ministrs spanish

NEAFS CE-DNA Workshop (Butler and McCord) Sept 29-30, 2004

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/NISTpub.htm 1

La Aplicación de Grupos de 'Primers' de STR de tamaño reducido en el Análisis de ADN

Humano de Muestras Degradadas o Comprometidas

Bruce R. McCordInternational Forensic Research

InstituteFlorida International University

[email protected]

WTC Disaster

Pero qué pasa con el ADN degradado?

Material esquelético siendo preparado para extracción

Dichas muestraspresentan un reto especial

Estuches de 'Multiplex' Grandes proveen AnálisisEfectivo y Rápido de Muestras de Ofensores

ConvictosJane Doe231657

Degradación de ADN

N

NO

OCH3

H

R

HOHO

Thymine glycol

1. Rompimiento de cadena

2. Dímeros de Pirimidina

3. Oxidación química ehidrolisis

4. Degradación Bacterianay contaminación por metales



Daño Hidrolítico al ADN

Shepard, T.L.; Ordoukhanian, P.; Joyce, G.F. A DNA enzyme with N-glycosylase activity. Biochemistry 2000, 97, 7802-7807.

Deaminación

Griffiths, A.J.F.; Gelbart, W.M.; Lewontin, R.C.; Miller, J.H. Gene Mutation: Origins and Repair Processes. Modern Genetic Analysis, 2nd Edition; W.H. Freeman: New York, NY 2002; Chapter 10

Daño Oxidativo al ADN

Sonntag, C. V. Polynucleotides and DNA. The Chemical Basis of Radiation Biology, Taylor & Francis, Inc. Philadelphia, PA 1987; Chapter 9



Powerplex 16 9947A Positive Control 0.250 ng/ 12.5 ul

Muestra de Hueso 2003.5.6

0.250 ng/ 12.5 ul

Degradación de ADN Note loss of intensity of larger alleles

ADN Degradado

1. Fragmentación debido al ambiente

2. Presencia de inhibidores de PCR

Resultado

1. Pobre eficiencia de amplificación

2. Desbalance de Picos y decaimientoalélico

Decaimiento AlélicoMuestra era un 8,11

Umbral de Señal-Ruido

AmplificaciónNo-específica

Umbral Estocástico

El Problema con ADN Degradado

Muestra: ADN Digerido con Dnase I

Desbalance de Picos



Périda de Intensidad en 'Loci' Grandes

DecaimientoAlélico

DecaimientoAlélico

Sobresaturación

“Pull up”

“Pull up”-A peak

El Método 'Miniplex'

• Rediseñar 'primers' para hacer cada'amplicon' de STR lo más corto posible

• Evitar traslapo teniendo solo un 'locus' por cada color de tinte

• Desarrolloar sistemas especializados de STR para ADN degradado

• Proveer una alternativa a mtDNA paraplantilla de ADN degradado

Diseño de Primer para 'Multiplexes' Grandes

Region de Repetición

Region ConstanteEnlace de 'Primer'

*

Localización de 'primer' es definida por restricciones de 'multiplex' e hibridación limpia



Diseño de 'primer' para Miniplex

'Primers' están localizados lo más cerca posible a la regiónde repetición

Región de Repetición

Región ConstanteEnlace de 'Primer'

*

Grupos de 'Primers' Para MiniplexSTR

6FAM VIC NEDMiniplex 1 TH01 CSF1PO TPOXMiniplex 2 D5S818 D8S1179 D16S539Miniplex 3 FGA D21S11 D7S820Miniplex 4 VWA D18S51 D13S317Miniplex 5 Penta D Penta E D2S1338

"Big Mini" TH01, FGA CSF, D21 TPOX, D7

TH01

CSF1P0

CSF1P0

THO1

TPOX

Miniplex 1 vs Powerplex 16



TPOX

CSF1PO

TH01

D7S820

D21S11

FGA -71 bp-71 bp

-33 bp-33 bp

-117 bp-117 bp

-105 bp-105 bp

-191 bp-191 bp

-148 bp-148 bp

Marcador de Big Mini

Resultados PowerPlex® 16

J. Butler - NIST

AMELD3S1358

TH01 TPOX

Penta D

Penta EFGA

D21S11

D18S51

CSF1P0

D16S539D7S820D13S317D5S518

VWA

D8S1179

Comparación entre resultados de estuches MiniSTR y estuches comerciales

ADN Inicial Degradado - NIST

Tamaño de producto de PCR (bp)

