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ANGELITA BOLDIERI DE SOUZA
DESENVOLVIMENTO DE DERIVADO VEGETAL DE
Sambucus nigra L. E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-
INFLAMATÓRIA IN VIVO
Itajaí (SC)
2018
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3
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ANGELITA BOLDIERI DE SOUZA
DESENVOLVIMENTO DE DERIVADO VEGETAL DE
Sambucus nigra L. E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-
INFLAMATÓRIA IN VIVO
Dissertação submetida à
Universidade do Vale do Itajaí como
parte dos requisitos para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências
Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Angélica
Garcia Couto
Co-orientadora: Profa. Dra. Tânia
Mari Bellé Bresolin
Itajaí (SC)
Março de 2018
4
Ficha Catalográfica
Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi CRB - 14/963
S89d
Souza, Angelita Boldieri de, 1983-
Desenvolvimento de derivado vegetal de sambucus nigra l. e
avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo [Manuscrito] / Angelita
Boldieri de Souza.- Itajaí, SC. 2018.
129 f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig.
Bibliografias f. 115-126
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos
requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
“Orientadora: Prof. Dra. Angélica Garcia Couto.”
“Co-orientadora: Dra. Tania Mari Bellé Bresolin.”
1. Plantas medicinais. 2. Sambucus nigra L. (sabugueiro). 3.
Farmacologia.
I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.
.
CDU: 615.32
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7
Aos meus pais, por todos os
ensinamentos e tempo dedicado a minha
formação.
Às minhas irmãs, pelo apoio e amizade
incondicionais.
Ao meu esposo pelo companheirismo e
paciência.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais Odair e Edna pelo incentivo, apoio constante e por
jamais me permitir desistir.
Ao meu esposo Paulo pela dedicação, paciência e por ter sido meu alicerce
durante todo este trabalho. Este trabalho não seria possível sem o seu apoio
incondicional.
Às minhas irmãs Mariene e Thaíssa, pela amizade, companheirismo e atenção
em todos os momentos e apesar da distância.
Ao meu cunhado James e meus sogros Regina e Roosevelt pelo apoio durante
esta caminhada.
À minha orientadora Dra. Angélica Garcia Couto, por todo conhecimento
compartilhado durante este trabalho, por acreditar na minha capacidade e por
estar sempre disponível para as discussões e orientações.
À co-orientadora Dra. Tania Mari Bellé Bresolin, pelos seus ensinamentos
em cromatografia e validação analítica, sugestões e colaboração constante a
este trabalho.
À professora Dra. Ruth Meri Lucinda da Silva pela dedicação nas correções
do projeto e sugestões que contribuíram significativamente na melhoria deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. José Roberto Santin pelas palavras positivas e sugestões dadas
durante a etapa de qualificação.
À professora Dra. Nara Meira Quintão pela realização dos testes de atividade
anti-inflamatória e participação neste trabalho.
À Letícia pela parceria, dedicação e seriedade com a qual colaborou neste
trabalho.
Á Clarissa e Milena pela colaboração nas análises cromatográficas e pelos
momentos de descontração durante este período.
À Ana Carolina por sempre acreditar no meu potencial como profissional e
flexibilizar meus horários de trabalho possibilitando minha dedicação ao
mestrado acadêmico.
À Aline, Glória e Thaís por todo apoio e amizade e a todos os colegas do
Laboratório Catarinense que me auxiliaram durante este trabalho.
Ao Laboratório Catarinense pelo apoio financeiro e flexibilização dos meus
horários de trabalho.
Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da UNIVALI
pela oportunidade de cursar o mestrado acadêmico nesta instituição.
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“A mente que se abre a uma
nova ideia jamais voltará
ao seu tamanho original”
Albert Einstein
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13
DESENVOLVIMENTO DE DERIVADO VEGETAL DE
Sambucus nigra L. E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-
INFLAMATÓRIA IN VIVO
Angelita Boldieri de Souza
Março/2018
Orientadora: Dra. Angélica Garcia Couto
Co-orientadora: Dra. Tania Mari Bellé Bresolin
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias bioativas
Número de Páginas: 129.
Sambucus nigra L. é uma planta medicinal de nome popular sabugueiro, cujas
flores tem uso aprovado para alívio dos sintomas do resfriado comum. No
Brasil, não há produtos registrados, embora esta espécie esteja na lista para o
registro simplificado, como produto tradicional fitoterápico (PTF). O
objetivo deste estudo foi desenvolver tinturas e extratos secos a partir das
flores de S. nigra, contribuindo para um possível registro do produto como
PTF. A fim de estabelecer as condições ótimas para a melhor eficiência
extrativa dos flavonoides, marcadores da droga vegetal, foram avaliadas as
metodologias de maceração, maceração dinâmica e percolação, utilizando
etanol 25% V/V. A percolação foi avaliada empregando-se dois níveis dos
fatores temperatura (25 e 60 °C) e % da droga vegetal (12 e 7,5% p/V) na
obtenção da solução extrativa. A melhor condição desenvolvida foi
reproduzida em escala piloto para avaliação do aumento de escala. O extrato
seco foi desenvolvido e otimizado por um desenho experimental estatístico
de dois parâmetros (A = temperatura de secagem e B= % de adjuvante) em
cinco diferentes níveis (A = 132, 140, 160, 180 e 188 °C; B = 22, 30, 50, 70
e 78%). A droga vegetal, tinturas e os extratos secos foram caracterizados por
métodos farmacopeicos e análise do teor dos flavonoides por CLAE. A droga
vegetal, tintura e extrato seco foram submetidos a um estudo de estabilidade
por 60 dias em condições aceleradas (40 °C/75% UR) e a temperatura
ambiente (15 a 30 °C). A atividade anti-inflamatória da tintura em modelo de
bolsa de ar em camundongos foi avaliada. A droga vegetal foi aprovada, de
acordo com os parâmetros farmacopeicos e apresentou 1,85% de teor de
flavonoides expressos como rutina, sendo 1,45% desta substância. O melhor
método de extração para a obtenção da tintura foi a percolação com
aquecimento a 60 °C e 7,5% de droga vegetal (p/V), com eficiência extrativa
de 61,9% na escala laboratorial e em torno de 70,0% na escala piloto e
14
1274,20 ± 8,64 µg/mL de flavonoides totais expressos em rutina. A melhor
condição de secagem para a obtenção do extrato seco, foi a temperatura de
188 °C e 64% de maltodextrina e nesta condição o extrato apresentou 16,97
± 0,65 µg/g de flavonoides totais expressos em rutina. Na avaliação da
estabilidade da tintura foi observada queda de quase 20% no teor de
flavonoides, em condições aceleradas, e superior a 15% na temperatura
ambiente em 60 dias de armazenamento. No extrato seco, na temperatura
ambiente, o teor de flavonoides teve queda inferior a 5% no mesmo período,
e na condição acelerada, observou-se uma elevada absorção de umidade. A
atividade anti-inflamatória do liofilizado da tintura foi significativa na dose
de 600 mg/kg. Em conclusão, a tintura de S. nigra foi desenvolvida com
processo reprodutível em escala piloto e teve sua atividade anti-inflamatória
in vivo confirmada para doses já utilizadas no uso tradicional. O extrato seco
desenvolvido é uma opção de derivado vegetal mais estável e de fácil
aplicação em formas farmacêuticas sólidas.
Palavras-chave: Sambucus nigra L. Tintura. Extrato seco. Secagem por
aspersão. Atividade anti-inflamatória. Estabilidade
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DEVELOPMENT OF A HERBAL PREPARATION OF
Sambucus nigra L. AND EVALUATION OF ANTI-
INFLAMMATORY ACTIVITY IN VIVO
Angelita Boldieri de Souza
March/2018
Advisor: Dr. Angélica Garcia Couto
Area of Co-advisor: Dr.Tania Mari Bellé Bresolin
Number of Pages: 129.
Sambucus nigra L. is a medicinal plant popularly known as elderflower,
which has an approved use for the relief of symptoms of common cold. There
are not registered products in Brazil, although this species is included in the
simplified registration list as a traditional herbal product. The aim of this
study was to develop tinctures and dry extracts from flowers of S. nigra,
contributing to a possible product registration. In order to establish the
optimum conditions to obtain the best extractive efficiency of the flavonoids,
markers of herbal substance, the methods of maceration, dynamic maceration
and percolation with 25% V/V ethanol were evaluated. The percolation was
evaluated using two levels of the temperature factors (25 and 60 °C) and %
of the herbal substance (12 and 7,5% w/v) to obtain the extract. The best
developed condition was reproduced on a pilot scale to evaluate the increase
in scale. The dry extract was developed and optimized by a statistical
experimental design with two parameters (A = drying temperature and B =%
of dry adjuvant) at five different levels (A = 132, 140, 160, 180 and 188 °C,
B = 22, 30, 50, 70 and 78%). The herbal substance, tincture and dry extract
were characterized by pharmacopoeial methods and the flavonoid content
calculated as rutin was analyzed by HPLC. The herbal substance, tincture and
dry extract were subjected to a stability study for 60 days under accelerated
conditions (40°C/75% RH) and room temperature (15-30 °C). The anti-
inflammatory activity of the tincture was evaluated in the air pouch model in
mice. The herbal substance was approved, according to the pharmacopeal
parameters, and presented 1,85% of flavonoid expressed as rutin and 1,45%
of this substance. The best extraction method to obtain the tincture was
heating percolation at 60°C and 7,5% of herbal substance (w/v), with
extractive efficiency of 61,9% in laboratory scale and around 70,0% in pilot
scale, with 1274,20 ± 8.64 µg/mL of flavonoids expressed as rutin. The best
drying condition to obtain the dry extract was a temperature of 188°C and
16
64% of maltodextrin, and in this condition, the extract presented 16,97 ± 0,65
µg/g of total flavonoids expressed as rutin. In the evaluation of the stability
of the tincture, a loss of almost 20% in accelerated condition and more than
15% at room temperature was observed after 60 days of storage. In the dry
extract, the flavonoid loss at room temperature was less than 5% in the same
period, and a high moisture absorption was observed in accelerated condition.
The anti-inflammatory activity of the lyophilized tincture was significant at
the dose of 600 mg/kg. In conclusion, the tincture of S. nigra was obtained
with a reproducible process in pilot scale, and its in vivo anti-inflammatory
activity was confirmed for doses already in traditional use. The developed
dry extract it is a more stable herbal preparation option that is easy to apply
in solid pharmaceutical forms.
Keywords: Sambucus nigra L. Tincture. Dry Extract. Spray drying. Anti-
inflammatory activity. Stability.
