mikrobiološka dijagnostika tuberkuloza
DESCRIPTION
Seminar, MLD izvanredni II.godinaTRANSCRIPT
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
MEDICINSKI FAKULTET RIJEKA
Braće Branchetta 20
Rijeka
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE
Kolegij: Laboratorijska dijagnostika tuberkuloze
Voditeljica kolegija: prof.dr.sc. Brigita Tićac, dr.med .
II. godina MLD izvanredni
Rijeka, svibanj 2014.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
2
Sadržaj 1. UVOD .................................................................................................................................................. 3
1.1. TUBERKULOZA I KLINIČKE MANIFESTACIJE ................................................................................... 3
1.1.1. EPIDEMIOLOGIJA .................................................................................................................... 4
1.1.2. PATOGENEZA ......................................................................................................................... 4
1.2 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (taksonomija. morfologija, patogenost) ................................... 6
1.3 NACIONALNI NAPUTAK ZA SUZBIJANJE TUBERKULOZE U RH ......................................................... 8
2. MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE ................................................................................ 13
2.1. PRIKUPLJANJE,TRANSPORT I POHRANJIVANJE UZORKA ............................................................... 13
Opća načela uzimanja uzoraka ....................................................................................................... 13
2.2 MIKROBIOLOŠKA OBRADA UZORKA ............................................................................................ 15
2.2.1 PRIPREMA UZORKA .............................................................................................................. 16
2.2.2 MIKROSKOPSKA PRETRAGA ................................................................................................... 17
2.2.2.1. Dokazivanje prisutnosti bacila tuberkuloze u mikroskopskim preparatima obojenim po
Ziehl-Neelsenu ............................................................................................................................... 19
2.2.3 KULTIVACIJA .......................................................................................................................... 21
2.2.3.1. Čvrste podloge .............................................................................................................. 22
2.2.3.2. Tekuće podloge ............................................................................................................. 24
2.2.3.3.Testovi ispitivanja osjetljivosti na antituberkulotike ....................................................... 28
2.2.4. DETEKCIJA ANTIGENA .......................................................................................................... 29
2.2.5. MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE ..................................................................... 31
2.3. PPD-TEST .................................................................................................................................... 33
2.4 IGRA ( interferon-gamma release assay )...................................................................................... 35
QuantiFERON – TB Gold In – Tube .............................................................................................. 35
2.4.2 Opis postupka ....................................................................................................................... 36
Literatura ............................................................................................................................................. 39
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
3
1. UVOD
1.1. TUBERKULOZA I KLINIČKE MANIFESTACIJE Tuberkuloza je zarazna bolest koju uzrokuje Mycobacterium tuberculosis (Kochov
bacil) od koje su bolovali i ljudi u pred povijesno doba, a pronađena je i na skeletu egipatskih
mumija koje datiraju čak i do 3000 godina prije Krista. Kulminacija zaraze tuberkulozom odvijala
se tijekom 17-og i 18-og stoljeća. Najveće zasluge u borbi protiv tuberkuloze pripadaju
Robertu Kochu koji je 24. ožujka 1882. godine objavio otkriće uzročnika tuberkuloze, pa se po
njemu uzročnik tuberkuloze još naziva i Kochov bacil.
Mycobacterium tuberculosis tipično zahvaća pluća ali može zahvatiti i druge organe kao
što su mozak, bubrezi i kosti. Prenosi se kapljičnim putem, zrakom, kihanjem i kašljanjem. U
većini slučajeva bolest je asimptomatska i latentna, ali u jednom od oko 10 slučajeva napreduje
u aktivnu bolest. Neliječena TBC dovodi do smrti u više od 50% bolesnika. Klasični simptomi
aktivne TBC infekcije su kronični kašalj s hemoptizom (krvavi iskašljaj), vrućica, noćno znojenje
i mršavljenje. Tuberkuloza se još naziva i sušica upravo zbog toga što bolesnici gube tjelesnu
masu. Za postavljanje dijagnoze koriste se radiološke slike pluća, mikroskopske pretrage
tjelesnih tekućina i mikrobiološki uzgoj uzročnika bolesti. U liječenju tuberkuloze koriste se
antibiotici - antituberkulotici: streptomicin, pirazinamid, etambutol, izonijazid i rifampicin.
Sredinom dvadesetog stoljeća u liječenje se uvodi i kemoterapija. Prevencija se provodi
cijepljenjem djece cjepivom BCG (Calmette-Guerin) koje je obavezno u Republici Hrvatskoj.
Iako se smatralo da je tuberkuloza pobijeđena bolest, krajem 70-ih i 80-ih godina dvadesetoga
stoljeća javlja se ponovno suočavanje sa tuberkulozom zbog pojave virusa HIV-a koji dovodi
do gubitka imunosti, te su takvi bolesnici izuzetno podložni razvijanju tuberkuloze.
Tuberkuloza je još uvijek najčešća zarazna bolest u svijetu. Prema podacima SZO-a
jedna trećina svjetske populacije zaražena je Mycobacterium tuberculosis, najvećim dijelom na
području Azije. 24. ožujak obilježava se kao svjetski dan borbe protiv tuberkuloze.
LITERATURA:
hr.wikipedia.org/wiki/sušica,
skripta prof.dr.sc. Brigite Tićac
KRISTINKA MRVOŠ
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
4
1.1.1. EPIDEMIOLOGIJA
Mycobacterium tuberculosis je obligatni uzročnik bolesti u ljudi. Čovjek je jedini prirodni
domaćin, bolest se prenosi s bolesne na zdravu osobu udisanjem inficiranog aerosola koji
nastaje pri govoru, kašljanju i kihanju. Aerosol može nastati i tijekom indukcije iskašljaja,
liječenja, bronhoskopije ili rukovanjem inficiranim uzorcima u bolnici i laboratoriju.
Najugroženije su osobe u prisnom kontaktu s oboljelima, naročito djeca. Tuberkuloza ostaje
jedna od najsmrtonosnijih bolesti u svijetu, zahvaća znatan dio svjetske populacije. Procjenjuje
se da se svake godine pojavi oko 8-9milijuna novih slučajeva i približno 2-3 milijuna osoba
umire. Veliki broj slučajeva bolesti javlja se kod osoba zaraženih HIV infekcijom stoga je najveća
stopa incidencije tuberkuloze u subsaharskoj Africi gdje je prevalencija HIV infekcije vrlo visoka.
1.1.2. PATOGENEZA
U većini slučajeva primarna infekcija s bacilima tuberkuloze dogodi se jednom u životu.
Studije su pokazale da 10% inficiranih osoba razvija aktivni oblik bolesti tijekom života. Razvoj
bolesti u prvih 1-2 godine nakon infekcije nazivamo primarnom tuberkulozom. Primarna
tuberkuloza naziva se i prvotnom infekcijom ili dječjom tuberkulozom a označava infekciju u
nesenzibiliziranom domaćinu. Mjesto prve infekcije naziva se Ghonovo žarište, i najčešće je
smješteno subpleuralno iznad ili ispod interlobarne fisure. Nakon ulaska u alveole mikobakterije
se najprije nesmetano umnožavaju, dok ne nastupi stanična reakcija u kojoj dominiraju CD4
limfociti i makrofagi. Makrofagi fagocitiraju bacile pokušavajući ih otkloniti stoga može se reći da
imaju ključnu ulogu u reakciji na Mycobacterium tuberculosis. Aktivaciji makrofaga značajno
pridonosi interferon γ. Nakon digestije fagocitiranih bacila makrofagi prezentiraju antigene CD4
limfocitima pri čemu nastaju karakteristični granulomi-tuberkuli koji su karakteristični za reakciju
kasne preosjetljivosti. Aktivirani se makrofagi diferenciraju u epiteloidne stanice ili se udružuju u
Langerhansove divovske stanice. U središtu tuberkula dolazi do odumiranja epiteloidnih stanica,
dolazi do nastanka kazeozne nekroze.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
5
Slijed događaja pri primarnoj pulmonalnoj tuberkulozi, što započinje inhalacijom virulenta M.tuberculosis i
kulminira razvojem staničnog imunog odgovora na organizam. (A) označava događaje u prva 3 tjedna
nakon izlaganja, a (B) događaje poslije. Razvoj otpornosti na organizam popraćen je pojavom pozitivnog
tuberkulinskog testa. [iNOS - inducible nitric oxide synthase; MHC - major histocompatibility complex;
MTB - M.tuberculosis; NRAMP1 - natura resistance-associated macrophage protein].
Makrofazi fagocitiranjem bacila uklanjaju velik broj uzročnika ali neke bakterije ipak
prežive unutar makrofaga. S obzirom na to da je Mycobacterium tuberculosis fakultativni
unutarstanični patogen u nekim slučajevima dolazi do razmnožavanja Mycobacterium
tuberculosis unutar makrofaga. Mnogi makrofagi nakrcani bacilima budu uništeni, a
mikobakterije se brzo šire kroz plućne limfne žile u regionalne limfne čvorove. U limfnim
čvorovima razvije se tuberkulozna upala, a čvorovi se znatno povećaju. Primarna plućna
promjena zajedno sa zahvaćenim regionalnim limfnim čvorovima naziva se Ghonov
kompleks.Ishod primarne tuberkulozne infekcije ovisi o: virulenciji mikobakterija, broju
mikobakterija koje su ušle u pluća, prirodnoj otpornosti organizma i sposobnosti organizma da
mobilizira limfocite i počne stavarati granulome.
Na latentno preboljelu upalu upućuje pozitivan tuberkulinski test. Aktivna plućna
tuberkuloza najizraženija je u djece predškolskog uzrasta kod kojih dolazi do razvoja
limfadenitisa hilusa i hematogene diseminacije. U starije dijece i adolescenata dominira
limfadenopatija uz dugogodišnju regresiju i kalcifikaciju žarišta. U imunosuprimiranih ili
kahektičnih bolesnika koji nemogu mobilizirati CD4 limfocite u obrani od infekcije, bacili
tuberkuloze mogu ući u limfne ili krvne žile i bronhe i proširiti se po plućima u obliku milijarne
tuberkuloze. U bolesnika koji su preboljeli primarnu tuberkulozu i razvili staničnu imunost protiv
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
6
bacila tuberkuloze razvija se sekundarna tuberkuloza, koja može biti posljedica reinfekcije ili
reaktivacije bacila koji su ostali u latentnom stanju u ovapnjenim žarištima primarne
tuberkuloze. Javlja se eksudativni tip pneumonije s kazeifikacijom i kavernama. Klinički znakovi
bolesti su: umor, slabost, gubitak apetita i tjelesne težine, subfebrilna temperatura i noćno
znojenje. Plućnu tuberkulozu prati dugotrajni kašalj. Meningitis se može razviti postepeno uz
glavobolje i ispade funkcija moždanih živaca a milijarna tuberkuloza je akutni oblik diseminirane
infekcije u više organa karakteriziran mnogobrojnim čvorićima – tuberkulima uz visoku
temperaturu i tresavicu te visoku smrtnost.
