micropropagaciÓn de lophophora williamsii (lem. ex s.d...
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UNIVERSIDAD MICHOACANA DE
SAN NICOLÁS DE HIDALGO
FACULTAD DE BIOLOGÍA
MICROPROPAGACIÓN DE Lophophora williamsii
(Lem. ex S.D.) COULT.
Tesis
Que presenta:
CELIA PÉREZ GARIBAY
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR POR
EL TÍTULO PROFESIONAL DE
B I Ó L O G A
DIRECTORES DE TESIS: M. C. MIGUEL ALVARADO RODRÍGUEZ
D.C. RAFAEL SALGADO GARCIGLIA
MORELIA, MICHOACÁN, MÉXICO
ENERO, 2010.
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de
Biotecnología Vegetal de la Unidad de Agronomía de la
Universidad Autónoma de Zacatecas bajo la dirección del
M.C. Miguel Alvarado Rodríguez. Asimismo, se contó con
la asesoría del D.C. Rafael Salgado Garciglia del Instituto
de Investigaciones Químico Biológicas de la Universidad
Michoacana de San Nicolás de Hidalgo
Dedicatoria
Este trabajo se lo dedico a Simitrio mi esposo, por su amor y su apoyo
incondicional. A mis hijas Azalea y Larissa porque ellas son mi inspiración. A mis padres Roberto Pérez Gil y Rosario Garibay Arias (finada). A mis abuelitos Abraham y Rita y a mis queridas tías Guadalupe, Margarita,
María, Teresa, Alicia, Luz María, Hermila y Elena. Y a mis hermanos Hermila, Roberto, Abraham y Rita.
Agradecimientos
Le agradezco a Dios por permitirme realizar este sueño tan importante
para mí y por haber puesto en mi camino a mis dos asesores:
Al Maestro Miguel Alvarado Rodríguez que tuvo la paciencia para
enseñarme todo lo hoy sé de Cultivo de tejidos vegetales y corregirme
cuando fue necesario como cuando le decía citocina a la citocinina y me
abrió un espacio en su laboratorio para llevar a cabo este trabajo.
Al Dr. Rafael Salgado Garciglia por aceptar ser mi asesor aún cuando
no me conocía y al darme todo su apoyo me he sentido muy afortunada por
esto. Para ellos es mi agradecimiento infinito.
Agradezco también a la Universidad Michoacana de San Nicolás de
Hidalgo, en especial a la Facultad de Biología, por la formación y estudios
brindados. A los profesores Dr. Alejandro Martínez Palacios y M.C. Javier
Robles del Valle, por sus atinados comentarios y sugerencias durante la
escritura de la tesis. Mil gracias.
Les agradezco también al maestro Chano, a la Maestra Lety, y a Meña
por su apoyo y su amistad.
ÍNDICE
Página ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS RESUMEN
i
ii
iii
1.
INTRODUCCIÓN
1
2.
ANTECEDENTES
4
2.1.
LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
4
2.1.1.
Cultivo de tejidos vegetales
4
2.1.2. Macronutrimentos 5 2.1.3. Micronutrimentos 6 2.1.4. Agentes quelatos 7 2.1.5. Vitaminas 7 2.1.6. Aminoácidos 8 2.1.7. Reguladores del crecimiento vegetal 8 2.1.8. Carbohidratos 9 2.1.9. Agentes gelificantes 9 2.1.10. Agua 10 2.2.
MICROPROPAGACIÓN
10
2.3.
CACTÁCEAS
12
2.3.1.
Cultivo in vitro de cactáceas
14
2.4.
PEYOTE (Lophophora williamsii)
15
2.4.1.
Importancia religiosa
16
2.4.2. Importancia etnobotánica 17 2.4.3. Distribución geográfica 17 2.4.4. Características de las poblaciones de peyote 18 2.4.5. Clasificación taxonómica de Lophophora williamsii 18 3. JUSTIFICACIÓN 20 4.
OBJETIVOS
21
4.1.
OBJETIVO GENERAL
21
Página
4.1.1. Objetivos Específicos 21 5.
MATERIALES Y MÉTODOS
22
5.1
SITIO DONDE SE REALIZÓ EL ESTUDIO
22
5.2.
MATERIAL BIOLÓGICO
22
5.3.
MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
23
5.4. ESTABLECIMIENTO IN VITRO
23
5.5. FORMACIÓN DE BROTES
24
5.6. ENRAIZADO DE BROTES, TRASPLANTE YACLIMATACIÓN 26
5.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 27 6.
RESULTADOS
28
6.1.
ESTABLECIMIENTO Y GERMINACIÓN IN VITRO
28
6.2.
MICROPROPAGACIÓN
30
6.3.
ENRAIZAMIENTO
34
6.4.
ACLIMATACIÓN
36
7.
DISCUSIÓN
38
8.
CONCLUSIONES
42
9.
LITERATURA CITADA
43
i
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Constituyentes y preparación del medio de cultivo 24 MS (Murashige y Skoog, 1962). Cuadro 2a. Tratamientos con diferentes concentraciones de 25 Benciladenina y Ácido Indolbutírico para inducir brotación adventicia múltiple de L. williamsii. Cuadro 2b. Tratamientos con diferentes concentraciones de 26 Cinetina y Ácido Indolbutírico para inducir brotación adventicia múltiple de L. williamsii. Cuadro 3. Registro del comportamiento de las 200 semillas de 29 L. williamsii, 21 días después de la siembra en el medio de cultivo. Cuadro 4. Resultados de la comparación de medias mediante la 33 prueba de Diferencia Mínima Significativa, de los brotes obtenidos en explantes de la parte apical de L. williamsii. Cuadro 5. Tratamientos utilizados para inducir raíces en los 34 brotes obtenidos de L. williamsii. Cuadro 6. Calidad relativa de las raíces de plántulas in vitro de 35 L. williamsii, generadas en los diversos tratamientos. Cuadro 7. Eficiencia relativa de enraizamiento in vitro de brotes 36 L. williamsii
ii
ÍNDICE DE FIGURAS Página
Figura 1. Respuestas generadas en los cultivos in vitro por las 9
auxinas y citocininas.
Figura 2. Planta de Lophophora williamsii en el desierto zacatecano. 19 Figura 3. Semillas de L. williamsii. 22 Figura 4. Semillas de L. williamsii germinando en condiciones de 28 cultivo in vitro (MS, 30 g/L sacarosa, 12 g/L agar). Figura 5. Plántula de L. williamsii, 5 meses después de la germinación 30 in vitro (MS, 30 g/L sacarosa, 12 g/L agar). Figura 6. Número de brotes/explante en segmentos de parte apical 31 e intermedia de plántulas de L. williamsii cultivados en MS con diferentes concentraciones de BA a las 8 semanas. Figura 7. Brotes de los dos tipos de explantes (apicales y basales). 32 Figura 8. Explante apical con un solo brote, en el medio 32 nutritivo MS suplementado con 1.0 mg/L BA y 0.2 mg/L de AIB. Figura 9. Resultados cualitativos del proceso de brotes de 35 Regenerados in vitro de L. williamsii. Figura 10. Plantas micropropagadas de L. williamsii en proceso de 37 aclimatación, bajo cultivo en invernadero. Figura 11. Planta micropropagada de L. williamsii, después de 37 dos meses de aclimatación.
iii
PÉREZ-GARIBAY CELIA. 2009. MICROPROPAGACIÓN DE Lophophora williamsii (Lem. ex S.D.) COULT. Tesis de Licenciatura, Fac. De Biología, UMSNH. 46 p.