17
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição nativa de S. nigra na Europa e Ilhas Britânicas. ..... 34
Figura 2. Imagem do arbusto florido (A) e arbusto (B) de S. nigra. .......... 35
Figura 3. Representação das flores de S. nigra. ......................................... 36
Figura 4. Estruturas químicas dos principais flavonoides das flores de S.
nigra. ........................................................................................................... 37
Figura 5. Estrutura básicas dos flavonoides. .............................................. 43
Figura 6. Formação de micropartículas na secagem por aspersão. ............ 48
Figura 7. Esquema dos secadores por aspersão (spray drying). ................. 49
Figura 8. Fórmula estrutural da maltodextrina. .......................................... 51
Figura 9. Picos dos flavonoides no cromatograma de CLAE da droga vegetal
de S. nigra. .................................................................................................. 60
Figura 10. Esquema do processo de extração realizado em percolador com
coluna de aquecimento. ............................................................................... 62
Figura 11. Picos dos flavonoides no cromatograma de CLAE das tinturas de
S. nigra. ....................................................................................................... 67
Figura 12. Picos dos flavonoides no cromatograma dos extratos secos de S.
nigra. ........................................................................................................... 69
Figura 13. Representação esquemática do aparelho Scott Volumeter........ 70
Figura 14. Imagem da droga vegetal de S. nigra do lote 25/20.................. 75
Figura 15. Aspecto macroscópico da corola e cálice das flores secas de S.
nigra. ........................................................................................................... 76
Figura 16. Aspecto microscópico das pétalas das flores de S. nigra. ......... 76
Figura 17. Cromatografia em camada delgada obtida da droga vegetal de S.
nigra. ........................................................................................................... 79
Figura 18. Perfil cromatográfico obtido por CLAE da droga vegetal de S.
nigra. ........................................................................................................... 80
Figura 19. Perfis espectrais dos principais picos no detector UV-DAD em
356 nm na droga vegetal de S. nigra. .......................................................... 82
Figura 20. Distribuição granulométrica da droga vegetal de S. nigra. ....... 83
Figura 21. Gráfico normal dos efeitos padronizadas para teor de flavonoides
calculados como rutina no resíduo seco (TR mg/g) na percolação. ............. 86
Figura 22. Gráfico normal dos efeitos padronizadas para eficiência extrativa
dos flavonoides (EE %) na percolação. ....................................................... 87
18
Figura 23. Gráfico das médias e intervalo de confiança e Gráfico do teste de
Tukey do teor de flavonoides calculados como rutina no resíduo seco (TR
mg/g) nos diferentes métodos de extração. ................................................. 89
Figura 24. Gráfico das médias e intervalo de confiança e Gráfico do teste de
Tukey da eficiência extrativa dos flavonoides (EE %) nos diferentes métodos
de extração. ................................................................................................. 90
Figura 25. Cromatograma obtido por CLAE para a tintura desenvolvida pelo
método de percolação empregando aquecimento na escala laboratorial. .... 91
Figura 26. Imagem da tintura de S. nigra obtida no Lote 02. ..................... 94
Figura 27. Perfil cromatográfico por CLAE da Tintura de S. nigra obtida na
escala piloto. ................................................................................................ 95
Figura 28. Representação de um desenho experimental estatístico pelo
modelo de desenho de composto central. .................................................... 95
Figura 29. Gráficos de superfície de resposta e de contorno para umidade no
extrato seco durante o desenvolvimento da secagem por spray drying. ...... 98
Figura 30. Gráficos de superfície de resposta e de contorno para %
flavonoides calculados como rutina durante o desenvolvimento da secagem
por spray drying. ......................................................................................... 99
Figura 31. Imagens do extrato seco de S. nigra obtidos utilizando-se as
condições otimizadas de secagem (a) Lote 01 (b) Lote 02. ....................... 101
Figura 32. Perfil cromatográfico por CLAE do extrato seco de S. nigra. 102
Figura 33. Eletromicrografias do lote 01 do extrato seco de S. nigra. ..... 104
Figura 34. Histograma da avaliação do diâmetro das micropartículas obtidas
por spray drying no Lote 01 do extrato seco de S. nigra. .......................... 105
Figura 35. Gráfico da variação do teor de marcadores na droga vegetal,
tintura e extrato seco de S. nigra durante o armazenamento a temperatura
ambiente. ................................................................................................... 110
Figura 36. Contagem total de leucócitos obtidos no exsudato inflamatório da
bolsa de ar induzida nos camundongos (contagem foi realizada em
microscópio óptico com auxílio da Câmara de Neubeuer). ....................... 112
19
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Resultados dos ensaios de pureza da droga vegetal de S. nigra. 77
Tabela 2. Resultados de teor de flavonoides e rutina por CLAE na droga
vegetal de S. nigra. ...................................................................................... 80
Tabela 3. Resultados obtidos na obtenção da tintura de S. nigra por
percolação. .................................................................................................. 84
Tabela 4. Análise de variância (ANOVA) para teor de flavonoides calculados
como rutina no resíduo seco (TR mg/g) na percolação. .............................. 85
Tabela 5. Análise de variância (ANOVA) para a eficiência extrativa dos
flavonoides (EE %) na percolação. ............................................................. 87
Tabela 6. Resultados da obtenção da tintura de S. nigra por maceração
(MAC) e maceração dinâmica (MACD). .................................................... 88
Tabela 7. Resultados analíticos obtidos nos lotes pilotos da Tintura de S.
nigra. ........................................................................................................... 93
Tabela 8. Comparação dos resultados na tintura de S. nigra nas escalas
laboratorial e piloto. .................................................................................... 94
Tabela 9. Resultados obtidos na obtenção do extrato seco de S. nigra por
spray drying utilizando delineamento de composto de central. .................. 96
Tabela 10. Seleção das condições ótimas para secagem do extrato seco de S.
nigra por spray drying. ............................................................................. 100
Tabela 11. Resultados obtidos para o extrato seco de S. nigra em condições
otimizadas de secagem. ............................................................................. 101
Tabela 12. Densidade aparente, ângulo de repouso e índice de solubilidade
para o extrato seco de S. nigra. ................................................................. 103
Tabela 13. Avaliação da estabilidade da droga vegetal de S. nigra (Lote
25/20) frente a diferentes condições de armazenamento. .......................... 107
Tabela 14. Avaliação da estabilidade da tintura de S. nigra frente a diferentes
condições de armazenamento. ................................................................... 108
Tabela 15. Avaliação da estabilidade do extrato seco de S. nigra frente a
diferentes condições de armazenamento. .................................................. 109
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21
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Gradiente de eluição empregado para a análise de flavonoides por
CLAE. ......................................................................................................... 58
Quadro 2. Desenho da etapa de otimização da obtenção do extrato seco de
S. nigra por spray drying. ........................................................................... 65
Quadro 3. Precisão do método de teor de flavonoides calculados como rutina
por CLAE na tintura de S. nigra. ................................................................ 68
Quadro 4. Precisão do método de teor de flavonoides calculados como rutina
por CLAE no extrato seco de S. nigra. ....................................................... 69
Quadro 5. Critérios de fluxo estabelecidos de acordo com o ângulo de
repouso. ....................................................................................................... 71
Quadro 6. Dados dos lotes da tintura de S. nigra produzidos em escala piloto
utilizando percolação aquecida e repercolação. .......................................... 93
22
23
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA – Análise de variância
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
CCD – Cromatografia em camada delgada
DER – relação entre a droga vegetal e o derivado vegetal
DPR – desvio padrão relativo
EE % - eficiência extrativa em %
EMA – European Medicine Agency
FLAV % - % de flavonoides totais calculados em rutina em comparação ao
teórico
FDA – Food and Drug Administration
IS – Índice de solubilidade em água
IFAV – insumo farmacêutico ativo vegetal
MAC – maceração
MACD – maceração dinâmica
MEV – microscopia eletrônica de varredura
MF – medicamento fitoterápico
PD% - perda por dessecação expressa em %
PERC – percolação
PTF – produto tradicional fitoterápico
R% - rendimento expresso em porcentagem
RS% - resíduo seco expresso em %
t – teor de flavonoides calculados como rutina
trut – teor de rutina
tr – tempo de retenção
TR – teor de marcador no resíduo seco em mg/g
WHO – World Health Organization
24
25
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 29
2 OBJETIVOS ........................................................................................... 31
2.1 Objetivo Geral ..................................................................................... 31
2.2 Objetivos Específicos .......................................................................... 31
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 33
3.1 Fitoterápicos ........................................................................................ 33
3.2 Sambucus nigra L. ............................................................................... 34
3.2.1 Características gerais da espécie ..................................................... 34
3.2.2 Composição química da espécie ...................................................... 36
3.2.3 Uso como produto tradicional fitoterápico .................................... 38
3.2.4 Estudos farmacológicos ................................................................... 39
3.2.5 Controle de qualidade ...................................................................... 42
3.2.6 Flavonoides ....................................................................................... 43
3.2 Desenvolvimento de derivado vegetal ................................................ 44
3.2.1 Tinturas ............................................................................................. 46
3.2.2 Extrato seco ...................................................................................... 47
3.2.2.1 Secagem por aspersão ou atomização .......................................... 47
3.2.2.2 Excipientes de secagem ................................................................. 51
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 53
4.1 Materiais .............................................................................................. 53
4.1.1 Material vegetal ................................................................................ 53
4.1.2 Matérias-primas e reagentes ........................................................... 53
4.1.3 Equipamentos ................................................................................... 54
4.2 Métodos ................................................................................................ 55
4.2.1 Controle de qualidade da droga vegetal ......................................... 55
4.2.1.1 Análise macro e microscópica ...................................................... 55
4.2.1.2 Perda por dessecação .................................................................... 55
4.2.1.3 Cinzas totais ................................................................................... 55
4.2.1.4 Material estranho .......................................................................... 56
4.2.1.5 Granulometria ............................................................................... 56
4.2.1.6 Teor de flavonoides expressos em quercetina ............................. 56
4.2.1.7 Teor de flavonoides calculados como rutina por CLAE ............ 57
4.2.1.8 Identificação por CCD .................................................................. 60
4.2.1.9 Identificação por CLAE ............................................................... 60
26
4.2.2 Desenvolvimento da tintura ............................................................. 61
4.2.2.1 Delineamento ................................................................................. 61
4.2.2.2 Desenvolvimento em escala laboratorial ..................................... 62
4.2.2.3 Desenvolvimento em escala piloto ................................................ 63
4.2.2.4 Análise dos dados .......................................................................... 64
4.2.3 Desenvolvimento do extrato seco .................................................... 64
4.2.3.1 Desenvolvimento dos parâmetros de secagem ............................ 64
4.2.3.2 Obtenção do extrato seco .............................................................. 66
4.2.4 Análises na tintura e extrato seco .................................................... 66
4.2.4.1 Determinação do pH na tintura ................................................... 66
4.2.4.2 Determinação do resíduo seco na tintura .................................... 66
4.2.4.3 Teor de flavonoides calculados como rutina nas tinturas .......... 66
4.2.4.4 Teor de flavonoides calculados como rutina nos extratos secos 68
4.2.4.5 Avaliação do perfil cromatográfico por CLAE nas tinturas e
extrato seco ................................................................................................ 70
4.2.4.6 Determinação da densidade aparente no extrato seco ............... 70
4.2.4.7 Determinação do ângulo de repouso no extrato seco.................. 71
4.2.4.8 Determinação da solubilidade do extrato seco ............................ 72
4.2.4.9 Perda por dessecação no extrato seco .......................................... 72
4.2.4.10 Tamanho e morfologia das micropartículas .............................. 72
4.2.4.11 Estudo de estabilidade ................................................................. 73
4.2.5 Atividade anti-inflamatória in vivo da tintura ............................... 73
4.2.5.1 Preparo da amostra ....................................................................... 73
4.2.5.2 Animais ........................................................................................... 73
4.2.5.3 Inflamação no tecido subcutâneo - bolsa de ar ........................... 74
4.2.5.4 Análise estatística .......................................................................... 74
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................... 75
5.1 Controle de qualidade da droga vegetal ............................................ 75
5.1.1 Análise macroscópica e microscópica ............................................. 75
5.1.2 Testes de pureza e integridade ........................................................ 77
5.1.3 Teor de flavonoides expressos em quercetina ................................ 77
5.1.4 Identificação por CCD ..................................................................... 78
5.1.5 Teor de flavonoides calculados como rutina por CLAE ............... 79
5.1.6 Granulometria da droga vegetal ..................................................... 83
5.2 Desenvolvimento da tintura ................................................................ 84
5.2.1 Desenvolvimento em escala laboratorial ........................................ 84
5.2.2 Desenvolvimento em escala piloto ................................................... 92
27
5.3 Desenvolvimento do extrato seco ....................................................... 95
5.3.1 Desenvolvimento dos parâmetros de secagem ............................... 95
5.3.2 Obtenção do extrato seco ............................................................... 100
5.3.3 Perda por dessecação, teor de flavonoides e perfil cromatográfico
por CLAE ................................................................................................ 101
5.3.4 Densidade aparente, ângulo de repouso e índice de solubilidade
.................................................................................................................. 103
5.3.5 Tamanho e morfologia das micropartículas por MEV ............... 104
5.4 Estudo de estabilidade ...................................................................... 106
5.5 Atividade anti-inflamatória in vivo ................................................. 111
6 CONCLUSÕES .................................................................................... 113
REFERÊNCIAS ...................................................................................... 115
ANEXO A – Laudo de análise da droga vegetal ................................... 127
ANEXO B – Parecer de aprovação do Protocolo no CEUA/UNIVALI
.................................................................................................................. 128
28
29
1 INTRODUÇÃO
Os fitoterápicos são produtos que podem conter em sua composição
somente matérias-primas ativas de origem vegetal, exceto substâncias
isoladas (BRASIL, 2014a). Além disso, as plantas medicinais podem ser um
ponto de partida para o desenvolvimento de novos princípios ativos
farmacologicamente ativos.
