1

2

MICROTESTER

ÚJ TECHNIKA A MIKROBIOLÓGIÁBAN

Dr. Reichart OlivérDr. Szakmár KatalinBudapest, 2012. február 15.

A redox-potenciál mérésen alapuló gyors vizsgálati módszer elméleti háttere

3

Probléma:• Klasszikus tenyésztéses módszerek időigénye nagy

(1 -3 nap).• A nagy időigény miatt az eredmények nem csatolhatók vissza a

technológiába.Cél:• Durva mikrobiológiai problémák gyors kiszűrése• Gyors tételminősítés• Átmeneti tárolási idő csökkentéseMegoldás:• Gyors mikrobiológiai vizsgálati módszerek

MIKROBIOLÓGIAI MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS PROBLÉMÁI

4

Élő és holt sejtek együttes számának meghatározása:• Direkt számlálás (csak tiszta folyadékban alkalmazható)

• Számlálókamra• Flow cytometer

• Turbiditásmérés (csak tiszta folyadékban alkalmazható)• ATP mérés (mikrobiális és élelmiszer eredetű ATP elkülönítése

nehéz)

Élősejtszám meghatározása:• Impedancia mérésen alapuló módszerek

• Malthus• Rabit• Bactrac

• Redox-potenciál mérése

GYORS MÉRÉSI MÓDSZEREK

A BCE ÉTK Fizika- és Automatizálás Tanszék és a

SZIE ÁOTK Élelmiszer-higiéniai Tanszék kutatói

által kifejlesztett és szabadalmaztatott eljárás.

MicroTester

REDOXPOTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ VIZSGÁLATI MÓDSZER

• Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú minták esetében.

• Egyszerű mérési technika.• Szabványos táptalajok használhatók.• A redox-görbe alakjából következtetni lehet a mikroba-

csoportra.• Nagyon széles (100-108) sejtszám-tartományban hígítás nélkül

alkalmazható.• Különösen célszerű membrán-szűréses módszer kiértékelésére.

MIT TUD A MICROTESTER?

7

Direkt mérés:• Szaporodás közvetlen detektálása a táptalaj redox-

potenciál változása alapján

Indirekt mérés: • Szaporodás detektálása a CO2 termelés alapján

A MICROTESTER ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI

Elméleti alapok:• A szaporodás energiaforrása a biológiai oxidáció, ami a

környezetben redukciót eredményez.• Biológiai rendszerekre jellemző általános redox reakció:

[Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]

• Nernst egyenlet:

reductant

Hoxidantln

Fn

TREE 0h

DIREKT MÉRÉS

9

E. coli szaporodás 1/2 TSB-ben

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

0 60 120 180 240 300

t (min)

Eh

(m

V)

4,5

5

5,5

6

6,5

7

7,5

8

8,5

lgN

(N

=cf

u/m

l)

Eh mV lgN

A REDOX-POTENCIÁL VÁLTOZÁSÁVAL A SZAPORODÁS NYOMON KÖVETHETŐ

10

KÜLÖNBÖZŐ BAKTÉRIUMOKREDOX-GÖRBÉI

Redox görbék TSB-ben

-400

-200

0

200

400

0 5 10 15 20

t (h)

Eh

(m

V)

steril Ps.aer. E.coli St. aur. Ent. faec. B.subt.

11

MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS (16 csatorna)

12

MICROTESTER MÉRŐCELLÁK

direkt mérőcella kémcső cella indirekt mérőcella

Lemezöntés, szélesztés• Látható telepek kialakulása

– Különálló (feltételezetten 1 telepképző egységből kiinduló), kb.

106 – 107 sejtből álló populáció.

Határhígítás (MPN)• Látható zavarosodás kialakulása, steril csövek jelenléte.

– Néhány (max. 10) sejtből kb. 107-108 sejt/ml sűrűségű populáció.

A SZAPORODÁS DETEKTÁLÁSA TENYÉSZTÉSES MÓDSZEREKNÉL

• A redox-potenciál változásának sebessége haladja meg az előírt kritikus értéket.

• Detektációs kritérium:

pl: |dE/dt|> 0,5 mV/min

Mikroorganizmustól és tápoldattól függően 0,4 – 1,0 mV/min közötti érték.

A SZAPORODÁS DETEKTÁLÁSAREDOX-POTENCIÁL MÉRÉSNÉL

15

A REDOX-GÖRBE JELLEMZŐ PARAMÉTEREI

Mikr oba T ápoldat kr it ér ium Mikr obaszám (mV/ min) lg N CFU/ ml

E. coli T SB 37 °C -1,0 6,2 1,6∙106 Ps. aer uginosa T SB 37 °C -0,4 6,3 2,0∙106 Ent er ococcus f aecalis T SB 37 °C -0,5 6,7 5,0∙106 S t aphylococcus aur eus T SB 37 °C -1,0 6,4 2,5∙106 Bacillus cer eus T SB 30 °C -0,8 6,5 3,2∙106

MICROTESTER DETEKTÁCIÓS KRITÉRIUMOKHOZ TARTOZÓ MIKROBASZÁMOK

Detektációs idő (Time To Detection, TTD):

a detektációs kritérium eléréséig szükséges idő.

Lemezöntés, szélesztés• Látható telepek kialakulása (106–107 sejt)• 1 sejtből indulva

Független a kiinduló mikrobaszámtól.

Határhígítás (MPN)• Látható zavarosodás kialakulása (107-108 sejt/ml)• 1-10 sejtből indulva

Független a kiinduló mikrobaszámtól.