U odrasloj dobi primarni oblik bolesti ne razlikuje se od sekundarnog.
LITERATURA:
G.Mlinarić Galinović, M.Ramljak Šeko i suradnici, Specijalna medicinska mikrobiologija i parasitologija
www.perpetuum-lab.com.hr/wiki/mikrobiologija tuberkuloze
SANDRA PAVLETIĆ
1.2 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS (taksonomija. morfologija, patogenost)
Rodu Mycobacterium pripada više od 100 vrsta koje su široko rasprostranjene u prirodi
osobito u vodenim sredinama. Razlikuju se s obzirom na brzinu rasta te ih dijelimo na brzo i
sporo rastuće mikrobakterije. Za ljude su kao obligatni patogeni značajni pripadnici svrstani u
Mycobacterium tuberculosis kompleks (M. tuberculosis. M. caprae, M. bovis M. africanum)
uzročnici tuberkuloze i vrsta M. lepre koja u čovjeka uzrokuje lepru. Po užetu nazvanih corde
serpentine fenomen. Za uzgoj mikro bakterija koriste se različita obogaćena umjetna hranilišta a
najčešće Lӧwenstein – Jensen (LJ) podloga koja sadrži jaja, glicerol, krumpirovo brašno i
malahitno zelenilo koje inhibira rast drugih bakterija. Na čvrstim hranilištima kolonije uzročnika
tuberkuloze se uočavaju tek nakon 2 do 8 tjedana inkubacije u aerobnim uvjetima na 350 C do
370C. Kolonije su obično blijede do svijetložute boje, nepravilnih rubova, suhe, izdignute i
neravne nalik cvjetači. Pripadnici M. tuberculosis kompleksa su nepokretni, nesporogeni štapići
bez kapsule. U preparatima se uočavaju kao ravni ili lagano savijeni pojedinačni štapići u
manjim nakupinama dok se u tekućim podlogama pojavljuju u vidu dugačkih, isprepletenih
mikrokolonija. Uzročnici tuberkuloze preživljava u mlijeku, organskim materijalima i okolišu sve
dok do njih ne dospiju UV zrake na koje su izuzetno osjetljivi. Osjetljivi su na temperature
pasterizacije, alkohol, glutaraldehid, hipokloite i fenolne dezinficijese. U odnosu na druge
bakterije rezistentnije su na djelovanje kiselina, baza i kvaternih amonijevih spojeva. Teško
bojenje uzročnika tuberkuloze je razlog da je otkriven dugo iza upoznavanja njegove
prenošljivosti. Kochu je pomogao slučaj. Zaboravio je na preparatima bojilo i da bi grešku
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
7
popravio odbrojavao ih je sodom. Urođena znatiželja ga je privukla mikroskopu da bi vidio i te
„pokvarene“ preparate. Ta znatiželja bila je nagrađena otkrićem bacila. Što je zauvijek proslavilo
njegovo ime.
Mycobacterium tuberculosis
Morfološka građa:
Nepokretan štapić (bacil)
Asporogen
2 – 4 µm duljine
0.2 – 0.5 µm širine
Obligatni aerob, fakultativni unutar stanični parazit, karakterističan po građi staničnog
zida jedinstvenog među prokariotima i ključnog za virulenciju. Virulencija onemogućava učinak
kationskih proteina, lizozima i radikala kisika u granulama fagocita. Štiti ekstra celularne bacile
od deponiranja komplementa u serumu. Sadrži preko 60 % lipida, peptidoglikane,
arabinomanane, 50 % mikolične kiseline. Mikroskopski preparati boje se po Ziehl – Neelsen.
Bojenje koristi specifičnist staničnog zida da se odupre odbojavanju kiselim alkoholom.
Generacijsko vrijeme 15 – 20 h, kolonije se uočavaju tek nakon 4 – 6 tjedana na čvrstom
hranilištu. „Cord“čimbenik (lipoarabinomanan) nastaje iz trehalozadimikolata kod virulentnih
sojeva M.tuberculosis.
Površinski glikolipid koji blokira aktivaciju makrofaga pod utjecajem INF¥.
Inducira sekreciju TNFα, Inhibira migraciju PMN, Toksičan za stanice sisavaca.
Tuberkuloza se prenosi uglavnom tijekom prolongiranog kontakta s bolesnikom
inhalacijom kontaminiranih kapljica nastalih prilikom govora i kašljanja, a primarna infekcija se
obično razvija u plućima (Ghon-ovo žarište) i regionalnim (hilusnim) limfnim čvorovima (Ghon-
ov kompleks), obično je asimptomatska. Inkubacija je 4 – 12 tjedana.
Virulencija uzročnika tuberkuloze zavisi od njegove sposobnosti preživljavanja u
makrofagu pod utjecajem interleukina koje izlučuju senzibilizirani limfociti T stvaraju se oko
makrofaga karakteristični granulomi čije središte je ispunjeno kazeoznom nekrozom. Simptomi
bolesti slabo su izraženi i podmukli. Obični su to subfebrilne temperature, noćno znojenje,
umor, gubitak teka i tjelesne težine. Tkiva i organi koji se odlikuju visokim zasićenjem kisika
osobito su pogodni za razmnožavanje uzročnika tuberkuloze. To su prije svega gornji djelovi
pluća, mozak, kralješci, bubrezi i druge kosti.
LITERATURA:
Vježbenica iz kolegija „ Medicinska bakteriologija i virologija“
MAKSIMOVIĆ JASNA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
8
1.3 NACIONALNI NAPUTAK ZA SUZBIJANJE TUBERKULOZE U RH
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
9
Klinička dijagnostika je skup dijagnostičkih pretraga prilikom utvrđivanja tuberkuloze, a
sastoji se od različitih postupaka koji u konačnici potvrđuju ili odbacuju sumnje na tuberkulozu.
Osnovne su propedeutičke vještine uzimanje kvalitetne anamneze i fizikalni pregled.
Anamneza je značajna zbog dobivanja informacija o općim i specijalnim znakovima koji
ukazuju na možebitni tuberkulozni proces. U anamnezi se navode i činjenice o zdravstvenom
stanju ostalih ukućana ili bliskih osoba od kojih bi netko moga biti potencijalni izvor zaraze.
Fizikalni pregled i nalazi oboljelog nisu specifični, premda bi trebali imati svrhu
razaznavanja simptoma tuberkuloze.
Kožni test tuberkulinom (PPD) i IGRA testiranje koristi se za dokazivanje imunološkog
odgovora na infekciju bacilom tuberkuloze.
Hematološke i biokemijske pretrage najčešće se koriste u ispitivanju funkcije jetre,
bubrega i gušterače, odnosno u slučaju komplikacije tuberkuloze.
Endoskopske pretrage (osobito bronhoskopske) indicirane su kad se sumnja na
tuberkulozu bronha i laringsa. Bronhalnih komplikacija (fistule i stenoze) i u diferencijalnoj
dijagnostici.
Testovi respiratorne i plućne cirkulacije imaju poseban značaj nakon završenog liječenja
bolesnika kako bi se procijenilo potencijalno oštećenje ili invaliditet.
6.1.1. Otkrivanje i dijagnostika tuberkuloze u bolesnika s HIV infekcijom
HIV infekcija mijenja kliničku sliku tuberkuloze i komplicira njezinu dijagnozu. HIV
infekcija povećava rizik od progresije nedavne infekcije bacilom tuberkuloze ili reaktivaciju
latentne infekcije za 5 – 15% godišnje, ovisno o stupnju imunodeficijencije.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
10
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
11
6.2.1. Metode u mikrobiološkoj dijagnostici tuberkuloze
6.2.1.1. Metode konvencionalne mikrobiološke dijagnostike tuberkuloze
6.2.1.2. Brza dijagnoza tuberkuloze
6.2.1.3. Testovi ispitivanj osjetljivosti na antituberkulotike
6.2.1.4. Genotipizacija sojeva M. tuberculosis
6.2.2. Standardi za broj i ritam bakteriološke pretrage na tuberkulozu (algoritam)
Broj i ritam mikrobioloških pretraga
6.2.2.1. Prije početka terapije
6.2.2.2. Tijekom terapije
6.2.2.3. Nakon završetka terapije
6.2.2.4. Kod bolesnika s inaktivnom tuberkulozom
6.2.2.5. Recidivi tuberkuloze
6.2.2.6. Bolesnik s kroničnom tuberkulozom
6.2.2.7. Za ocjenu radne sposobnosti
6.2.2.8. Uzorci sputuma svih osoba koje su u kontaktu s aktivnom tuberkulozom
6.2.2.9. Uzorci sputuma osoba koje su ranije liječene od tuberkuloze
6.2.3. Uzimanje i slanje uzoraka za pretragu na tuberkulozu
Opća načela uzimanja uzoraka
6.2.3.1. uzimanje uzoraka
6.2.3.2. slanje uzoraka
6.2.4. Laboratorijska prijava BK pozitivnih bolesnika
6.2.5. Organizacija laboratorijske službe za mikrobiološku dijagnostiku tuberkuloze
6.2.5.1. Prva i druga razina
6.2.5.3. treća razina
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
12
6.2.6. L12
Laboratorijska dokumentacija
U laboratorij se šalje klinički uzorak popraćen čitko ispunjenom uputnicom gdje se vodi
dvostruka evidencija.
6.3. Radiološka dijagnostika tuberkuloze
6.3.1. Algoritam pretraga
6.3.2. prva razina (primarna zdravstvena zaštita)
6.3.3.druga razina (specijalističko konzilijarna)
6.3.4. treća razina (klinička ustanova)
6.4. Histološka dijagnoza tuberkuloze
Upalne promjene izazvane bacilom tuberkuloze imaju karakterističnu histološku sliku
6.5. Dijagnostika dječje tuberkuloze
6.5.1. posebne karakteristike tuberkuloze u djece
6.5.2. Dijagnoza tuberkuloze u djece
Djeca su jako podložna tuberkulozi koja je otporna na lijekove kao i tuberkulozi koja je osjetljiva
na lijekove. Na rezistentni oblik tuberkuloze treba posumnjati ako je prisutna bilo koja od
sljedećih karakteristika:
1. Karakteristike kod izvornog pacijenta koje ukazuju rezistentnu tuberkulozu
2. Karakteristike djeteta kod kojeg se sumnja na rezistentnu tuberkulozu
MAKSIMOVIĆ JASNA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
13
2. MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE
Mikrobiološka dijagnostika tuberkuloze temeljni je i obavezni dio svakog nacionalnog
programa za suzbijanje tuberkuloze. Bitna je u postavljanju dijagnoze, otkrivanju novooboljelih,
odabiru terapije i praćenju uspješnosti liječenja.