Os fitoterápicos podem ser utilizados na terapêutica como opção de
primeira escolha, a exemplo no tratamento da hiperplasia benigna da próstata,
quanto em substituição ao medicamento de origem sintética, como no caso
de ansiedade leve, ou, ainda, como um coadjuvante da terapia alopática
convencional (BRASIL, 2012). Desta forma, caracterizam-se como válido
objeto de estudo para que se ampliem as opções de tratamento eficaz a partir
das plantas medicinais.
Embora o Brasil seja um dos países com a maior biodiversidade mundial
(BARREIRO; BOLZANI, 2009), o número de registro de medicamentos
fitoterápicos na Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é de
apenas 359 produtos, sendo 332 simples e apenas 27 que podem conter mais
de uma espécie vegetal associadas que podem conter mais de uma espécie
vegetal (CARVALHO et al., 2018). Estes dados demonstram a grande
oportunidade e necessidade de inovação a partir de princípios ativos de
origem vegetal.
A espécie Sambucus nigra L., pertencente à família Adoxaceae, tem uso
tradicional descrito em literatura e aprovado por órgãos reguladores. O infuso
e tintura obtidos das flores secas podem ser utilizados para o tratamento de
febres, calafrios e como expectorante no caso de inflamações brandas do trato
respiratório superior. Na Europa, em países como Áustria, Polônia e
Alemanha, são encontrados produtos contendo a espécie isolada ou associada
na forma de chá, xarope e comprimido revestido, com base nas evidências de
uso tradicional (BRASIL, 2014b; EMA, 2008a, 2008b; WHO, 2003).
No Brasil não se encontram produtos registrados contendo esta espécie
(CARVALHO et al., 2018). Dessa forma, o desenvolvimento de uma forma
farmacêutica a partir das flores de S. nigra justifica-se pela viabilidade de
registro no Brasil como produto tradicional fitoterápico simplificado
(BRASIL, 2014b) e oportunidade de mercado.
30
Considerando-se a possibilidade de interesse comercial em obter-se um
produto tradicional fitoterápico a partir das flores de S. nigra, o
desenvolvimento do derivado vegetal, o estudo de suas propriedades pré-
formulação e a avaliação da atividade biológica são cruciais para garantir que
o mesmo tenha qualidade e eficácia asseguradas.
Neste contexto, este trabalho buscou desenvolver o insumo
farmacêutico ativo vegetal (IFAV) como contribuição ao desenvolvimento
do produto tradicional fitoterápico na expectativa que possa constituir uma
opção de tratamento de origem natural em gripes e resfriados.
31
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Desenvolver o derivado vegetal para uso oral a partir das flores secas de
S. nigra L. e avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo.
2.2 Objetivos Específicos
Caracterizar a droga vegetal utilizando ensaios farmacopeicos;
Desenvolver a tintura a partir das flores de S. nigra, empregando-se
diferentes métodos de extração;
Desenvolver o extrato seco a partir da tintura de S. nigra, utilizando
secagem por spray drying;
Caracterizar os derivados vegetais desenvolvidos quanto às
propriedades físico-químicas e de pré-formulação;
Avaliar a estabilidade físico-química da droga vegetal, tintura e extrato
seco;
Avaliar a atividade anti-inflamatória in vivo dos derivados
desenvolvidos.
32
33
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Fitoterápicos
O uso das plantas medicinais na forma de chá ou outras formas
farmacêuticas tem papel fundamental na saúde da população em patologias
leves (OLIVEIRA; OLIVEIRA; MARQUES et al., 2016). Este tipo de
terapia vem sendo reconhecida pelo Ministério da Saúde por meio da Política
e Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (BRASIL, 2016),
e também da integração deste tipo de terapia às Práticas Integrativas e
Complementares do Sistema Único de Saúde – SUS (BRASIL, 2012).
No Brasil os medicamentos de origem natural estão atualmente
divididos em duas classes, os medicamentos fitoterápicos (MF) e os produtos
tradicionais fitoterápicos (PTF). Os medicamentos fitoterápicos são aqueles
que tem sua segurança e eficácia comprovada por estudos não clínicos e
clínicos e os produtos tradicionais fitoterápicos são aqueles que tem
segurança e efetividade comprovada pelas evidências de uso tradicional
(BRASIL, 2014a).
Os produtos tradicionais fitoterápicos são aqueles que podem ser
utilizados em condições de baixa gravidade, para sintomas que não
necessitam de acompanhamento médico. A comprovação de segurança e
efetividade pode ser feita pelo uso tradicional por mais de 30 anos ou pelo
registro simplificado (BRASIL, 2014c; CARVALHO et al., 2014).
A expectativa com a publicação da RDC n° 26 de 2014 é de que a
tradicionalidade de uso possa ser mais amplamente utilizada pelas empresas
como forma de registro de novos fitoterápicos. A espécie S. nigra L. é uma
das espécies com possibilidade de registro simplificado de PTF no Brasil,
caracterizando um potencial mercado a ser explorado (CARVALHO et al.,
2018). Em 2011 o mercado brasileiro de medicamentos fitoterápicos
movimentou 1,1 bilhão de reais, o que corresponde a 43 milhões de unidades
de produtos vendidos (IMS Health 2011, apud ALVES, 2013).
A regulamentação brasileira para essa classe evoluiu muito nos últimos
20 anos, e continua sob constante atualização pelo órgão sanitário. Essa
evolução vem ocorrendo para gerar uma regulamentação específica e
harmonizada com outros países. Observa-se atualmente que há maior rigor
nas normas quanto aos requisitos de qualidade destes produtos e que houve
34
ampliação nas possibilidades de espécies a serem registradas no Brasil
(OLIVEIRA; OLIVEIRA; MARQUES et al., 2016).
3.2 Sambucus nigra L.
3.2.1 Características gerais da espécie
A espécie S. nigra L. é popularmente conhecida como sabugueiro,
saúgo, european elder, black elder, sabugo e flor de noiva (ALONSO, 2007;
APPLEQUIST, 2006; MISSOURI BOTANICAL GARDEN, 2017).
A S. nigra é nativa das Ilhas Britânicas e Europa Continental com maior
concentração nas áreas mais escuras demonstradas na Figura 1. Foi
introduzida em outras partes do mundo como Ásia, África, América do Norte
e Austrália. A subespécie S. canadensis pode ser encontrada na América do
Norte e Central, e a subespécie S. peruviana na América do Sul. A espécie é
ausente em altitudes muito elevadas e cresce em zonas frescas, solos úmidos
e ricos em nitrogênio (ALONSO, 2007; APPLEQUIST, 2006; ATKINSON,
2002). A espécie do gênero de ocorrência no Brasil, desde a região do Sudeste
até o Rio Grande do Sul, e também no Paraguai, Argentina e Uruguai, é a
Sambucus australis (NUNES et al., 2007).
Figura 1. Distribuição nativa de S. nigra na Europa e Ilhas Britânicas.
Fonte: Adaptado de Atkinson, 2002.
35
Durante um longo período, a S. nigra foi considerada pertencente à
família Caprifoliaceae, porém, atualmente, foi reclassificada como parte da
família Adoxaceae (APPLEQUIST, 2015). Essa família é formada por cinco
gêneros com aproximadamente 200 espécies distribuídas nos dois
hemisférios. O gênero Sambucus compreende 9 a 20 espécies e é constituído
por árvores, arbustos e ervas subtropicais de pequeno porte. O gênero possui
taxonomia controversa e suas principais espécies, S. nigra, S. cerulea, S.
canadensis, S. maderensis e S. palmensis, são reconhecidas por alguns
autores como espécies diferentes e por outros como subespécies
(APPLEQUIST, 2015; BADENES; BYRNE, 2012).
A S. nigra é um arbusto ou árvore ramificada com 4 a 10 metros de
altura, de copa globosa, brotos eretos e retos a partir da base. O caule tem
casca enrugada de coloração marrom acinzentado, folhas pecioladas verde
escuras, com aglomerados de pequenas flores brancas ou amareladas (Figura
2) e frutos negros (APPLEQUIST, 2006; DERMARDEROSIAN;
BEUTLER; 2012; SCOPEL, 2007).
Figura 2. Imagem do arbusto florido (A) e arbusto (B) de S. nigra.
Fonte: (A) Buckallew, 2017; (B) Howard, 2017.
As flores e frutos apresentam uso medicinal mencionado na literatura
científica (ALONSO, 2007; APPLEQUIST, 2006; GARCIA et al., 1999). As
flores são pequenas, amareladas ou brancas, apresentam entre 3 a 5 mm de
A
B
36
diâmetro (Figura 3), odor fraco e característico, sabor doce e mucilaginoso
(WITCHL et al., 2004).
Figura 3. Representação das flores de S. nigra.
Fonte: Applequist, 2006.
3.2.2 Composição química da espécie
As flores de S. nigra são constituídas majoritariamente por flavonoides
em quantidade superior a 3%, principalmente os glicosilados como a rutina
(Figura 4), que pode atingir quantidades superiores a 2,5% nas flores secas.
Além da rutina, as flores contêm isoquercitrina, astragalina, hiperosídeo,
nicotiflorina, glicosídeos de isoramnetina e agliconas como campferol e
quercetina em menor quantidade (DAVIDECK, 1961; EMA, 2008b,
WAGNER; BLADT, 1996; WHO, 2003; WITCHL et al., 2004) e a flavanona
naringenina (CHRISTENSEN et al., 2010).
Além desses, as flores contêm mais de 3% de outros compostos
fenólicos, como ácido clorogênico, cafeico, ferúlico e p-cumárico e seus
ésteres β- glucosilados (EMA, 2008b; SCOPEL, 2005; WHO, 2003;
WITCHL, 2004).
Outros grupos químicos presentes são os triterpernos, em torno de 1%,
incluindo α e β amirina, ácido ursólico e oleanólico, e 1% de esteróis como
β-sitosterol, campesterol e estigmasterol (WHO, 2003; WITCHL, 2004). Os
óleos essenciais estão presentes, entre 0,03 a 0,14%, dos quais 65% são
ácidos graxos livres, como ácido palmítico e linoleico, e 7% são alcanos e
compostos como éteres, óxidos, acetonas, aldeídos, álcoois e ésteres (EMA,
2008b; TOULEMOND, RICHARD, 1983; WHO, 2003; WITCHL, 2004).
37
Figura 4. Estruturas químicas dos principais flavonoides das flores de S. nigra.
Rutina
(C27H30O16)
CAS: 153-18-4
Isoquercitrina
(C21H20O12)
CAS: 482,35-9
Quercetina
(C15H10O7)
CAS: 522-12-3
Também fazem parte da composição das flores minerais com alta
concentração de potássio (4-9%), taninos e mucilagem (EMA, 2008b;
GARCIA et al, 1999; WITCHL, 2004), além de traços do glicosídeo
cianogênico sambunigrina (ALONSO, 2007).
Senica et al. (2017) verificaram que a quantidade de flavonoides nas
flores é influenciada pela altitude do cultivo da espécie, aumentando entre 51
a 63% nos topos de colina, devido às diferenças de temperatura, luz e
precipitação entre essas regiões. O mesmo ocorre para os glicosídeos
cianogênicos e outros compostos fenólicos, porém não de forma gradual.
38
Entretanto, Rieger et al. (2008) verificaram que a isoquercitrina e os
derivados cafeoiquínicos em flores de S. nigra aumentam com altitude entre
670 e 1000 m, ao contrário da rutina, que diminui.
O fruto negro é bastante conhecido por conter antocianinas em maior
quantidade que os polifenois, além de vitaminas, taninos, açúcares, pectina,
óleos essenciais e ácidos orgânicos. Há traços de glicosídeos cianogênicos,
dentre eles a sambunigrina (ALONSO, 2007; GARCIA et al., 1999).
