DINAMIKA EKSPRESI GEN MATRIX METALLOPROTEINASE-8 DAN

TISSUE INHIBITOR METALLOPROTEINASE-1 PADA PEMAKAI PIRANTI

ORTODONTIK LEPASAN

Susilowati*, Imam Mudjari**

*Department of Orthodontics, Faculty of Dentistry, Hasanuddin University**Department of Dental Public Health, Faculty of Dentistry,Hasanuddin University

Kompleks Dosen Unhas, Jl. Sunu CX-6Makassar 90213, Sulawesi SelatanEmail: susmudjari@yahoo.co.id

Abstract

The teeth will move if subjected into pressure from orthodontic appliances which causes a remodeling of periodontal ligament and alveolar bone. MMP-8 plays an important role in the remodeling process during orthodontic movement. The expression of MMP-8 gene is regulated by a natural inhibitor namely TIMP-1. The purpose of this study was to observe the MMP-8 and TIMP-1gene expressions in the gingival crevicular fluid (GCF) of patients with removable orthodontic appliance. A sample of 8 patients wearing removable orthodontic appliances was obtained. The finger springs were activated with 75 grams of force to produce canine distalization. GCF samples were collected from the distal side of upper canines before force application, 1-, 2-, 3-, and 4 weeks after application consecutively. The samples were analyzed by using RT-PCR. Statistical univariate analysis was used to show the distribution and percentages of the gene expressions. The gene expression of MMP-8 at t0 was 28.1% but the force application elevated its expression to 62.5 % at t 1, and then decreased continously at t2 (37.5%), t3 (34.4%), and t4 (31,3%). The gene expression of TIMP-1 at t0 was 40,6% but the force application elevated its expression to 59,4% at t1, and then decreased continously at t2 (43,8%), t3 (40,6%), and t4 (37,5%). In conclusion, there was a dynamic gene expressions of MMP-8 and TIMP-1 before and after force application and the pattern was similar, i.e. the highest level was happened on the first week, but it declined continously in the following weeks.

Key words: matrix metalloproteinase-8, tissue inhibitor metalloproteinase-1, gene expression, removable orthodontic appliance

1

1

PENDAHULUAN

Tuntutan dan kebutuhan akan perawatan ortodontik pada masa kini semakin

meningkat, baik di Indonesia maupun negara-negara lain di dunia. Pemakaian

piranti ortodontik cekat semakin diminati walaupun piranti ortodontik lepasan juga

masih banyak dipakai, terutama di negara-negara yang sedang berkembang’.

Penelitian tentang pergerakan gigi dimulai kurang lebih 100 tahun yang lalu,

dilihat dari aspek-aspek seluler, histologis, radiologis, dan yang terbaru adalah

biologi molekuler dan genetika. Profil dari bermacam-macam sitokin, faktor

pertumbuhan, gen, dan enzim-enzim yang dihubungkan dengan pergerakan gigi

ortodontik telah banyak diteliti, dan biasanya pengambilan sampelnya dari cairan

krevikuler gingiva yang berada di sulkus gingiva..

Gigi geligi akan bergerak jika dikenai tekanan. Piranti-piranti ortodontik aktif,

dapat memberikan tekanan ke arah yang dikehendaki operator dengan tujuan untuk

memperbaiki maloklusi. Tekanan pada gigi akan menimbulkan perubahan-perubahan

pada jaringan periodontal dan tulang alveoler. Pada sisi regangan / tarikan akan terjadi

aposisi sedangkan pada sisi tekanan, akan terjadi resorpsi tulang alveoler yang

memerlukan keaktivan sel-sel osteoblas dan osteoklas yang berada di dalam matriks

ekstraseluler. Untuk memudahkan mobilitas sel-sel tersebut, diperlukan suatu enzim

yang dapat memecah kolagen yang merupakan komponen terbesar dari matriks

ekstraseluler yaitu kolagenase (matriks metaloproteinase/ MMP), misalnya MMP-1, -

8, dan -131.