2.1. PRIKUPLJANJE,TRANSPORT I POHRANJIVANJE UZORKA
Opća načela uzimanja uzoraka
Količina i kvaliteta uzoraka, čuvanje i transport te metode koje se koriste u laboratoriju
direktno utječu na konačni rezultat pretrage.
Tuberkuloza može zahvatiti svaki organ te se različiti klinički uzorci, kao likvor, pleuralni,
perikardijalni i peritonealni punktat, gnoj, bris fistule, bioptički materijal, menstrualni sekret,
stolica i krv mogu poslati na bakteriološku pretragu na tuberkulozu..
Uzimanje uzoraka:
1. Iskašljaj (sputum) – za pretragu je najpogodniji prvi jutarnji iskašljaj, natašte u količini
3- 5 ml. Preporuča se poslati 3 različita uzorka (povećati do 6, ako su 1. i 2. uzorak
mikroskopski negativni) uzeta pod istim uvjetima: ujutro, nakon propisane toalete usne šupljine,
duboki iskašljaj (ne ispljuvak). Uzorak se spremi u sterilnu posudu s poklopcem na navoj i
dostavlja u laboratorij u roku 2 sata. Pacijentu treba točno objasniti što se od njega očekuje
prilikom uzimanja uzorka. Može mu se dati dodatno pismeno uputstvo. Prozirna pljuvačka ili
nazofaringealni sekret nisu sputum i nemaju značaja u dijagnostici tuberkuloze. Zdravstveni
radnici trebaju biti oprezni ako se uzorak sputuma uzima u samom laboratoriju jer prilikom
kašljanja može nastati aerosol koji sadrži bacile tuberkuloze. Prilikom prijema uzorka treba
provjeriti da li je posuda ispravno zatvorena da materijal ne bi iscurio van. Isto je tako važno
provjeriti da li je uzeta dovoljna količina uzorka.
2. Inducirani iskašljaj – postoji nekoliko načina da se dobije inducirani iskašljaj. Najčešće se
koristi postupak inhalacije hipertoničnom otopinom natrijeva klorida (3–5%). Nakon inhalacije
bolesnik miruje oko 10 minuta i potom iskašljava. Inducirani iskašljaj je vodenast i podsjeća na
slinu te ga je potrebno posebno označiti.
3. Aspirat bronha, bronhoalveolarni lavat – na pretragu se šalje cijeli uzorak, uz što manji
sadržaj anestetika, koji može spriječiti rast bacila tuberkuloze.
4. Obrisak larinksa – uzima se ujutro, natašte, kod bolesnika koji ne može dati iskašljaj. Bris je
prije uzimanja uzorka potrebno namočiti u sterilnu destiliranu vodu ili u fiziološku otopinu,
metalni dio lagano savinuti da prati krivinu jezika. Neposredno prije uzimanja uzorka bolesnik se
mora nakašljati.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
14
5. Želučani lavat – često se uzima kod djece koja ne mogu dati iskašljaj ni nakon
inhalacije aerosolom. Aspirira se 50 ml želučanog sadržaja rano ujutro dok je bolesnik još u
krevetu, nakon što je mirovao najmanje 8–10 sati. Uzorak je potrebno neutralizirati s Na2HPO4
odmah po uzimanju (na 35–50 ml lavata dodati 1,5 ml 40% Na2HPO4).
6. Urin – preporučuje se sukcesivno uzimanje jutarnjeg urina (srednji mlaz) u tri do pet
različitih dana (30–50 ml). Uzorke urina potrebno je što prije (najbolje isti dan) poslati u
laboratorij, a ako to nije moguće, do dostave ih čuvati u hladnjaku.
7. Krv, koštana srž – dezinficirati mjesto uboda alkoholom. Uzeti 5–10 ml krvi u sterilnu
posudicu s navojem i dodati heparin (0,2 mg/ml) ili 1,5 ml 0,35% otopine natrijevog polietanol
sulfata (SPS) na 8,5 ml krvi da se uzorak ne bi zgrušao. Moguće je krv uzeti i direktno u
komercijalno dostupne epruvete sa saponinom »Isolator tube« (Oxoid).
8. Punktati (pleuralni, perikardijalni, peritonealni i dr.) – uzeti što veću količinu,
najmanje 10–15 ml. Preporučuje se uzeti u epruvetu s antikoagulantnim sredstvom (heparin,
natrijev citrat), a nakon uzimanja epruveta se obavezno nekoliko puta okrene.
9. Likvor – uzeti što veću količinu u sterilnu epruvetu bez sredstva protiv zgrušavanja
(5–10 ml, nikako ne manje od 2 ml).
Prikupljanje uzoraka
Uzorke u bolnicama prikuplja medicinsko osoblje po dogovoru. Npr. u OB Zabok šofer je
zadužen da prikupi uzorke sa odjela i dostavi ih u najkraćem roku do druge zdravstvene
ustanove koja obrađuje uzorke!
Slanje uzoraka
Uzorci se uzimaju u propisane plastične sterilne posudice sa zatvaranjem na navoj. Za
transport uzoraka potrebno je dvostruko pakiranje. Svaki uzorak mora biti spakiran na način da
se onemogući izlijevanja sadržaja i da se spriječe drugi nepovoljni utjecaji koji mogu nastati u
toku transporta. Ne smije doći do kontaminacije materijala tijekom transporta. Tokom
transporta uzorke treba držati na niskoj temperaturi i zaštiti od sunca. Na posudici mora biti
velikim slovima napisano ime i prezime oboljelog. Svaki uzorak mora biti popraćen uputnicom.
Uzorke je potrebno dostaviti u laboratorij u roku od 24 sata (ne dulje od 48 sati). Do slanja u
laboratorij sve uzorke treba čuvati na hladnom mjestu, po mogućnosti u hladnjaku na +4 C. Po
dospijeću u laboratorij uzorke bi trebalo preuzeti na posebno odvojenom mjestu. Pri tome treba
koristiti zaštitne rukavice, pažljivo otvarati transportne kutije i pregledati da li ima oštećenih
posuda, i da li su uzorci obilježeni.
LITERATURA:
Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze /NN 083/2012)
KOŠANSKI SNJEŽANA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
15
2.2 MIKROBIOLOŠKA OBRADA UZORKA
Klasična bakteriološka dijagnostika TBC-a se sastoji od četiriju pretraga:
1. Mikroskopije acidorezistentnih bacila
2. Kultivacije na tekućim i čvrstim hranilištima
3. Identifikacije poraslog soja
4. Testa osjetljivosti na antituberkulotike
Tuberkuloza je bolest koja može zahvatiti bilo koji dio i organ ljudskog tijela. S obzirom
na tu činjenicu na mikrobiološku obradu za TBC od materijala koji se najčešće šalje na obradu
su uzorci iz respiratornog sustava (sputum, iskašljaj, bronhoskopski uzorci ispirak želuca kod
djece i žena). Kod izvanplućnih oblika se pretražuje (likvor, urin, krv, tkivo dobiveno biopsijom,
obrisci rana, genitalni obrisci, sadržaj prostate, stolica). Od uzimanja uzorka do dostave u
laboratorij mora proći što manje vremena. Potrebno je dostaviti dovoljnu količinu materijala.
Uzorci se eventualno mogu čuvati u frižideru na +40C kako bi se sačuvala vijabilnost.
Uzorci moraju biti u odgovarajućim posudama sa navojem dobro zatvoreni, moraju biti
pravilno obilježeni i označeni, uputnica mora biti pravilno ispisana, ime i prezime pacijenta,
dijagnoza, i o kojoj se vrsti materijala radi, te spremljena u posebnu foliju kako ne bi došlo do
kontaminacije sa uzorkom. Obzirom da se radi o vrlo infektivnom materijalu svaki laboratorijski
tehničar je odgovoran za vlastitu kao i za sigurnost svojih suradnika. U laboratoriju infekcija
turberkulozom najčešće nastaje udisanjem infektivnog aerosola koji nastaje za vrijeme procesa
rada.
Moramo izbjegavati, smanjiti i kontrolirati sve laboratorijske manipulacije, kod kojih se
stvara aerosol kao što su: odčepljivane posuda sa uzorkom i prelijevanje, odčepljivanje epruveta
tijekom obrade, nalijevanje sredstva za homogenizaciju, odlijevanja supernatanta nakon
centrifugiranja, izrade mikroskopskih preparata, žarenja eze s uzorkom, nasađivanja uzoraka,
puknuća epruvete za vrijeme centrifugiranja te pipetiranja osobito kod ispuhivanja zadnje
kapljice.
Za vrijeme rada moramo provoditi zaštitne mjere. Radna površina mora biti pokrivena
staničevinom koja je natopljena dezificijensom. Radni stol se mora prebrisati dezificijensom
nakon završenog posla. Sve operacije kod kojih postoji mogućnost nastanka zaraznog aerosola
moramo pažljivo izvoditi.
Za vrijeme rada prozori u prostoriji moraju biti zatvoreni, a provjetravanje prostorije se
vrši nakon obavljenog rada. Da zaštitimo sebe moramo nositi zaštitne kute, pregače, maske,
jednokratne rukavice, često prati ruke tijekom radnog procesa i obavezno pranje ruku prilikom
napuštanja laboratorija. Svaki tehničar mora se strogo pridržavati procedure rada i ni jedan se
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
16
postupak ne smije odraditi mimo onoga što je propisano i bez konzultacije sa odgovornom
osobom.
LITERATURA:
Upute za rad u TBC laboratoriju ZZJZ Primorske-goranske županije
Vježbenica iz kolegija Medicinska bakteriologija i virologija
VOLARIĆ STELA
2.2.1 PRIPREMA UZORKA
Bolest koju izaziva Mycobacterium tuberculosis zove se tuberkuloza . Od nje može
oboljeti svaki organ, a najčešće su to pluća. Kao najčešću vrstu uzorka dobivamo iskašljaj, a
može se obrađivati i aspirati bronha, lavati bronha i želuca, urini, pleuralni punktati, brisevi, krv,
ejakulati.
Materijal pristigao u laboratorij mora se posebno obraditi radi uklanjanja popratnih
bakterija i gljivica, u cilju dobivanja što kvalitetnije izolacije Mycobacterium tuberculosis.
