1

MIKROBIOLOGIJA

MB/4

Podloge za uzgoj mikroorganizama� Kombinacija različitih tvari-hranjiva

podloga (osigurava različite zahtjeve mikroorganizmima za nutrientima)

� Žive stanice zahtjevaju: biogene elemente-N, C,…, vitamine, mineralne tvari, faktor rasta, vodu (aw-vrijednost, relat. vlažnost-RH)

� Upotreba: za izolaciju i identifikaciju� Korist: test sterilizacije, mikrobiološku

analiza namirnica, priprava biološkog materijala (proizvodnja antibiotika, vakcine)

Hranjive podloge

� Vrste: Prirodne hranjive podloge; Kemijski definirane podloge (sintetičke, kompleksne)

� Konzistencija: tekuće (hranjivi bujon - peptonskavoda, sladovina); čvrste – dodatkom 1,5-2.0 % agara (hranjivi agar, sladni agar)

� Primjena: za uzgoj bakterija (hranjivi bujon, hranjivi agar); kvasaca i plijesni (sladovina,

sladni agar)

� Po funkciji razlikujemo: selektivne,

diferencijalne i specijalne podloge (za prenošenje, transportiranje), podloge za namnožavanje

� Rast mikroba: u tekućoj-submerzan; na čvrstoj-emerzan

2

Morfologija bakterijskih kolonija

Neke fiziološke osobine u bakterija

� Pri identifikaciji, uz morfološke osobine nužno odrediti:sintezu odreñenih enzima

(enzimska razgardnja kemijskih spojeva)

� Enzimska razgradnja

(hidroliza) supstrata- hranjivog medija-podloge

(npr. škroba uz amilazu, kazeina uz kazeinazu, želatine uz želatinazu)

� Katalazna i peroksidazna aktivnost

� Porodica

Enterobacteriaceae

3

� Porodica Enterobacteriaceae (autohtoni mikroorganizmi u probavnom sustavu) -značajke,izolacija i identifikacija

� Klasifikacija: na osnovi prisutnost ili odsutnost enzima iz izravnog metabolizma bakterija (biokemijskim testovima)

� Porodica podijeljena u 5 plemena (na osnovi genetičkih informacija:sadržaja purinske baze-

gvanin (G) i pirimidinske baze-citozin (C) te biokemijskih različitosti). Unutar plemena, rod i vrsta se odreñuju prema homologiji DNA

Porodica Enterobacteriaceae

� Pri identifikaciji nužni su složeni biokemijski testovi i znatno vrijeme

� Značajke gotovo svih predstavnika:- Glu metaboliziraju fermentativnim

putem (EMP, Embden-Meyerhof-Parnas put fermentacije Glukoze; put mješovito-kisele /MK/

- nedostaje im aktivnost citokrom-oksidaze- reduciraju nitrate do nitrita

4

Fermentativni metabolizam� Glu ›pirogožñana kis.› razne org.kiseline

(mravlja, octena, maslačna, jantarna, propionska), alkoholi (etanol, butanol), H2, CO2,…

� Za provjeru ove sposobnosti korištenja šećera, kao izvora C fermentativnim putem, nužne su različite hranjive podloge.

� Selektivne podloge za izolaciju (Salmonella-Shigella agar /SSA/;bizmut-sulfitni agar /BSA/; ksiloza-lizin deoksikolatni agar / KLDA/)

� Podloge za namnožavanje (bujoni: selenit, gram-negativni, tetrationatni)

� Fermentacija Laktoze (Lac+)� Fermentacija Glu i Lac na KŽA i TŠŽA;

biokemijski principi reakcija na KŽA (Kliglerov željezni agar)

� --Žuto kosina/žuto dubina-fermentirana Glu i Lac (E. coli)

-crveno kosina/žuto dubina-fermentirana Glu, Lac nije (Proteus sp., Shigella sp.)

-crveno kosina/žuto i crno dubina-fermentirana Glu, Lac nije, proizveden plin H2S (Salmonella sp.)

Fermentacija laktoze s pomoću bakterija(Lac+)

5

� Gljive (Fungi)

Gljive (Fungi): Morfologija i sistematika

� Mikologija (grana znan.discipline Mikrobiologija)

� Gljive (Fungi): kvasci, plijesni, mesnate gljive, rñe, snijeti

� poznate od prije 400 milijuna god.� poznato oko 250000 vrsta � Eukarioti (nefotosintetički organizmi,

posjeduju staničnu stjenku-od hitina Zajedno s bakterijama sudjeluju u razgradnji organskih tvari)

6

Karakteristike-aktivnosti:

� izrazita biokemijska aktivnost

� komercijalna uloga (nekih)

u proizvodnji hrane i lijekova

� uzrokuju infektivne bolesti u ljudi (patogene)

� razgrañuju rezerve hrane

� sintetiziraju snažne toksine

� Razlika u odnosu na bakterije: veličina (1-30

µm), oblik (dimorfizam), struktura, stanična organizacija, način razmnožavanja

Usporedba gljiva i eubakterija

Gljive EubakterijeTip stanice Eukariotska s jasno

odreñenom jezgrinom membranom

prokariotska

Citoplazmena membrana

steroli nema sterola

Stanična stijenka glukani, hitin( N -acetilglukozamin), nema peptidoglikana

peptidoglikan

Spore spolne i nespolne endospore

Metabolizam heterotrofan, aeroban, fakultativno anaeroban

heterotrofan,kemo-autotrofan,fotoauto-trofan,aeroban, anaeroban,fak.anaerob.

