Fluorescencia

Biología celular 2017Dra. Melisa Monteleone

Visualizar partes de la célula:membrana plasmática, núcleo,vacuolas, retículo endoplásmico, etc.

Estudiar la interacción entremoléculas in vivo

Localizar moléculas específicas:proteínas, lípidos, etc

Diferenciar partículas muy pequeñasque por contraste de fases no seresolverían.

Estudiar procesos celulares: divisióncelular, muerte celular, cambios en elpotencial de membrana, endocitosis yexocitosis.

¿Para qué sirve?

¿Qué es?Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en elcual un material absorbe radiación de una fuente específica ymuy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayorlongitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido

Fuentes:Excitación por absorción de fotones: fotoluminiscenciaExcitación por una reacción química: quimio-luminiscenciaExcitación por un ser vivo: bioluminiscencia

1) La absorción de la luz de excitación elevala molécula del fluorocromo a un estado deexcitación con un mayor contenido deenergía, S1

2) En este estado de excitación semantienen un tiempo determinado, en elcual la molécula sufre cambiosconformacionales e interacciona con lasmoléculas de su entorno.Como consecuencia, parte de la energía delestado S1 se disipa, creándose un estadoS1’ de menor energía

3) Pasado este tiempo de excitación lamolécula emite luz de menor energíavolviendo a su estado fundamental, S0

S0

S1

S1’

1

2

3

Diagrama de Jablonski

Fotoluminiscencia

Fluorescencia

Fosforescencia

La diferencia entre ambos fenómenos es la capacidad de almacenar la energía.

La fluorescencia absorbe la energíaexcitación e inmediatamente emite laradiación luminosa (singuete excitado)

La fosforescencia, comienza igual,absorbiendo energía de excitación, perola almacena, retardando la emisión,siendo capaz de emitir esa radiaciónluminosa poco a poco durante minutos uhoras después de haber cesado la fuentede radiación excitadora inicial (tripleteexcitado).

Ambos procesos emiten luz

Un fluorocromo es una moléculacapaz de absorber fotones y emitirfotones de menor energía (mayorlongitud de onda). Un fluoróforo esla parte del fluorocromoresponsable de la emisión de lafluorescencia.

Los materiales que fluorescen lohacen porque contienen estructurascon configuraciones molecularesparticulares conocidas comofluoróforos o fluorocromos.

¿Por qué algunos materiales fluorescen?

1-Moléculas orgánicas: Los fluoróforosAlexa Fluor (derivados de la rodamina)han sido utilizados como marcadores debiomoléculas. La fotoestabilidad es unade las principales características de estetipo de colorantes, además barren todo elespectro.

Tipos de fluoróforos

2-Puntos cuánticos: son nanocristales (2-50nm) semiconductores que al seriluminados, re-emiten luz en una longitudde onda muy específica y que depende deltamaño de este. Cuanto más pequeñossean los puntos, menor es la longitud deonda y más acotadas las propiedadescuánticas de la luz que emiten. Por ello laluz emitida vira del azul al rojo a medidaque el tamaño del punto se incrementa.

3-Proteicos: GFP posee un barril beta formadopor 11 cadenas e incluye una hélice alfa centralque atraviesa el barril en toda su longitud. Enesta hélice hay tres aminoácidos consecutivosque forman un cromóforo natural, de forma quecuando la GFP es iluminada con luz ultravioleta,produce una brillante fluorescencia verde.

Mutaciones en residuos clavepermitieron obtener variantesde la GFP (espectro de coloresy estabilidad).

Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada unopresenta un espectro de excitación y de emisión característico y único.Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión obien los espectros de excitación y emisión.

Espectros de excitación y emisión

Características

Fluorímetro

¿Cómo se obtienen estos espectros?

La presencia de 2 monocromadores permiten el registro de dos tipos de espectros: el espectro de absorción y el espectro de emisión

Espectro de excitación: Muestra la diferente intensidad defluorescencia observada en función de la longitud de onda deexcitación, a una longitud de onda de emisión fija

Espectro de excitación

Variación de la IF al variar la λex a una λem constante

Eficacia de las diferentes λex para producir fluorescencia

Espectro de emisión: Muestra la intensidad de la emisión fluorescente enfunción de la longitud de onda de emisión, con una longitud de onda deexcitación fija (máxima).