RESUMEN
Se desarrolló una metodología para propagar in vitro la especie Lophophora
williamsii (Lem. ex S.D.) Coult, 1894, a partir de 200 semillas colectadas en el
semidesierto norte del estado de Zacatecas. Se utilizó el medio nutritivo de
Murashige y Skoog, con diversas concentraciones de benciladenina (BA) y
cinetina (KIN) con ácido indol butírico (AIB). La germinación de semillas se efectuó
en un periodo entre 9 y 21 días. Se realizó escarificación física para aumentar el
índice de germinación; la contaminación no fue significativa, sin embargo más del
25% de las semillas no fueron viables. La tasa de multiplicación más alta (4.87) se
logró con el tratamiento 1.5 mg/L de BA sin auxina. Para el enraizamiento, la
producción de un sistema radical más vigoroso y/o con la forma típica de la
especie, se obtuvo al cultivar los brotes en dos diferentes medios de cultivo, en
MS ½ sin reguladores del crecimiento vegetal, y en MS completo con 0.6 mg/L de
AIB. Para la aclimatación se utilizó como sustrato una mezcla de arena y suelo de
labranza en relación 1:1, lográndose un 88% de supervivencia.
1
1. INTRODUCCIÓN
Las cactáceas conforman una de las familias botánicas más importantes en el
contexto de la flora nacional, ya que es en México donde alcanzan su
representación más significativa, además de los mayores endemismos registrados
para América, continente del cual son originarias. Su importancia se refleja en la
fusión que tienen con la vida del mexicano, pues son varias las especies que
intervienen en su bienestar ya sean como fuentes de alimento, para la obtención
de fibras, jabones, pegamentos, además de colorantes como los que se extraen
de la cochinilla de la grana (Dactylopius coccus), insecto que parasita algunos
nopales. Algunas son consideradas como plantas sagradas y elevadas a la
categoría de dioses por varios grupos étnicos como los tarahumaras, tepehuanes,
coras y huicholes (Bravo y Sánchez, 1989).
La familia Cactaceae comprende unas 2000 especies, de las cuales alrededor de
715 especies de cactáceas existen en México y de éstas el 80% son endémicas
(Sánchez y Hernández, 2002).
Dentro de las plantas superiores amenazadas de extinción, las cactáceas ocupan
desafortunadamente un sitio preponderante según la International Union for
Conservation of Nature (IUCN, 1983). Si además de este hecho se considera que
México es centro de diversidad genética y principal nicho ecológico de esta familia,
se comprenderá la importancia que para nuestro país tiene el análisis y eventual
solución del problema que pende sobre este grupo taxonómico (Rubluo, 1990).
Es bien sabido que las principales presiones que disminuyen la tasa de
supervivencia de las especies son: 1) la destrucción de sus hábitats naturales y 2)
tal vez con un mayor peso, la mencionada depredación criminal e inconsciente
que con fines de lucro se mantiene sobre aquellas plantas que su belleza o
constitución rara hace que alcance elevadas cotizaciones en el mercado mundial
(Oldfield, 1985).
2
En el área de la Biotecnología Vegetal existen diferentes técnicas que pueden
lograr un claro impacto en el rescate de especies en extinción, la principal de ellas
es la micropropagación llamada también cultivo in vitro o propagación por cultivo
de tejidos vegetales (CTV), la cual utiliza el principio de la totipotencialidad celular
para obtener grandes cantidades de individuos en un tiempo menor que el que
usualmente se requeriría en la naturaleza (Rubluo, 1990).
Con esta herramienta biotecnológica se ha logrado la propagación in vitro de un
sinnúmero de especies vegetales, de interés ornamental u hortícola, medicinal,
forestal y de aquellas que se encuentran en alguna categoría de riesgo de
extinción. Entre estas últimas plantas, la familia Cactaceae tiene un lugar
preponderante, ya que debido al gran número de especies en riesgo de
desaparecer, se han establecido sistemas de micropropagación de especies de
Astrophytum, Cephalocereus, Coryphantha, Echinocactus, Echinofossulocactus,
Ferocactus, Mammillaria, Nyctocereus y Stenocactus, entre otras más. En el caso
de cactáceas es importante considerar las ventajas de la presencia de las areolas,
las cuales constituyen en si la característica esencial de la familia y contienen
centros meristemáticos capaces de generar yemas axilares, espinas (hojas
modificadas) y yemas florales, siendo esta una característica muy útil en la
micropropagación (Rubluo, 1990).
En nuestro país, es una necesidad la conservación de este tipo de plantas, debido
a su vulnerabilidad y a su extracción masiva del hábitat, como es el caso del
peyote (Lophophora williamsii) una cactácea importante del semidesierto
zacatecano, catalogada con protección especial (Pr) en la Norma Oficial de
Ecología de México (NOM-059-ECOL-2004) y como especie vulnerable por el
CITES (Convención sobre el Tráfico Internacional de Especies de Flora y Fauna
Amenazadas) que la incluye en el apéndice II (Arias et al., 2005). Se encuentra
distribuida en Zacatecas además de Tamaulipas, Nuevo León, Coahuila,
Chihuahua así como en el estado de Texas en los Estados Unidos (Glass, 1998).
3
El peyote ha despertado interés mundial por los efectos singulares que produce en
el organismo cuando se ingiere. Su sabor es amargo, debido a la presencia de
unos 60 alcaloides, donde el principal de ellos es la mezcalina, Esta sustancia
actúa en el cuerpo humano de la misma manera que lo hace el neurotransmisor
norepinefrina y su ingestión provoca alteración de la conciencia. Es tóxica en dosis
mayores a 0.5 gramos y produce síntomas como náusea severa, vómito,
taquicardia, ansiedad e hipertensión arterial (Batis y Rojas-Aréchiga, 2002). Las
sustancias activas que contiene son consideradas como drogas peligrosas y su
posesión es ilegal excepto para los indígenas huicholes en México y la Iglesia
Nativa Americana en Estados Unidos. En el resto del mundo no es penalizada su
posesión (Glass, 1998).
El peyote tiene muchos usos en la medicina tradicional: para tratar la influenza, la
artritis, la diabetes, los desórdenes intestinales, la mordedura de serpiente, el
piquete de escorpión y el envenenamiento por Datura sp. Los tarahumaras
consumen cantidades pequeñas de peyote para combatir el hambre, la sed el
agotamiento mientras van a cazar y cuando corren detrás de un ciervo durante
días sin comida, agua o descanso alguno (Batis y Rojas-Aréchiga, 2002).
Por ello, como una alternativa para conseguir la conservación de esta cactácea,
es propósito de la presente investigación el establecer un sistema de propagación
masiva a través del uso de cultivos in vitro de L. williamsii, a partir de segmentos
de plántulas establecidas in vitro.
4
2. ANTECEDENTES
2.1. LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
La biotecnología vegetal tiene como una de sus bases el cultivo de tejidos
vegetales, que consiste en una serie de técnicas que permiten cultivar y
manipular, bajo condiciones artificiales y controladas, células, tejidos y órganos
vegetales. Entre las aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales se tiene la
micropropagación de plantas, la producción in vitro de compuestos naturales de
alto valor en cultivos de células o órganos vegetales, la obtención de materiales
mejorados mediante la selección in vitro u otras técnicas, la conservación de
germoplasma vegetal mediante la criopreservación o almacenamiento de mínimo
crecimiento, la selección de variantes somaclonales y mutantes, la obtención de
metabolitos secundarios a escala industrial, la producción continua y controlada
de sustancias difíciles de obtener por extracción o por síntesis química y el cultivo
de brotes y raíces principalmente para la obtención de aceites esenciales y
compuestos que requieren de cultivo de tejido de cultivos diferenciados (Pierik,
1990).