Nas cascas encontram-se quantidades significativas de lectinas e
proteínas inativadoras ribossomais, bastante estudadas na literatura técnico-
científica (ATKINSON, 2002). As folhas também contêm polifenois e
glicosídeos cianogênicos em maior quantidade que nas flores (ALONSO
2007; SENICA et al., 2017), sendo utilizadas tradicionalmente como anti-
inflamatório tópico (YESILADA et al., 1997).
Segundo EMA (2008 b) não há relatos de efeitos tóxicos ou prejudiciais
pelo uso das flores de S. nigra, apesar da presença de traços de sambunigrina.
No entanto, maior quantidade deste componente pode ser encontrada nos
frutos não maduros e outras partes da planta e seu uso pode ocasionar vômitos
ou diarreia caso sejam consumidos.
3.2.3 Uso como produto tradicional fitoterápico
O uso das flores desta espécie com base em evidências de uso
tradicional é amplamente descrito em literatura. É indicada para o tratamento
da febre, calafrios e como expectorante no caso de inflamações brandas do
trato respiratório superior. Devido às propriedades citadas, a droga vegetal é
utilizada no alívio de sintomas iniciais do resfriado comum
(BLUMENTHAL, 1998; BRASIL, 2014b; EMA, 2008a; WHO, 2003).
Com base em diferentes referências de uso tradicional
(BLUMENTHAL, 1998; BRADLEY, 1992; WHO, 2003), a European
Medicine Agency (EMA) recomenda três tipos de derivado vegetal para uso
terapêutico a partir das flores secas de S. nigra: o chá obtido a partir de 2 a 5
g, 3 a 5 mL do extrato fluido 1:1 e 10 a 25 mL da tintura 1:5 administrados 3
vezes ao dia (EMA, 2008a).
No Brasil, segundo a Instrução Normativa n° 2 de 2014 da ANVISA, há
previsão para o registro simplificado como PTF, que deve ser obtido a partir
das flores da espécie na forma de extrato. Esta norma aprova o seu uso como
mucolítico e no tratamento sintomático de gripes e resfriados (BRASIL,
39
2014b). A dose diária é descrita com base na quantidade de marcadores, que
deve ser entre 80 a 120 mg de flavonoides expressos em isoquercitrina.
O Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira também
considera que a infusão obtida de 3 g das flores secas de S. nigra, utilizando
150 mL de água, três vezes ao dia, pode ser indicada como diaforético
(BRASIL, 2011).
Cavero, Akerreta e Clavo (2011) realizaram estudo etnofarmacológico,
entrevistando 253 indivíduos na região de Navarra, na Península Ibérica.
Dentre os participantes, 86 indivíduos citaram o uso da espécie S. nigra como
sendo de uso tradicional da população da região. Dentre os usos relatados,
destaca-se a melhoria de sintomas respiratórios como congestão nasal e dor
de garganta.
Um estudo foi realizado na região de Kosovo por Mustafa et al. (2015),
no qual o uso das flores de S. nigra, na forma de infuso para tratamento de
sintomas do sistema respiratório como bronquite e tosse, foi citado por mais
de 30% dos entrevistados.
3.2.4 Estudos farmacológicos
Apesar de ser utilizada na terapêutica devido a suas propriedades
farmacológicas relatadas a partir do uso tradicional, existem apenas alguns
estudos farmacológicos publicados para a espécie S. nigra, incluindo as
diversas partes da planta, como as flores, folhas, cascas e frutos.
A atividade anti-inflamatória do extrato das flores, obtido com etanol a
80%, por soxhlet, foi avaliada por Mascolo, Autore e Capasso (1987). Nesse
estudo, verificou-se a atividade anti-inflamatória moderada, na dose de 100
mg/kg no modelo de edema de pata em rato. O extrato inibiu 27% do volume
do edema induzido por carragenina.
Yesilada et al. (1997) avaliaram a atividade anti-inflamatória in vitro de
diferentes extratos obtidos das flores de S. nigra utilizando ELISA.
Observou-se que o extrato metanólico apresentou efeito inibitório na
biossíntese de interleucina-1α (IL-1α) de 44%, de 49% para interleucina-1β
(IL-1β), e de 50% no fator de necrose tumoral (TNF-α). Utilizando extrato
lipofílico houve inibição de 38% na biossíntese do IL-1α, 45% para IL-1β e
31% para o TNF-α.
A capacidade antioxidante das flores e frutos da S. nigra foi demostrada
por Mikulic-Petkovsek et al. (2016). Neste estudo observaram que a infusão
40
das flores contém alto conteúdo de polifenois equivalente ao ácido gálico
(EAG), em média 40137 mg/kg, e consequentemente, maior atividade
antioxidante sobre o radical ABTS (2,2 azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido
sulfônico) que o infuso dos frutos com apenas 6831 mg/kg de polifenóis
EAG.
Viapiana e Wesolowski (2017) observaram que, ao comparar a
atividade antioxidante da infusão obtida de flores e frutos de S. nigra,
utilizando o radical padrão DPPH e redução do íon ferro, as flores
demonstraram maior capacidade antioxidante. O resultado foi atribuído ao
maior teor de fenólicos totais e flavonoides encontrados nessa parte da planta.
Ho, Wangensteen e Barsett (2017) demonstraram que os extratos
etanólicos produzidos das flores e também dos frutos da espécie apresentam
efeito modulador na inflamação devido à forte fixação do complemento e
inibição do óxido nítrico em macrófagos e células dendríticas.
Serkedjieva et al. (1990) demonstraram a atividade antiviral de um
preparado liofilizado obtido pela infusão das flores de S. nigra, partes aéreas
de Hypericum perforatum, e raízes de Saponaria officinalis, misturadas na
proporção 100:70:40. Tal preparação inibiu o crescimento de cepas do vírus
Influenza dos tipos A e B, in vitro e in vivo, e também Herpes simples tipo 1
in vitro.
A atividade diurética do extrato aquoso das flores de S. nigra também
já foi estudada em ratos, para a dose de 50 mg/kg, administrada via
intraperitoneal. Foi observado aumento no volume de urina no período de 2-
24 horas, e também aumento na excreção de sódio após 8 e 24 horas da sua
administração (BEAUX et al., 1999).
A atividade farmacológica relacionada à diabetes também tem sido
investigada, com resultados promissores. O extrato metanólico obtido das
flores de S. nigra apresentou eficácia na prevenção e tratamento de resistência
à insulina em modelo in vitro, utilizando o bioensaio de transativação
mediada por PPARγ e diferenciação de adipócitos. Tal atividade nesse estudo
foi atribuída à presença da flavanona naringenina e dos ácidos graxos
linolênico e linoleico (CHRISTENSEN et al., 2010).
Bhattacharya et al. (2013) também evidenciaram que extratos das flores
obtidos com diclorometano e metanol aumentaram a captação de glicose em
tecido suíno e diminuíram o acúmulo de gordura nesse tecido.
Raafat e El-Lakani (2015) estudaram os efeitos agudos e subcrônicos
do extrato aquoso das flores de S. nigra em ratos com diabetes induzida por
41
aloxana e verificaram a diminuição significativa do nível de glicose
sanguíneo, sendo a dose mais eficaz a de 200 mg/kg.
Além das flores, os frutos da S. nigra, mais do que as folhas, têm sido
estudados, sobretudo no que se relaciona aos efeitos sobre o sistema
imunológico.
Barak, Halperin e Kalickman (2001) estudaram o efeito do extrato
padronizado dos frutos de S. nigra na produção das citocinas inflamatórias
IL-1b, TNF-a, IL-6, IL-8 em monócitos e verificaram que o extrato foi capaz
de aumentar a sua produção, indicando que esse extrato pode ativar o sistema
imunológico. Kinoshita et al. (2012) também evidenciaram atividade sobre o
sistema imune a partir do suco obtido do fruto de S. nigra.
O extrato padronizado do fruto de S. nigra utilizado no produto
Sambucol® demonstrou efeito estimulante do sistema imune pelo aumento da
produção de citocinas (BARAK; HALPERIN; KALICKMAN, 2001) e
inibição do vírus H1N1 in vitro (KRAWITZ et al., 2011; ROSCHEK JR et
al., 2009).
O extrato aquoso da casca de S. nigra mostrou ser eficaz em um modelo
de inibição de retrovírus de imunodeficiência em gatos, um modelo utilizado
para avaliação de possíveis substâncias com atividade anti-HIV (UNCINI
MANGANELLI; ZACCARO; TOMEI, 2005).
A fração contendo polifenois, esteróis e terpenos de frutos de S. nigra e
S. canadensis, na concentração de 10 µg/mL, apresentou potencial
anticarcinogênico, que foi observado através da forte indução de quinona
redutase e inibição da ciclo-oxigenase tipo 2 (THOLE et al., 2006), o que
indica propriedade anti-iniciação e anti-promoção, respectivamente.
A capacidade antioxidante de S. nigra foi também demonstrada no
vinho obtido dos seus frutos, utilizando o radical padrão DPPH
(SCHMITZER et al., 2010).
David et al. (2014) avaliaram a eficácia de nanopartículas de prata
contendo extrato do fruto de S. nigra na inflamação induzida por radiação
UVB em queratinócitos e no modelo de inflamação por indução de edema em
patas de rato por carragenina. As nanopartículas apresentaram efeito anti-
inflamatório in vivo e in vitro, evidenciado pela diminuição na produção de
citocinas e manutenção de baixos níveis das mesmas após exposição à
radiação UVB.
42
As nanopartículas de prata contendo extrato do fruto de S. nigra também
foram estudadas por Moldovan et al. (2016), que comprovaram a capacidade
antioxidante deste material in vivo e in vitro.
Mahmoudi et al. (2014) evidenciaram também atividade antidepressiva
dos extratos metanólicos da folhas e frutos de S. nigra e S. ebulus utilizando
o modelo do nado forçado e suspensão de cauda na dose 1200 mg/kg.
Um estudo clínico confirmou os benefícios do uso do extrato
padronizado dos frutos de S. nigra em resfriados. O extrato reduziu o tempo
do resfriado e também os sintomas em viajantes aéreos (TIRALONGO;
WEE; LEA, 2016). Zalay-Rones et al. (2004) já haviam evidenciado a
eficácia do composto na redução do tempo de duração da gripe causada por
Influenza tipo A e B.
Ciocoiu et al. (2016) verificaram que o tratamento combinado de
inibidores de renina (aliscireno) e extrato etanólico do fruto de S. nigra
reduziu a pressão arterial in vivo em maior nível que o aliscireno isolado. O
tratamento combinado também levou a um efeito antioxidante e
hipolipidemiante que foi benéfico aos animais.
Opris et al. (2017) avaliaram o uso de nanopartículas de ouro contendo
extrato dos frutos de S. nigra em um modelo de diabetes induzida em ratos
por estreptozotocina. As nanopartículas demonstraram potencial uso como
adjuvante no tratamento da diabetes devido a seu efeito antioxidante e
redução da inflamação nos tecidos do fígado.
3.2.5 Controle de qualidade
O controle de qualidade das flores secas de S. nigra está descrito nas
Farmacopeia Brasileira e Europeia. Nesses compêndios os flavonoides são os
marcadores utilizados para controle de qualidade desta droga vegetal.
Segundo a Farmacopeia Brasileira 5ª edição (2010), a droga vegetal
deve apresentar no mínimo 1,5% de flavonoides expressos em quercetina, e
no mínimo 1% de rutina. E ainda, de acordo com a Farmacopeia Europeia 8ª
edição (2014), um mínimo de 0,8% de flavonoides expressos em
isoquercitrina. A utilização da rutina como marcador possibilita estabelecer
uma correlação entre a droga e o derivado vegetal.
Os adulterantes mais comuns das flores secas da espécie são S. ebulus e
S. racemosa, que também ocorrem na Europa e diferem de S. nigra pelas
43
flores mais avermelhadas e formato piramidal das pétalas (ALONSO, 2007;
APPLEQUIST, 2006).
A Farmacopeia Brasileira traz os requisitos de qualidade da espécie S.
australis, que apresenta flores e pétalas maiores e proeminência apical nas
brácteas. O ovário de S. nigra apresenta três lóculos, e o S. australis cinco. A
espécie S. nigra apresenta no mínimo 1,5% de teor de flavonoides em
quercetina e 1,0% de teor de rutina, e a S. australis apresenta no mínimo 2,0%
e 0,8%, respectivamente (BRASIL, 2010; NUNES et al., 2007; SCOPEL et
al., 2007).
