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Plateau technique d’imagerie cellulaire du CPTP-Purpan Sophie Allart - [email protected] – Astrid Canivet – [email protected]

Tél : 05. 62. 74. 45. 78 05. 31. 54. 79. 01

Plateau technique d'imagerie

cellulaire du CPTP-Purpan

Juillet 2013

Mode d'emploi Microscope Apotome Zeiss


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Composition du système

Type de microscope Zeiss Axio-observer (statif inversé) Type de Brûleur HXP 120 Shutter de fluorescence Obturateur de la lampe

Filtres de fluorescence présents

VERT 38 HE eGFP shift free EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 ROUGE 43 HE Cy 3 shift free EX BP 550/25, BS FT 570, EM BP 605/70 DAPI 49 DAPI shift free EX G 365, BS FT 395, EM BP 445/50 FAR RED 50 Cy 5 shift free

EX BP 640/30, BS FT 660, EM BP 690/50

Objectifs pour observation en fluorescence

Objectif EC "Plan-Neofluar" 10x/0,3 Ph1 M27 (Phase) Objectif "Plan-Apochromat" 20x/0,8 M27 Objectif "Plan-Apochromat" 40x/1,4 Oil DIC M27 Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27

Objectifs pour observation en contraste interférentiel (DIC)

40X, 63X

Platine de déplacement Motorisée par joystick

Déplacement en Z Galvanométrique précision de 25 nm Changement d’objectifs Motorisé Facteur de grossissement du tube 1X Chambre C02 Thermorégulateur

Non Non

Caméra Résolution et taille du pixel CCD refroidi Digitalisation Bruit noir

Axiocam HRm Rev.3 1388x1040 et jusqu'à 4164x3120 - pixel 6,45 µm

oui jusqu’à 14bit

0,07 e-/p/s @ -30°C

Acquisition

Images multi-marquages en séquentiel

2D à 6D Multi-champ, Mosaïque

Logiciel d’acquisition

Zen 2012

Système d’exploitation Windows XP Ordinateur Processeur Xéon 6 Core MUI, 6 Go RAM


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Filtre 38 (vert):

Excitation: BP 470/40 Beam Splitter: FT495 Emission: BP 525/50 Fluorochromes: 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) 5-FAM (5-Carboxyfluorescein) Acridine Orange, both DNA & RNA Acridine Yellow Alexa Fluor 488™ Astrazon Orange R Auramine Aurophosphine Cy2™ DiO (DiOC18(3)) EGFP FITC FITC Antibody Fluo-3 Fluo-4 Fluorescein (FITC) Fluoro-Emerald GFP (S65T) GFP red shifted (rsGFP) GFP wild type, non-UV excitation (wtGFP) Lyso Tracker Blue-White Mitotracker Green FM Oregon Green 488-X Oregon Green™ 488 Oregon Green™ 500 PKH67 rsGFP S65A S65C S65L S65T sgGFP™ (super glow GFP) SYTO 13 SYTO 18 Filtre 43 (rouge):

Excitation: BP 545/25


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Beam Splitter: FT570 Emission: BP 605/70 Fluorochromes: DsRed (Red Fluorescent Protein) Ethidium Bromide Fluor Ruby Magdala Red (Phloxin B) Phloxin B (Magdala Red) Rhodamine B Rhodamine BB Rhodamine B 200 R-phycoerithrin (PE) Sevron Brilliant Red B Xylene Orange FilterSet 49 (bleu):

Excitation: G365 Beam Splitter: FT395 Emission: BP 445/50 Fluorochromes: 1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid); 1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS); 6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0; 7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0; 7-Hydroxy-4-methylcoumarin; 7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0; Alexa 350; AMCA conjugate; Amino Coumarin; BFP (Blue Fluorescent Protein); Cascade Blue; Coumarin; DAPI; DAPI-DNA; DyLight 350; Hoechst 33258; Hoechst 33258-DNA; Hoechst 33342; Indo-1 Ca2+; Indo-1, Ca free; Indo-1, Ca saturated; LysoSensor Blue; LysoSensor ; Blue pH 5.0; LysoSensor Yellow pH 9.0; LysoTracker Blue; Marina Blue Filtre 50 (rouge lointain):


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Excitation: BP 640/30 Beam Splitter: FT660 Emission: BP 690/50 Fluorochromes: Alexa 647; Alexa 660, Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2; Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2; Allophycocyanin pH 7.5; APC (allophycocyanin); Atto 647; BODIPY 650/665-X, MeOH; Cy 5; DDAO pH 9.0; DyLight 649; Nile Blue, EtOH; TO-PRO-3-DNA; TOTO-3-DNA Allumage du système - Eteindre le PC - Basculez l'interrupteur sur ON au niveau de la multiprise (allume la lampe HXP 120 + le boîtier de l'Apotome-2 + le boîtier control Unit 232 ) - Allumez le microscope (bouton à gauche du statif) - Attendre que le microscope soit complètement allumé (la barre d'initialisation et le logo Zeiss n'apparaissent plus sur l'écran TFT) puis démarrez le PC. Sur le bureau, choisir le logiciel Zen 2012 Observation aux oculaires L'observation de l'échantillon aux oculaires se pilote au travers du logiciel en sélectionnant

dans l'onglet le bouton Oculaire et le fluorochrome à observer.