2.1.1. Cultivo de tejidos vegetales
En el cultivo de tejidos vegetales se manejan tres principios básicos que definen el
éxito de los experimentos: la elección del explante (órgano, tejido o segmento
vegetal) que será utilizado para iniciar y por regla general entre más joven y
menos diferenciado esté, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo in
vitro. La elección del medio es otro principio, el cual tiene otros dos componentes
importantes: elementos o nutrientes esenciales para el crecimiento y desarrollo, y
sustancias denominadas reguladores del crecimiento vegetal, que determinan el
tipo de respuesta y el éxito del establecimiento in vitro. El último principio es la
condición aséptica del medio con la esterilización del mismo y del material
vegetal. Estos tres principios determinan la respuesta del tejido que puede
5
presentarse, como la organogénesis (formación de órganos como raíces y brotes),
la embriogénesis somática y la formación de tejido calloso o simple desarrollo del
tejido. Una respuesta no deseable es la muerte del tejido, necrosis (Pérez-Molphe
et al., 1999).
Para mantener los cultivos in vitro, se requiere la presencia de varios elementos
que naturalmente las plantas necesitan, de los cuales se han identificado más de
60 elementos, incluyendo oro, planta, plomo, mercurio, arsénico y uranio.
Obviamente, no todos los elementos presentes en las plantas son esenciales. Los
elementos llamados micronutrientes son requeridos en cantidades muy pequeñas,
en concentraciones iguales o menores a los 100 mg/kg de materia seca y los
macro nutrientes son requeridos en concentraciones de 1,000 mg/kg de materia
seca (Raven et al., 1999).
2.1.2. Macronutrimentos
Además del carbono, hidrógeno, y oxígeno, los elementos más demandados por
las plantas son: nitrógeno, fósforo, potasio, calcio, magnesio y azufre. El nitrógeno
es importante porque forma parte de las estructuras proteicas, ácidos nucléicos,
porfirinas que intervienen en la fotosíntesis, y es un elemento esencial porque
determina en gran medida la tasa de crecimiento del tejido; comparado con el ion
nitrato NO3- (es la forma más oxidada del nitrógeno), el ión amonio, NH4- es la
forma más reducida; las plantas utilizan nitrógeno reducido para su metabolismo, y
dentro de la planta el nitrógeno existe casi en su mayor parte en la forma reducida
(Salgado-Garciglia, 2003).
El fósforo interviene en la estructura de moléculas nucleicas y en la síntesis de
compuestos de alta energía, además de que participa en la activación de diversas
enzimas; el fósforo es adsorbido por la planta en forma de iones de fosfato. El
potasio es necesario para la división celular normal, síntesis de carbohidratos,
clorofila y asimilación de nitrógeno importante en la apertura de estomas, es un
6
activador de enzimas en la síntesis de ciertos péptidos, de proteínas y de
carbohidratos; los iones de potasio son rápidamente transportados a través de las
membranas y dos de sus funciones más importantes son regular el pH y el
ambiente osmótico dentro de las células (Salgado-Garciglia, 2003).
El calcio es un constituyente de la pared celular en forma de pectato de calcio y
está involucrado en la plasticidad de las células, ya que la remoción de calcio
incrementa la permeabilidad y la plasticidad de la membrana, entre otras
funciones también están la organización de cromatina en la mitosis, activador de
enzimas (fosfolipasa, arginina-cinasa, ADP fosfatasa y adenil cinasa), número de
mitocondrias y en la translocación de carbohidratos (CHOs).
Magnesio es importante en los procesos de fotosíntesis y metabolismo de
carbohidratos, es un constituyente de la clorofila, activador de enzimas (biosíntesis
de CHOs, síntesis de ADN y ARN, fijación de CO2-RUBISCO y PEP carboxilasa) y
agente de unión de ribosomas (síntesis de proteínas) (Salgado-Garciglia, 2003).
El azufre está presente en algunas proteínas en forma de aminoácidos azufrados
y constituyentes de vitaminas (tiamina y biotina), coenzima A, enzimas (grupos
sulfhidrilos), síntesis de esteroles y lignina, importante en la fotosíntesis (síntesis
de ferrodoxina); el azufre es absorbido por la planta como SO4-2 (Pérez-Molphe et
al., 1999).
2.1.3. Micronutrimentos
Los más importantes son fierro, manganeso, zinc, boro, cobre, cobalto y
molibdeno, estos últimos cinco son fundamentales para la síntesis de clorofila y la
función de los cloroplastos (López, 1990). El fierro es requerido para la formación
de los precursores de la clorofila, tiene incorporación en citocromos y ferrodoxina,
y es componente de varias flavoproteínas (peroxidasas y catalasas). El
manganeso es necesario para el mantenimiento de ultraestructura y el proceso
7
fotosintético (la actividad del fotosistema II es proporcional al contenido de
manganeso), esencial en los pasos de transferencia de electrones, activador de
enzimas en: ciclo de Krebs, reducción de nitratos y oxidación del ácido
indolacético (AIA). Cobre y zinc se requieren en la oxidación e hidroxilación de
compuestos fenólicos, el zinc además participa en la síntesis de AIA, a través de
la síntesis de triptofano. Molibdeno y fierro forman parte de las enzimas nitrato
reductasa y nitrogenasa, Cobalto es el metal componente de la vitamina B12, la
cual se involucra en la síntesis de ácidos nucléicos. Boro es necesario para el
mantenimiento de la actividad meristemática, está involucrado en la síntesis de
bases nitrogenadas, en particular uracilo, interviene en el transporte de
carbohidratos dentro de la planta y facilita transporte a través de membranas
(George, 1993).
2.1.4. Agentes quelatos
Son moléculas que retienen un ión de metal con varias uniones químicas
formando un complejo en forma linear o de anillo (EDTA=ácido etilendiamino tetra-
acético) (López, 1990; George, 1993).
2.1.5. Vitaminas
Se requieren en la realización de una serie de reacciones catalíticas en los
sistemas enzimáticos y se emplean en pequeñas cantidades. Las más utilizadas
son: tiamina (vitamina B1) es la única realmente esencial en casi todos los tejidos
vegetales, ácido nicótico (niacina), piridoxina (vitamina B6), ácido pantoténico
ayuda en el crecimiento de ciertos tejidos, ácido fólico, disminuye la proliferación
de tejido en la obscuridad, mientras que en la luz la aumenta, riboflavina, inhibidor
del crecimiento de raíces, vitamina E ayuda a la formación de callos (López, 1990;
Salgado-Garciglia, 1999).
8
2.1.6. Aminoácidos
Se utilizan como fuente de nitrógeno; glicina es el único aminoácido usado en
medios de cultivo para células vegetales; caseína hidrolizada se emplea para
enriquecer en nitrógeno el medio de cultivo; otros arginina, L-metionina, glutamina
y asparagina (Salgado-Garciglia, 1999).
2.1.7. Reguladores del crecimiento vegetal
Las fitohormonas o reguladores de crecimiento vegetal actúan en concentraciones
muy bajas (μmol hasta máximo mmol por litro) sobre el crecimiento y la
diferenciación celular. El transporte de estas sustancias puede ser apolar o polar,
el primero es por difusión a lo largo de un gradiente, y el segundo es más
específico y depende de la energía metabólica, se transportan por xilema y floema
(Lüttge et al., 1993). Las fitohormonas en pequeñas cantidades, fomentan, inhiben
o modifican cualquier proceso fisiológico vegetal (Weaver, 1990). En la actualidad,
las auxinas, citocininas, giberelinas, etileno, ácido salicílico, triacontanol,
brasinoesteroides, turgorinas y poliamidas, son considerados dentro del grupo de
hormonas y reguladores de crecimiento. En cultivos in vitro solo son utilizadas las
auxinas (ácido naftalenacético, ANA; ácido indolbutírico, AIB; ácido indolacético
AIA; etc.), las citocininas (benciladenina, BA; cinetina, KIN; y zeatina, ZEA) y las
giberelinas (ácido giberélico, GA3) (Salgado-Garciglia, 1999).