3.2.6 Flavonoides
Os flavonoides são um grande grupo de metabólitos encontrados no
reino vegetal. São de forma geral moléculas polifenólicas que contém
substituintes hidroxilados e/ou seus derivados funcionais. Ocorrem
naturalmente na forma de agliconas ou de heterosídeos (GONZALES et al.,
2015; ZUCOLOTTO et al., 2017). Tem grande importância devido a seu
potencial antioxidante, anti-inflamatório, regulador do sistema imune e na
regulação da diabetes (ZUCOLOTTO et al., 2017).
A estrutura química básica dos flavonoides (Figura 5) é composta
geralmente por 15 átomos de carbono, constituída de dois aneis fenila ligados
por uma cadeia de três carbonos entre elas. Nos compostos tricíclicos as
unidades são chamadas de A, B e C (ZUCOLOTTO et al., 2017).
Figura 5. Estrutura básicas dos flavonoides.
Fonte: Gonzales et al. (2015).
O anel B pode estar ligado em C2 ou C3 e os pontos mais comuns de
hidroxilação são 5 e 7 no anel A, 3’, 4’ e 5’ no anel B e 3 e 2 no anel C. Outras
diferenças comuns são a presença de dupla ligação entre C2 e C3 e
44
grupamento cetona em C4. Além disso, os flavonoides costumam ser
divididos de acordo com a variabilidade de suas estruturas químicas
(GONZALES et al., 2015). A quercetina é um composto que faz parte do subgrupo dos flavonois,
que são caracterizados por apresentar uma hidroxila na posição C-3. A rutina
e isoquercitrina são O-heterosídeos deste composto, em que o açúcar está
ligado à aglicona via ligação glicídica na hidroxila. Para esses compostos, o
aquecimento pode levar à hidrólise dos O-heterosídeos. Também pode
ocorrer hidrólise ácida ou alcalina (ZUCOLOTTO et al., 2017).
Outro ponto relevante que deve ser levado em consideração com relação
à estabilidade dos flavonoides é sua capacidade de neutralizar espécies
oxidantes atuando como antioxidantes e de ligar íons metálicos, o que os
tornam compostos susceptíveis a degradação por oxidação (ZUCOLOTTO et
al., 2017).
Wang, Li e Bi (2011) avaliaram a seletividade da hidrólise da rutina nas
ligações β-D-glicosídica, com formação da quercetina, e formação da
isoquercitina nas ligações α-L-ramnosídica. Em meio ácido, à 1% de HCl, foi
constatada uma maior taxa de conversão da rutina em quercetina do que em
isoquercitrina. A isoquercitrina é formada em maior proporção por hidrólise
enzimática utilizando hesperidinase.
Prosen e Pendry (2016) estudaram a estabilidade, por meio de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), da tintura das flores de S.
nigra recém obtida e de uma amostra adquirida comercialmente utilizando os
marcadores rutina, isoquercitrina e quercetina. Na análise inicial do estudo, a
tintura recém preparada apresentou um pico maior para rutina em relação à
quercetina, ao contrário do que ocorreu com a tintura comercialmente
adquirida. Na tintura recém preparada, observou-se que após 200 dias houve
queda de 44,7% da rutina a temperatura ambiente, e 48,6% a temperatura de
40 °C, com aumento da quantidade de isoquercitrina de 128% na temperatura
ambiente e 33,2% a 40 °C. A quercetina apresentou queda em ambas as
tinturas e em ambas as temperaturas de armazenamento durante o estudo.
3.2 Desenvolvimento de derivado vegetal
A espécie vegetal quando utilizada como finalidade terapêutica é
denominada planta medicinal e, após sua colheita/estabilização e
disponibilização na forma íntegra, triturada, rasurada ou pulverizada, é
45
denominada droga vegetal. Segundo a RDC n° 26 de 2014, o derivado vegetal
caracteriza o produto da extração da planta ou droga vegetal (BRASIL,
2014a).
As formas de derivado vegetal comumente utilizadas são os extratos,
que podem ser fluidos, moles, secos ou glicólicos, e os óleos, fixos ou
essenciais. Os derivados podem ser apresentados também na forma de ceras,
exsudatos, tinturas e alcoolaturas (BRASIL, 2014c). Dessa forma os
derivados vegetais compreendem desde preparações processadas de forma
mais simples até extratos refinados ou purificados (EMA, 2010).
Na obtenção do derivado vegetal, a operação de extração é a mais
comumente utilizada. Nessa operação, os constituintes do material vegetal
são removidos com auxílio de líquido solvente, que embebe o material, se
difunde por ele e dissolve os componentes de interesse (BASSANI;
PETROVICK, 2017; LOCKWOOD, 2016). Por esse motivo, a definição do
líquido extrator, tempo, metodologia de extração e grau de cominuição do
material vegetal são determinantes na composição fitoquímica do extrato
obtido.
É fundamental que os derivados vegetais desenvolvidos sejam
submetidos a estudos de estabilidade para avaliação de possíveis degradações
e outras alterações físico-químicas e determinação do prazo de validade. No
Brasil os produtos devem ser testados em condições de estabilidade acelerada
(40 °C/75% UR) e de longa duração (30 °C/75% UR) de acordo com as
condições para zona climática IV (quente e úmida) (BRASIL, 2005).
Porém, um método analítico indicativo de estabilidade deve ser
utilizado nesses estudos. Esse tipo de metodologia mede com precisão e
exatidão os ingredientes ativos, sem interferência dos produtos de
degradação, impurezas do processo, excipientes ou outras impurezas
potenciais, sendo um processo analítico quantitativo validado que pode
detectar as alterações com o tempo das propriedades relevantes da droga
vegetal e do fitoterápico (FDA, 2000).
Segundo o FDA (2000) os procedimentos analíticos empregados em
estudos de estabilidade devem ser indicativos de estabilidade, a menos que
haja uma justificativa aceitável.
Atualmente a Instrução Normativa n° 4 isenta os fitoterápicos da
avaliação quantitativa de produtos de degradação, e o acompanhamento nesse
tipo de produto deve ser via perfil cromatográfico (BRASIL, 2014c). No
entanto, durante a fase de desenvolvimento a utilização de um método
46
indicativo de estabilidade possibilita a verificação das melhores condições de
processamento da droga e derivado vegetal para manutenção de suas
propriedades.
Durante o desenvolvimento do derivado vegetal devem ser avaliadas
suas propriedades relevantes na etapa de pré-formulação do produto
farmacêutico, como sua solubilidade em água, tamanho e formato das
partículas obtidas, caracterização do perfil por análise térmica,
higroscopicidade, densidade e propriedades de fluxo e avaliação da
estabilidade (FIESE; TIMOTHY, 2001; GAISFORD, 2016). As informações
coletadas a partir desses testes servem de parâmetros para direcionar o
desenvolvimento de produtos farmacêuticos, respeitando-se as suas
especificidades, como o estado físico da forma farmacêutica, a sua
estabilidade, a via de administração e as facilidades de uso e armazenamento
(GIBSON, 2009).
3.2.1 Tinturas
As tinturas são um tipo de extrato vegetal caracterizadas por ser uma
solução extrativa alcoólica ou hidroalcoólica obtida da extração da droga
vegetal. Nesse tipo de preparação uma parte da droga vegetal é extraída com
quantidades de solvente equivalente a duas a dez partes, e nesse caso, podem
ser obtidas por maceração ou percolação (BASSANI; PETROVICK, 2017,
BRASIL, 2010; BRASIL, 2011). As tinturas também podem ser produzidas
a partir da diluição de outros extratos (BRASIL, 2014c).
A caracterização das tinturas deve ser feita através das análises físico-
químicas de resíduo seco, pH, densidade relativa, determinação do teor
alcoólico, determinação de metanol e 2-propanol, teor de marcadores,
limpidez de soluções e também através de análise microbiológicas (BRASIL,
2014c).
As tinturas podem ser obtidas por maceração, método no qual a droga
pulverizada permanece em recipiente fechado e em temperatura ambiente
durante um período de horas ou dias. Essa operação pode apresentar
variações, como, por exemplo, o emprego de aquecimento entre 40 e 60 °C,
quando é chamado de digestão e pode ser feito sob agitação constante,
caracterizando a maceração dinâmica. O processo pode ser repetido
utilizando a mesma droga vegetal, caracterizando uma remaceração
(BASSANI; PETROVICK, 2017).
47
A percolação é outro método que pode ser empregado na obtenção das
tinturas. Nessa metodologia o solvente passa através da droga vegetal
previamente macerada, sob velocidade controlada (BRASIL, 2011). A
percolação também pode apresentar variações como repercolação, extração
contracorrente, soxhlet e a percolação fracionada, em que as frações de
percolado são coletadas separadamente. Essas variações geralmente são
empregadas para gerar economia de solvente, já que a quantidade empregada
na percolação simples é bastante elevada (BASSANI; PETROVICK, 2017).
3.2.2 Extrato seco
O extrato seco é a uma preparação obtida pela eliminação da fase líquida
da solução extrativa e que pode conter adjuvantes que possibilitem a obtenção
de um produto sólido (BRASIL, 2010).
O processamento da droga vegetal na forma de extrato seco possui a
vantagem, na maioria das vezes, de fornecer maior estabilidade físico-
química do que outros tipos de extrato. A secagem diminui a atividade de
água em comparação com as formas líquidas e concentra os compostos com
atividade terapêutica (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010; RANKELL;
LIEBERMAN; KANIG, 2001).
As técnicas que podem ser empregadas para obtenção de extratos secos
são geralmente baseadas em eliminação da fase líquida, que pode ser feita
pelo emprego de calor, como na secagem por aspersão ou spray drying, ou
por emprego de pressão reduzida como na liofilização (BASSANI;
PETROVICK, 2017; SOARES; SOUZA, 2011).
A caracterização dos extratos secos de origem vegetal deve ser realizada
através de análises físico-químicas como granulometria, determinação de
água, densidade aparente, teor de marcadores e solubilidade, e de análise
microbiológicas, com contagem total de bactérias aeróbias, fungos e
leveduras, presença de Salmonella sp e Escherichia coli (BRASIL, 2014c).
3.2.2.1 Secagem por aspersão ou atomização
Uma das técnicas mais empregadas na obtenção de extratos secos é a
secagem por atomização ou spray drying, na qual o fluido é disperso em
gotículas finas, cuja fase líquida evapora em uma corrente de ar quente antes
48
de atingir as paredes do equipamento, e o produto seco é separado em um
ciclone e depositado no coletor (RANKELL et al., 2001).
Os parâmetros do processo como temperatura do ar de entrada e de saída
e a pressão de atomização podem influenciar nas características dos pós ou
grânulos obtidos (JAIN MANU et al., 2012).
A secagem pela aspersão em gotículas é bastante eficiente e vantajosa
ao promover a rápida evaporação, pois a transferência de calor ocorre a partir
uma elevada área superficial e pode ser realizada de forma contínua na escala
industrial. Esta rápida evaporação impede que as gotículas atinjam
temperaturas muito elevadas, minimizando a degradação térmica. Além
disso, apresenta como vantagem a formação de partículas ocas e esféricas
(Figura 6), com tamanho relativamente uniforme e boa compactação
(AULTON, 2016; OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
Figura 6. Formação de micropartículas na secagem por aspersão.
Fonte: AULTON (2016).
Os secadores por atomização ou aspersão são estruturados conforme
disposto na Figura 7. O ar aquecido entra em contato com as gotículas na
câmara de secagem, promovendo a formação das partículas sólidas que são
aspiradas até o ciclone, onde são separadas pelo tamanho e direcionadas para
o coletor. O tamanho das partículas formadas está diretamente relacionado ao
tamanho das gotículas atomizadas. Na Figura está evidenciado, à esquerda, o
equipamento em escala laboratorial que apresenta bico de atomização em
jato, onde pode haver deposição de material prejudicando a uniformidade do
49
tamanho das partículas. À direita está demonstrado o atomizador do tipo
disco giratório, mais comum na escala industrial, e que foi projetado para
melhorar a uniformidade de tamanho das partículas formadas (AULTON,
2016).