Cijeli postupak obrade uzorka mora se vršiti u bio-zaštitnom kabinetu zbog toga što se
bolest prenosi udisajem zaraženog aerosola.
OBRADA UZORKA
1. HOMOGENIZACIJA 2. NEUTRALIZACIJA 3. KONCENTRACIJA
1. HOMOGENIZACIJA
Prebacujemo iskašljaj u 50 mililitarske konične epruvete. Dodajemo jednaki volumen
NALC otopine ( N-ACETYL-L-CYSTEIN otopina NaOH i NaCitrata ). Ovim postupkom vršimo
uklanjanje fiziološke flore.
2. NEUTRALIZACIJA
U epruvetu zatim dodajemo do 40 ml fosfatnog pufera i sve zajedno dobro zatvorimo.
Homogenizaciju tada radimo mućkanjem i vorteksiranjem epruvete. Tim se postupkom bacili
oslobađaju iz stanica, sluzi i staničnog detritusa. Fosfatni pufer zaustavlja proces neutralizacije.
3.KONCENTRACIJA
Centrifugiramo uzorak 15 min na 3000 okretaja.
Odlijemo supernatant u posebnu posudu sa dezinficijensom. Rub epruvete obrišemo sa staničevinom namočenom u dezinficijens koja se odbacuje u
posebnu posudu s dezinficijensom.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
17
Sediment suspendiramo s 1-2 ml fosfatnog pufera.
Inokuliramo na podlogu 0,5 ml. Preparat na predmetnici napravimo iz ostatka sedimenta.
LITERATURA:
Vježbenica iz kolegija « Medicinska bakteriologija i virologija»,
radni materijali prof.dr.sc. Brigita Tićac
TANJA LOVRINOV
2.2.2 MIKROSKOPSKA PRETRAGA
Mikrobiološka dijagnostika je temeljni i obavezni dio nacionalnog programa za suzbijanje
tuberkuloze. Mikroskopija je prva od tri standardizirane pretrage i kao takva jedan od standarda
javljanja rezultata unutar 24 sata od dostavljanja uzorka. U mikroskopskoj dijagnostici koristimo
mikroskopske preparate obojene po Ziehl –Neelsenu ili bojanje fluorokromnim bojama.
Princip:
Bojanjem po Ziehl- Neelsenu, bacil Mycobacterium tuberculosisa pokazuje izrazitu
acidoalkoholnu rezistenciju što znači sposobnost vezanja i zadržavanja bazične boje karbol
fuksina i nakon što se ispere kiselim alkoholom.Peptidoglikolipidi koji se nalaze u staničnoj
stjenci sprječavaju odbojavanje karbol fuksina koji se vezao za mikoličnu kiselinu. Prilikom
bojanja se koriste boje u većoj koncentraciji i uz zagrijavanje kako bi lakše prodrle u bakterijsku
stanicu.
Potrebni materijal:
• Predmentno stakalce,
• Mikrobiološka eza,
• Plamenik,
• Boje karbol- fuksin, metilensko modrilo (za Ziehl- Neelsen),
• Boja Auramin, kalij-permanganat (za fluorokromno bojanje),
• Kiseli alkohol, voda.
Postupak:
Nakon što uzorak pristigne u laboratorij, potrebno ga je dekontaminirati, homogenizirati
i neutralizirati kako je navedeno u poglavlju br.2.2.1. Nakon toga radimo mikroskopski preparat
na predmetnom stakalcu koje smo prije samog izvođenja označili brojem protokola na suprotnoj
strani stakalca. Zatim sterilnom mikrobiološkom ezom uzmemo uzorak i ravnomjerno
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
18
razvučemo po srednjoj trećini stakalca. Ostavimo da se osuši i zatim fiksiramo plamenom. Kad
se stakalca sa uzorkom osuše i fiksiraju treba ih položiti na most za bojenje. Sve ove postupke
treba odrađivati u bio-zaštitnom kabinetu i treba se zaštititi odgovarajućim odjelima.
Postupak bojenja po Ziehl-Neelsonu:
1. Preparat se prekrije bojom karbol fuksin i pažljivo se zagrijava plamenikom dok se ne
pojave pare ali ne smije doći do vrenja
2. Zatim treba ostaviti da se preparat ohladi pa nakon toga ponoviti isto još dva puta
3. Ohlađeni preparat isprati kiselim alkoholom, a nakon toga i vodom također još dva puta
4. Preliti metilenskim modrilom i držati boju 3-5 minuta
5. Ponovno sve isprati vodom i ostaviti preparat da se osuši na zraku i tek tada je spreman
za mikroskopiju
Postupak bojenja fluorokromnim bojama (fluorescentna boja)
1. Osušeni i fiksirani preparat prekriti bojom auramin i ostaviti 15 minuta (nije
potrebno zagrijavati niti prekrivati filter papirom)
2. Isprati vodom i ocjediti
3. Preparat isprati kiselim alkoholom
4. Isprati vodom i prekriti kalij-permanganatom 2-4 minute.
5. Ponovno isprati vodom i ostaviti preparat da se osuši
Literatura:
Color atlas and textbook of Diagnostic mycrobiology, Third edition ,ElmerW. Koneman, Stephen D.Allen,
VR.Dowel JR, i dr. , 1988. str.541,542.
Medicinska mikrobiologija, Smilja Kalenić i suradnici, Medicinska naklada , Zagreb 2013,
str.163,1683.
Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze, II.dopunjeno izdanje,Ministarstvo zdravstva i
socijalne skrbi, HZJZ, Zagreb , lipanj 2010 str.33,34
MARIJANA GRBAC
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
19
2.2.2.1. Dokazivanje prisutnosti bacila tuberkuloze u mikroskopskim preparatima
obojenim po Ziehl-Neelsenu
Mikroskopiranje preparata obojenih po Ziehl-Nellsenu danas je jedna od najpoznatijih i
najraširenijh metoda za dokazivane prisutnosti bacila tuberkuloze u uzorcima respiratornog
sustava. Nedostatak joj je nedovoljna osjetljivost i specifičnost. Za detekciju se koristi svjetlosni
mikroskop koji se nalazi u svim mikrobiološkim laboratorijima. Sastoji se od dva osnovna
sustava koji međusobnim djelovanjem dovode do uvećane slike: sustava leća i svjetlosnog
sustava. Razlikujemo mehanički dio koji čine podloga, stalak tubus, stolić, makrovijak i
mikrovijak i optički dio koji se sastoji od okulara, objektiva, izvora svjetla, kondenzora i zaslona.
Sustav leća svjetlosnog mikroskopa sastoji se od objektiva i okulara. Različita povećanja
mikroskopa postižu se mijenjanjem leća objektiva koji se rotacijom revolvera postavlja na
odgovarajuće mjesto. Za analizu preparata obojenih po Ziehl-Neelsenu koristi se imerzijski
objektiv, za koji nam je potrebno imerziono sredstvo. Najčešće je to cedrovo ulje. Uz povećanje
okulara 10x uporabom imerzijskog objektiva 100x, ukupno povećanje slike uzorka iznosi 1000x.
POSTUPAK:
1. Stakalce s obojenim uzorkom postaviti na stolić svjetlosnog mikroskopa s oznakom
okrenutom prema dolje.
2. Podesiti imerzioni objektiv rotacijom revolvera.
3. Na stakalce kapnuti kap imerzionog sredstva.
4. Pomoću makrovijka uroniti imerzioni objektiv u kapljicu imerzionog sredstva i pronaći
sliku.
5. Mikrovijkom izoštriti sliku i analizirati preparat.
Prema preporukama CDC-a mikroskopira se serija vidnih polja u 3 horizontalne paralele i
9 okomitih linija. Na taj način vidimo od 100 do 300 vidnih polja što iznosi samo 1-4 % površine
cijelog preparata. Preporuka je da razmaz pokriva površinu 1 x 2 cm jer veća površina razmaza
smanjuje efikasnost mikroskopiranja.
INTERPRETACIJA NALAZA:
Pronalazak crvenih štapićastih bakterija obojenih Carbol fuksinom na kontrastnoj plavoj
podlozi (Methylene Blue) dokaz je postojanja mikobakterija. Ukoliko imamo dva uzorka
iskašljaja, potrebna su jedan ili dva pozitivna nalaza da se nalaz interpretira kao BK pozitivan
TBC. Većina mikobakterija su acidoalkoholno rezistentne pa njihova prisutnost u kliničkim
uzorcima daje samo preliminarne dokaze tuberkuloze.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
20
Prema novim dokumentima i definicijama SZO-a tuberkuloza je mikroskopski pozitivna
kada ja otkriven najmanje jedan acidorezistentni bacil u najmanje jednom uzorku iskašljaja.
Ova definicija eksplicitno isključuje samo mikroskopsko dokazivanje pogrešaka u liječenju.
Primjenjuje se u zemljama s mrežom TBC laboratorija gdje se kontinuirano provodi vanjska
kontrola kvalitete rada.
• Lažno pozitivni rezultati mikroskopije brisa sputuma:
Mogu se pojaviti zbog sljedećeg: crvena boja zadržava se zbog ogrebotina na stakalcu,
slučajnog prijenosa acidoalkoholnorezistentnih bakterija sa pozitivnog na negativno stakalce,
kontaminacije mikobakterijom iz okoline, prisustva različitih djelića koji zadržavaju kiselinu, npr.
komadića hrane, taloga ili drugih mikroorganizama.
• Lažno negativni rezultati mikroskopije brisa sputuma:
Mogu se pojaviti zbog problema u prikupljanju, procesiranju, tumačenju brisa sputuma ili zbog
administrativnih pogrešaka.
Iako je svjetlosna mikroskopija najčešća metoda detekcije Mycobacterium tuberculosis
sve se češće koristi i mikroskopija fluoroscentnim mikroskopom zbog svoje brzine i veće
osjetljivosti. Preparati koji se mikroskopiraju na fluoroscentnom mikroskopu moraju biti obojani
fluorokromima odnosno fluoroscentnim bojama. Najčešće su to auramin koji fluorescira žuto , te
fluoroscein izocijanat koji daje žuto-zelenu fluorescenciju. Preparati se promatraju pod
povećanjem od 250-630x, a samo povećanje daje prednost u brzini pregledavanja preparata i
značajnu uštedu vremena za osobu koja mikroskopira. Prednost je i to što ljudsko oko lakše
uočava žuti štapić koji fluorescira u tamnoj podlozi.
Nalaz mora biti izdan u roku od 24 sata.
LITERATURA:
Vježbenica iz kolegija „Opća mikrobiologija“
Vježbenica iz kolegija“Medicinska bakteriologija i virologija“
Radna skripta prof.dr.sc. Brigita Tićac
Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze, II. Dopunjeno izdanje, Ministarstvo zdravstva i
socijalne skrbi, HZJZ, Zagreb, lipanj 2010.,str.355.