Gljive i izvori hrane� Razlike u odnosu na bakterije:

- rastu u okolišu nepovoljnom za bakterije- u pravilu rastu u kiselom pH području (pH=5,0)- aerobni organizmi (rastu na površini, manjeispod površine); kvasci-fakultativni (neobvezatni)anaerobi

- većina otpornija na osmotski tlak (mogupodnijeti ekstremno visoke koncentracije šećera-više od 50%)

- mogu rasti na tvarima sa malim sadržajem vode(13-14 %)

- zahtijevaju nižu koncentraciju N2 za rast- mogu iskorištavati složene ugljikohidrate

7

Prehrana i metabolizam

� Najveći broj su saprofiti - žive na mrtvoj organskoj tvari – izvor hrane

� Mogu izlučivati hidrolitičke enzime-razgradnja okolišnog supstrata

� Važne (neke) u proizvodnji: kruha, sira, vina piva, vitamina, antibiotika, org. kiselina itd.

� Kemoheterotrofi (kemoorganotrofi)-gljive,

protozoe, najveći broj bakterija: koriste (metaboliziraju)

jednostavne organske spojeve za dobivanje ugljika i potrebne energije

Razmnožavanje

� Nespolno (dijeljenje, tvorba pupa, nespolne spore-konidiospore, sporangiospore, klamidospore, artrospore, blastospore)(Spore se stvaraju u procesu dijeljenja stanice u odsutnosti fertilizacije, bez oplodnje i mejoze)

� Spolno (spolne spore-zigospore, askospore, bazidiospore, oospore)(Fertilizacija:Haploidna stanica donora /+/ prodire u citoplazmu stanice akceptora /-/ te se njihove jezgre spajaju i tvore diploidnu jezgru. Mejozom se na polovicu smanjuje broj kromosoma u diploidnoj jezgri. Te dvije haploidne stanice-gamete u procesu oplodnje tvore zigotu /spolna spora/).

Vrste nespolnih spora u gljiva

8

Hranjive podloge za uzgoj gljiva

� - prirodne (deficitarne)- sintetičke (kemijski definirane)

- većina jesu kompleksne (dehidrirane)

(Sabouraudov glukozni agar)Sadrže u pravilu: Glu kao izvor C i E; soli; nužne AK; vitamine; faktor rasta; neke i pufere

� Za identifikaciju i klasifikaciju gljiva bitno: - način razmnožavanja,- tvorba micelija (tijelo plijesni),- tvorba staničnih struktura

Klasifikacija gljiva (Ainsworth 1973.)

� 5 taksonomskih skupina (na osnovi tipa spora, morfologije hifa, spolnog ciklusa)

� Razredi:Zygomycetes (N, NSMJ, SSM),

Ascomycetes (S,NSH,SSMJ),

Basidiomycetes (S,NSH,SSB),

Deuteromycetes (S,NSH,SS ne posjeduju)

Oomycetes (N,NSMJ)(S-septiran micelij; N-neseptiran; NSH-nespolne spore na hifama;

NSMJ-nespolne spore u mješinici; SSMJ-spolne spore u mješinici; SSB-na bazidiju; SSM-u miceliju)

Karakteristike taksonomskih skupina� - Zygomycetes: neseptirane; razmnožavanje-

sporangiospore, zigospore; brz rast (Mucor, Rhizopus,...)� - Ascomycotes: septiran; konidiospore, askospore-

najčešće po 8 u mješinici-askusu (Aspergillus, Penicillium,...)

� - Deuteromycetes (Fungi imperfecti): nesavršene gljive; konidiospore, artrospore, klamidospore (Geotrichum, Trichoderma, Alternaria,...)

� - Oomycetes: vodene, jajolike plijesni; gljive algašice, bičaste gljive-spolno-oplodnja staničnom spermom, nespolno-zoosporama koje posjeduju dva bića (Phytophthora infestans - crno truljenje krumpira, Plasmopara viticola - pahuljasta pljesnivost grožña, Peronospora hyoscyami – plava plijesan na lišću duhana, ...)