Figura 7. Esquema dos secadores por aspersão (spray drying).
(1) aquecimento do ar de entrada (2) formação das gotículas (3) câmara de secagem
(4) ciclone – coleta das partículas (5) Filtro de saída (6) aspiração do ar ou gás e à
direita detalhe da câmara de secagem.
Fonte: BUCHI®; AULTON (2016).
Na literatura técnico-científica encontram-se vários estudos de
desenvolvimento de extratos secos vegetais por spray drying demonstrando
que a técnica é amplamente estudada e aplicada para este fim.
Cortés-Rojas, Souza e Oliveira (2015) estudaram o impacto do uso de
diferentes tipos e concentração de excipientes, temperatura de secagem e
fluxo de alimentação na obtenção do extrato seco das partes aéreas de Bidens
pilosa L. Foi demonstrado que altas temperaturas podem reduzir a atividade
antioxidante do extrato e que o dióxido de silício coloidal aumenta o
rendimento do produto obtido, o que ressalta a necessidade de um adequado
desenvolvimento dos parâmetros de secagem.
Sharifi et al. (2015) desenvolveram um extrato seco dos frutos de
Berberis vulgaris e observaram que a combinação de maltodextrina e goma
arábica, na proporção 1:1, otimizou o teor de marcadores e o rendimento do
extrato, e que a temperatura de 180 °C reduziu o teor de marcadores a um
nível inferior ao que verificado na temperatura de 160 °C.
50
O extrato seco da casca do caule de Rapanea ferruginea Mez foi
desenvolvido por Baccarin et al. (2016), avaliando-se o emprego de
diferentes concentrações e tipos de excipientes e variando-se a temperatura,
fluxo de alimentação e diferentes porcentagens de sólidos no líquido de
aspersão durante a secagem do extrato. Por meio das condições estudadas foi
possível determinar que as melhores condições de secagem para este material
foram 5% de sólidos no líquido para aspersão, 30% de dióxido de silício
coloidal no extrato seco final, fluxo de alimentação de 4 mL/minuto e
temperatura de secagem de 170 °C.
O emprego da secagem por spray drying na obtenção de extratos
contendo substâncias polifenólicas como os flavonoides é amplamente
descrito em literatura e pode conferir melhoria em sua solubilidade e
biodisponibilidade, além de reduzir sua sensibilidade às condições
ambientais como luz, temperatura, umidade e oxigênio (OUTUKI et al.,
2016; ZOKTI et al., 2016).
Outuki et al. (2016) testaram a secagem por spray drying e avaliaram o
teor dos flavonoides rutina e hiperosídeo presentes no extrato das folhas de
Eschweilera nana. Os autores observaram que houve aumento na estabilidade
térmica, controle na liberação da rutina e presença de atividade antioxidante
nas micropartículas produzidas utilizando como excipiente uma mistura de
goma arábica e goma xantana.
Foram produzidas micropartículas do extrato de Vitis vinifera contendo
polifenois utilizando-se maltodextrina e goma arábica com encapsulantes, o
que conferiu maior estabilidade a esses compostos (TOLUN et al., 2016).
Kuck e Caciano (2016) conseguiram obter micropartículas do extrato de
Vitis labrusca contendo alto conteúdo de polifenois utilizando como agente
encapsulante goma guar e polidextrose, que mantiveram sua atividade
antioxidante.
Ibrahim Silva et al. (2013) obtiveram extratos por spray drying de
Myrciaria jaboticaba, utilizando maltodextrina como agente encapsulante, o
que, além, de conferir um formato esférico às micropartículas, possibilitou a
obtenção de um pó com boa preservação da coloração característica da
espécie e demonstrou estabilização dos pigmentos presentes no extrato.
As antocianinas foram avaliadas no extrato seco da espécie Hibiscus
sabdariffa obtido por aspersão utilizando maltodextrina, goma arábica e
amido, e foi observado aumento da estabilidade destas substâncias quando
51
armazenadas a 37 °C com todos os agentes encapsulantes testados (IDHAM
et al., 2012).
3.2.2.2 Excipientes de secagem
É comum na secagem por aspersão o emprego de excipientes como
adjuvantes para melhoria das características tecnológicas do produto,
estabilidade e rendimento do produto obtido. Dentre os excipientes
comumente utilizados podem ser citados amido, ciclodextrinas, dióxido de
silício coloidal, fosfato tricálcico, gelatina, goma arábica, lactose e
maltodextrina, entre outros (OLIVEIRA; PETROVICK, 2010).
A maltodextrina é muito utilizada como adjuvante de secagem devido a
sua propriedade formadora de filme, redução de permeabilidade do oxigênio
na matriz formada e baixo custo (MEDINA-TORRES et al., 2016;
SANSONE et al., 2015). É livremente solúvel em meio aquoso (ROWE et
al., 2009), o que é desejável em produtos formulados para reconstituição em
água.
A maltodextrina é um sacarídeo formado por unidades de D-glucose
através de ligação α -1, 4 e em alguns segmentos α-1, 6 (Figura 8). É
preparada pela hidrólise parcial ácido ou enzimática do amido. Tem aspecto
de pó ou grânulos brancos, sem dulçor. A concentração de uso como veículo
é de 10-99% (ROWE et al., 2009), o que implica em uma adequada
determinação da concentração a ser empregada em cada formulação.
Figura 8. Fórmula estrutural da maltodextrina.
Fonte: Rowe et al. (2009)
52
A maltodextrina é bastante utilizada como adjuvante na secagem por
spray drying devido à sua alta temperatura de transição vítrea, que geralmente
fica entre 140 e 180°C. A maltodextrina DE (dextrose equivalente) 10 é uma
das mais estáveis e apresenta menor higroscopicidade que as variações com
maior DE (NURHADI; ROOS; MAIDANNYK, 2015; ROWE, 2009).
O uso da maltodextrina como excipiente na obtenção de extratos secos
vegetais a partir de espécies que contém substâncias polifenólicas foi
pesquisado por alguns autores como Krishnaiah, Sarbatly e Nithyanandam
(2012), que obtiverem um extrato seco dos frutos de Morinda citrifolia L. na
forma de micropartículas regulares e esféricas. A aplicação da maltodextrina
como adjuvante foi superior à da carragenina ao se avaliar a atividade
antioxidante, rendimento, distribuição de tamanho de partículas, umidade e
teor de flavonoides.
Robert et al. (2010) avaliaram o processo de secagem por aspersão em
extratos da espécie Punica granatum. Nesse estudo foram comparados
extratos obtidos com maltodextrina e proteína isolada de soja, e verificaram
que, embora as micropartículas produzidas com maltodextrina tenham
apresentado menor eficiência de microencapsulação de polifenois do que a
proteína de soja, elas foram mais estáveis durante o armazenamento,
resultado que foi demonstrado pela baixa constante de degradação nessas
preparações.
113
6 CONCLUSÕES
A droga vegetal seguiu os critérios farmacopeicos e apresentou-se
dentro dos parâmetros de qualidade descritos na Farmacopeia Brasileira e
outras publicações que se referem ao controle de qualidade das flores secas
de S. nigra.
Sendo a tintura um derivado vegetal aprovado na Europa e Brasil com
base no uso tradicional, foi desenvolvido uma metodologia para sua extração
e obtenção utilizando-se a avaliação do teor de flavonoides calculados como
rutina e a sua eficiência extrativa.
O método que apresentou melhor resultado foi a percolação associada a
recursos como a repercolação e o aquecimento para melhoria da eficiência
extrativa. Com emprego desse processo foi atingido 61,9% de eficiência
extrativa na escala laboratorial e 70% na escala piloto. Além disso, o processo
desenvolvido apresentou reprodutibilidade na escala piloto, o que o torna
promissor para aplicação na escala industrial.
Um extrato seco foi desenvolvido e otimizado a partir da tintura e,
utilizando-se desenho experimental estatístico, observou-se que a melhor
condição para secagem é a utilização de temperatura de secagem de 188 °C e
64% de maltodextrina como adjuvante de secagem.
O extrato seco desenvolvido apresentou recuperação do teor de
flavonoides superior a 90% na secagem, boas características de fluxo e
solubilidade em água, fatores que são relevantes na obtenção de formas
farmacêuticas sólidas e líquidas.
Na avaliação da estabilidade por 60 dias, a tintura de S. nigra apresentou
um teor remanescente de 80,31 e 84,25% em condições de estudo acelerado
e a temperatura ambiente, respectivamente. O extrato seco apresentou
alteração física nas condições de estudo acelerado e apresentou 95,70% do
teor inicial após armazenamento por 60 dias em prateleira.
A atividade anti-inflamatória foi avaliada na tintura liofilizada e foi
verificada redução significativa na contagem total de leucócitos no modelo
de bolsa de ar na dose de 600 mg/kg, o que tornou possível estabelecer uma
correlação com a dose indicada para uso terapêutico segundo o conhecimento
tradicional.
114
115
REFERÊNCIAS
ALVES, L.F. Produção de fitoterápicos no Brasil: história, problemas e
perspectivas. Revista Virtual de Química, v.5, p.450-513, 2013.
ALONSO, J. Tratado de fitofármacos y nutracéuticos. 1ª reimpressão.
Rosario: Corpus editorial y distribuidora, 2007.
APPLEQUIST, W. The identification of medicinal plants: handbook of
the morphology of botanicals in commerce. Missouri: Missouri Botanical
Garden Press, 2006.
APPLEQUIST, W. A brief review of recent controversies in the taxonomy
and nomenclature of Sambucus nigra sensu lato. Acta Horticulturae, v.
1061, p.25-33, 2015.
ATKINSON, M.; ATKINSON, E. Biological flora of the British Isles:
Sambucus nigra L. Journal of Ecology, v.90, p. 895-923, 2002.
BACCARIN, T.; DEBRASSI, A.; DE SOUZA, M. M.; YUNES, R. A.;
MALHEIROS, A.; SILVA, R. M. L. Influence of process conditions on
physicochemical properties and antinociceptive activity in vivo of spray-
dried Rapanea ferruginea Mez. stem bark extract. Powder Technology,
v.291, p.66-74, 2016.
BACCARIN, T. Desenvolvimento e padronização de extrato seco de
Rapanea ferruginea Mez. (Mirsinaceae) obtido por spray drying e avaliação
in vivo da atividade antinociceptiva. 2010. 145f. Dissertação (Mestrado) –
Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Universidade do
Vale do Itajaí, Itajaí, 2010.
BADENES, M.; BYRNE, D. Elderberry. Fruit Breeding. Nova Iorque:
Springer, 2012.
BARAK, V.; HALPERIN, T.; KALICKMAN, I. The effect of Sambucol, a
black elderberry-based, natural product, on the production of human
cytokines: I. Inflammatory cytokines. European Cytokyne Network, v. 12,
n. 2, 2001.
BARREIRO, E. J.; BOLZANI, V. S. Biodiversidade: fonte potencial para a
descoberta de fármacos. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 679-688, 2009.
116
BASSANI, V.L.; PETROVICK, P.R. Desenvolvimento tecnológico de
produtos farmacêuticos a partir de produtos naturais. In: SIMÕES, C.M.O.;
SCHENKEL, E.P.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.; PETROVICK, P.R.
Farmacognosia: do produto natural ao medicamento. Porto Alegre:
Artmed, 2017.
BEAUX, D.; FLEURENTIN, J.; MORTIER, F. Effect of extracts of
Orthosiphon stamineus Benth, Hieracium pilosella L., Sambucus nigra L.
and Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. in rats. Phytotherapy Research,
v. 13, p.222-225, 1999.
BHATTACHARYA, S.; CHRISTENSEN, K. B.; OLSEN, L. C.B.;
CHRISTENSEN, L. P.; GREVSEN, K.; FAERGEMAN, N. J.;
KRISTIANSEN, K.; YOUNG, J. F.; OKSBJERG, N. Bioactive components
from flowers of Sambucus nigra L. increase glucose uptake in primary
porcine myotube cultures and reduce fat accumulation in Caenorhabditis
elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 61, p. 11033-
11040, 2013.