2

2

Aksi dari MMP diatur oleh inhibitor spesifik yaitu Tissue Inhibitor

Metalloproteinase (TIMP). Dikenal ada 4 TIMP, yaitu: TIMP-1, -2,-3, dan - 4 . Yang

paling banyak diteliti adalah TIMP-1, suatu glikoprotein yang disintesis oleh

kebanyakan sel jaringan ikat. TIMP menghambat aksi dari MMP dengan cara

mengikat sisi aktifnya2.

Perubahan-perubahan morfologis dan histokimiawi dari sel-sel ligamentum

periodontal telah banyak diteliti , tetapi masih sedikit penelitian tentang ekspresi gen

MMP-8 dan TIMP-1 secara in vivo dan in vitro pada cairan krevikuler gingiva (GCF)

akibat dari tekanan mekanis yang berasal dari piranti ortodontik. Penelitian-penelitian

yang dilakukan di negara-negara barat hampir selalu menggunakan piranti ortodontik

cekat, belum ada yang menggunakan piranti lepasan dalam hubungannya dengan

ekspresi gen. Data yang didapatkan juga kebanyakan meneliti kadarnya, bukan

ekspresi gennya.

Oleh karena itu perlu diteliti bagaimana dinamika ekspresi gen MMP-8 dan

TIMP-1 di dalam GCF selama pergerakan gigi pada pemakai piranti ortodontik

lepasan. Hasil dari penelitian ini diharapkan bisa menambah pengertian tentang

respons jaringan paradental terhadap tekanan ortodontik pada umumnya serta peran

MMP-8 dan TIMP-1 dalam proses biomekanik pergerakan gigi akibat tekanan dari

piranti lepasan pada khususnya

BAHAN DAN CARA

3

3

Jenis penelitian ini adalah uji coba klinik (clinical trial) dengan rancangan

time series.Pemasangan piranti ortodontik dilakukan di RSGMP FKG Unhas,

sedangkan pemeriksaan ekspresi gen (TIMP-1 dan MMP-8) menggunakan uji RT-

PCR dilakukan di Laboratorium Biologi Molekular dan Imunologi, Fakultas

Kedokteran Unhas.

Subjek penelitian adalah mahasiwa FKG dan pasien yang memakai piranti

ortodontik lepasan, sebanyak 8 orang (6 perempuan dan 2 laki-laki, berusia 19-25

tahun), yang memenuhi kriteria inklusi sebagai berikut: gigi lengkap dari molar

pertama atas kiri sampai dengan molar pertama atas kanan, pasien menderita crowded

gigi anterior atau protrusi, berdasarkan analisis ruang (metode Kesling) diperlukan

pencabutan gigi atas, oral hygiene baik, tidak ada kelainan periapikal / periodontal,

akar gigi tidak mengalami kelainan ekstrim dalam hal bentuk dan ukuran (panjang),

belum pernah atau tidak sedang menjalani perawatan ortodontik, dan mau

berpartisipasi dalam proses penelitian sampai selesai.

Sebagai kriteria eksklusi adalah sebagai berikut: menderita penyakit sistemik

(DM), posisi gigi kaninus atas mesioversi atau distoversi ekstrem, posisi gigi kaninus

atas ektopik/ di luar lengkung, gigi kaninus dan molar pertama atas goyang, dan cairan

krevikuler gingiva tercampur darah.

Pada pasien dilakukan pemasangan piranti ortodontik seminggu setelah

dilakukan pencabutan gigi premolar pertama atasnya. Besar gaya awal (aktivasi

finger spring) yang diberikan adalah 75 gram. Setelah itu dilakukan pengumpulan

4

4

GCF pada sisi distal dari gigi kaninus atas pada waktu sebagai berikut: sebelum

dilakukan aktivasi finger spring (to), seminggu setelah aktivasi (t1), dua minggu

setelah aktivasi (t2), tiga minggu setelah aktivasi (t3), dan empat minggu setelah

aktivasi (t4).