TBC/HIV, Klinički priručnik,drugo izdanje, A.Harries, D.Maher, S.Graham, str. 29
BAŠIĆ DAJANA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
21
2.2.3 KULTIVACIJA
Nakon što je uzorak prikupljen i transportiran do laboratorija na standardiziran način
slijedi homogenizacija, neutralizacija PBS-om i centrifugiranje uzorka na 3000 okretaja 20 min.
supernatant se odlije i plamenikom prođe rub epruvete.
Kultivacija uzročnika tuberkuloze vrši se, iz pripremljenog sedimenta, na tekućim i
čvrstim hranjivim podlogama. To su postupci standardne izravne metode mikrobiološke
dijagnostike.
Kultivacija mikobakterije na čvrstim podlogama radi se najčešće na Lowenstein-Jensen
(LJ) podlozi. Podloga sadrži jaja, glicerol, krumpirovo brašno i malahitno zelenilo koje inhibira
rast drugih bakterija
Radi se istovremeno i nasađivanje na tekuću podlogu, ostavlja se u kosom položaju 3
dana. Kultivacija na ovoj podlozi vrši se zbog brže izolacije bakterija, a korisiti se MGIT tekuća
podloga (Mycobacteria Growth Indicator Tube) s indikatorom za dokaz mikobakterija.
Proces nasađivanja se odvija u digestorima s naglaskom na veliku opreznost pri radu
(obavezno korištenja rukavica i zaštitnih pregača), zbog vrlo lake zaraze.
Slijedi inkubacija u termostatu na temperaturi 35-37° C u aerobnim uvjetima. Kolonije
sporo rastu, te se uočavaju tek nakon 2-8 tjedana inkubacije, a pregledavanje se vrši svakih 2.
tjedna.
Očitavanje rezultata:
Kolonije su bijele do svijetložute boje, nepravilnih rubova, suhe, izdignute i nepravilne
površine nalik cvjetači.
U slučaju negativnog rasta ostavljaju se u inkubaciji do 12. tjedna i ponovno očitavaju.
Uz uzorak je potrebna i pravovaljana uputnica na kojoj uz opće identifikacijske podatke
bolesnika obavezno treba navesti vrstu uzorka, datum (a za neke uzorke i vrijeme uzorka),
dijagnozu ili vodeće simptome, laboratorijske i epidemiološke podatke.
Prilikom zaprimanja uzoraka u laboratorij provodi se upis u kompjuter i evidencijsku
MGIT (mycobacteria growth indicator tube) knjigu u kojoj su navedeni :
ime i prezime uzorka, vrsta uzorka, ime liječnika, datum kad je zaprimljen uzorak i
datum obrade, koje ujedno služe i kao arhiva svih uzoraka.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
22
Izdavanje nalaza:
iz materijala nije izoliran M. tuberculosis
iz materijala je izoliran M. tuberculosis ( brojivo do 50 kolonija )
1+ iz materijala je izoliran M. tuberculosis ( brojivi 50 do 100 kolonija)
2+ iz materijala je izoliran M. tuberculosis ( više od 100 kolonija )
3+ iz materijala je izoliran M. tuberculosis (nebrojivo – konfluentan rast)
LITERATURA:
Naputak za suzbijanje i sprječavanje tuberkuloze (NN 083/2012). Preuzeto sa:
http://cadial.hidra.hr/searchdoc.php?query=&lang=hr&bid=TNL55lsNFr1cWun3pquCv
Q%3D%3D
Vježbenica iz kolegija „Medicinska bakteriologija i virologija “ Sveučilište u Rijeci,Medicinski fakultet
GUSTIN KRISTINA
2.2.3.1. Čvrste podloge
Za uzgoj Mycobacterium tuberculosis koriste se različita obgaćena umjetna hranilišta, a
najčešće Löwenstein-Jensen podloga koja je najšire primjenjivana podloga za primoizolaciju
bacila tuberkuloze. Preporučena je modifikacija od strane Međunarodnog udruženja za borbu
protiv tuberkuloze i plućnih bolesti (IUATLD).
IZGLED I POSTUPAK
Podloga Löwenstein-Jensen sadrži jaja, glicerol, krumpirevo brašno i malahitno zelenilo
koje inhibira rast drugih bakterija. Kompletna podloga se razlijeva u količini od 6-8 ml u sterilne
ukošene epruvete sa zatvaračima na navoj. Tako pripremljene podloge treba inkubirati na 35-
37° C 24 sata radi provjere sterilnosti.
Uzorke koje nacjepljujemo mogu biti iz respiratornog sustava iskašljaj (sputum),
brohonskopski uzorci te ispirak želuca kod djece i žena, urin, likvor, bioptati, obrisci rana i
genitalni obrisci, sadržaj prostate, krv...
Na svaku kosinu podloge trebalo bi sa jednokratnom plastičnom ezom aplicirati od 0,2
do 0,4 ml (2 do 4 omče eze) sedimenta raspoređenoj po cijeloj površini podloge.
Kolonije uzročnika tuberkuloze se uočavaju tek nakon 2-8 tjedana inkubacije u aerobnim
uvjetima na 35°C do 37°C. Kolonije su obično bijele do svijetlo žute boje, nepravilnih rubova,
suhe, izdignute, neravne površine nalik cvjetači.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
23
REZULTAT
Kod negativnog rezultata može biti gotov za 8 tjedana od dana uzorkovanja a kod
pozitivnog rezultata može biti gotov za 12 tjedana od dana uzorkovanja jer se dodatno radi test
osjetljivosti na antituberkulotike-ALT.
LITERATURA:
Vježbenica iz kolegija „Medicinska bakteriologija i virologija“; prof.dr.sc.Brigita Tićac
www.tbc.zdravlje.gov.rs./files/biblioteka/vodiczamikrobioloskudijagnostikutuberkoloze
AVDOVIĆ SABINA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
24
2.2.3.2. Tekuće podloge
Tekuće podloge omogućuju bržu i osjetljiviju kultivaciju, te ispitivanje osjetljivosti
Mycobacterium tuberculosis. Tekuća podloga (engl. Mycobacterium Growth Indicator Tube,
MGIT) u dijagnostici M. Tuberculosis spada u standardizirane pretrage i suvremenu
mikrobiološku dijagnostiku tuberkuloze. Standard su i indirektni fenotipski testovi na tekućim
podlogama za ispitivanje osjetljivosti M. tuberculosis na antituberkulotike prvog i drugog reda.
Epruveta MGIT s indikatorom rasta mikobakterija sadrži 4 mL modificirane baze
Middlebrook 7H9 bujona. Kompletan medij je obogaćen sa 0,5 mL OADC i 0,1 mL antibiotske
mješavine PANTA, jedan je od najčešće korištenih tekućih medija za uzgoj mikobakterija. Svi
tipovi kliničkih uzoraka, plućni kao i izvanplućni (osim krvi), mogu se obrađivati za primarnu
izolaciju u epruveti MGIT pomoću standardnih metoda. Obrađeni se uzorak inokulira u epruvetu
MGIT, inkubira i očitava pomoću dugovalnog UV svjetla. U vrijeme kada epruveta postane
pozitivna prisutno je otprilike 104 – 107 CFU/mL mikobakterija.
Princip
Fluorescentni sastojak umetnut je u silikon na dnu epruvete s okruglim dnom. Fluorescentni sastojak osjetljiv je na prisutnost kisika rastopljenog u bujonu. Velika količina rastopljenog kisika na početku gasi emisije sastojka, pa se može otkriti malo fluorescencije. Kasnije, M.tuberculosis troši kisik i omogućuju otkrivanje fluorescencije pomoću UV uređaja za vizualizaciju gela valne duljine 365 nm ili dugovalnog UV svjetla (Woodova lampa). Rast se može otkriti i prisutnošću nehomogene zamućenosti, malih zrnaca ili pahuljica u mediju za kulturu.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
25
Sastojci medija ključne su tvari za brzi rast mikobakterija. Bacili tuberkuloze koriste oleinsku kiselinu koja ima važnu ulogu u metabolizmu mikobakterija. Albumin djeluje kao zaštitni agens jer veže slobodne masne kiseline koje mogu biti otrovne za vrste Mycobacterium i na taj način povećava njihovu izolaciju. Dekstroza je izvor energije. Katalaza uništava otrovne perokside koji mogu biti prisutni u mediju. Kontaminacija se smanjuje kombiniranim dodavanjem baze MGIT i obogaćenja MGIT OADC s antibiotskom mješavinom MGIT PANTA prije inokulacije s kliničkim uzorkom.
Materijal i pribor
Epruvete MGIT s indikatorom rasta
mikobakterija,
MGIT PANTA,
OADC,
Epruvete za centrifugiranje marke
Falcon od 50 Ml,
NALC (N-acetil-L-cistein prašak),
fosfatni pufer pH 6,8,
vorteks mikser,
inkubator na temperaturi od 37°C,
sterilne pipete od 1 mL,
sterilne prijenosne pipete,
UV uređaj za vizualizaciju gela (valna
duljina 365 nm) ili Woodova lampa,
MycoPrep, bujon ,
mikobakterijski agari ili mediji na
bazi jaja,
sterilni štapić,
mikroskop i materijali za bojenje,
pipete od 100 μL i 500 μL,
odgovarajući nastavci pipeta,
tuberkulocidno sredstvo za
dezinfekciju.
Obrada uzorka
LIKVOR – direktno se nasađuje u MGIT epruvetu
URIN – treba ga centrifugirati, a sediment obraditi NALC-om, najviše do 5 ml
BRIS RANE i ostali brisevi – otopiti u 3-5 ml NALC-a
SPUTUM (iskašljaj) – direktno prebaciti u FALCON epruvetu
STOLICA – rastopiti 1g uzorka u bujonu te potom 5 s promiješati na vorteksu
Postupak
Postupak se odvija u bio-zaštitnom kabinetu (digestoru).
Najprije je potrebno pripremiti sterilan dio, staviti MGIT epruvete u stalak, te ih sve
redom otvoriti, a čepove odložiti na staničevinu natopljenu s dezificijensom okrenute naopačke.
Prvo se otpipetira PANTA (razrijedi se sa 3 ml sterilne fiziološke otopine - tako pripremljena
PANTA može stajati u hladnjaku 3 dana, a može se i smrznuti) 0,1 ml, a potom 0,5 ml OADC.
Tako pripremljene začepiti čepovima i odložiti sa strane do samog nasađivanja.