BLUMENTHAL, M.; WERNER, R. B.; GOLDBERG, A.; GRUENWALD,
J.; HALL, T.; RIGGINS, C.W.; SISTER, R.S. The complete German
Comission E monographs: therapeutic guide for herbal medicine. 1ª edição
Austin: American Botanical Council, 1998.
BRASIL. ANVISA. Resolução RE n°1 de 29 de julho de 2005. Guia para
realização de estudos de estabilidade. D.O.U., 01 de agosto de 2005.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Práticas Integrativas e
Complementares: Plantas Medicinais e Fitoterapia na Atenção Básica,
2012.
BRASIL. ANVISA. RDC n°26 de 13 de maio de 2014. Dispõe sobre o
registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos
tradicionais fitoterápicos. D.O.U., 14 de maio de 2014a.
BRASIL. ANVISA. Instrução Normativa n°2 de 13 de maio de 2014. Publica
a lista de medicamentos fitoterápicos de registro simplificado e lista de
produtos tradicionais fitoterápicos de registro simplificado. D.O.U., 14 de
maio de 2014b.
BRASIL. ANVISA. Instrução Normativa n°4 de 18 de junho de 2014. Guia
de orientação para registro de medicamento fitoterápico e registro e
117
notificação de produto tradicional fitoterápico. D.O.U., 20 de junho de
2014c.
BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Política e Programa Nacional de
Plantas Medicinais e Fitoterápicos, 2016.
BRASIL. ANVISA. RDC n°166 de 24 de julho de 2017. Dispõe sobre a
validação de métodos analíticos e dá outras providências. D.O.U, 25 de
julho de 2017.
BUCHI® Switzerland. Mini Spray Dryer B-290: technical data sheet.
Disponível em:https://www.buchi.com/sites/default/files/downloads/B-
290_Data_Sheet_en_D.pdf?83b925aae302a8e76f002d1ce679fa06904d1039
. Acesso em 12 de novembro de 2017
BUCKALLEW, R. USDA (United States Department of Agriculture:
Natural Resources Conservation Service. PLANTS Database. Disponível
em: <http://plants.usda.gov>. Greensboro. Acesso em 22 de outubro de
2017.
CARVALHO, A. C. B.; RAMALHO, L. S.; MARQUES, R.F.O.;
PERFEITO, J. P. Regulation of herbal medicines in Brazil. Journal of
Ethnopharmacology, v. 158, p. 503-506, 2014.
CARVALHO, A. C. B.; LANA, T. N.; PERFEITO, J. P. S. SILVEIRA, D.
The Brazilian market of herbal medicinal products and the impacts of the
new legislation on traditional medicines. Journal of Ethnopharmacology,
v. 212, p. 29-35, 2018.
CAVERO, R.Y.; AKERRETA, S.; CALVO, M.I. Pharmaceutical
ethnobotany in Northern Navarra (Iberian Peninsula). Journal of
Ethnopharmacology, v. 133, p. 138-146, 2011.
CHRISTENSEN, K. B.; PETERSEN, R. K.; KRISTIANSEN, K.;
CHRISTENSEN, L. P. Identification of bioactive compounds from flowers
of black elder (Sambucus nigra L .) that activate the human peroxisome
proliferator- activated receptor (PPAR) γ. Phytotherapy Research, v. 132,
p. 129-132, 2010.
CIOCOIU, M.; BADESCUA, M.; BADULESCUA, O.; BADESCU, L. The
beneficial effects on blood pressure, dyslipidemia and oxidative stress of
Sambucus nigra extract associated with renin inhibitors. Pharmaceutical
Biology, v. 54, p. 3063-3067, 2016.
118
CORTÉS-ROJAS, D.F.; SOUZA, C.R.F,; OLIVEIRA, W.P. Optimization
of spray drying conditions for production of Bidens pilosa L. dried extract.
Chemical Engineering Research and Design, v. 93, p. 366-376, 2015.
DAVID, L.; MOLDOVAN, B.; VULCU, A.; OLENIC, L.; PERDE-
SCHREPLER, M.; FISCHER-FODOR, E.; FLOREA, A.; CRISAN, M.;
CHIOREAN, I.; CLICHICI, S.; FILIP, G. A. Green synthesis,
characterization and anti-inflammatory activity of silver nanoparticles using
European black elderberry fruits extract. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, v. 122, p. 767-777, 2014.
DAVÍDEK, J. Isolation of chromatographically pure rutin from flowers of
Elder. Nature, v. 189, n. 4763, p. 487-488, 1961.
DERMARDEROSIAN, A.; BEUTLER, J.A. The review of natural
products. the most complete source of natural products information. 7 ed. St.
Louis: Fact and Comparisons, 2012.
EMA. European Medicine Agency. Committee on herbal medicinal
products (HMPC). Community herbal monograph on Sambucus nigra L.
Flos, 2008a. Disponível em: http://www.ema.europa.eu/docs/en
GB/document library /Herbal community herbal
monograph/2009/12/WC500018233. Acesso em 31 de janeiro 2016.
EMA. European Medicine Agency. Committee on herbal medicinal
products (HMPC). Assessment report for the development of community
monographs and for inclusion of herbal substance (s) preparation or
combinations thereof in the list: Sambucus nigra L., flos. 2008b
Disponível em: http://www.ema.europa.eu/docs/en GB/document library
/Herbal community herbal monograph/2009/12/WC500018233. Acesso em
31 de janeiro 2016.
EMA. European Medicine Agency. Committee on herbal medicinal
products (HMPC). Guideline on declaration of herbal substances and
herbal preparations in herbal medicinal products /traditional herbal
medicinal products, 2010. Disponível em:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guidel
ine/2009/09/WC500003272.pdf. Acesso em 11 de novembro de 2017.
EUROPEAN PHARMACOPOEIA. European Directorate for the Quality
of Medicine & Healthcare. Council of Europe. 8th ed. Strasbourg, 2014.
119
Farmacopeia Brasileira. ANVISA. 5 ed. Brasília, 2010.
FDA. Guidance for Industry: Analytical Procedures and Methods
Validation: Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation, Draft
Guidance, Food and Drug Administration. Disponível
em:<http://www.fda.gov/downloads/Drugs/…/Guidances/ucm122858.pdf〉2000.
FIESE, E. F; TIMOTHY, H. A. In: LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H. A.;
KANIG, J. L. Teoria e Prática na Indústria Farmacêutica. Lisboa:
Fundação Calouste Gulbenkian, v. 1, 2001.
GABBAY ALVES, T. V.; SILVA DA COSTA, R.; ALIAKBARIAN, B.;
CASAZZA, A. A.; PEREGO, P.; CARRÉRA SILVA, J. O.; RIBEIRO
COSTA, R. M.; CONVERTI, A. Microencapsulation of Theobroma cacao
L. waste extract: optimization using response surface methodology. Journal
of Microencapsulation, v. 2048, p. 1-34, 2017.
GAISFORD, S. Pré-formulação farmacêutica. In: AULTON, M.E.;
TAYLOR, K.M.G. Delineamento de Formas Farmacêuticas. Tradução de
Francisco S. Menezes. 4 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2016.
GIBSON, M. Early drug development: product design. In: GIBSON, M.
Pharmaceutical Preformulation and Formulation. 2 ed. Nova Iorque:
Informa Healthcare, 2009.
GARCIA, A. A.; VANACLOCHA, B.; SALAZAR, J.I.G.; COBO, R.M.
Fitoterapia: Vademecum de prescription. 3ª edição. Barcelona: editora
Masson S.A, 1999.
GONZALES, G. B.; SMAGGHE, G.; GROOTAERT, C.; ZOTTI, M.; RAES
K.; VAN CAMP, J. Flavonoid interactions during digestion, absorption,
distribution and metabolism: a sequential structure–activity/property
relationship-based approach in the study of bioavailability and bioactivity.
Drug Metabolism Review, v. 47, p.175-190, 2015.
HO, G. T. T.; WANGENSTEEN, H.; BARSETT, H. Elderberry and
elderflower extracts, phenolic compounds, and metabolites and their effect
on complement, RAW 264.7 macrophages and dendritic cells.
International Journal of Molecular Sciences, v. 18, p. 1-17, 2017.
120
HOWARD, R. USDA (United States Department of Agriculture: Natural
Resources Conservation Service. PLANTS Database. Disponível em:
<http://plants.usda.gov>. Greensboro. Acesso em 22 de out.2017.
IBRAHIM SILVA, P.; STRINGHETA, P. C.; TEOF́ILO, R. F.; DE
OLIVEIRA, I. R. N. Parameter optimization for spray-drying
microencapsulation of jaboticaba (Myrciaria jaboticaba) peel extracts using
simultaneous analysis of responses. Journal of Food Engineering, v. 117,
p. 538-544, 2013.
IDHAM, Z.; MUHAMAD, I. I.; SARMIDI, M. R. Degradation kinetics and
color stability of spray-dried encapsulated anthocyanins from Hibiscus
sabdariffa L. Journal of Food Process Engineering, v. 35, p. 522-542,
2012.
INTERNATIONAL CONFERENCE ON THE HARMONIZATION OF
TECHNICAL REQUIREMENTS FOR REGISTRATION OF
PHARMACEUTICAL FOR HUMAN USE. ICH Quality Guideline:
Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1).
Genebra, 2005.
JAIN MANU, S.; LOHARE G. B.; BARI M. M.; CHAVAN R. B.;
BARHATE S. D.; SHAH C. B. Spray drying in pharmaceutical industry: a
review. Research Journal of Pharmaceutical Dosage Forms and
Technology, v. 4, p. 74-19, 2012.
KINOSHITA, E.; HAYASHI, K.; KATAYAMA, H.; HAYASHI, T.;
OBATA, A. Anti-Influenza virus effects of elderberry juice and its
fractions. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, v. 76, p. 1633-
1638, 2012.
KRAWITZ, C.; MRAHEIL, M. A.; STEIN, M.; IMIRZALIOGLU, C.;
DOMANN, E.; PLESCHKA, S.; HAIN, T. Inhibitory activity of a
standardized elderberry liquid extract against clinically-relevant human
respiratory bacterial pathogens and influenza A and B viroses. BMC
Complementary & Alternative Medicine, v. 11, p. 11-16, 2011.
KRISHNAIAH, D.; SARBATLY, R.; NITHYANANDAM, R.
Microencapsulation of Morinda citrifolia L. extract by spray-drying.
Chemical Engineering Research and Design, v. 90, p. 622-632, 2012.
121
KUCK, L. S. N.; CACIANO P. Z. Microencapsulation of grape (Vitis
labrusca var. Bordo) skin phenolic extract using gum arabic, polydextrose,
and partially hydrolyzed guar gum as encapsulating agents. Food
Chemistry, v. 194, p. 569-576, 2016.
LAPONI, J. C. Estatística usando Excel. 4 ed. Rio de Janeiro: Elsevier,
2013.
LOCKWOOD, G.B. A formulação e a fabricação de fitomedicamentos. In:
AULTON, M.E.; TAYLOR, K.M.G. Delineamento de Formas
Farmacêuticas. Tradução de Francisco S. Menezes.4 ed. Rio de Janeiro:
Elsevier, 2016.
MASCOLO, N.; AUTORE, G.; CAPASSO, F. Biological screening of
Italian medicinal plants for anti-inflammatory activity. Phytotherapy
Research, v. 1, p. 28-31, 1987.
MAHMOUDI, M.; EBRAHIMZADEH, M. A.; DOOSHAN, A. ARIMI, A.;
GHASEMI, N.; FATHIAZAD, F. Antidepressant activities of Sambucus
ebulus and Sambucus nigra. European Review for Medical and
Pharmacological Sciences, v. 18, p. 3350-3353, 2014.
MEDINA-TORRES, L.; SANTIAGO-ADAME R.; CALDERAS, F.;
GALLEGOS-INFANTE, J.A.; GONZÁLEZ-LAREDO, R.F.; ROCHA
GUZMÁN, N.E.; NUNEZ-RAMÍREZ, D.N.; BERNARD-BERNARD,
M.J.; MANERO, O. Microencapsulation by spray drying of laurel infusions
(Litsea glaucescens) with maltodextrin. Industrial Crops and Products, v.