Pengumpulan GCF dilakukan sebagai berikut: pasien diminta untuk kumur-

kumur kemudian permukaan gigi yang akan diambil cairannya dibersihkan dari plak

lalu dikeringkan dengan udara dan dijaga tetap kering dengan pemasangan cotton

roll3. Dua buah paper point dimasukkan ke dalam sulkus, ditunggu 1 menit lalu

dibuang. Diulang lagi aktivitas yang sama, setelah paper point berada di sulkus 1

menit, paper point dimasukkan ke dalam tabung L6 (transport buffer). Sampel

disimpan di lemari pendingin pada suhu -20o untuk menunggu dianalisis.

Sampel GCF diekstraksi untuk mendapatkan RNA total. Analisis RT-PCR

(Reverse Trancriptase- Polymerase Chain Reaction) dilakukan dengan memasukkan

reagensia berikut ke dalam sebuah tabung mikro: 6 l Reverse Transcription buffer

(Primecript, Takara, Japan), 1.5 l primer spesifik untuk MMP-8 yaitu sense primer:

TGGACCCAATGGAATCCTTGC dan antisense primer:

ATAGCCACTCAGAGCCCAGTA yang menghasilkan fragmen 544 bp, 1,5 l

enzyme mixt, 19.5 l H2O and 1.5 l sampel mRNA. Kemudian tabung diinkubasi

pada temperatur 37ο C selama 15 menit, yang memungkinkan transkripsi terbalik

bekerja. Temperatur dinaikkan menjadi 94o C selama 2 menit, 60o C selama 2 menit,

dan 72o C selama 3 menit. Pita (band) DNA terlihat setelah 37 siklus PCR. GAPDH

(Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase) ditambahkan pada masing-masing

5

5

sampel yang berfungsi sebagai kontrol internal. Produk PCR dilewatkan melalui 2%

gel agarose untuk elektroforesis dan dilihat di bawah sinar UV.

Semua prosedur di atas juga diulang untuk TIMP-1 dengan menggunakan :sense

primer 5-GGGGACACCAGAAGTCAACCAGA-3, antisense primer 5-

CTTTTCAGAGCCTTGGAGGAGCT-34.

Pengambilan foto DNA dalam gel agarosa dilakukan dengan kamera digital.

Hasil uji laboratorium dengan RT-PCR dinyatakan dalam skor semi-kuantitatif 1-

4 sebagai berikut: skor 1 jika cahaya dari band kurang terang dibanding kontrol, skor

2 jika cahaya dari band adalah sama dengan kontrol, skor 3 jika cahaya dari band

sedikit lebih terang dibanding kontrol, dan skor 4 jika cahaya dari band jauh lebih

terang dibanding kontrol.

Data yang diperoleh dari penelitian diproses secara elektronik dengan

menggunakan program SPSS versi 15.0, kemudian dianalisis secara statistik dengan

analisis univariat.Penyajian datanya dilakukan dalam bentuk grafik persentase yang

diharapkan memberikan gambaran distribusi ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1

menurut lamanya waktu pemberian tekanan.

HASIL PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan terhadap 8 pasien yang memakai piranti ortodontik

lepasan, dilakukan aktivasi pada finger spring dengan gaya awal sebesar 75 gram.

Selanjutnya dilakukan observasi secara bertahap selama 4 minggu mengenai ekspresi

gen MMP-8 dan TIMP-1 melalui GCF.

6

6

Grafik 1: sebaran ekspresi gen MMP-8 untuk piranti ortodontik lepasan

Grafik 1 memperlihatkan bahwa ekspresi gen MMP-8 sebelum diberi tekanan sebesar

28,1%. Pemberian tekanan pada minggu pertama memberikan kenaikan sebesar 62,5%.

Selanjutnya mengalami penurunan pada minggu kedua sebesar 37,5%. Pada minggu

ketiga, mengalami penurunan menjadi 34,4% , kemudian semakin menurun pada minggu

keempat menjadi 31,3 %.