Pripremiti FALCON epruvete u odgovarajući stalak i na njih napisati laboratorijske
brojeve protokola. Uzorke prebaciti u epruvete, pazeći da se stvara što manje aerosola. Dodati
istu količinu NALC-a kao i uzorka i epruvete dobro začepiti.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
26
Svaki uzorak se dobro promiješa na vorteksu, te se potom stavljaju na treskalicu na
4000 okretaja kroz 20 minuta. Nakon toga epruvete staviti u stalak, sve ih redom otvoriti,
čepove odložiti na staničevinu natopljenu dezinficijensom okrenute naopačke. Paziti da se
čepovi ne zamijene jer su sada kontaminirani.
U epruvete nadolijati fosfatni pufer (pH 6,8) do oznake 45. Kod nadolijevanja paziti da
se ne dodiruje rub epruvete, te je zbog spriječavanja stvaranja aerosola potrebno nakositi
epruvetu kod nadolijevanja.
Epruvete se potom začepe, lagano promiješaju te centrifugiraju na 3000 okretaja kroz
15 minuta. Staničevinu sa dezinficijensom zamijeniti sa novom. Kad su uzorci centrifugirani
složiti ih u stalak, sve ih redom otvoriti. Supernatant odlijati u posudu s dezinficijensom, a iz
sedimenta napraviti mikroskopski preparat. Za izradu preparata koristiti automatsku pipetu sa
dugačkim nastavcima ili plastične, jednokratne laboratorijske eze. Preostali dio sedimenta
resuspendirati (neutralizirati) sa 0,5 ml fosfatnog pufera. Taj uzorak promiješati sa sterilnom
psipetom i nasaditi 15 kapi u MGIT epruvetu i na krutu podlogu. MGIT epruvetu začepiti i
lagano promiješati.
MGIT epruvete stavljaju se u inkubator na 370C, te očitavaju pomoću UV uređaja za
vizualizaciju gela (valna duljina 365 nm) ili Woodova lampa.
Kod pozitivnog MGIT-a radi se mikroskopski preparat. Epruveta se otvori i sa sterilnom
psipetom ili automatskom pipetom sa dugim nastavkom se cijela količina dobro promiješa i
uzme se mala količina za mikroskopski preparat. Ako u preparatu ima acido alkoholo
rezistentnih štapića uzorak se nasađuje (subkultivacija) na krute podloge, a MGIT epruveta se
čuva do porasta subkulture na krutim podlogama. Ukoliko u preparatu ima i acido alkoholo
rezistentnih bacila i kontaminacije (najčešće koki) taj se uzorak ponovno obrađue s NALCom.
Cijela se količina prebaci u FALCON epruvetu i ponovno obrađuje. Ako se u preparatu vidi samo
kontaminacija, taj se uzorak odbacuje kao kontaminirani.
OGRANIČENJA POSTUPKA
Izoliranje mikobakterija u epruveti MGIT ovisi o broju organizama prisutnih u uzorku,
metodama prikupljanja uzoraka, faktorima pacijenta kao što su prisutnost simptoma, prethodno
liječenje i metode obrade.
Morfologija i pigmentacija kolonija mogu se utvrditi samo na čvrstom mediju. Otpornost
mikobakterija na kiseline može varirati ovisno o soju, starosti kulture i drugim promjenjivim
činjenicama
Epruvete MGIT koje su pozitivne mogu sadržavati i druge vrste koje nisu
mikobakterijske. Vrste koje nisu mikobakterijske mogu nadmašiti prisutne mikobakterije.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
27
Takve epruvete MGIT treba ponovno dekontaminirati i ponovno tretirati kulturom.
Upotreba antibiotske mješavine PANTA, iako neophodna za sve nesterilne uzorke, može
imati inhibicijski učinak na neke mikobakterije.
LITERATURA:
Vježbenica iz kolegija « Medicinska bakteriologija i virologija», radni materijali prof.dr.sc. Brigita Tićac
Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze /NN 083/2012)
BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube, OADC Enrichment, PANTA Antibiotic Mixture
Radna uputa MGIT – Mikrobiološki laboratorij Čakovec
Značenje laboratorijskih u nadzoru nad tuberkulozom u Međimurskoj županiji; Marina Payerl-Pal, Vera
Katalinić-Janković, Mihaela Obrovac, Vesna Vršić Krištofić, Biserka Poje Jelenić, Marijana, Acta Med
Croatica, 65 (2011) 11-17
Novi horizonti u molekularnoj dijagnostici TB: trebamo li još uvijek konvencionalnu mikrobiologiju ?,
Vera Katalinić-Janković
DEBELEC DAMJAN
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
28
2.2.3.3.Testovi ispitivanja osjetljivosti na antituberkulotike
Standard su indirektni fenotipski testovi na tekućim podlogama za ispitivanje osjetljivosti
M. tuberculosis na antituberkulotike prvog i drugog reda. Nove tehnologije za brzo otkrivanje
rezistencije na antituberkulotike prvog reda su prioritet. Prvi red antituberkulotika (ATL) čini šest
lijekova: izoniazid (H), rifampicin (R), pirazinamid (Z), etambutol (E), streptomicin (S) i
tioacetazon (T).
SZO je 2008. godine u dijagnostički algoritam uveo hibridizacijske testove (line probe
assays) za otkrivanje rezistencije na rifampicin i izoniazid.
Kritične koncentracije antituberkulotika dobivene metodom proporcije u Löwenstein-
Jensen podlozi:
Antituberkulotik Koncentracija u Löwenstein-Jensen podlozi
Kritična proporcija
Izoniazid 0,2-1,0 1%
Rifampicin 40,0 1%
Etambutol 2,0 1%
Streptomicin 4,0 1%
Interpretacija nalaza:
S - soj je osjetljiv
R - soj je rezistentan
LITERATURA:
NAPUTAK ZA SUZBIJANJE I SPRJEČAVANJE TUBERKULOZE(„Narodne novine“, broj 83/12)
ODREĐIVANJE OTPORNOSTI VRSTE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NA IZONIAZID MULTIPLEKS
PCR METODOM Medicina 2007;43:47-54 UDK: 616.24-002.5:615.28.015.8
GUSTIN KRISTINA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
29
2.2.4. DETEKCIJA ANTIGENA
Mycobacterium tuberculosis uzročnik je tuberkuloze, kronične zarazne bolesti čovjeka
koja može zahvatiti sva tkiva i organe. Biokemijskim, imunološkim i molekularno biološkim
ispitivanjima M. tuberculosis detektiralo se nekoliko antigena koji bi mogli biti korisni u razvoju
poboljšanih dijagnostičkih metoda kako bi odredili razliku između Mycobacterium tuberculosis
kompleksa i ostalih uvjetno patogenih i apatogenih mikobakterija. Poznato je da M.tuberculosis
luči više od trideset i tri različita proteina. Jedan od glavnih proteina, MPT 64 pronađen je u
tekućini samo kulture sojeva M. tuberculosis kompleksa. Zbog jednostavne i brze identifikacije
M. tuberculosis kompleksa razvijena je metoda sa monoklonskim mišjim protutijelima anti-
MPT64 „ SD BIO LINE TB Ag MPT 64 Rapid“. To je brzi imunokromatografski test, koji je
jednostavan za upotrebu, a test se izvodi iz sojeva uzgojenih na krutom ili tekućem hranilištu.
Princip testa: Kazeta testa sadrži jastučić za uzorak, jastučić za zlatni konjugat, nitroceluloznu
membranu i upijajući jastučić. Mišja monoklonska protutijela anti- MPT 64 su imobilizirana na
nitroceluloznoj membrani. Još jedna protutijela koja prepoznaju epitop MPT 64 konjugirana su
koloidnim zlatnim česticama korištena su za vezanje i detekciju u tipu „sandwich“ testa.
SD – bioline TB Ag MPT 64 brzi test obilježen je slovima T (testna linija) i C (kontrolna linija).
Niti jedna linija se ne vidi prije dodavanja bilo kojeg uzorka. C linija služi za kontrolu procedure i
pojavljuje se svaki put, ako je procedura odrađena pravilno i ako reagensi rade.
Kako se uzorak doda u jažicu za uzorak, on putuje membranom, protutijela zlatnog konjugata
vežu se za MPT 64 iz uzorka. Takav kompleks tada putuje dalje i veže se za mišja monoklonalna
anti- MPT 64 na solidnoj fazi testne linije, producirajući crvenu do ljubičastu liniju. U odsutnosti
MPT 64 nema linije u testnoj regiji.
Materijal i pribor:
SD BIOLINE TB MPT 64 Rapid test sadrži:
1. Testne kazete pojedinačno pakirane u vrećici za prevenciju isušivanja
2. Ekstraktni pufer (za pripremu uzorka iz čvrstih kultura)
3. Upute za korištenje
4. Epruveta
5. Automatska pipeta od 200 µl i pripadajući nastavci s aerosolnom barijerom
Postupak:
Priprema i izvođenje testa u bio-zaštitnom kabinetu!
1. Otvoriti imunokromatografski test i na pločici naznačiti broj protokola.
2. Priprema i izvođenje testa
Tekući medij:
Homogenizirati tekuću kulturu (eventualno centrifugirati na 3000 okretaja kroz 15
minuta)
100 µl tekuće kulture staviti u jažicu za uzorak na pločici
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
30
Kolonije (kultura na čvrstoj podlozi):
200 µl pufera za ekstrakciju staviti u ependorf epruvetu
3-4 kolonije rigorozno homogenizirati u puferu za ekstrakciju
100 µl pripremljene suspenzije staviti u jažicu za uzorak na pločici
Kondenzna voda:
100 µl kondenzne vode staviti u jažicu na pločici
Ili kolonije mogu biti resuspendirane u kondenznoj vodi, umjesto u puferu za ekstrakciju
(homogenizirati)
100 µl pripremljene suspenzije staviti u jažicu za uzorak na pločici
3. Očitavanje testa:
Test se očitava nakon 15 minuta!
POZITIVAN NALAZ
Prisutna linija (eng. band) u području C (kontrolna linija)
Prisutna linija u području T (testna linija)
NEGATIVAN NALAZ
Prisutna linija u području C (kontrolna linija)
Nedostatak linije u području T (testna linija)
Ukoliko se ne pojavi bend u području kontrolne linije test se obavezno mora ponoviti.