� - Basidiomycetes: gljive klobučarke; ispod klobuka bazidium-uključen u spolni način razmnožavanja (bazidiospore)Problem: toksini gljiva-otrovanje (npr. Amanita phaloides)

9

� Plijesni

PLIJESNI

� Nakupine vlaknastih razgranatih, isprepletenih cjevastih stanica-hife (bezbojnih, bez klorofila)koje tvore tijelo plijesni- micelij: zračni (iznad podloge) i supstratni (u podlozi)

� Općenita klasifikacija plijesni:- s polja; - u skladištu; - uznapredovalog kvarenja

� Septirane; neseptirane; poluseptirane(septa – poprečna pregrada)

Izgled poraslih kolonija odabranih plijesni

10

Prikaz grañe cjevaste stanice-hife

Septirane hifeNeseptirane hife

Primjer klasifikacije plijesni: Rhizopus nigricans

� CARSTVO: Fungi� RAZDJEL: Amastigomycota� PODRAZDJEL: Zygomycotina� RAZRED: Zygomycetes� RED: Zygomycetales� PORODICA: Zygomycetaceae� ROD: Rhizopus� VRSTA: nigricans

11

Životni ciklus Rhizopus sp. (Zygomycotina)-(jarmašice; neseptirane)

Životni ciklus Penicillium sp. (Ascomycotina)-(septirane)

Struktura i rast plijesni (Penicillium sp.)

12

Penicillium italicum(plava) i Penicillium notatum (zelena)

antibiotik penicilin, od plijesni Penicilium chrisogenum,

Aspergillus flavus

Aspergillus niger

13

Ergot (francuski: roščić, čapak) je sinonim za otporni oblik gljivice, prema kojemsu ovi alkaloidi i dobili ime, (dobivaju ekstrakcijom iz sklerocija). Ergot alkaloidi (zarazliku od ostalih alkaloida) su proizvodi metabolizma gljiva razreda Ascomycetes –posebno roda Claviceps (Claviceps purpurea).

Ergotizam je gljivična infekcija koja primarno napada raž ali i druge žitarice.

U prošlosti otrovanje ergotom – “ vatra sv. Antuna”, kasnije “ergotizam”. Izvor otrovanja:raženo brašno, raženi kruh (raž se mljela zajedno sa sklerocijom). Prisutni alkaloidi izsamljevenog micelija, prouzročili su stezanje krvnih žila i time ograničili opskrbu krvi, naročitoekstremnih dijelova tijela; grčenje; halucinacija.

A - Vješanje “vještica” (oboljelihod ergotizma) u Salemu (Massachusetts, 1690.)

B - Sv. Antun, okružen bolesnicima od ergotizma (943., Francuska)

A B

SKLEROCIJ NA RAŽISKLEROCIJI

Opći simptomi bolesti: konvulzivni i gangrenozni.

Konvulzivni ergotizam: vrlo blagi slučajevi, blage početne pojave. U kasnijoj fazijavlja se opći umor, poteškoća u glavi i udovima, vrtoglavica, tlak te bol u prsima,obamrlost u rukama i nogama. Ekstremni slučajevi: smrt za 12 sati.

Gangrenozni ergotizam: pokazuje osim spomenutih znakova nabreklosti i upaleekstremiteta, slijede uz “vručicu” vrlo jaki bolovi, a potom dolazi do gangrene.

A i B - Primjeri gangrenoznog ergotizma u ljudi i goveda

17. st. – spoznaja da je ergot uzročnik “ergotizma”;18. st. – otkriveno je da jeuzrok gljivica. Tulasne (1853.) opisao razvojni ciklus gljivice, nazvane

Claviceps purpurea.- sastojci ergota, ergot alkaloidi – danas velika primjena u medicini (krvožilnisustav-liječenje krvnog tlaka, liječenje migrene, aktivni sastojak dietilamidalizerginske kiseline /LSD/,…)

A B

Životni ciklus podrazdjela Basidiomycotina (Basidiomycetes)

14

� Kvasci

KVASCI� morfološki se razlikuju od ostalih

gljiva� jednostanični, mikroskopski,

nemicelijski mikroorganizmi� Neki proizvode pseudomicelij (u

anaerobnim uvjetima-Candida albicans)-Pleomorfizam

� veličina stanica: 5-10 µm� oblik: kugličast, jajolik, izdužen� osnovni tip stanice: blastospora

Struktura stanice kvasca

15

� Blastospora: kuglasta ili jajolika� Razmnožavanje kvasaca:

nespolno - pupanjemspolno - askosporama (4-8 u askusu)

� Vrste iz roda Saccharomyces: proizvode enzime (fermentacija šećera),proizvode etanol i CO2

� Upotreba-primjena: u proizvodnji vina, piva, kiselog tijesta,...

Nespolno razmnožavanje stanice kvasca

Bolesti uzrokovane gljivama

� Fungalne infekcije - mikoze� klasifikacija: sustavne (dubinske),

subkutane (potkožne), kutane (kožne), superficijalne (površinske), oportunističke (uvjetne, kod oslabljenog organizma)

� bolesti mikotoksikoze – rezultat aktivnosti toksina-mikotoksina (sekundarnih produkata metabolizma) patogenih plijesni

16

Uvjetne mikoze (Candida albicans)

Kontrola i liječenje fungalnih infekcija

� Površinske kandidoze - amfotericin B� Dermatofitoze (lišajevi na kosi,

koži, noktima,...) - mikonazol� Površinske infekcije s kvascima -

mikoze (usna šupljina, koža, ...) –nistatin

� fungalni antibiotici tzv. polieni