En los procesos de morfogénesis in vitro, son elementales estos tres tipos de
reguladores de crecimiento (auxinas, citocininas y giberelinas), ya que estimulan la
elongación y división celular, según la combinación y concentración de éstos,
como se muestra en la figura 1. Los reportes de regeneración in vitro, indican que
dependiendo del tipo de regulador de crecimiento y las dosis utilizadas, es la
respuesta del tejido, la cual es diferente para cada especie vegetal, por lo que no
existe una regla general para una respuesta morfogenética. Aunque no se debe
9
olvidar que la respuesta de un tejido in vitro es el producto de la interacción de
reguladores de crecimiento endógenos y exógenos (Castro-Gallo, 2001).
Figura 1. Respuestas generadas en los cultivos in vitro por las auxinas y citocininas.
2.1.8. Carbohidratos
Se utilizan como fuente de energía y reguladores osmóticos. La sacarosa es la
mejor fuente de carbono (George, 1993), y es el azúcar más empleado, le siguen
la glucosa, maltosa, rafinosa, fructosa, galactosa, manosa y lactosa (López, 1990).
Se adiciona usualmente en cantidades de 20 a 45g/L (Salgado-Garciglia, 1999).
2.1.9. Agentes gelificantes
El agar se ha empleado como soporte en los medios sólidos y semisólidos, es un
derivado de un alga marina; es un polisacárido con una elevada masa molecular
que tiene capacidad de gelificar los medios (Pierik, 1990). Generalmente se
emplea agar-agar en una concentración de 0.5 a 0.6% (Caña et al., 1999).
RESPUESTA
PRODUCCIÓN DE RAÍCES
EMBRIOGÉNESIS
TEJIDO CALLOSO
BROTES ADVENTICIOS
PROLIFERACIÓN DE YEMAS
NULA ALTA
ALTA NULA
CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN DE AUXINAS DE CITOCININAS
10
2.1.10. Agua
El agua constituye el 95% del medio de cultivo, por lo tanto la purificación es
necesaria, misma que se lleva a cabo por destilación, por intercambio de iones y
por ósmosis inversa (George, 1993).
2.2. MICROPROPAGACIÓN
La micropropagación es la propagación asexual de plantas utilizando las técnicas
de cultivo de tejidos in vitro (Pérez-Molphe et al., 1999). Salgado-Garciglia y
colaboradores (1997) definen micropropagación como el incremento masivo de
especies por medio de su fragmentación y el posterior desarrollo de plantas
completas a partir de dichos fragmentos en un medio aséptico.
Existen tres vías diferentes para la regeneración de plantas in vitro: la brotación y
proliferación de yemas, la embriogénesis somática y la organogénesis. El primer
caso se parte de meristemos ya formados para la obtención a partir de ellos de
una o varias plantas completas, mientras que en la embriogénesis somática y la
organogénesis se parte de tejidos no meristemáticos y se requiere de un proceso
de desdiferenciación y rediferenciación de los tejidos para dar lugar a embriones
somáticos o brotes adventicios. Otra diferencia básica es que en el primer sistema,
las nuevas plantas se originan a partir de estructuras multicelulares mientras que
en los sistemas de embriogénesis somática y órgano génesis las nuevas plantas
se originan a partir de una sola célula (Pérez-Molphe et al., 1999).
La potencialidad de las células vegetales para su regeneración In vitro se explica
debido a su totipotencialidad, lo que permite su propagación, de tal manera que a
partir de células desdiferenciadas (callos) puede inducirse la producción de brotes
(organogénesis) o de embriones somáticos (embriogénesis somática), de esta
manera se obtienen plantas completas (plántulas) (Salgado-Garciglia, 2003).
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El desarrollo del cultivo de tejidos puede conducir selectivamente a un proceso de
clonación o a un proceso con alta probabilidad de producción de mutantes
(variación somaclonal). Los mecanismos de selección están dados por el origen
del explante: cuando se utilizan meristemos, la clonación es el efecto dominante,
en tanto que al utilizar cualquier otro explante (tallos, hojas, epicotilos, etc.) que
induzcan callo de forma abundante, se favorece la aparición de la variación
somaclonal (Rubluo, 1990).
La importancia de la micropropagación está basada en las siguientes ventajas
(Hartmann et al., 1997; Dodds y Roberts, 1995).
a) Permite la obtención de plantas de alto registro fitosanitario, ya que al
someter al tejido vegetal a este sistema de cultivo se eliminan totalmente
las enfermedades de tipo bacteriano y fúngico y en unas ocasiones las de
tipo viral.
b) Las plantas obtenidas por este sistema son réplicas exactas entre si y fieles
copias de la planta progenitora.
c) El número de individuos obtenidos por este método es muy superior al
obtenido por cualquier otro método de propagación, por unidad de
propágulo.
d) En algunas ocasiones es posible acortar los tiempos de producción de
plantas.
e) Permite tener en un espacio relativamente pequeño un gran número de
plantas.
f) Facilita el almacenaje y transporte de plantas reales o potenciales. Estos
dos últimos son de gran importancia tanto en el establecimiento de bancos
de germoplasma como en la reducción de costos por concepto de manejo,
almacenaje y transporte de plantas.
12
g) Elimina los problemas adicionados por largas cuarentenas a que son
sometidas las plantas en las fronteras cuando se trata de introducirlas de
una nación a otra.
h) Es un método de propagación que hace posible a corto plazo establecer la
uniformidad genética de una población.
Consta de varias etapas:
1. La selección de la planta madre, se escoge el genotipo ideal.
2. El establecimiento de los culticos axénicos.
3. Manipulación del tejido, activación de las yemas axilares y generación de
brotes.
4. Elongación y enraizamiento, adquisición de raíces por parte de los brotes.
5. Adaptación a condiciones ambientales.
2.3. CACTÁCEAS
Las cactáceas son autóctonas del Continente Americano y se distribuyen en zonas
áridas y semiáridas principalmente. En México se alberga la mayor cantidad de
especies (Bravo-Hollis, 1997), pero se han diversificado ampliamente y también
pueden encontrarse en regiones tropicales y subtropicales, templadas, frías y
hasta nevadas (Arias, 1997).
Las cactáceas son plantas perennes que pueden vivir varios años, presentan
formas que van desde un aspecto globoso hasta columnares y algunas otras son
subterráneas (Anderson, 2001). Pertenecen al grupo de las dicotiledóneas, con la
presencia de tejidos muy desarrollados para el almacenamiento de agua y
nutrimentos. Los tallos y las raíces están adaptados para soportar sequías y
carecen de hojas laminares para reducir o eliminar el área de contacto con el
medio. La reproducción de las cactáceas tiene lugar por medio de semillas o por
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multiplicación vegetativa y aún cuando los frutos producen numerosas semillas,
muy pocas son las que llegan a germinar y formar nuevas plantas ya que sirven
como alimento a algunos animales como aves y mamíferos (Bravo-Hollis y
Sánchez-Mejorada, 1991).
La mayoría son terrestres, también las hay epífitas y rupícolas. Generalmente son
solitarias con raíces que pueden ramificarse y con tallos articulados (capaces de
enraizar y originar nuevos individuos). El tallo forma el cuerpo de la planta, es
verde pues realiza la actividad fotosintética, muestra gran diversidad morfológica y
presenta tubérculos o mamilas con disposición helicoidal. La areola es una
estructura vegetativa distintiva en este grupo y se encuentra sobre las costillas
formadas por la fusión de los tubérculos, ésta es una zona de crecimiento y las
areolas desarrolladas poseen múltiples pelos o tricomas. Las cactáceas poseen
espinas que son hojas modificadas para la protección contra predadores,
producen sombra, condensan la humedad y la dirigen a la zona de absorción. Las
espinas se disponen de diversas maneras en la areolas y tienen además
diferentes formas: aciculares, cónicas, sublobuladas, plumosas suaves, etc., por
su ornamentación pueden ser lisas, anilladas, acanaladas y envainadas. Los frutos
en su gran mayoría son comestibles (Arreola, 1997).