7

7

Grafik 2: sebaran ekspresi gen TIMP-1 untuk piranti ortodontik lepasan

Grafik 2 memberikan informasi bahwa sebelum diberi tekanan, persentase TIMP-1

sebesar 40,6%. Dengan pemberian tekanan selama minggu pertama menaikkan nilai

TIMP-1 menjadi 59,4%. Pada minggu kedua, turun menjadi 43,8 %. Pada minggu ketiga,

mengalami penurunan lagi menjadi 40,6%. Selanjutnya turun lagi menjadi 37,5% pada

minggu keempat.

PEMBAHASAN

Pada penelitian ini, semua pasien mempunyai kebersihan mulut yang baik dan

tidak menderita gingivitis maupun periodontitis. Alasannya adalah bahwa adanya sisa-

sisa makanan pada permukaan gigi bisa memicu terjadinya gingivitis dan

periodontitis. Periodontitis adalah penyakit inflamasi yang menyerang jaringan

pendukung gigi, menyebabkan kerusakan progresif dari perlekatan jaringan

pendukung dan tulang alveolar. Salah satu penyebabnya adalah adanya infeksi bakteri.

Bakteri yang ada di dalam plak, termasuk lipopolisakarida (LPS) dan asam

8

8

lipoteichoic, berinteraksi dengan toll-like receptor pada sel epitel, leukosit dan

fibroblas, merangsang produksi sitokin seperti IL-1 beta, TNF-alfa, IL-6, IL-8,

prostaglandin E2 (PGE2)5. Untuk memudahkan infiltrasi leukosit, fibroblas yang

distimulasi oleh IL-1 beta dan TNF-alfa mensekresi MMP yang mendegradasi

molekul-molekul ECM termasuk kolagen6,7. Telah diteliti bahwa pada penderita

periodontitis, terjadi peningkatan MMP-8 pada GCF8.

Pergerakan gigi yang disebabkan oleh gaya ortodontik ditandai oleh perubahan

remodeling pada jaringan gigi dan paradental, termasuk pulpa, ligamentum

periodontal (PDL), tulang alveolar, dan gingiva. Jaringan-jaringan tersebut bila

dikenai tekanan dengan besaran, frekuensi, dan durasi tertentu, menunjukkan

perubahan-perubahan makroskopis dan mikroskopis. Gaya ortodontik merubah

vaskularisasi PDL, menghasilkan sintesis lokal dari molekul-molekul penting seperti

neurotransmitter, sitokin, faktor pertumbuhan, colony stimulating factor, dan

metabolit asam arakhidonat. Molekul-molekul ini dapat memicu respons seluler oleh

berbagai tipe sel di dalam dan sekitar gigi, menciptakan kondisi mikro yang cocok

untuk resorpsi dan deposisi jaringan9,10

Pemberian tekanan pada gigi akibat piranti ortodontik mengakibatkan

kenaikan kadar MMP-8 pada GCF. Pada penelitian pada GCF dari pemakai piranti

ortodontik yang dianalisis dengan teknik IFMA (Immunofluorometric Assay) terbukti

bahwa konsentrasi MMP-8 pada GCF meningkat 2-5 kali dibanding baseline setelah

4 jam dan meningkat 3-5 kali setelah 6 jam11.

9

9

Ingman dkk.1 meneliti kadar dan aktivitas MMP-1 dan -8 pada GCF dari 5

pemakai piranti ortodontik cekat yang diobservasi setiap hari selama satu bulan juga

membuktikan adanya peningkatan rerata kadar MMP-8 sebesar 12 kali dibandingkan

dengan kontrol. Teknik yang dipakai adalah IFMA dan Western Blot. Walaupun rerata

kadar MMP-8 selama satu bulan mengalami peningkatan, tetapi konsentrasi tertinggi

justru pada akhir minggu keempat. Mantyla dkk.12 dalam penelitiannya membuktikan

bahwa adanya kenaikan kadar MMP-8 yang berasal dari PMN dan fibroblas pada

pergerakan gigi secara translasi menunjukkan adanya proses remodeling periodontal.

