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Modelización del crecimiento de una población microbiana en medio líquido
y su implicación en el estudio de la morfología
celular a través del análisis digital de imágenes
Ángel Viteri 1, Mónica Blanco 2, Rosa Carbó 3, Marta Ginovart 2
1 Escola Superior d’Agricultura de Barcelona
2 Departament de Matemàtiques 3 Departament d'Enginyeria Agroalimentària i Biotecnologia
Universitat Politècnica de Catalunya
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ÍNDICE
1. Introducción
2. Objetivos
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
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Introducción
Aplicación de matemáticas en microbiología
Atractivo y gratificante
Visión más profunda del proceso de
crecimiento microbiano
Sistemas microbianos como ejemplos dónde aplicar conceptos y herramientas desarrolladas en
clase de matemáticas
Buenas oportunidades para evaluar y comparar
metodologías diferentes de modelización
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Introducción
Jacques Monod (1910-1976),
biólogo francés, escribió, hace
65 años, una interesante
revisión sobre el crecimiento de
cultivos bacterianos, mostrando
algunas ideas en un intento de
caracterizar,
por medio de parámetros y
funciones continuas,
poblaciones microbianas
"viviendo" en un medio líquido.
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J. Monod, Recherches sur la croissance des
cultures bactériennes. Hermann, Paris, 1958.
Monod (1910-1976) definió la naturaleza del crecimiento bacteriano limitado por la cantidad de nutrientes con diversos experimentos en
medios líquidos.
Introducción
Cambios en las tasas de crecimiento en función del
tiempo (encima)
y curvas de crecimiento
típicas (debajo)
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En el crecimiento de una población de microorganismos en un cultivo cerrado en medio líquido
(sin entradas ni salidas) se puede distinguir
una sucesión de fases caracterizada por
las variaciones en la velocidad de crecimiento.
Fases o etapas en la evolución temporal del crecimiento poblacional microbiano
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Adapted from ustration by : Michał Komorniczak (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacterial_growth)
i) Fase de latencia o adaptación, “lag phase”, con tasa de crecimiento nula.
ii) Fase de aceleración con aumento progresivo de esta tasa de crecimiento.
iii) Fase exponencial, “log phase”, con tasa de crecimiento positiva, constante y máxima.
iv) Fase de retraso con la disminución progresiva de la tasa de crecimiento.
v) Fase estacionaria con una tasa de crecimiento (aproximadamente) nula.
vi) Fase de declive o muerte con una tasa de crecimiento negativa.
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MICROORGANISMO: La levadura Saccharomyces cerevisiae
§ Hongo unicelular § Facilidad de crecimiento y buen manejo en el laboratorio § Interviene en fermentaciones industriales diversas (vino,
cerveza, pan…) § La propia célula y los componentes o material que la
constituyen son utilizados para propósitos diversos en biotecnología
Capaz de crecer en
condiciones aerobias,
microaerófilas y
anaeróbicas
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La levadura Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae var. bayanus (x500)
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La levadura Saccharomyces cerevisiae
S. cerevisiae var. bayanus (x500)
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Proliferación vegetativa con reproducción asimétrica (no bipartición)
Reproducción por gemación
Célula madre
Célula hija
La gema crece en la superficie de la célula madre y deja una cicatriz en la separación física.
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Vida replicativa limitada. Edad genealógica asociada al número de gemas producidas.
La media de los tamaños de las células crece con la edad.
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Morfometría
} Estudio cuantitativo del tamaño y forma, y su variación
} Conjunto de variables cuantitativas (directas o indirectas)
para analizar
Etapas
Procesamiento de imágenes Obtención de variables Análisis estadístico
𝐶𝑖𝑟𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟𝑖𝑑𝑎𝑑=4 𝜋∗( Á𝑟𝑒𝑎⁄𝑃𝑒𝑟í𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜↑2 )
𝐸𝑙𝑜𝑛𝑔𝑎𝑐𝑖ó𝑛= 𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜↓𝑚á𝑥 ⁄𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜↓𝑚í𝑛
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Proceso digital de imágenes
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ÍNDICE
1. Introducción
2. Objetivos
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
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El objetivo fundamental de este trabajo es
la modelización de la población de células de levadura Saccharomyces cerevisiae
que se encuentran creciendo en dos condiciones,
aerobia y microaerófila, que corresponden a dos concentraciones de
oxígeno diferentes
desde dos perspectivas distintas: a nivel poblacional y a nivel individual.
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Objetivos específicos ü Caracterizar las evoluciones temporales de
los tamaños de las poblaciones de levaduras (numero de células) correspondientes a las dos condiciones de crecimiento establecidas.
ü Obtener y analizar los resultados de diversos
parámetros morfométricos directos y sus derivados de las células de levadura para poder comparar entre las distintas fases de crecimiento y entre las dos condiciones (aerobia y microaerófila).