Set of 92 aged blood stains tested; ambient storage for 15 years on untreated paper

TH01TPOX CSF1PO D21S11

D7S820

FGA

Resultados Big Mini (miniplex 1&3)

-191 bp-191 bp

Validación de Desarrollo

• Especimenes Estándar y Reproducibilidad

• Sensitividad• Balance de Picos• 'Stutter'• Número de Ciclos• Volumen de Reacción• Concentración de Magnesio• Concentración de polimerasa• Temperatura de Enlace• Condiciones ambientales• Estudios de Matriz• Estudios de Mezclas• No-Humano

• Concentración de 'Primer'

Genotipos Consistentes para todas lasmuestras analizadas125 pg – 250 pg Óptimo>60% a 125 pg ó más<15%30 a 33 (degradado/LCN)10-25 µL1.5-2 mM2 U/25 µL55 °CNo decaimiento alélicoNo pérdida de amplificación excepto papelMenor visible a 1:9Chimp (1 ng/25 µL), Ratón (Off-ladder)M2: 0.4,0.4,0.2M4: 0.4,0.4,0.56BM: 0.16,0.16,0.2,0.24,0.24,0.32



Publicaciones hasta el momento

• Opel K. L.; Chung, D. T.; Drábek, J.; Tatarek, N. E.; Jantz, L. M.;. McCord, B.R.; The Application of MiniplexPrimer Sets in the Analysis of Degraded DNA from Human Skeletal Remains, J. Forensic Sciences, 2006, 51(2), 351- 356.

• Drábek, J.; Chung, D.; Butler, J.; McCord, B. Concordance study between Miniplex assays and a commercial STR typing kit, J. Forensic Sciences, 2004, 49(4), 859-860.

• Butler, J.; Buel, E.; Crivelente, F.; McCord, B. Forensic DNA typing by capillary electrophoresis, Electrophoresis, 2004, 25 (10-11), 1397-1412.

• Chung, D.; Drabek, J.; Opel, K.; Butler, J.; McCord, B., A study on the effects of degradation and template concentration on the amplification efficiency of the STR miniplex primer sets, J. Forensic Sciences, 2004, 49(4).

• Butler, J.; Shen, Y.; McCord, B. The Development of reduced size STR amplicons as tools for analysis of degraded DNA. Journal of Forensic Sciences, 2003, 48(5), 1054-1064.

• In Preparation:

• Kerry L. Opel.; Denise T Chung; Jiří Drábek ; John M. Butler; and Bruce R. McCord*, Developmental Validation of Reduced-Size STR Miniplex Primer Sets

• Kerry L. Opel1, M.A., Sarah E. Hughes 1,3, B.Sc., Jan Nicklas 4, Ph.D., Eric Buel and Bruce R. McCord, Ph.D., Evaluation and Quantification of Nuclear DNA from Human Telogen Hairs*

Estudios de Concordancia

Mutación de Punto

'Primers' para Multiplex Grande

'Primers' para Miniplex

Desbalance de Picos

Decaimiento Alélico

No Mutación =Concordancia

Estudios de Concordancia

• 542 muestras analizadas – AA, Cau., Hisp.

• 99.8% concordancia con 16 discrepanciasencontradas – muchas de las cuales ocurren en 2 'loci' (d13 y vWA) y envuelve delecionesentre los dos sitios de 'primer'

• Secuenciar estas localizaciones revela la presecia de redundancias interesantes querodean los lugares de enlace de los 'primers' t

• Muestras Asiaticas están siendo analizadas al momento - más muestras necesarias



Discrepacias de muestras entre multiplexes de STR

Ĺocus Origin Miniplex Identifiler PowerPlex161 D13S17 African American 11,13 10,13 10,132 D13S17 Hispanic 14,14 8,14 8,143 D13S17 African American 10,11 9,11 9,114 D13S17 Hispanic 10,11 9,11 9,115 D13S17 Hispanic 10,14 9,14 9,146 D5S818 African American 11,11 11,12 11,127 vWA African American 16,16 12,16 12,168 vWA African American 18,18 13,18 13,189 vWA African American 15,15 14,15 14,15

10 vWA African American 15,15 14,15 14,1511 vWA African American 17,17 14,17 14,1712 vWA African American 17,17 14,17 14,1713 vWA African American 19,19 14,19 14,1914 vWA African American 19,19 14,19 14,1915 vWA African American 19,19 14,19 14,1916 vWA Caucasian 17,18 17,17 17,18

Deleción dentrode 'primers'

Problema con enlace de 'Primer' al Mini

Problema de enlace de 'primer' Ident.