Otra adaptación muy importante de esta familia es que en estas plantas la
apertura de los estomas ocurre principalmente durante la noche cuando la
temperatura es más baja, de esta manera evitan la pérdida de agua mientras
ocurre la toma de CO2, esto conduce a una acidificación gradual del tallo, la
senda CAM (metabolismo ácido de las crasuláceas). Esta senda se presenta más
o menos en el 6% de las especies vegetales. Entre las plantas CAM se
encuentran las piñas, las suculentas de las zonas áridas y semiáridas, las epífitas
tropicales no parásitas, como la mayoría de las orquídeas, los agaves y más o
menos el 98% de los cactos (en todos excepto en las especies con hoja del
género Pereskia y otros cuantos). La fijación inicial de CO2 en las plantas CAM
involucra a la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPCasa) que fija HCO3-- y
14
como ya se mencionado ocurre en la noche, mientras que en plantas C3 y C4
ocurre durante el día. Las plantas CAM también fijan CO2 durante el día, pero gran
parte de él proviene de los compuestos dentro de las plantas que ya incorporaron
este gas durante la noche anterior. La fijación diurna del CO2 en las plantas CAM
usa la enzima Rubisco (ribulosa-1, 5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa) y la senda
fotosintética C3 (Nobel, 1998).
2.3.1. Cultivo in vitro de cactáceas
Al revisar la literatura mundial, se puede constatar que comparativamente este
grupo ha recibido poca atención en cuanto al cultivo in vitro, sin embargo de los
trabajos publicados se puede concluir que las cactáceas ofrecen amplias
perspectivas para su cultivo in vitro, y que los resultados hasta ahora permiten
vislumbrar aplicaciones de impacto para la propagación masiva de estas plantas y
su rescate de la extinción, así como un uso racional de esta riqueza (Rubluo,
1990).
Dentro de los estudios de micropropagación en cactáceas destacan los siguientes:
Havell y Kólar en 1983, trabajaron con Turbinicarpus krainzianus; Escobar y
colaboradores en 1986, reportaron un trabajo de micropropagación en Opuntia
amyclea e hicieron hincapié en la aplicación del cultivo de tejidos vegetales en
cactáceas con el fin de investigar la biosíntesis de alcaloides, inducción de la
proliferación de brotes y la realización de estudios morfogenéticos fisiológicos;
Vyscot y Jára en 1984, trabajaron con especies del género Mammillaria; Martínez-
Vázquez y Rubluo en 1989, realizaron un trabajo sobre la micropropagación con
Mammillaria san-angelensis que es una especie en peligro de extinción y por tanto
el principal objetivo fue el rescate de esta especie.
Asimismo, Infante en 1992 realizó un trabajo sobre la proliferación de brotes y
embriogénesis en Mediocactus coccineus (pitaya amarilla). Apreciada de Olivera y
colaboradores, en 1995, realizaron un trabajo acerca de las condiciones de
15
inducción y mantenimiento del tejido calloso en Cereus peruvianus Mill. con el
propósito de regenerar la planta completa. Malda en 1998, reportó la inducción de
embriogénesis somática y la regeneración de plántulas de Obregonia denegrii. En
este mismo año Pérez-Molphe-Balch y colaboradores (1999), reportaron la
micropropagación de 21 especies de cactáceas mexicanas de los siguientes
géneros: Astrophytum, Cephalocereus, Coryphantha, Echinocactus,
Echinofossulocactus, Ferocactus, Mammillaria, Nyctocereus y Stenocactus.
Meza-Rangel en el 2000, citado por Castro-Gallo (2001), reportó el desarrollo de
sistemas de cultivo y propagación in vitro de cinco especies: Atrophytum ornatum,
Coryphantha bumamma, Mammillaria bocasana, Mammillaria oteroi y Thelocactus
hexaedrophorus. Castro-Gallo y colaboradores en el 2002 reportaron la
propagación in vitro de 10 especies mexicanas de cactáceas. Pérez-Molphe-Blach
y Dávila-Figueroa en 2002 también reportó la propagación in vitro de tres
especies columnares de cactus del Desierto de Sonora. Pérez-Molphe-Balch y
Dávila-Figueroa en este mismo año trabajaron con la micropropagación in vitro de
Pelecyphora aselliformis y P. strobiliformis. Para plantas del género Stenocereus,
Morales-Rubio y col. (2004), señalan el éxito solamente para la regeneración de
brotes en S. gummosus y en S. queretaroensis. Más actualmente, se ha
reportado la micropropagación de ocho especies de Turbinicarpus (Dávila-
Figueroa et al., 2005), de Aztekium hintonii (Bejarano-León et al., 2005) y de
Stenocereus quevedonis (Villalobos-Jarquín et al., 2007).
2.4. PEYOTE (Lophophora williamsii)
Fray Bernardino de Sahagún fue el primero en describir esta planta en 1560 al
referirse al uso que daban los chichimecas mexicanos a la raíz de “peiotl”, peyote
y peyotl son modificaciones de esta palabra. Los indígenas tanto de México como
de Estados Unidos que hacen uso del peyote también le han dado nombres en
sus propios lenguajes a continuación se mencionan algunos (Anderson, 1980).
16
En México:
Cora-huatari
Huichol-hícouri, híkuli, hícori, y xícori
Tarahumara-híkuli, híkori, houanamé, y híkuli wanamé, entre otros.
Tepehuan-kamba ó Kamaba
Otomi-beyo
En Estados Unidos:
Comanche-wokowi ó wohoki
Delawere-biisung
Mezcalero –Apache- ho
Navajo-azee
2.4.1. Importancia religiosa
El continente americano es el espacio geográfico donde se ha registrado mayor
diversidad de plantas que contienen principios psicoactivos (más de 100
especies). Estas plantas contienen sustancias químicas -alcaloides- capaces de
promover estados anormales de conciencia que ocasionan alteraciones visuales,
auditivas, táctiles, olfativas e incluso gustativas. Por esta razón son vistas por
algunas culturas como portadoras de inteligencia y son consideradas instrumentos
divinos, fuente de una profunda y misteriosa sabiduría y de belleza e inspiración,
así como un medio para mantener la identidad cultural. Algunas de las prácticas
rituales se conservan entre los tarahumaras, tepehuanes coras y huicholes, etnias
de México cuyas leyendas, tradiciones e historia están asociadas de manera
importante las cactáceas y sobre todo al peyote el más famoso de los cactos
alucinógenos (Batis y Rojas- Aréchiga, 2002). Un ejemplo de cómo el peyote es
parte elemental de la tradición religiosa de los huicholes es el siguiente párrafo:
“Aunque el culto del peyote pertenece al ciclo de la temporada seca es tan grande
su importancia dentro de la religión huichol, que no debe sorprender que también
17
abarque cosas tan vitales como lo son el nacimiento de un niño, su salud
crecimiento y la procreación o multiplicación de animales...” (Zingg, 1982).
2.4.2. Importancia etnobotánica
El peyote tiene muchos usos en la medicina tradicional como ya se había
mencionado anteriormente: para tratar la influenza, la artritis, la diabetes, los
desórdenes intestinales, la mordedura de serpiente, el piquete de escorpión y el
envenenamiento por Datura. Durante cientos de años los huicholes han frotado el
peyote en las heridas para prevenir la infección. Se ha probado que la hordenina
muestra una acción inhibitoria contra un espectro amplio de bacterias resistentes a
la penicilina. También actúa para combatir el hambre y el agotamiento. En la
actualidad se prescribe como un emético (induce el vómito) como un estimulante
cardiaco y como un narcótico (reduce o alivia el dolor) (Batis y Rojas- Aréchiga,
2002).