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ÍNDICE
1. Introducción
2. Objetivos
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
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Datos experimentales Ø Para cada una de las dos condiciones de crecimiento (aerobio y
microaerófilo), 4 réplicas (ensayos) de cultivos en medio liquido
Ø Muestreos a lo largo del tiempo y recuento del número de células
Ø Fotos de células tomadas de los ensayos en distintos tiempos
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Parámetros cinéticos útiles
en microbiología
Maxima velocidad de crecimiento
µ (fase exponential)
Tiempo de
latencia λ
(duración fase de adaptación)
Fase Lag
Fase Estationaria
Evolución temporal del número de células
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Modelo BUCHANAN: Modelo pseudo-mecanicista y lineal a trozos, describe de forma aproximada las tres fases principales de una curva de crecimiento poblacional
t Lag-Exp
µ máx
log10 (N0)
log10 (Nmáx)
Fase de adaptación (fase lag) Fase exponencial (fase log) Fase estacionaria
Buchannan et al. (1997)
“When is simple good enough: a comparison of the Gompertz,
Baranyi, and three-phase linear models for fitting bacterial growth
curves”
t Exp-Est
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nlsMicrobio: Nonlinear
regression in predictive
microbiology
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Tratamiento de imágenes
Programa libre (Fiji is just) Image J.
Establecer escala
Duplicación de imagen y resta de ruido
Pasar la imagen a 8 bits
Mejorar el contraste
Ajuste del umbral
Pasar la imagen a binario
Cerrar células
Llenar agujeros
Separar células
Cerrar células manualmente
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ÍNDICE
1. Introducción
2. Objetivos
3. Materiales y métodos
4. Resultados y discusión
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Parámetros cinéticos de crecimiento microbiano a partir del modelo Buchanan obtenidos con el programa R
Ejemplo de la curva de crecimiento ajustada para los datos de la réplica 1 en condiciones aerobias
Parameters: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|)
lag 6.3120 1.3827 4.565 0.000441 *** mumáx 0.7995 0.1261 6.342 1.82e-05 *** LOG10N0 4.6236 0.2661 17.373 7.18e-11 *** LOG10Nmáx 8.9698 0.2173 41.279 5.02e-16 ***
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Modelo de Buchanan
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Tabla resumen de parámetros cinéticos para las 4 réplicas
en las dos condiciones de crecimiento t Lag-Exp - Tiempo de duración de la fase lag, tiempo de fase lag a fase log (h) µ máx - Tasa máxima de crecimiento (log ufc/mL h -1) log10 (N0) - Logaritmo de la población inicial (log ufc/mL) log10 (Nmáx) - Logaritmo de la población máxima (log ufc/mL) t Exp-Est - Tiempo del cambio de fase de log a fase estacionaria
Medio Aerobio Medio Microaerófilo
Réplica 1 2 3 4 1 2 3 4
t Lag-Exp 6,31 8,63 7,51 7,37 6,79 7,95 7,22 7,14
µ máx 0,80 0,95 1,01 0,74 0,54 0,60 0,52 0,55
log10 (N0) 4,62 4,90 4,45 4,70 4,48 4,60 4,53 4,59
log10 (Nmáx)
8,97 9,14 9,03 8,86 9,16 9,19 9,09 9,57
t Exp-Est 18,83 18,89 18,00 20,34 26,58 25,61 27,25 28,03
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Comparación entre medios de crecimiento
Influencia del medio sobre los parámetro cinéticos Variabilidad y tendencia central (valores p de los test estadísticos)
log10 (N0) t Lag-‐Exp µ máx log10 (Nmáx) t Exp-‐Est
F de Fisher 0,086 0,296 0,017 0,353 0,916
t de Student 0,259 0,747 0,016 0,086 < 0,001
MicroaerófiloAerobio
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
Medio
µ máx
(1/h)
MicroaerófiloAerobio
5,0
4,8
4,6
4,4
4,2
4,0
Medio
No (Lo
g ufc/m
L)
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Medio aerobio } Área
20 25 30 35 40 45 50 55 60
0 10 20 30 40 50
Áre
a (µ
m2 )
Tiempo (h)
Réplica 3
Área (µm2)
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Medio aerobio } Perímetro
17 19 21 23 25 27 29 31 33
0 10 20 30 40 50
Perí
met
ro (µm
)
Tiempo (h)
Réplica 3
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Comparación entre medios } Medio aerobio
} Medio microaerófilo
0
20
40
60
80
100
Adaptación Logarítmica Estacionaria Po
rcen
taje
(%
)
0
20
40
60
80
100
Adaptación Logarítmica Estacionaria
Porc
enta
je (
%)
Gemación
Gemación
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Comparación entre medios } Estudio de la variable área según gemación
Área (µm2)
Área (µm2)
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Medio aerobio } Circularidad
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SON MUCHOS Y DIVERSOS LOS DATOS QUE SE HAN ANALIZADO…. … Y SEGUIREMOS ANALIZANDO PARA MODELIZAR ESTAS POBLACIONES DE LEVADURAS a dos niveles diferentes: - A nivel poblacional con parámetros cinéticos involucrados en
modelos continuos para describir evoluciones temporales de numero de individuos.
- A nivel individual con distribuciones de variables morfométricas de las células que se encuentran relacionadas con su estado reproductivo y son reflejo de su vitalidad y actividad.
CON EL FIN DE PODER INTEGRAR TODA ESTA INFORMACION
Y CONSEGUIR REPRESENTACIONES APROXIMADAS MÁS COMPLETAS DE ESTAS POBLACIONES MICROBIANAS.
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Muchas gracias por su atención!