Pada penelitian kami, yang diteliti bukan kadarnya MMP-8 tetapi ekspresi

gennya. Secara teoritis, peningkatan ekspresi gen akan meningkatkan kadar enzim

yang disandi, begitu pula sebaliknya.

Kenaikan ekspresi gen MMP-8 yang tajam pada minggu 1 (Grafik 1)

kemungkinan karena finger spring baru diaktivasi. Sedangkan penurunan ekspresinyai

kemungkinan disebabkan karena gaya dari finger spring yang untuk menggerakkan

gigi kaninus ke distal berasal dari coil sebagai timbunan energi yang disalurkan

melalui lengan klamer yang mana setelah diaktifkan, lama kelamaan akan kembali ke

posisi semula.

TIMP-1 merupakan protein yang dikode oleh familia gen TIMP yang

menjadi inhibitor alami untuk matriks metaloproteinase (MMP), menginduksi

proliferasi berbagai macam sel, dan mempunyai sifat anti-apoptosis. Transkripsi gen

TIMP-1 sangat dipengaruhi oleh berbagai sitokin dan hormon.

10

10

Aktivitas dari MMP dikontrol oleh TIMP, memainkan peran yang sangat

penting dalam remodeling fisiologis dari periodontium maupun dalam merespons

terhadap gaya mekanik selama perawatan ortodontik13,14. Penghambatan dari MMP

sintetik telah terbukti mengurangi pergerakan gigi ortodontik15,16

Uji coba pergerakan gigi ortodontik pada binatang (biasanya tikus),

menunjukkan adanya peningkatan ekspresi MMP-1, -2, -8, -9, dan -13 dan TIMP-1

dan -3 pada PDL dan tulang alveolar17. Adanya kenaikan MMP dan TIMP menurut

Bildt dkk.16 terjadi pada sisi resorpsi dan aposisi, tetapi menurut Garlet dkk.18,

kenaikan TIMP-1 hanya terjadi pada sisi aposisi saja.

Pada pemakai piranti lepasan, ekskpresi gen TIMP-1 sebelum diberi tekanan

(baseline) sebesar 40,6% (Grafik 2). Dengan pemberian tekanan selama seminggu

pertama menaikkan nilai TIMP-1 menjadi 59,4%. Kemudian menurun pada minggu

ke 2, 3, dan 4. Hal ini sejalan dengan ekspresi MMP-8 yang juga mengalami kenaikan

yang hampir sama. Kenaikan ekspresi gen TIMP-1 ini bisa jadi merupakan

kompensasi untuk menekan kenaikan ekspresi gen MMP-8 yang juga naik.

Keseimbangan yang tepat antara aktivitas TIMP dan MMP penting untuk

integritas komponen ECM antara lain kolagen, vibronektin, laminin, elastin, dan

proteoglikan 17. TIMP-1 menghambat semua jenis MMP kecuali MMP-14. Telah

diyakini oleh beberapa peneliti bahwa TIMP berguna untuk membatasi resorpsi tulang

/ proses remodeling sehingga bisa membatasi translasi gigi secara ortodontik. Apabila

kadar TIMP-1 di daerah resorpsi menurun, resorpsi tulang akan meningkat, Pada sisi

aposisi, kadar TIMP-1 meningkat sehingga resorpsi akan menurun 16.

11

11

Pada jaringan periodontal yang sehat, kadar TIMP biasanya lebih tinggi

dibanding jaringan periodontal yang mengalami inflamasi, yang mana kadar MMP

melebihi kadar TIMP. Tetapi pada umumnya kadar MMP dan TIMP pada daerah

aposisi dan resorpsi lebih tinggi dibanding dengan kontrol

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat ditarik kesimpulan bahwa dinamika

ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 pada GCF pasien yang memakai piranti ortodontik

lepasan mempunyai pola yang sama yaitu: sebelum piranti diaktivasi ekspresinya

rendah, sesudah piranti diaktivasii mengalami kenaikan dimana puncak ekspresi

tertinggi adalah pada akhir minggu pertama, kemudian menurun secara berturut-turut

pada minggu 2, 3, dan 4. Tingkat ekspresi gen mulai kembali normal pada minggu

kedua.