2.4.3. Distribución geográfica
Esta planta se encuentra distribuida en los estados mexicanos de San Luis Potosí,
Zacatecas, Tamaulipas, Nuevo León, Coahuila, Chihuahua, así como el estado de
Texas en los Estados Unidos. En su mayoría forman parte del Desierto
Chihuahuense, representativo de un tipo de vegetación llamado matorral xerófilo
con suelos predominantemente de tipo calizos, con un pH desde 7.9 a 8.3. Estos
suelos se caracterizan por tener más de 150 ppm (partes por millón) de calcio. En
el semidesierto zacatecano se la encuentra en compañía de la gobernadora
(Larrea tridentata), el hojasén (Fluorencia cernua), la Mariola o guayule (Partenium
incanum), el mezquite dulce (Prosopis glandulosa), la cholla (Opuntia imbricata),
yucas (Yucca carnerosana, Yucca filifera) y agaves como la lechuguilla (Agave
lechuguilla) entre otros (Glass, 1998).
18
2.4.4. Características de las poblaciones de peyote
La apariencia de L. williamsii varía mucho. En algunos casos las plantas se
presentan en forma individual pero también exhiben formas cespitosas, formando
montículos que pueden alcanzar hasta 2 metros de diámetro. El número y arreglo
de costillas varía ampliamente resultado tanto de la edad como una respuesta al
medio ambiente, así en ejemplares jóvenes se pueden observar de 4-5 costillas
mientras que en plantas maduras alcanzan hasta más de 14. Presentan los dos
tipos de reproducción sexual por semilla y asexual con brotes laterales desde las
areolas o cuando es cortada la corona y es reemplazada por dos o más y cuando
la raíz sufre algún daño brotan raíces adventicias y se pude regenerar la planta
(Anderson, 2001).
2.4.5. Clasificación taxonómica de Lophophora williamsii
La Familia Cactaceae comprende tres subfamilias: Pereskiodeae, Opuntioideae y
Cactoideae. Dentro de esta última se encuentra el género bajo estudio,
Lophophora que presenta solo dos especies (L. diffusa y L. williamsii). Ha habido
mucha confusión en cuanto a la ubicación taxonómica de L. williamsii y ésta ha
transitado por varios géneros como Echinocactus, Ariocarpus y Mammillaria hasta
que en 1894 Coulter propuso un nuevo género para el peyote: Lophophora
(Guzmán et al., 2003):
Reino Plantae Haeckel, 1866
División Magnoliophyta Cronquist, Takht & Zimmerm., 1966
Clase Magnoliopsida Cronquist, Takht & Zimmerm., 1966
Orden Caryophyllales
Familia Cactaceae A. L. Juss, 1789
Subfamilia Cactoideae Eaton, 1836
Género Lophophora J.M.Coult., 1894
Especie L. williamsii (Lem. ex S.D.) Coult. 1894
19
Descripción de Lophophora williamsii (Lem. ex Salm-Dyck) J.M. Coult. (Contr. U.
S. Nat. Herb. 3:131.1894).- Son plantas verde azuladas, de forma globular
achatada o aplanadas en la parte apical, de 5 a 8 cm de diámetro, con una raíz
engrosada de hasta 10 cm o más; costillas de 7 a 13, verticales o irregulares,
tuberculadas; flores centrales, las cuales están rodeadas por una masa de pelos
largos, flores blancas o rosa pálido de 2.5 cm de diámetro cuando están
totalmente abiertas, con tubo en forma de embudo; el perianto presenta
coloraciones verdes en la parte del envés, con un endurecimiento en la punta; los
filamentos son mucho más cortos que el perianto, blancos; el estilo es blanco
amarillo rosado en la parte de arriba, más corto que el perianto; los lóbulos del
estigma son 5, lineares y rosados; el ovario en forma de bastón; fruto de más o
menos 2 cm, semillas de 1 mm de diámetro, con un ancho hilo basal (Britton y
Rose,1963) (Figura 2).
Figura 2. Planta de Lophophora williamsii en el desierto zacatecano.
20
3. JUSTIFICACIÓN
Después de observar que no existe literatura acerca de investigaciones sobre la
propagación masiva de Lophophora williamsii, y a que existe la necesidad para su
conservación dado el valor que tiene esta especie no solo como elemento
importante en el semidesierto zacatecano, sino también en los ámbitos cultural y
religioso, el realizar trabajos que lleven a establecer sistemas de propagación, es
una alternativa para ayudar a su conservación. La propagación in vitro de L.
williamsii apoyaría de manera indirecta a su conservación.
21
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Establecer un sistema de propagación masiva a través del uso de cultivos in vitro
de Lophophora williamsii. (Lem. ex S.D.) Coult a partir de segmentos de plántulas
establecidas in vitro.
4.1.1. Objetivos Específicos
1. Determinar el balance de la concentración de los reguladores del crecimiento
vegetal más adecuados para la fase de establecimiento e inducción de brotación
múltiple adventicia in vitro de L. williamsii.
2. Definir la composición adecuada del medio de cultivo y balance hormonal para
inducir el enraizado de brotes de L. williamsii.
3. Evaluar las condiciones para realizar la aclimatación de las plantas
micropropagadas de L. williamsii.
22
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. SITIO DONDE SE REALIZÓ EL ESTUDIO
La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos
Vegetales, de la Escuela de Agronomía de la Universidad Autónoma de
Zacatecas.
5.2. MATERIAL BIOLÓGICO
Para establecer los cultivos in vitro se partió de 200 semillas de Lophophora
williamsii obtenidas de frutos maduros recolectados directamente en su hábitat
natural en el municipio de Mazapil, Zacatecas, a finales de agosto, 2007. En la
figura 3 se muestra el tamaño de las semillas.
Figura 3. Semillas de L. williamsii.
23
5.3. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
Se utilizó el medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con
reguladores del crecimiento vegetal (auxinas y citocininas) en diferentes
concentraciones. Para la preparación del medio de cultivo se partió de soluciones
concentradas o stock de macronutrimentos, micronutrimentos, fierro-EDTA y
vitaminas; además, de agar y de sacarosa (Cuadro 1).
5.4. ESTABLECIMIENTO IN VITRO
La germinación de las semillas in vitro se indujo sembrándolas en el medio de
cultivo MS sin reguladores del crecimiento. La esterilización superficial de las
semillas, previa a su incubación se realizó de acuerdo a la siguiente rutina de
asepsia:
-Se lavaron 5 veces con 1.0% de Extran® y se enjuagaron con agua corriente.
-Se colocaron dentro de un matraz kitazato de 500ml, con 100 ml agua destilada,
50 µl de Tween® y 0.2 g del fungicida Nitrasán D por 20 min. Agitando de manera
continua y dando un minuto de vacío cada 5min.
- Se enjuagaron con agua destilada y a continuación, bajo condiciones de asepsia
(campana de flujo laminar) se depositaron en una solución de alcohol etílico al
70% en volumen durante 1 min. Nuevamente se enjuagaron con agua destilada.
-Después, se pasaron las semillas a una solución de hipoclorito de sodio comercial
(Cloralex®) al 10, 15 y 20% durante 10, 20 y 30 min, para su esterilización externa
y se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril.
-Se sembraron 5 semillas en frascos con 30ml de medio MS ajustado a un pH de
5.7 y solidificado con 12g/L de agar (Sigma, Co.®).
-Finalmente los frascos se taparon y sellaron con película adherible y se
mantuvieron bajo luz continua a 25±2ºC.
24
Cuadro 1. Constituyentes y preparación del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962).