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Pour acquérir une image en transmission il faut d'abord faire un réglage de Koehler. Le réglage de Koehler doit être fait aux oculaires lorsque l'on souhaite observer l'échantillon en transmission afin d'obtenir une image de meilleure qualité. Il est à régler sur le plus faible grossissement puis à re-régler à chaque changement d'objectif.

Charger une configuration Tous les canaux qu'il est possible d'acquérir (Dapi, vert, rouge, rouge lointain) sont présents dans l'onglet Channels. Activez les canaux que vous souhaitez acquérir.

Pour définir un temps d'exposition, cliquez sur Live et sélectionnez chaque canal afin de déterminer le temps d'exposition adéquat. Pour cela, cochez Auto Exposure et ce temps sera déterminé de manière automatique.

En dessous de l'image Live qui s'affiche, activez l'icône Range Indicator. Les pixels saturés vont alors apparaître en rouge.

En mode oculaire :

• Faire la mise au point sur l'échantillon

• Fermer à fond le diaphragme de champ

• Régler la hauteur du bloc condenseur jusqu'à voir les bords du diaphragme net

• Centrer le diaphragme à l'aide des vis argentées.

• Elargir le diaphragme juste assez pour faire disparaître les bords.

2. diaphragme de champ

3. hauteur bloc condenseur

4. centrage bloc condenseur

1. mise au point échantillon


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Si le temps d'exposition proposé vous convient, cliquez sur Stop. Si ce n'est pas le cas, réduisez-le manuellement jusqu'à ne plus avoir de pixels saturés. La calibration du temps d'exposition est à faire pour chaque canal (fluo et transmission). Une fois ces réglages faits pour la fluorescence et la transmission, vous pouvez acquérir une image en cliquant sur Snap. Il est aussi possible de charger une configuration à partir d'une image .czi. Ouvrez l'image

(File/Open) puis cliquez sur ReUse sous l'image acquise. Les paramètres d'acquisition de cette image seront automatiquement re-appliqués (canaux, temps d'exposition, stack…). Comparaison d'intensité: Si vous souhaitez faire une étude d'intensité sur vos images, réalisez d'abord vos mesures de temps d'exposition sur l'échantillon le plus brillant et gardez ces paramètres pour acquérir les images suivantes. Utilisation de l'apotome Poussez le bras de l'apotome délicatement dans le trajet de la fluorescence sur le côté du microscope. Un bip sonore signale que l'apotome a bien été placé. Les fonctions basiques sont les même qu'en épifluorescence.


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Attention: La mise au point est identique en mode champ large et en mode apotome mais le temps d'exposition est différent. Il faut donc le mesurer de nouveau après avoir enclenché le bras de l'apotome. Attention: il ne sert à rien d'utiliser l'apotome avec l'objectif 10X

Afin que le logiciel fasse les acquisitions en mode Apotome, vérifiez dans l'onglet Apotome Mode que Enable Apotome est coché (et pour acquérir en Champ large, il doit être décoché).

Une fois l'image acquise, dans l'onglet Apotome sous l'image, cliquez sur Create Image. Une nouvelle image est alors créée et c'est cette image qui doit être sauvegardée.

Si vous observez des résidus de grilles sur votre image, avant de cliquer sur Create Image vous pouvez appliquer un filtre (Fourrier)( menu déroulant au dessus de Create Image. Acquérir une pile d'images en Z Cochez Zstack, l'onglet Zstack apparaît. Mettez vous en Live sur le canal d'intérêt et déplacez-vous en Z à l'aide de la vis micrométrique et déterminez le premier plan en cliquant sur Set First (1). Faites la même chose pour déterminer le dernier plan en cliquant sur Set Last (2). Vous pouvez déterminez vous-même le nombre d'images à acquérir ou l'intervalle entre chaque image. Pour obtenir de

Mode Champ Large Mode Apotome


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meilleurs résultat, cliquez sur le bouton à côté d'Optimal (3)pour avoir un intervalle entre deux images qui respecte le théorème de Nyquist.

Afin de ne pas observer de saturation, se mettre en Live en fausse couleur et chercher pour chaque canal séparément en naviguant en Z s'il y a un plan plus lumineux que celui sur lequel les réglages ont été précédemment faits. Si c'est le cas, ajustez le temps d'exposition pour qu'il n'y ait plus de saturation. Réaliser des acquisitions au cours du temps Cochez Time Lapse et dans le nouvel onglet Time Lapse qui s'est ouvert choisissez le nombre de cycles et l'intervalle entre chaque acquisition. Pour ne pas perdre les données si un problème se produit au cours de l'acquisition, faire une sauvegarde automatique (cf Sauvegarde).

Attention: l'Apotome n'a pas d'incubateur ni de régulateur de CO2! Acquérir une Mosaïque Cochez Tiles.