Disarankan untuk penelitian lebih lanjut sebaiknya di dalam menganalisis

ekspresi gen MMP-8 dan TIMP-1 dugunakan metode kuantitatif murni seperti Real

Time – PCR.

Daftar Pustaka

1. Ingman T, Apajalahti S, Mantyla P, Sorsa T. Matrix metalloproteinase-1 and -8 in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement: a pilot study during 1 month of follow-up after fixed appliance activation. European J of Orthod 2005; 27: 202-7.

12

12

2. Nagase H, Visse R, Murphy G. Structure and function of matrix metalloproteinase and TIMP. Cardiovascular Research 2006; 69(3):562-7.

3. Isik F, Sayinsu K, Arun T, Unlucerci Y. Bone marker level in gingival crevicular fluid during orthodontic intrusive tooth movement: a preliminary study. J of Contemp Dent Pract 2005; 6 (2): 7-35.

4. De Quan Li, Tie Yan Shang, Hyun-Seung Kim, Solomon A, Stephen C. Regulated Expression of Collagenases MMP-1, -8, and-13 aStromelysins MMP-3, - 10, and -11 by Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci; 44: 2928–36.

5. Madianos PN, Bobetsis YA, Kinane DF. Generation of inflammatory stimuli: how

bacteria set-up inflammatory responses in gingival. J Clin Periodontal 2005; 32:57-71.

6. Nedbal W, Tomakidi P, Lehmann MJ. Antisense mediated inhibition of ICAM-1 expression: a therapeutic strategy against inflammation of human periodontal tissue. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 2002; 12:71-8.

7. Rai B, Kharb S, Jain R, Anand SC. Biomarkers of periodontitis in oral health. J of Oral Sci 2008; 50(1): 53-6.

8. Pozo P, Melej C, Javier P, Martinez B. Longitudinal analysis of metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and clinical parameters in gingival crevicular fluid from periodontitis-affects patients. J of Period Res 2008; <http://hdl.handle.net/2250/2434> ( January 2009).

9. Bass NM. Measurement of the profile angle and the aesthetic analysis of the facial profile. J Orthod 2002; 70(30):546-50.

10. Domeij H. Expresiion and regulation 0f MMP-1 and MMP-3 in human gingival fibroblast. Thesis. Kongl Caroliska Medico Chirurgiska Institutet. 2005; 1-55.

11. Apajalahti, S, Sorsa T, Railavo S, Ingman T. The in vivo levels of matrix metalloproteinase-1 and -8 in gingival crevicular fluid during initial orthodontic tooth movement. J.Dent.Res 2003; 82:1018-22.

12. Mantyla P, Stenman M, Kinane DF, Tikanoja S. Sorsa T. Gingival crevicular fluid collagenase-2 (MMP-8) test stick for chair-side monitoring of periodontitis. J Periodontal Res 2003; 38(4):436-39.

13

13

13. Verstappen J, Von den Hoff JW. Tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs): their biological functions and involvement in oral disease. J of Dent Res 2006; 85:1074-84.

14. Ejeil A, Igondjo TS. Expression of MMPs and TIMPs in healthy and diseased human gingival. J of Periodontol. 2006. 74:188-95.

15. Holliday LS, Vakani A, Archer L. Effects of matrix metalloproteinase inhibitors on bone resorption and orthodontic tooth movement. J Dent Res 2003; 82:687-91

16. Bildt MM, Bloemen M, Kuijpers-Jagtman AM. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement. European J of Orthod 2009; 31:529-35.

17. Leonardi R, Talic NF, Loreto C. MMP-13 (collagenase 3) immunolocalisation during orthodontic tooth movement in rats. ActaHistochemica. 2007; 109:215-20.

18. Garlet TP, Coelho U, Silva JS. Cytokine expresiion pattern in compression and tension sides of periodontal ligament during orthodontic tooth movement in humans. European J.of Oral Sci 2007; 115:355-62.

14

14