MACRONUTRIMENTOS 20X
(Tomar 50 mL/L de medio) FÓRMULA
mg/L
(Requerimient /L) P.M. Stock (g)
(1 L)
Nitrato de Amonio NH4NO3 1,650.00 80.05 33.00
Nitrato de Potasio KNO3 1,900.00 101.11 38.00
Cloruro de Calcio dihidratado CaCl2. 2H2O 440.00 147.03 8.80
Sulfato de Magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O 370.00 246.50 7.40
Fosfato diácido de Potasio KH2PO4 170.00 136.09 3.40
MICRONUTRIMENTOS 500X (Tomar 2 mL/L de medio)
Stock (mg) (100 ml)
Sulfato de Manganeso monohidratado MnSO4.H2O 16.90 169.01 845.00
Sulfato de Zinc heptahidratado ZnSO4.7H2O 8.60 287.56 430.00
Ácido Bórico H3BO4 6.20 61.84 310.00
Ioduro de Potasio KI 0.83 166.00 41.50
Molibdato de Sodio dihidratado Na2MoO4.2H2O 0.25 241.95 12.50
Sulfato cúprico heptahidratado CuSO4.7H2O 0.025 249.70 1.25
Cloruro de Cobalto hexahidratado CoCl2.6H2O 0.025 237.95 1.25
FIERRO-EDTA 200X (Tomar 5 mL/L de medio)
Stock (g) (500 ml)
Sal disódica (Etilendiaminotetracético disódico) Na2EDTA 37.30 372.20 3.73
Sulfato Ferroso heptahidratado FeSO4.7H2O 27.80 278.03 2.78
VITAMINAS 200X (Tomar 5 mL/L de medio)
Stock (mg) (100 mL)
Tiamina HCl 0.10 2
Ácido Nicotínico 0.50 10
Piridoxina HCl 0.50 10
Mio-inositol 100.00 2,000
Agar 12.0 g/L
Sacarosa 30 g/L
5.5. FORMACIÓN DE BROTES
Para la inducción de la formación de brotes mediante la activación de areolas en
segmentos de plántulas de L. williamsii, se hizo un experimento preliminar con el
fin de seleccionar la concentración y tipo de reguladores del crecimiento vegetal,
se tomó la parte apical de las plántulas (explante apical) y la parte superior de la
raíz (explante basal) que es donde según la literatura se encuentran meristemos
25
de crecimiento, para obtener explantes transversales en forma de rodajas. Éstos
se cultivaron en 5 diferentes tratamientos con 6-bencil-aminopurina o
benciladenina (BA) (0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0 mg/L), con 12 réplicas.
Una vez observado el comportamiento de los explantes en las diferentes
concentraciones de BA en el experimento anterior se diseñó el segundo
experimento donde las citocininas utilizadas fueron BA y cinetina (KIN). Las
concentraciones utilizadas para BA 0, 0.5, 1.0, 1.5, y 2.0 mg/L, que fueron
adicionadas solas o en combinación con la auxina ácido indolbutírico (AIB), en una
concentración de 0.2mg/L (Cuadro 2a). Las de cinetina fueron 1.0, 1.5 y 2.0 mg/L
en combinación con 0.2 mg/L de AIB (Cuadro 2b). En todos los casos se utilizaron
de 10 explantes por tratamiento, manteniendo los cultivos bajo una temperatura
constante de 25±2°C y un fotoperiodo de 16 h de luz (2000 lux de intensidad
luminosa), en un cuarto de cultivo.
Se determinó el porcentaje de explantes que presentaron brotes, así como el
número y tamaño de éstos. Se analizó cuál balance hormonal generó más brotes y
más vigorosos. Para identificar los mejores tratamientos, los resultados se
sometieron a un análisis de varianza (ANDEVA).
Cuadro 2a. Tratamientos con diferentes concentraciones de BA y AIB para
inducir brotación múltiple de L.williamsii.
BA (mg/L)
AIB (mg/L)
0 0.5 1.0 1.5 2.0
0 T1 T2 T3 T4 T5
0.2 T6 T7 T8 T9 T10
26
Cuadro 2b. Tratamientos con diferentes concentraciones de KIN y AIB para inducir brotación múltiple de L. williamsii.
KIN (mg/L)
1.0 1.5 2.0
AIB(mg/L) 0.2 T11 T12 T13
5.6. ENRAIZADO DE BROTES, TRASPLANTE Y ACLIMATACIÓN
Para el enraizado de los brotes generados in vitro en el proceso anterior, se
eliminó la parte basal y se colocaron en posición vertical en el medio de
enraizamiento.
Para este fin se probaron 5 tratamientos:
1) medio MS, 2) medio MS pero con 50% de macronutrimentos, 3) medio MS más 2.5g/L de carbón activado, 4) medio MS más 0.6 ó 1mg/L de ácido indolacético (AIA), 5) medio MS más 0.6 ó 1mg/L de ácido indolbutírico (AIB).
Se colocaron 10 brotes por tratamiento. Se registró la presencia o ausencia de
raíces y se obtuvo el porcentaje de enraizamiento para cada tratamiento.
En la transferencia a suelo de las plántulas micropropagadas, se retiró el sello y se
aflojó la tapa de los recipientes con las plántulas enraizadas, esto con el fin de
iniciar la adaptación al medio externo. Después de una semana las plántulas se
sacaron del frasco, se eliminaron con agua totalmente los restos de medio de
cultivo; se colocó la parte basal de la plántula durante 1 min en una solución de
AIB a una concentración de 20 mg/L. Posteriormente se sembraron en macetas
con una mezcla de arena y suelo. Se cubrieron 3 días con bolsas de plástico
transparente para conservar la humedad, después se hicieron perforaciones en las
bolsas, diariamente para obtener una humedad relativa similar a la externa. Se
determinó el porcentaje de supervivencia.
27
5.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
En el cultivo de tejidos vegetales cada una de las unidades experimentales
(frascos con medio de cultivo y tejido vegetal) se mantuvieron en condiciones
físicas y químicas homogéneas. Esto se considera así porque son pocos
tratamientos (menos de 30), y el número de repeticiones, aunque al principio fue
igual para todos los tratamientos (10), varió por un problema de contaminación.
Por lo anterior, en este trabajo se utilizó un diseño estadístico no equilibrado
completamente al azar, para realizar la comparación de respuesta en lo referente
a las siguientes etapas:
1. Establecimiento del cultivo in vitro 2. Multiplicación 3. Enraizamiento
El análisis de varianza es un método mediante el cual se determina la variación
con respecto a los diversos tratamientos, para establecer si al menos uno de ellos
es diferente a los demás.
La prueba de hipótesis que se consideró es la siguiente:
Hipótesis nula H0: T1=T2=T3=…Tn Los tratamientos T tienen
la misma respuesta
Hipótesis alternativa HA:Ti ≠ Ti’, i≠i’,donde:
i, i’ € {T1, T2, T3…,Tn }
Existen cuando menos
dos tratamientos T con
diferente respuesta
Cuando al menos uno de los tratamientos fue diferente a los demás, los datos se
sometieron a la prueba estadística llamada Diferencia Mínima Significativa (DMS),
para jerarquizar las respuestas en cada uno de los tratamientos.
28
6. RESULTADOS
6.1. ESTABLECIMIENTO Y GERMINACIÓN IN VITRO
La germinación de semillas de Lophophora williamsii cultivadas in vitro inició a los
9 días después de la siembra, con observación visual del rompimiento de la testa.
El proceso de germinación no fue homogéneo ya que se presentó en un rango de
entre los 9 y los 21 días, germinando solamente el 48.5% de las semillas (97/200).
En la figura 4 se muestra la germinación heterogénea de las semillas.
Figura 4. Semillas de L. williamsii germinando en condiciones de cultivo
in vitro (MS, 30 g/L sacarosa, 12 g/L agar).
Al resto de las semillas se les practicó escarificación mecánica en condiciones de
asepsia, utilizando pinzas y bisturí, auxiliándonos con microscopio estereoscópico.