LITERATURA:
TB Ag MPT64 Rapid, STANDARD DIAGNOSTIC, INC. 08FK50Germany, 2013
BABIĆ MIRJANA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
31
2.2.5. MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA TUBERKULOZE
Konvencionalne metode za identifikaciju Mycobacterium tuberculosis kompleksa mogu
potrajati i do 12 tjedana. Zbog velikog kliničkog i epidemiološkog značaja, stalna je tendencija
razvoja molekularnih tehnika za identifikaciju uzročnika tuberkuloze. Jedna od takvih metoda je
metoda amplifikacije nukleinskih kiselina lančanom reakcijom polimeraze (eng. PCR-Polimerase
Chain Reaction). U mikrobiološkom laboratoriju molekularne se metode primjenjuju za direktni
dokaz mikobakterija iz uzorka bolesnika i iz bakterijskih kultura kultiviranih na krutim ili u
tekućim hranilištima.
Princip
Molekularna dijagnostika tuberkuloze temelji se na tri glavna procesa: izolacija
bakterijske DNK, umnožavanje specifične genomske regije lančanom reakcijom polimeraze
(PCR) i detekcija odnosno vizualizacija dobivenog produkta.
Potrebni materijal i pribor
1. Uzorak dobiven od pacijenta ili
bakterijska kultura
2. Jednokratne zaštitne rukavice bez
pudera
3. Automatske pipete i pripadajući
nastavci s aerosolnom barijerom
4. Stalak za mikroepruvete
5. Mikroepruvete od 1,5 ml i 2,0 ml
6. Komercijalni set za izolaciju DNK
7. Temperaturni blok (termomikser)
8. Centrifuga
9. Uređaj za amplifikaciju
(eng. thermalcycler)
10. Hladni stalci za mikroepruvete
11. Komercijalni set za PCR
12. Reagensi i kalup za izradu agaroznog
gela
13. Uređaj za elektroforezu (kadica i
izvor struje)
14. UV transluminator
15. Oprema za snimanje agaroznog gela
16. Posude za odbacivanje
17. Računalo i računalni program za
obradu slike dobivene
elektroforezom
Opis postupka
Izolacija se odvija pomoću komercijalnih setova za izolaciju DNK prema protokolu
navedenom od strane proizvođača, a započinje liziranjem bakterijskih stanica iz uzorka
(poželjno nakon obrade) ili iz bakterijske kulture. Pri izolaciji DNK mikobakterija uputno je
stanice izložiti duljem djelovanju lizozima zbog specifične građe bakterijske ovojnice. Raspadom
stanica oslobađa se DNK koju je potrebno pročistiti, isprati i konačno izdvojiti.
PCR se temelji na umnožavanju specifične genomske regije. Specifična genomska regija
Mycobacterium tuberculosis kompleksa je IS6110. Umnožavanje se izvodi pomoću enzima
polimeraze i specifičnih početnica (eng. primera). Uz uzorke se obavezno rade pozitivna i
negativna kontrola kojima se kontrolira amplifikacija. Reakcija se odvija u automatiziranom
uređaju (thermlacycler) koji precizno diže i spušta temperaturu u točno određenim vremenskim
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
32
intervalima koji se ponavljaju u 30 do 40 ciklusa. U svakom ciklusu događa se denaturacija,
hibridizacija i produljivanje DNK.
Po završetku zadnjeg ciklusa slijedi detekcija, odnosno vizualizacija dobivenog PCR
produkta. U tu svrhu najčešće se koristi gel elektroforeza, nakon koje se agarozni gel prenese
na UV transluminator, a rezultat elektroforeze zabilježi na disketu. Dobivena slika se obrađuje
pomoću računalnog programa.
Interpretacija nalaza
Prisutnost linije (eng. band) na agaroznom gelu u području pozitivne kontrole dokaz je
pozitiviteta uzorka na Mycobacterium tuberculosis compleks.
Zaključak
Danas se koriste metode „end point“ PCR-a, Real-time PCR-a, hibridizacije i masene
spektometrije (MALDI TOF). Metode molekularne dijagnostike su visoko specifične, osjetljive i
ubrzavaju dijagnostički postupak. Ovo je izuzetno važno zbog ranog i brzog otkrivanja uzročnika
tuberkuloze i praćenja rezistencije, no nedostatak ovih metoda je u tome što ne možemo biti
sigurni da li je detektirana genomska regija iz živog ili mrtvog uzročnika i da uzorak nije
kontaminiran.
Prema tome postupak kultivacije je još uvijek „zlatni standard“ u dijagnostici tuberkuloze i kao
takav ima najvažniju ulogu u njenom dokazivanju.
LITERATURA
Kalenić, Smilja i suradnici. Medicinska mikrobiologija. Zagreb : Medicinska naklada, 2013. p. 169
Sacace Biotechnologies. MTB complex 390/750IC (Cat.No. B-15-50R). Italija : Sacace Biotechnologies,
2010.
Rapid detection of Smear-Negative Micobacterium tuberculosis by PCR and Sequencing for Rifampin
Resistance with DNA Exstracted Directly from Slides. Patnaik, M., Liegmann, K. and Peter, J.B. 2001,
Jurnal of Clinical Microbiology.
KLAUSBERGER LIDIJA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
33
2.3. PPD-TEST
Robert Koch je prvi otkrio da filtrat tekuće kulture Mycobacterium tuberculosis ubrizgan
životinji već zaraženoj sa Mycobacterium tuberculosis izaziva u njoj specifičnu reakciju. Ta
reakcija, nazvana tuberkulinska reakcija, je posebna vrsta kasne alergijske reakcije. Koch je
pomoću toga napravio svoj alt-tuberkulin. To je gusta tekućina tamno sive boje koja se sastoji
od autoliziranih, toplinom ubijenih tekućih kultura Mycobacterium tuberculosis koje su
profiltrirane a zatim isprane.
Aktivni dio te tuberkulinske supstance nalazi se u proteinima. Izdvajanjem proteina iz
tuberkulina, Seibertova i njeni suradnici su dobili aktivan protein u čistom stanju. Taj protein
nazvan je PPD-pročišćeni proteinski derivat.
PPD kao pročišćeni specifični alergen danas se koristi umjesto ranije korišenog alt-
tuberkulina za otkrivanje osoba zaraženih sa tuberkulozom, tj kao tuberkulinski test. Postoji više
raznih tuberkulinskih reakcija, a najčešće se koristi Mantouxova kožna reakcija.
Da bi se utvrdilo treba li izvršiti BCG cijepljenje izvodi se tuberkulinski test. Samo osobe
koje ne reagiraju na tuberkulin (''nereaktori“) treba cijepiti. Taj test se izvodi intrakutano (tzv.
metoda Mantoux) na volarnoj strani lijeve podlaktice. Tuberkulin u količini od 0,1 ml se uštrcava
strogo intrakutano. Igle za to moraju biti tanke i kratke, a štrcaljke uske (tzv. PPD šprice).
Poslije ispravno izvedene intrakutane injekcije stvori se na koži bjelkasti mjehurić koji je na
površini hrapav kao narančina kora. Za testiranje se upotrebljava tuberkulin koji u 0,1 ml sadrži
2 jedinice PPD tuberkulina.
Reakcija se čita nakon 72 sata. Pritom se vodi računa samo o promjeru infiltrata
odnosno induracije, a ne o promjeru crvenila (eritema). Granice induracije mogu se odrediti
prevlačenjem jagodice prstiju preko infiltrata kože. Veličina infiltrata mjeri se ravnalom od
prozirne plastične mase koje je podijeljeno na mm. Korisno je osim promjera induracije
zabilježiti i eventualnu prisutnost eritema (E), ili vezikule (V), ili bule (B), ili nekroze (N).
Rezultati testa se moraju pažljivo protumačiti. Medicinski rizični faktori jedne osobe
određuju na kojoj inkrementaciji (5mm, 10mm, 15mm) induracije se rezultat smatra pozitivnim:
5mm ili više je pozitivno kod:
HIV pozitivne osobe
osobe sa nedavnim kontaktom sa TB pacijentom
pacijentima koji su imali transplantaciju organa ili kod osoba sa
oslabljenim imunološkim sustavom
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
34
10mm ili više je pozitivno kod :
osoba koje su nedavno stigle iz zemalja sa visokom razinom frekvencije
tuberkuloze
radnika TBC laboratorija
osoba sa kliničkim kondicijama koje povećavaju rizik (diabetes, leukemija
itd.)
djece mlađe od 4 godine
15mm ili više je pozitivno kod:
osoba koje nemaju druge rizične faktore tuberkuloze
Može se desiti da test bude lažno pozitivan. To može biti uzrokovano sa strane od
netuberkuloznog micobacteriuma. U nekim slučajevima je test lažno pozitivan radi alergijske
reakcije ili hipersenzitivnosti.
Rezultat testa može biti potisnut od slijedećih faktora:
mononukleoze
sarkoidoza
Hodgkinova bolest
upotreba steroida
pothranjenost
Literatura:
Mikrobiologija i parazitologija, urednik Bogdana Karakašević, Medicinska knjiga 1987., str.873.,
paragraf 5-7
Provedbeni program obveznog cijepljenja u Hrvatskoj u 2013. godini, str. 5, '' Upute za izvođenje BCG
cijepljenja''
http://en.wikipedia.org/wiki/Mantoux_test
ŠIMAC INES
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
35
2.4 IGRA ( interferon-gamma release assay )
QuantiFERON – TB Gold In – Tube
QFT (QuantiFERON test) je in vitro dijagnostički test koji služi za dokazivanje latentne
tuberkulozne infekcije ( LTBI, engl. Latent TB Infection).
LTBI je nezarazno asimptomatsko stanje, imuni odgovor na prije unesene antigene
M.tuberculosis. Nužno ne znači da će nazočnost uzročnika biti prisutna za vrijeme testiranja.
Ključni čimbenik kontrole tuberkuloze jest ciljano traženje i liječenje osoba sa LTBI koje imaju
povišen rizik od progresije infekcije u aktivnu bolest.
QFT-GIT je ELISA-test (enzyme-linked immunosorbent assay) koji nakon inkubacije s
mješavinom sintetskih peptida koji simuliraju mikobakterijske proteine: ESAT-6, CFP-10 i
TB7.7(p4) detektira otpuštanje interferona-gama (IFN-γ) iz T-limfocita u svježoj hepariniziranoj
punoj krvi senzibiliziranih osoba. Svi BCG- cijepni sojevi, kao i većina netuberkuloznih
mikobakterija, s izuzećem M. kansasii, M. szulgai i M. marinum, ne sadrže ove proteine. Osobe
zaražene mikobakterijama iz M. tuberculosis kompleksa u krvi imaju limfocite koji prepoznaju
mikobakterijske antigena. Detekcija, a zatim i kvantifikacija interferona-gama (IFN-γ) čine
temelj ovog testa.
