

1992;24:638–642

152. Sinaki M, McPhee M, Hodgson S, Merritt J, and Offord K. Relationship

between bone mineral density of spine and strength of back extensors in

healthy postmenopausal women. Mayo Clin Proc 61: 116–122, 1986

153. Smith D, Perry P. The efficacy of ergogenic agents in athletic competition. Part

II: other performance-enhancing agents. Ann Pharmacother. 1992;26:653–659

154. Sprecher DL, Massien C, Pearce G, Billin AN, Perlstein I, Willson TM, Hassall

DG, Ancellin N, Patterson SD, Lobe DC, Johnson TG. Triglyceride:high-

density lipoprotein cholesterol effects in healthy subjects administered a

72

peroxisome proliferator activated receptor delta agonist. Arterioscler. Thromb.

Vasc. Biol. 2007;27:359–65

155. Sun G, Gagnon J, Chagnon YC, Perusse L, Despres JP, Leon AS, Wilmore

JH, Skinner JS, Borecki I, Rao DC, and Bouchard C. Association and linkage

between an insulin-like growth factor-1 gene polymorphism and fat free mass

in the HERITAGE Family Study. Int J Obes Relat Metab Disord 23: 929–935,

1999

156. Taylor WE, Bhasin S, Artaza J, Byhower F, Azam M, Willard DH, Jr., et al.

Myostatin inhibits cell proliferation and protein synthesis in C2C12 muscle

cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 2001;280:E221-8

157. Thibault M, Simoneau J, Cote C, Boulay M, Lagasse P, Marcotte M, and

Bouchard C. Inheritance of human muscle enzyme adaptation to isokinetic

strength training. Hum Hered 36: 341–347, 1986

158. Thomis MA, Beunen GP, Maes HH, Blimkie CJ, Leemputte MV, Claessens

AL, Marchal G, Willems E, and Vlietinck RF. Strength training: importance of

genetic factors. Med Sci Sports Exerc 30: 724–731, 1998

159. Tian H, McKnight SL, Russell DW (Feb 1997). "Endothelial PAS domain

protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial

cells". Genes Dev 11 (1): 72–82. doi:10.1101/gad.11.1.72

160. Toogood AA and Shalet SM. Ageing and growth hormone status. Baillieres

Clin Endocrinol Metab 12: 281–296, 1998

161. Topliss D, Isaacs D, Lander C, McNeil J, Shenfield G, Strasser S, et al.

Fluticasone and adrenal crisis. Australian Government Department of Health

and Aging. Therapeutic Goods Administration. 2003

162. Tsuchida K. The role of myostatin and bone morphogenetic proteins in

muscular disorders. Expert Opin Biol Ther 2006; 6: 147-154

163. Valberg SJ, MacLeay JM, Billstrom JA, Hower-Moritz MA, Mickelson JR.

Skeletal muscle metabolic response to exercise in horses with 'tying-up' due to

polysaccharide storage myopathy. Equine Vet J. 1999;31:43–47

164. van Baak MA, de Hon OM, Hartgens F, Kuipers H. Inhaled salbutamol and

endurance cycling performance in non-asthmatic athletes. Int J Sports Med.

2004;25:533–538

73

http://dx.doi.org/10.1101%2Fgad.11.1.72

http://en.wikipedia.org/wiki/Digital_object_identifier

165. van Baak MA, Mayer LH, Kempinski RE, Hartgens F. Effect of salbutamol on

muscle strength and endurance performance in nonasthmatic men. Med Sci

Sports Exerc. 2000;32:1300–1306

166. Verhoeckx KC, Doornbos RP, van der Greef J, Witkamp RF, Rodenburg RJ.

Inhibitory effects of the β-adrenergic receptor agonist zilpaterol on the LPS-

induced production of TNF-alpha in vitro and in vivo. J Vet Pharmacol Ther.

2005;28:531–537

167. Verroken M. Drug use and abuse in sport Drugs in Sport 2005. Routledge:

New York; 29, 62In: DR Mottram (ed).

168. Vlahoviček Mraović Gordana, doc.dr.sc, Kolegij Molekularna biologija s

genetičkim inženjerstvom; Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju

Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta

169. Wang YX, Lee CH, Tiep S, Yu RT, Ham J, Kang H, Evans RM. Peroxisome-

proliferator-activated receptor delta activates fat metabolism to prevent

obesity. Cell. 2003;113:159–70

170. Wang YX, Zhang CL, Yu RT, Cho HK, Nelson MC, Bayuga-Ocampo CR, Ham

J, Kang H, Evans RM. PLoS Biol. 2004 Oct;2(10):e294. Epub 2004 Aug 24.

Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARdelta. Gene

Expression Laboratory, Salk Institute, La Jolla, California, USA

171. Wang YX, Zhang CL, Yu RT, Cho HK, Nelson MC, Bayuga-Ocampo CR, Ham

J, Kang H, Evans RM. Regulation of muscle fiber type and running endurance

by PPARdelta. PLoS. Biol. 2004;2:e294

172. Williams RS, Neufer PD (1996) in The Handbook of Physiology. Exercise:

Regulation and Integration of Multiple Systems, Regulation of gene expression

in skeletal muscle by contractile activity, eds Rowell LB, Shepherd JT (Oxford

University Press, New York, USA), pp 1124–1150

173. Woodhouse LJ, Mukherjee A, Shalet SM, Ezzat S (2006). The influence of

growth hormone status on physical impairments, functional limitations, and

health-related quality of life in adults. Endocr Rev 27: 287–317

174. Wu Z, Puigserver P, Andersson U, Zhang C, Adelmant G, Mootha V, Troy A,

Cinti S, Lowell B, Scarpulla RC, Spiegelman BM (1999) Mechanisms

controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic

coactivator PGC-1. Cell 98:115–124

74


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Evans%20RM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kang%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ham%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ham%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bayuga-Ocampo%20CR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nelson%20MC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cho%20HK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yu%20RT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zhang%20CL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20YX%22%5BAuthor%5D

175. Yamazaki T, Kanzaki M, Kamidono S, Fujisawa M. Effect of erythropoietin on

Leydig cell is associated with the activation of Stat5 pathway. Mol Cell

Endocrinol 2004; 213: 193-198

176. Yang YT, McElligott MA. Multiple actions of β-adrenergic agonists on skeletal

muscle and adipose tissue. Biochem J. 1989;261:1–10

177. Zeman RJ, Ludemann R, Easton TG, Etlinger JD. Slow to fast alterations in

skeletal muscle fibers caused by clenbuterol, a β2-receptor agonist. Am J

Physiol. 1988;254:E726–E732

178. Zhang ZL, He JW, Qin YJ, Hu YQ, Li M, Zhang H, et al. Association between

myostatin gene polymorphisms and peak BMD variation in Chinese nuclear

families. Osteoporos Int 2008;19:39-47

75

10. ŽIVOTOPIS

Rođen sam u Splitu 02. veljače 1987.g., živio i odrastao u Kaštel Lukšiću gdje sam

završio osnovnu školu. Srednju školu sam pohađao u Splitu u općoj gimnaziji „Marko

Marulić“, gdje sam postizao uspjehe na državnim natjecanjima, prvo mjesto iz

praktične kemije i drugo mjesto iz biologije sa znanstevnim radom o ekologiji mora. U

Zagrebu sam 2005. godine upisao studij medicine, s jednom godinom pauze koju

sam iskoristio za boravak u specijalnoj klinici za istraživanje liječenja metodom

primjene matičnih i dendritičnih stanica, u Kolnu, Njemačka. Od svoje pete godine

sam sportski aktivan, 10 godina kao član plivačkog kluba „Mornar“ Split, zatim sve do

danas kao osnivač i instruktor skijanja u skijaškom klubu „Kaštela“, a dolaskom na

studij u Zagreb i kao član judo kluba „Mladost“ s kojim sam osvojio prvo mjesto na

sveučilišnom prvenstvu u judu. Tijekom studija započeo sam aktivnu suradnju sa više

sportskih institucija i pojedinaca u Zagrebu i širom Hrvatske, u smislu stjecanja novih

znanja te savjetovanja i podrške o sportsko medicinskim aspektima specifičnog

sporta. Od toga je važno istaknuti odličnu suradnju sa trenerom hrvatske plivačke

reprezentacije Perom Kuterovcem, Plivačkim klubom ZPK, plivačima plivačkog kluba

„Dubrava“ i „Rijeka“, reprezentativcima u maratonskom plivanju Tomislavom Soldom i

Jakšom Tadićem, boksačima u profesionalnom i amaterskom boksu Stipom

Vugdelijom i Ivicom Bačurinom, taekwando reprezentativcem Kristijanom Kraljem,

tijekom kojih su ostvarili vrhunske europske i svjetske rezultate; suradnjom s

hrvatskom body building reprezentacijom na čelu s Mariom Jarnečićom, suradnju s

juniorskom postavom GNK „Dinamo“, Zagreb, te međunarodnu suradnju s plivačima

u Sjedinjenim Američkim Državama na sveučilištima Fresno - CA, Arizona- Ar,

Chicago- IL.

76

modern doping-the future of sport

Documents