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Attention: Avant d'acquérir une mosaïque, décochez Auto Exposure pour tous les canaux. Dans ce nouvel onglet, les mosaïques peuvent être acquises de manières différentes: - La méthode la plus simple est de déterminer directement le nombre de tuiles dans Add Tile Region et de cliquer sur +. La mosaïque apparaît dans Tile Regions and Positions et la position actuelle sera le centre de la mosaïque.

- Il est aussi possible de dessiner soi-même la mosaïque. Pour cela, cliquez sur le bouton Advanced Setup, une nouvelle fenêtre s'ouvre avec une fenêtre Live. Différents points de la mosaïque peuvent être marqués en appuyant sur F2 (une image va être acquise à cette position) afin de servir de repères. On peut alors ensuite dessiner la mosaïque autour de ces points. Pour cela, sous l'image, choisir l'onglet Tile Region Setup et l'option Contour puis dessinez votre mosaïque autour de vos repères


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- Enfin, une mosaïque peut être réalisé en fonction du support de votre échantillon (plaque 96 puis…) Tout d'abord, dans Sample Carrier choisissez le support de votre échantillon en cliquant sur Select.

Ensuite, il faut calibrer la platine et la boîte. Dans l'onglet Tiles, dans Sample Carrier, cliquez sur le bouton Calibrate. Une nouvelle fenêtre s'ouvre. Vérifiez qu'il n'y a rien qui peut gêner la platine puis cliquez sur Calibrate. La platine s'initialise seule.

Ensuite, cliquez sur Next. Il faut alors calibrer le support de l'échantillon. Suivez les indications données par le logiciel qui varient en fonction du support utilisé.


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Pour définir ensuite votre mosaïque, cliquez sur Advanced Set up. Sous l'image, dans Carrier , sélectionnez dans quels puits, si vous utilisez une plaque à puits, vous souhaitez faire une mosaïque (2) (Ctrl+ A pour sélectionner tous les puits, Ctrl+clic pour en sélectionner certains). Puis, dans Tile Region Setup, cliquez sur Carrier et dans Fill factor, choisissez la superficie de la zone du puits couverte par la mosaïque et cliquez sur Create (2).

Si votre mosaïque comporte un grand nombre de tuiles, il faut faire une correction de focus en différents points afin de corriger les variations de position en Z de votre échantillon. Pour cela, aller dans la partie Focus Surface de l'onglet Tiles. Double-cliquez sur une tuile de la mosaïque; faîtes la mise au point à l'aide de l'image Live puis cliquez sur le bouton +. Répétez sur différentes tuiles (la correction de focus doit au moins être faite sur les 4 coins de la mosaïque). Plus la mosaïque est grande, plus il faut enregistrer de points. Les points marqués apparaissent en jaune sur le modèle de la mosaïque.

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Afin que le logiciel tienne compte des différents focus, choisissez Local Focus Surface dans l'onglet Focus Devices. Une fois la mosaïque acquise, la superposition des tuiles peut être à parfaire. Pour cela, aller dans l'onglet Processing et choisissez l'option Stitching. Si la démarcation entre les tuiles est visible, aller dans New output et cochez Fuse Tiles puis Apply. Enfin, pour sauvegarder une mosaïque, exportez la en .tiff. En effet, à l'ouverture d'une mosaïque, ImageJ ouvrira chaque tuile séparément et non pas en une seule mosaïque si le fichier a été sauvegardé en .czi . Acquérir des multipositions sur plusieurs jours A faire avant la première acquisition:

1. Dévissez les vis du porte échantillon afin qu'il soit bien à plat. 2. Bien caler le porte échantillon à chaque acquisition dans le même sens . 3. Placez votre boîte à chaque acquisition de la même manière

Cochez Tiles puis dans l'onglet Tiles

4. Choisissez le support de l'échantillon 5. Calibrez la platine (à faire avant chaque acquisition) et le support suivant les

instructions données par le logiciel. 6. Déterminez les points à étudier dans le sous-onglet Position en cliquant sur le bouton

+.

7. Faire une auto-sauvegarde

Pour les acquisitions suivantes, les point 1, 2, 3, 4, 5 et 7 sont à faire. Pour importer les positions, ouvrez la précédentes acquisitions et cliquez sur le bouton Reuse. Sauvegarde


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Toute image acquise sur l'apotome doit être sauvegardée en format .czi afin de conserver les méta données. Vous pouvez ensuite sauvegarder en .tif mais PAS en Jpeg (qui compresse et donc perd des informations). A gauche, cliquez sur l'image à sauvegarder puis clic droit/ Save As.

Sauvegarde automatique: Lorsque vous faîtes un time lapse ou une grande mosaïque, il est important de faire une sauvegarde automatique afin de ne pas perdre de données en cas de problème. Allez dans Tools / Options puis dans Saving choisissez le dossier dans lequel vos fichiers seront sauvegardés.

Extinction du système Nettoyez les objectifs à huile avec de l’alcool et du papier Kimtech. Baisser la tourelle des objectifs. - Ne pas Eteindre le PC - Eteindre le microscope avec le bouton à gauche du statif - Basculez l'interrupteur sur ON au niveau de la multiprise Remettre le cache en tissus bleu sur le microscope.

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