Načela QFT-GIT testa
Sustav QFT-GIT sadržava posebne epruvete (Nil kontrola-nulta kontrola, TB antigen i
Mitogen kontrola-pozitivna kontrola odnosno kontrola pravilnog postupanja sa krvi i pravilne
inkubacije) u koje se uzimaju uzorci pune krvi koji se najkasnije u roku od 16 sati nakon
uzorkovanja trebaju inkubirati pri temperaturi od 370C u razdoblju od 16 – 24 sata. Uzorci se
nakon inkubacije centrifugiraju, a nakon oduzimanja plazme slijedi utvrđivanje IFN-γ (uIJ/ml)
metodom ELISA.
Postupak rada:
2.4.1 Uzorkovanje
QFT- GIT epruvete: Nil kontrola (sivi čep), TB antigen (crveni čep), Mitogen kontrola
(ljubičasti čep). Antigeni se nalaze u suhom obliku na unutarnjoj stjenci epruvete.
Svakom pacijentu potrebno je uzeti po 1ml krvi postupkom venepunkcije direktno u
QFT-GIT epruvetu (Nil, TB, Mitogen). Poredak epruveta mora biti kako je navedeno: Nil, zatim
TB Antigen i potom Mitogen. S obzirom da 1ml teče sporo (zbog slabijeg vakuuma) potrebno je
pričekati 2-3 sekunde dulje kako bi smo bili sigurni da je epruveta napunjena. Na svakoj
epruveti je nacrtana crta koja označava volumen krvi (0.8-1.2ml) koji treba biti u epruveti.
Nakon vađenja epruvete se trebaju obavezno okrenuti nekoliko puta,a zatim intenzivno
promiješati (okretati 8-10 puta). Miješanje je bitno kako bi se krv promiješala sa sadržajem
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
36
epruvete. Potrebno je pravilno označiti epruvete i transportirati u uspravnom položaju unutar 16
sati od uzorkovanja. Tijekom transporta uzorci se ne smiju držati u hladnjaku ili zamrzivaču.
INKUBACIJA I ODVAJANJE PLAZME
Ako krv nije inkubirana odmah nakon vađenja, miješanje mora biti ponovljeno
neposredno prije inkubacije. Epruvete moraju biti u uspravnom položaju tijekom inkubacije,na
temperaturi od 37 C tijekom 16-24 sata. Nakon inkubacije epruvete se centrifugiraju 5-15
minuta na 1500 do 2200 RCF (g). Želatinozni čep će odvojiti stanice od plazme. Potrebno je
odvojiti plazmu pipetom i prebaciti u mikroepruvete. Uzorci plazme koja se odvoji može se
direktno stavljati na QFT- GIT ELISA pločice. ELISA metodom se utvrđuje količina IFN – γ
citokina.
IFN-γELISA
Potreban pribor i materijal:
• plazma
• Standard kit
• Konjugat 100x
• Enzyme substrate
• Enzyme Stopping
• Wash Buffer
• Green Diluent
• Sterilna destilirana voda
• Mikropipete i nastavci
• Mikroepruvete za
S1,S2,S3,S4
• Stalak
• Radni papir sa tablicom
ELISA pločice
2.4.2 Opis postupka
QFT–GIT ELISA je komercijalizirani test, te ima svoj postupak izvođenja i korištenja
reagensa, tj. cijelog ELISA kita. i po tim postupcima se se izvodi.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
37
Interpretacija nalaza
Dijagnoza LTBI iziskuje zajedničku ocjenu epidemioloških, anamnestičkih, medicinskih i
dijagnostičkih rezultata; svi ovi rezultati se moraju uzeti u obzir pri interpretaciji rezultata testa
QuantiFERON-Tb Gold In Tube.
Nula (IJ/ml) Tb antigen –
Nula Mitogen- Nula QT Interpretacija
<0,35 >0,5 negat. Nije vjer.LTBI
>0,35 i <25%
Nula >0,5 negat. Nije vjer.LTBI
<8,0 >0,35 i >25%
Nula svejedno pozitiv. LTBI vjerojatna
<0,35 <0,5 nejasan *
>0,35 i <25%
Nula <0,5 nejasan *
>8,0 svejedno koliko svejedno nejasan *
*Rezultati TB Antigen reakcije nejasni
Iz izmjerene visine IFN-γ koncentracije ne može se izvesti zaključak o stadiju ili stupnju
infekcije, mjeri imunološke aktivnosti ili i vjerojatnosti aktivnog oboljenja.
Sva mjerenja izražena su u IJ/ml.
QT je pozitivan ako je vrijednost nulte epruvete ispod 8,o IJ/ML, a vrijednost TB antigen
epruvete minus vrijednost nulte epruvete iznosi jednako ili više od 0,35 IJ/ml vrijednost i to je
istovremeno više od 25% vrijednosti nulte epruvete; svejedno koliko je tada mitogen epruveta.
Tb odgovor –
Nula Nula Mitogen-Nula
POZITIVAN > 0,35 IJ/ml i
> 25% od Nule < 8,0 Bilo koliko
NEGATIVAN < 0,35 IJ/ml ili 25% od Nule
< 8,0 > 0,5
NEJASAN < 0,35 IJ/ml ili < 25% od Nule
< 8,0 0,5
Bilo koliko > 8,0 Bilo koliko
U osoba s pozitivnim testom treba isključiti aktivnu tuberkulozu. Kada se dokaže da se
radi o LTBI, treba procijeniti da li je potrebna kemoprofilaksa.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
38
Negativan nalaz
Rezultat se interpretira ovisno o tome radi li se o imunokompetentnoj ili
imunokompromitiranoj osobi. Ako se radi o imunokompetentnoj osobi sa negativnim QFT, bez
simptoma, daljnja dijagnostika nije potrebna jer se smatra da osoba nema infekciju
M.tuberculosis. Ako osoba ima simptome (kašalj, mršavljenje, povišena temperatura), potrebno
je učiniti dodatnu obradu (minimum radiološka snimka prsišta i mikrobiološka obrada sputuma).
Ako se radi o imunokompromitiranoj osobi s negativnim QFT – TB GIT testom, bez simptoma,
daljnja je dijagnostika ipak potrebna da bi se isključila aktivna TBC (minimum radiološka snimka
prsišta i mikrobiološka pretraga sputuma). Negativna prediktivna vrijednost QFT – a u
imunokompromitiranih osoba nije poznata, stoga je u osobe sa simptomima (kašalj,
mršavljenje, povišena temperatura, znojenje) potrebno učiniti proširenu obradu na
ekstrapulmonalnu TBC (radiološka snimka prsišta, mikrobiološka obrada sputuma, urina,
stolice). Kod neodredivog nalaza nema svjetskih smjernica što dalje učiniti. Tada treba postupiti
u skladu s odgovorom na pitanje kolika je vjerojatnost da je osoba inficirana s M. tuberculosis;
U nalazu je važno navesti zbog čega je nalaz neodrediv, jer npr. Neadekvatan odgovor
na mitogen može biti povezan s imunosupresivnim stanjima.
Literatura:
• Liječnički vjesnik 133:361-432, br.11-12, Zagreb, studeni – prosinac 2011
• The Whole Blood IFN-gamma Test, Mesauring Responses To ESAT-6, CFP-10, TB7.7 (p4) Peptide Antigens- package insert
• http://www.bolnica-klenovnik.hr/index.php?task=group&gid=9&aid=666
MAJSTOROVIĆ SUZANA
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
39
Literatura
Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze /NN 083/2012)
G.Mlinarić Galinović, M.Ramljak Šeko i suradnici, Specijalna medicinska mikrobiologija i
parasitologija
www.perpetuum-lab.com.hr/wiki/mikrobiologija tuberkuloze
hr.wikipedia.org/wiki/sušica,
Vježbenica iz kolegija « Medicinska bakteriologija i virologija», radni materijali prof.dr.sc.
Brigita Tićac
Mikrobiologija i parazitologija, urednik Bogdana Karakašević, Medicinska knjiga 1987.,
str.873., paragraf 5-7
Prvedbeni program obveznog cijepljenja u Hrvatskoj u 2013. godini, str. 5, '' Upute za
izvođenje BCG cijepljenja''
Color atlas and textbook of Diagnostic mycrobiology, Third edition ,Elmer W. Koneman,
Stephen D.Allen, VR.Dowel JR, i dr. , 1988 str.541,542
http://en.wikipedia.org/wiki/Mantoux_test
Naputak za suzbijanje i sprečavanje tuberkuloze, II. Dopunjeno izdanje, Ministarstvo
zdravstva i socijalne skrbi, HZJZ, Zagreb, lipanj 2010,str.35
TBC/HIV,Klinički priručnik,drugo izdanje,A.Harries,D.Maher,S. Graham,str. 29
ODREĐIVANJE OTPORNOSTI VRSTE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS NA IZONIAZID
MULTIPLEKS PCR METODOM Medicina 2007;43:47-54 UDK: 616.24-002.5:615.28.015.8
www.tbc.zdravlje.gov.rs./files/biblioteka/vodiczamikrobioloskudijagnostikutuberkoloze
Upute za rad u TBC laboratoriju ZZJZ Primorsko –goranske županije
Kalenić, Smilja i suradnici. Medicinska mikrobiologija. Zagreb : Medicinska naklada,
2013. p. 169.
Sacace Biotechnologies. MTB complex 390/750IC (Cat.No. B-15-50R). Italija : Sacace
Biotechnologies, 2010.
Rapid detection of Smear-Negative Micobacterium tuberculosis by PCR and Sequencing
for Rifampin Resistance with DNA Exstracted Directly from Slides. Patnaik, M.,
Liegmann, K. and Peter, J.B. 2001, Jurnal of Clinical Microbiology.
MIKROBIOLOŠKA DIJAGNOSTIKA TUBERULOZE
40
TB Ag MPT64 Rapid, STANDARD DIAGNOSTIC, INC. 08FK50Germany, 2013
Liječnički vjesnik 133:361-432, br.11-12, Zagreb, studeni – prosinac 2011
The Whole Blood IFN-gamma Test, Mesauring Responses To ESAT-6, CFP-10, TB7.7
(p4) Peptide Antigens- package insert
http://www.bolnica-klenovnik.hr/index.php?task=group&gid=9&aid=666
BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube, OADC Enrichment, PANTA Antibiotic
Mixture
Radna uputa MGIT – Mikrobiološki laboratorij Čakovec
Značenje laboratorijskih u nadzoru nad tuberkulozom u Međimurskoj županiji; Marina
Payerl-Pal, Vera Katalinić-Janković, Mihaela Obrovac, Vesna Vršić Krištofić, Biserka Poje
Jelenić, Marijana, Acta Med Croatica, 65 (2011) 11-17
Novi horizonti u molekularnoj dijagnostici TB: trebamo li još uvijek konvencionalnu
mikrobiologiju ?, Vera Katalinić-Janković