Espectro de emisión

Variación de la IF al variar la λem a una λex constante

Intensidad de la radiación emitida a las diferentes λ

Espectro de excitación

Espectro de emisión

1- La intensidad de fluorescencia emitida varía con la longitud (λ)de excitación. La excitación a la λmax (A), produce la fluorescencia más intensa (A).

Características de los espectros

2- El perfil o aspecto delespectro de emisión no dependede la l de excitación.

3- El espectro de emisión es laimagen especular del espectrode absorción.

4- Los espectros se encuentrandesplazados

Puntos 1 y 2: Regla de Kasha

La emisión siempre proviene del S1 con una

intensidad proporcional al número de fotones

absorbidos.

Esto ocurre por la rápida conversión interna que

precede a la emisión

Punto 3: La regla del espejo

El espectro de absorción muestra los niveles vibracionales del estado excitado y el espectro de emisión los niveles vibracionalesdel estado basal, los cuales en la mayoría de los fluorocromos son

similares (ocurren las mismas transiciones electrónicas)

Cuando los electrones pasan del estado excitado al estado basal existe unapérdida de energía vibracional. Como consecuencia, el espectro de emisión esdesplazado hacia longitudes de onda mayores respecto al espectro deexcitación. A este desplazamiento se lo denomina corrimiento de Stokes.

Punto 4: Corrimiento de Stokes

La distancia entre los picos de excitación yemisión de un fluoróforo depende de suestructura electrónica.

Es fundamental para la sensibilidad dadoque permite que los fotones de emisiónsean detectados contra un fondo bajo,aislado de los fotones de excitación

http://www.lifetechnologies.com/ar/es/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

http://www.mcb.arizona.edu/IPC/spectra_page.htm

Tipos de fluorescencia.

La fluorescencia primaria (fluoróforosintrínsecos) es la que se da porque existe unaconfiguración inherente a la estructuramolecular. Ejemplo: clorofila, GFP

La fluorescencia secundaria (fluoróforosextrínsecos) ocurre cuando una moléculaespecífica o un grupo capaz de fluorescer, unfluorocromo, se introduce en la estructura dela muestra. Ejemplo: sondas catiónicasplanares como BrEt o DAPI que se agregan alos ácidos nucléicos

Éste es el procedimiento para la mayoría de las aplicaciones biológicas de la microscopía de

fluorescencia.

Aequorea victoria

DAPI intercalado en una molécula

de ADN

Los fluoróforos extrínsecos pueden ser, a través de vectores de expresión,introducidos en bacterias, células u organismos para dirigir la expresión tanto delas proteínas fluorescentes solas como fusionadas a otra proteína de interés en elcontexto del proceso biológico en estudio.

1) Photobleaching: Descomposición irreversible de las moléculas de losfluorocromos.Está directamente relacionado con la intensidad de la excitación y con el tiempodurante el cual estamos excitando la muestra.Se usan detectores altamente sensibles, objetivos y filtros ópticos optimizados.

2) Quenching: Disminución de la intensidad de la emisión debida a condicionesde temperatura o presión elevada, agentes oxidantes y algunas sales. Tambiénpuede ser debida a interacciones entre moléculas de fluorocromo, por lo queaumentar la concentración de éste no siempre supone un aumento defluorescencia.Se debe trabajar con agentes secuestradores de oxígeno.

Comercialmente se han desarrollado productoscon menor labilidad ante la estimulaciónlumínica (por ejemplo los fluoróforos Alexa).También se desarrollaron sustancias “antifade”que reducen el bleaching (Slow Fade, VectaShield, etc). Sin embargo estas sustancias no sepueden utilizar en células vivas

Factores que afectan la fluorescencia

Cuando se solapan los espectros de emisión. Ejemplo GFP/Alexa 488

Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos

NO SE PUEDEN USAR JUNTOS

SE PUEDEN USAR JUNTOS

Cuando la emisión de un fluoróforo es capaz de excitar un segundo fluoróforo y es esta fluorescencia la que es detectada.

Problemas al utilizar dos (o más) fluoróforos

Usos de estos “problemas” como herramientas en la investigación

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/spectralimaging/fretbiosensors/indexflash.html

Nature

FRET

FRAP y FLIP

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específicapor altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación defluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiemporegulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad demacromoléculas.

Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decoloradapor el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célulacompleta. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmentedecolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexiónla fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas,movimiento de proteínas