90, p.1-8, 2016.
MIKULIC-PETKOVSEK, M.; IVANCIC, A.; SCHMITZER, V.;
VEBERIC, R.; STAMPAR, F. Comparison of major taste compounds and
antioxidative properties of fruits and flowers of different Sambucus species
and interspecific hybrids. Food Chemistry, v. 200, p. 134-140, 2016.
MISSOURI BOTANICAL GARDEN. Tropicos®. Missouri, 2017.
Disponível em: < http://tropicos.org >. Acesso em 22 de out.2017.
MOLDOVAN, B.; ACHIM, M.; CLICHICI, S.; FILIP, A. G. A green
approach to phytomediated synthesis of silver nanoparticles using
Sambucus nigra L . fruits extract and their antioxidant activity. Journal of
Molecular Liquids, v. 221, p. 271-278, 2016.
122
MONTGOMERY, D. C. Diseño y analisis de experimentos. Arizona State
University. Tradução de Rodolfo Pina Garcia. 2 ed. Baldera: Editorial
Limusa, 2004.
MUSTAFA, B.; HAJDARI, A.; PIERONI, A.; PULAJ, B.; KORO, X.;
QUAVE, C.L. A cross-cultural comparison of folk plant uses among
Albanians, Bosniaks, Gorani and Turks living in south Kosovo. Journal of
Ethnobiology and Ethnomedicine, v. 11, p. 39, 2015.
NUNES, E.; SCOPEL, M.; VIGNOLI-SILVA, M.; VENDRUSCOLO, G.
S.; HENRIQUES, A. T.; MENTZ, L.A. Caracterização farmacobotânica das
espécies de Sambucus (Caprifoliaceae) utilizadas como medicinais no
Brasil. Parte II. Sambucus australis Cham. & Schltdl. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 17, p. 414-425, 2007.
NURHADI, B.; ROOS, Y.; MAIDANNYK, V. Physical properties of
maltodextrin DE 10: water sorption, water plasticization and enthalpy
relaxation. Journal of Food Engineering, v. 174, p.68-74, 2016.
OLIVEIRA, O. W.; PETROVICK, P. R. Secagem por aspersão (spray
drying) de extratos vegetais: bases e aplicações. Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 20, n. 4, p. 641-650, 2010.
OLIVEIRA, D. R.; OLIVEIRA, A. C. D.; MARQUES, L. C. O estado
regulatório dos fitoterápicos no Brasil: Um paralelo entre a legislação e o
mercado farmacêutico (1995–2015). Vigilância Sanitária em Debate, v. 4,
p. 139-148, 2016.
OPRIS, R.; TATOMIR, C.; OLTEANU, D.; MOLDOVAN, R.;
MOLDOVAN, B.; DAVID, L.; NAGY, A.; DECEA, N.; KISS, M. L.;
FILIP, G. A. The effect of Sambucus nigra L. extract and phytosinthesized
gold nanoparticles on diabetic rats. Colloids and Surfaces B:
Biointerfaces, v. 150, p. 192-200, 2017.
OUTUKI, P. M.; DE FRANCISCO, L. M. B.; HOSCHEID, J.;
BONIFÁCIO, K. L.; BARBOSA, D. S.; CARDOSO, M. L. C.
Development of arabic and xanthan gum microparticles loaded with an
extract of Eschweilera nana Miers leaves with antioxidant capacity.
Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, v.
499, p. 103-112, 2016.
123
PROSEN, H.; PENDRY. B. Determination of shelf life of Chelidonium
majus, Sambucus nigra, Thymus vulgaris and Thymus serpyllum herbal
tinctures by various stability-indicating tests. Phytochemistry Letters, v.
16, p. 311-323, 2016.
Pubchem. Disponível em: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Acesso em 25
de fevereiro 2018.
RAAFAT, K.; EL-LAKANY, A. Acute and subchronic in-vivo effects of
Ferula hermonis L. and Sambucus nigra L. and their potential active
isolates in a diabetic mouse model of neuropathic pain. BMC
Complementary and Alternative Medicine, v. 15, p. 2-14, 2015.
RANKELL, A. S.; LIEBERMAN, H. A.; SCHIFFMAN R.F. Secagem. In:
LACHMAN, L.; LIEBERMAN, H. A.; KANIG, J. L. Teoria e Prática na
Indústria Farmacêutica. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, v. 1,
2001.
RIEGER, G.; MÜLLER, M.; GUTTENBERGER, H.; BUCAR, F. Influence
of altitudinal variation on the content of phenolic compounds in wild
populations of Calluna vulgaris, Sambucus nigra, and Vaccinium myrtillus.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 56, p. 9080-9086, 2008.
ROBERT, P.; GORENA, T.; ROMERO, N.; SEPULVEDA, E.; CHAVEZ,
J.; SAENZ, C. Encapsulation of polyphenols and anthocyanins from
pomegranate (Punica granatum) by spray drying. International Journal of
Food Science and Technology, v. 45, p. 1386-1394, 2010.
ROSCHEK JR, B.; FINK, R. C.; MCMICHAEL, M. D; LI, D.; ALBERTE,
R. S.Elderberry flavonoids bind to and prevent H1N1 infection in vitro.
Phytochemistry, v. 70, p. 290-296, 2009.
ROWE, R.C.; SHESKEY, P.J.; QUINN, M.E. Handbook of
Pharmaceutical Excipients. 6 ed. Washington: Pharmaceutical Press,
2009.
SANSONE, F.; PICERNO, P.; MENCHERINI, T.; VILECCO, F.; D’URSI,
A.M.; AQUINO, R.P.; LAURO, M.R. Flavonoid microparticles by spray-
drying: influence of enhancers of the dissolution rate on properties and
stability. Journal of Food Engineering, v. 103, p.188-196, 2011.
124
SCHMITZER, V.; VEBERIC, R.; SLATNAR, A.; STAMPAR, F.
Elderberry (Sambucus nigra L.) wine: A product rich in health promoting
compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 58, p.
10143-10146, 2010.
SCOPEL M. Análise botânica, química e biológica comparativa entre
flores das espécies Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. &
Schltdl. e avaliação preliminar da estabilidade. 2005. 227f. Dissertação
(Mestrado) – Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2005.
SCOPEL, M. et al. Caracterização farmacobotânica das espécies de
Sambucus (Caprifoliaceae) utilizadas como medicinais no Brasil. Parte I.
Sambucus nigra L. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 17 p.414-425,
2007.
SENICA, M.; STAMPAR, F.; VEBERIC, R.; MIKULIC-PETKOVSEK,
M. The higher the better? Differences in phenolics and cyanogenic
glycosides in Sambucus nigra leaves, flowers and berries from different
altitudes. Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 97, p. 2623-
2632, 2017.
SERKEDJIEVA, J.; MANOLOVA, N.; ZGÓRNIAK NOWOSIELSKA, I.;
ZAWILINSKA, B.; GRZYBEK, J. Antiviral activity of the infusion (SHS-
174) from flowers of Sambucus nigra L., aerial parts of Hypericum
perforatum L., and roots of Saponaria oficinalis L. against influenza and
herpes simplex viroses. Phytotherapy Research, v. 4, p. 97-100, 1990.
SHARIFI, A.; NIAKOUSARI, M.; MASKOOKI, A.; MORTAZAVI, S.
A.Effect of spray drying conditions on the physicochemical properties of
barberry (Berberis vulgaris) extract powder. International Food Research
Journal, v. 22, p.2364-2370, 2015.
SOARES, L. A. L.; SOUZA, T. P. Extrato seco vegetal e produtos derivados.
In: SOUZA, G. H. B; MELLO, J.C. P. LOPES, N. P. Farmacognosia:
Coletânea Científica. Ouro Preto: UFOP, 2011.
SONAGLIO, D.; ORTEGA, G.G.; PETROVICK, P.R; BASSANI, V.L.
Desenvolvimento tecnológico e produção de fitoterápicos. In: SIMÕES,
C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ,
L.A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento.
Porto Alegre/Florianopolis: Editora da UFRGS/Editora da UFSC, 2003.
125
TESTONI, L.D.; BOLDIERI, A.S.; COUTO, A.G.; BRESOLIN, T.M.B.
Validação de método por CLAE para quantificação simultânea de
rutina, isoquercitrina e quercetina na tintura de Sambucus nigra,
Adoxaceae. I SIMPÓSIO INTERNACIONAL EM INVESTIGAÇÕES
QUÍMICO-FARMACÊUTICAS, Universidade do Vale do Itajaí, 11-12 de
dezembro de 2017.
THE MERCK INDEX: an encyclopedia of chemicals, drugs, and
biologicals. 15 ed. New Jersey: Royal Society of Chemistry, 2013.
THOLE, J. M.; KRAFT, T. F. B.; SUEIRO, L. A.; KANG, Y.; GILLS, J. J.;
CUENDET, M.; PEZZUTO, J. M.; SEIGLER, D. S.; LILA, M. A. A
comparative evaluation of the anticancer properties of European and
American elderberry fruits. Journal of Medicinal Food, v. 9, p. 498-504,
2006.
TIRALONGO, E.; WEE, S. S.; LEA, R. A. Elderberry supplementation
reduces cold duration and symptoms in air-travellers: A randomized,
double-blind placebo-controlled clinical trial. Nutrients, v. 8, p. 1-15, 2016.
TOLUN, A.; ALTINTAS, Z.; ARTIK, N. Microencapsulation of grape
polyphenols using maltodextrin and gum arabic as two alternative coating
materials: development and characterization. Journal of Biotechnology, v.
239, p. 23-33, 2016.
TOULEMONDE, B.; RICHARD, H. M. J. Volatile constituents of dry
Elder (Sambucus nigra) flowers. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v. 31, p. 365-370, 1983.
UNCINI MANGANELLI, R. E.; ZACCARO, L.; TOMEI, P. E. Antiviral
activity in vitro of Urtica dioica L., Parietaria diffusa M. et K. and
Sambucus nigra L. Journal of Ethnopharmacology, v. 98, p. 323-327,
2005.
VIAPIANA, A.; WESOLOWSKI, M. The Phenolic Contents and
Antioxidant Activities of Infusions of Sambucus nigra L. Plant Foods for
Human Nutrition, v. 72, p. 82-87, 2017.
WAGNER, H.; BLADT, S. Plant Drug Analysis: A Thin Layer
Chromatography Atlas. 2 ed. Berlin: Springer-Verlag, 1996.
126
WANG, T.; LI, Q.; BI, K. Bioactive flavonoids in medicinal plants:
structure, activity and biological fate. Asian Journal of Pharmaceutical
Sciences, v.13, p.12-23, 2017
WICHTL, M. Herbal drug and phytopharmaceuticals: a handbook for
practice on a scientific basis. 3th ed. Washington: CRC Press, 2004.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. WHO Monographs on Selected
Medicinal Plants, v. 2, 2003.
YESILADA, E.; USTÜN, O.; SEZIK, E.; TAKAISHI, Y.; ONO, Y.;
HONDA, G. Inhibitory effects of turkish folk remedies on inflammatory
cytokines: interleukin-1α, interleukin-1β, and tumor necrosis factor α.
Journal of Ethnopharmacology, v. 58, p. 59-73, 1997.
ZAKAY-RONES Z.; THOM, E.; WOLLAN, T.; WADSTEIN, J.
Randomized study of the efficacy and safety of oral elderberry extract in the
treatment of influenza A and B virus infections. The Journal of
International Medical Research, v. 32, p. 132-140, 2004.
ZOKTI, J.; SHAM BAHARIN, B.; MOHAMMED, A.; ABAS, F. Green tea
leaves extract: microencapsulation, physicochemical and storage stability
study. Molecules, v. 21, p. 940, 2016.
ZUCOLOTTO, S.M.; ZUANAZZI, J.A.S.; MONTANHA, J.A. Flavonoides.
In: SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.A.;
PETROVICK, P.R. Farmacognosia: do produto natural ao medicamento.
Porto Alegre: Artmed, 2017.
127
ANEXO A – Laudo de análise da droga vegetal
128
ANEXO B – Parecer de aprovação do Protocolo no CEUA/UNIVALI
129