TENYÉSZTÉSES MÓDSZEREKHEZ TARTOZÓ DETEKTÁCIÓS IDŐK

106–107 sejt/ml koncentráció elérése az inokulumról

indulva. A kiindulási sejtszám függvénye.

Meghatározva a TTD és a kiindulási sejtkoncentráció közötti

összefüggést, kalibrációs görbe alapján a kiindulási

mikrobák száma (lgNo) TTD méréssel becsülhető.

MICROTESTER DETEKTÁCIÓS IDŐK

19

A KIINDULÁSI SEJTSZÁM HATÁSA A REDOX-GÖRBÉRE

E. coli 1/2 TSB-ben

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

0 2 4 6 8 10 12 14

t (h)

Eh (

mV

)

steril lgN=0,09 lgN=2,38 lgN=3,39 lgN=4,25 lgN=4,80

20

KALIBRÁCIÓS GÖRBE

E. coli 1/2 TSB-ben y = -1,1736x + 8,4416

R2 = 0,9851

0

2

4

6

8

10

0 1 2 3 4 5

lgN (cfu/ml)

TT

D (

h)

Jelenlét/hiány próba:• Minta közvetlen beoltása

Nagyságrendi becslés (Titer):• Hígítási sor készítése, mérés

• Eredmény megadása nagyságrendként

MPN módszer:• Hígítási sor készítése

• Hígításonként beoltások

• Kiértékelés automatikusan

MÉRÉSI MÓDSZEREKKALIBRÁCIÓS GÖRBE NÉLKÜL

Kalibrációs görbe felvétele:• Telepszám és TTD összefüggés meghatározása.

• Egyenlet betáplálása a gépbe.

Mikroba (telepképző egység) szám meghatározás:• Közvetlenül a mintából.

• Előzetesen hígított mintából.

• Előzetesen koncentrált (membránszűrt) mintából.

Probléma:• Csak akkor alkalmazható, ha a mikroflóra összetétele ismert és van

kalibrációs görbénk.

MÉRÉS ELŐZETESEN FELVETT (KÜLSŐ) KALIBRÁCIÓS GÖRBE ALAPJÁN

MPN módszeren alapuló kiértékelés:• Hígítási sor készítése hígításonként egy, vagy több leoltással.• Redox-görbék felvétele.• A TTD értékek meghatározása. (Ha szükséges.)• Szaporodást mutató és nem mutató hígítási szintek alapján az MPN

érték meghatározása.• Az MPN érték és a különböző hígítási szintekhez tartozó TTD

értékek ismeretében a kalibrációs görbe felvétele.• A kalibrációs görbe alapján a hasonló minták mikrobaszámának

kiszámítása.

MÉRÉS MINTÁBÓL FELVETT (BELSŐ) KALIBRÁCIÓS GÖRBE ALAPJÁN

24

ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 1.

25

ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 2.

26

ESCHERICHIA COLI BELSŐ KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJÉNEK FELVÉTELE 3.

Elméleti alapok:• A szaporodás során keletkező CO2-ot lúgban elnyeletjük és

az oldat redox-potenciál változását mérjük.• Az elnyelető oldatban a potenciál-meghatározó

összefüggés:

23

30 ln

CO

HCOH

Fz

TREE

INDIREKT MÉRÉS

28

INDIREKT MÉRÉS

Saccharomyces cerevisiae

200

250

300

350

400

450

500

550

600

0 10 20 30 40 50

t (h)

Eh

(m

V)

lgN=4,1 lgN=3,1 lgN=2,1 lgN=1,1 lgN=0,1 Steril

29

INDIREKT MÉRÉS KALIBRÁCIÓS GÖRBÉJE

Saccharomyces cerevisiae(detektációs kritérium: dE/dt=0.2 mV/min)

TTD(h) = -7.2048.lgN + 41.254

R2 = 0.9856

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 1 2 3 4 5

lgN (cfu/cella)

TT

D (

h)

30

• Kísérletileg beállított koncentrációkkal az összefüggés jól reprodukálhatóan mérhető.

• Megfelelő koncentrációjú lúgoldat alkalmazásával a redox-potenciál változásából az elnyelt CO2 mennyisége számítható.

• Alapul szolgálhat a képződő CO2 mennyiségi meghatározásához (BOI mérés).

• Nagy BOI értékek esetén a predikció jelentős időmegtakarítást tesz lehetővé.

INDIREKT MÉRÉS

31

Szennyvíz

150

200

250

300

350

0 50 100 150

t (h)

Eh

(m

V)

BOI=400 mg/l BOI=200 mg/l BOI=100 mg/l

BOI BECSLÉSE INDIREKT MÉRÉS ALAPJÁN

32

Nyers szennyviz y = 26,179x - 15,58

R2 = 1

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5

BOI0/BOI

TT

D (

h) BOI0 = 400 mg/l

BOI PREDIKCIÓ REDOX-POTENCIÁLMÉRÉS ALAPJÁN

33

MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS (32 csatorna)

34

MICROTESTER MÉRŐBERENDEZÉS (2 csatorna)

35

A redox-potenciál mérésen alapuló gyors vizsgálati módszer validálva,

és élelmiszeripari vizsgálatokraakkreditálva van.

36

Köszönöm a figyelmet!

microtest1@t-online.hu Budapesti Corvinus Egyetem

Élelmiszertudományi Kar – Fizika-Automatika TanszékMicrotest Kft.