D13S317 'Primers' y Mutaciones

Resultados de Secuencia

0

1000

2000

3000

4000

5000

31.3 62.5 125.0 250.0 500.0

Template Concentration [pg/25μl reaction volume]

Mean Peak Height [RFU]

D5S818

D8S1179

D16S539

Mini 2: Sensitividad



0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

31.3 62.5 125.0 250.0 500.0

Template Concentration [pg/25 μl reaction volume]

Mean Peak Ratio

D16S539

D5S818

D8S1179

Mini 2: Balance de Picos

La Gran Pregunta: ¿Trabaja con ADN degradado?

Método: Examinar el efecot del tamaño de la plantillaen la amplificación de ADN

1) Extraer grandes cantidades de ADN de sangre líquida

2) Digerir con DNaseI3) Cortar secciones con diferentes rangos de tamañoy amplificar4) Comparar con estuche 'multiplex' comercial

Concentracionde Dnase :

0.01 U/ μL

ADN Degradado con DNase I

pGemcontro

l2 m

ins5 m

ins

10 mins

15 mins

20 mins

30 mins

2645 bp1605 bp1198 bp

676 bp517 bp460 bp396 bp350 bp

222 bp179 bp126 bp

AD

N A

isla

do

Chung, D.T., Drabek, J., Opel, K.L., Butler, J.M., McCord, B.R. (2004) A study on the effects of degradation and template concentration on the efficiency of the STR miniplex primer sets. J. Forensic Sci. 49(4): 733-740.



01000200030004000

>1198 ~676-1198

~460-517

~350-460

~222-350

~179-222

<150

Base Pairs

RFU

01000200030004000

>1198 ~676-1198

~460-517

~350-460

~222-350

~179-222

<150

Base Pairs

RFU

“Big Mini” PowerPlex 16

TH01 – 80bp TH01-160bp

FGA- 160 bp FGA-340 bp

02000400060008000

>1198 ~676-1198

~460-517

~350-460

~222-350

~179-222

<150

Base Pairs

RFU

02000400060008000

>1198 ~676-1198

~460-517

~350-460

~222-350

~179-222

<150

Base Pairs

RFU

Chung, D.T., Drabek, J., Opel, K.L., Butler, J.M., McCord, B.R. (2004) A study on the effects of degradation and template concentration on the efficiency of the STR miniplex primer sets. J. Forensic Sci. 49(4): 733-740.

Muestras No-Tradicionales

• La aplicación obvia para Mini-STRs son muestrasque estén degradadas, sean difíciles ó tengan un bajo número de copias

• Hemos llevaco a cabo experimentos para examinarsu sensitividad y– Capacidad para amplificar ADN de cabello y huesos– Capacidad para amplificar ADN proveniente de muestras

degradadas– Gran pregunta: ¿Cómo determinar la calidad y cantidad de

ADN de bajo nivel?

AND extraído de los cuerpos sometidos a varias condiciones ambientales

En cooperación con el Centro de Antropología Forense, University of Tennessee, Knoxville, TN

Experimentos con muestras de huesodegradadas



Decaimiento Alélico: Estuche de ADN EstándarPromega Powerplex 16

100 bp 400 bp300 bp200 bp

D5 D13 D7 Penta DCSFD1681% 23% 16%61% 58% 39%

D3 Penta ETH01 D18D21100% 23% 16%76%97%

vWAA FGATPOXD8

90% 74% 35%61%87%

Rango de Tamaños

Decaimiento Alélico: 'Loci' de Miniplex

100 bp 200 bp

D5S818 94%

D16S539 94%

D8S1179 97%

Miniplex 2

100 bp 200 bp

vWA 100%

D13S317 91%

D18S51 97%

Miniplex 4

100 bp 300 bp200 bp

TPOX D7S82090%100%

TH01 FGA

100% 90%CSF1PO D21S11

90% 68%

Big Miniplex

Determinación de Calidad de ADN por qPCR

Diseño de 'Primer'

0.0 ng

5.0 ng1.3 ng

0.31 ng0.078 ng

Ct

Cuantificación Real Timecon Sybr Green

'Primers' AluYa5 –Jan Nicklas y Eric Buel



Cuantificación de muestras de Hueso: 'Primers' Alu Cortos v. LargosQuantification of Bone Samples: Short vs Long Alu Primers

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

9947

A

2003

.4.1

2003

.5.6

2003

.5.7

2003

.5.1

2003

.5.2

2003

.5.3

2003

.5.8

2003

.5.16

2003

.5.22

2003

.5.25

2003

.5.26

2003

.5.29

Muestra

Con

cent

raci

ón(n

g/uL

)

'Primers' Alu Cortos 'Primers' Alu Largos

Resultados Cuantitativos para Muestras de Cabello con 3 'Primers' Alu

Quantification with 3 Alu Primers

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

PC S1 S2 D6 C3 C5 C6 R1 R2 R3

Muestra

ng/u

L

82

124

201

Nuclear DNA Extracted from Telogen Hairs

0

20

40

60

80

100

120

Samples

pg/μ

L

ADN Nuclear Extraído de Cabello en etapa TelógenoPromedio de ADN Extraído, Individuos

<10 pg/uL72%

11 to 25 pg/uL18%

>25 pg/uL10%

<10 pg/uL 11 to 25 pg/uL >25 pg/uL



Muestra Amplificada – Powerplex

5 µL Extracto de cabello, 12.5 µL volumen de reacción, 32 ciclos

100 pg ADN control, 12.5 µL volumen de reacción, 32 ciclos

Muestra Amplificada - Miniplex

5 µL Extracto de cabello, 12.5 µL volumen de reacción, 0.5 µL BSA

añadido, 32 ciclos

100 pg ADN control, 12.5 µL volumen de reacción, 0.5 µL BSA añadido, 32 ciclos

Nuevo 'loci' de miniSTR (no-CODIS) Bajo Investigación

Coble, M.D. and Butler, J.M. (Jan 2005) J. Forensic Sci., in press

STR Sequence Allele Size Range ObservedLocus Motif Range (bp) Heterozygosity

D1S1677 (GGAA) n 9-18 81-117 0.75

D2S441 (TCTA) n 9-17 78-110 0.76

D4S2364 (GAAT)(GGAT)(GAAT) n 8-12 67-83 0.53

D10S1248 (GGAA) n 10-20 83-123 0.78

D14S1434 (GATA) n(GACA) n 13-20 70-98 0.68

D22S1045 (TAA) n 5-16 76-109 0.77



6FAM (blue)

(blue)

VIC (green)

(green)

NED (yellow)

(yellow)

D10S1248

D22S1045

D14S1434

Tamaño de Producto de PCR (bp)

D14S1434

D10S1248

D22S1045

Marcadores Alélicos NIST

.

Miniplex "NC01"

Coble and Butler (2005) Characterization of new miniSTR loci to aid analysis of degraded DNA J. Forensic Sci. 50(1): 43-53

http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/miniSTR.htm

Artículo Abogando por miniSTRsRecomendaron que los miniSTRs “fuesen adoptadoscomo la manera de aumentar ambos la sesitividad y capacidad de análisis."

Recomendaron que los laboratorios Europeosadoptaran tres nuevos 'loci' de mini-STR loci: D10S1248, D14S1434 and D22S1045. (Cambiosactualizados: D2S441 por D14S1434)

Conclusiones

• MiniSTRs son para ADN degradado• Data de validación revela una amplificación de

'multiplex' capaz y sensitiva• Gelatina virtual utilizando qPCR ayuda a obtener los

resultados analíticos apropiados• Efectos estocásticos todavía ocurren con muestras por

debajo de 125 pg• Mejores resultados son posibles para cabello en

telógeno y huesos



Reconocimientos

Dr. John Butler, Michael Coble, NISTDr. Jan Nicklas, Vermont Crime LabDr. Eric Buel, Vermont Crime LabDr. Yin Shen, Ohio UniversityDr. Denise Chung, Harvard Medical SchoolDr. Jiří Drábek, Czech RepublicDr. Nancy Tatarek, Ohio UniversityDr. Lee Meadows-Jantz, University of Tennessee

NIJ Grants 2002-IJ-CX-K007 and 2005-MU-BX-K073

Grupo McCordKerry OpelAda Nunez

Rayna HebardDesiree DiazCarla Turner

Megan BottegalSacha DehereStella Rohas

Madai Gomez

ministrs spanish

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