En este proceso se eliminó la mayor cantidad de la testa, procurando no dañar el
endospermo ni el embrión. La escarificación se realizó para asegurar un mayor
29
número de semillas germinadas. Después de tres semanas de cultivo in vitro se
tuvo un registro de 135 semillas germinadas (67.5%).
La contaminación al momento de la siembra no fue significativa, ya que solo se
presentó un 5% (10/200 semillas), mayormente por hongos, aunque también se
observó la presencia de bacterias. Las semillas que no germinaron mostraron
tejido con necrosis, indicativo de muerte. En la cuadro 3 se muestra el
comportamiento de la totalidad de las semillas durante el proceso de germinación.
Cuadro 3. Registro del comportamiento de las 200 semillas de L. williamsii, 21 días después de la siembra en el medio de cultivo.
Semillas Comportamiento
No. Germinación (%)
97 48.5 Germinadas de manera natural
38 19.0 Germinadas mediante escarificación mecánica
10 5.0 Contaminación (hongos y/bacterias)
55 27.5 No germinaron
Debido a que la germinación no se presentó de manera uniforme, el crecimiento y
desarrollo de las plántulas también fue desigual, pues mientras algunas de ellas a
los 38 días alcanzaron 6 mm de largo, otras solamente alcanzaron los 2 mm de
longitud.
A los 5 meses de cultivo las plantas registraron en promedio 7mm de largo y 4mm
de diámetro con elongación del tallo (Figura 5).
30
Figura 5. Plántula de L. williamsii, 5 meses después de la germinación in
vitro (MS, 30 g/L sacarosa, 12 g/L agar).
6.2. MICROPROPAGACIÓN
En el experimento preliminar con los tratamientos de solo BA (0, 0.5, 1.0, 1.5 y 2.0
mg/L) a las dos semanas, pudo observarse el inicio de la brotación en algunos
explantes, apreciándose también en este proceso que la emisión de brotes
también presentó una alta heterogeneidad, al igual que en la etapa de
germinación. El conteo final del número de brotes se realizó a las 8 semanas. La
formación de brotes fue mínima, con tan solo un brote por explante en la mayoría
de los tratamientos, sin embargo puede observarse en la figura 6, que la respuesta
de los explantes provenientes de la parte apical de la plántula en el mejor de los
tratamientos presentaron una tasa de multiplicación promedio de 1.1; mientras que
en los explantes de la parte intermedia mostraron la respuesta mayor con 1.92
brotes/explante, al ser cultivados con 1.5 mg/L de BA sin auxinas.
31
Figura 6. Número de brotes/explante en segmentos de parte apical e intermedia de plántulas de L. williamsii cultivados en MS con diferentes concentraciones de BA a las 8 semanas.
Segundo experimento.- Con base a la respuesta observada en el experimento
anterior, los explantes de L. williamsii fueron cultivos en el medio nutritivo MS bajo
la combinación de benciladenina (BA, 0, 0.5, 1, 1.5 y 2 mg/L) con ácido
indolbutírico (AIB, 0, 0.2 mg/L) y la combinación de cinetina (KIN, 1, 1.5 y 2 mg/L)
con AIB (0.2 mg/L), obteniendo un total de 13 tratamientos. También se
inocularon los dos tipos de explantes, parte intermedia y parte apical. La cantidad
de brotes correspondientes a los explantes intermedios no se reporta, ya que en
este experimento el 17.4% presentaron vitrificación, y el 25.4% presentaron
necrosis, estos dos problemas frecuentes en el cultivo de tejidos vegetales
impidieron tener resultados confiables. Sin embargo es conveniente señalar, que
en los explantes intermedios que no mostraron los problemas antes señalados,
presentaron brotes aparentemente más vigorosos, como se puede apreciar en la
Figuras 7 y 8.
32
Figura 7. Brotes de los dos tipos de explantes considerados. El de la izquierda corresponde a un explante apical, mientras que el de la derecha a un explante intermedio
Figura 8. Explante apical con un solo brote, en el medio nutritivo MS
suplementado con 1.0 mg/L BA y 0.2 mg/L de AIB.
33
En este experimento se mantuvieron los explantes 16 semanas, ya que se
consideró que en el experimento anterior no se le dio el tiempo suficiente para que
todos los explantes tuvieran una respuesta. Al realizar un análisis de varianza de
los resultados obtenidos en este experimento, se demostró que existían
diferencias significativas en el conjunto de tratamientos.
Posteriormente se realizó una comparación de medias, para un nivel de
significancia de 0.05, se utilizó la prueba llamada Diferencia Mínima Significativa,
confirmándose que el mejor tratamiento para inducir brotación múltiple en L.
williamssii es el número 4 (1.5 mg/L BA) como se muestra en el Cuadro 4.
Cuadro 4. Resultados de la comparación de medias mediante la prueba de Diferencia Mínima Significativa, de los brotes obtenidos en explantes de la parte apical de L. williamsii.
TRATAMIENTOS MEDIA
T4 (1.5 mg/L BA) 4.875 A
T10 (2.5 mg/L BA+0.2mg/L AIB) 4.667 AB
T11(1.0 mg/L KIN+0.2mg/L AIB) 4.333 ABC
T3(1.0 mg/L BA) 3.333 ABC
T7(0.5 mg/L BA+0.2mg/L AIB) 2.875 ABC
T5(2.0 mg/L BA) 2.500 BC
T2(0.5 mg/L BA) 2.111 C
T6(0.2 mg/L AIB) 2.200 C
T1(Sólo medio MS) 2.200 C
T13(2.0 mg/L KIN+0.2mg/L AIB) 2.200 C
T12(1.5 mg/L KIN+0.2mg/L AIB) 1.833 C
T8(1.0 mg/L BA+0.2mg/L AIB) 1.625 C
T9(1.5 mg/L BA+0.2mg/L AIB) 1.500 C
Nivel de Significancia = 0.05
34
6.3. ENRAIZAMIENTO
Una vez que los brotes alcanzaron un tamaño de 7 mm o más, se separaron del
explante que les dio origen, se sometieron al proceso de enraizamiento,
incubándolos en 7 diferentes tratamientos, señalados en el cuadro 5. La
experimentación de enraizado se realizó con 70 brotes (10 por cada tratamiento),
seleccionándose los que presentaron una apariencia vigorosa y con un diámetro
de 7 a 8 mm. Los resultados de enraizado se registraron semanalmente durante 8
semanas. Las primeras raíces se presentaron a las dos semanas en algunos
tratamientos aunque el registro final se hizo a las 8 semanas.
Cuadro 5. Tratamientos utilizados para inducir raíces en los brotes obtenidos de L. williamsii.
Suplementos
0
AIB (mg/L) AIA (mg/L) C activado
(2.5 g/L) 0.6 1.0 0.6 1.0
MS (basal) T1 T2 T3 T4 T5 T6
½ MS
(50%
macronutrimentos)
T7
Los resultados cualitativos del proceso de enraizamiento se indican en la cuadro 6.
Donde se considera una escala de 0+ para cuando no hubo enraizamiento, hasta
4+ para las raíces más vigorosas y con la forma típica de L. williamsii. Los valores
1+, 2+, 3+ se consideraron de manera estimativa dentro de los extremos de esta
escala para los datos intermedios. La V corresponde a cuando las plantas se
vitrificaron. Lo anterior se puede apreciar en la última foto de la figura 9.
35
Cuadro 6. Calidad relativa de las raíces de plántulas in vitro de L. williamsii, generadas en los diversos tratamientos.
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7
4+ 3+ 3+ 2+ 0+ 0+ 4+
4+ 1+ 0+ 1+ 3+ 0+ 4+
4+ 3+ 4+ 1+ 3+ 0+ 0+
1+ 3+ 2+ 0+ 2+ 0+ V
2+ 3+ 2+ 0+ 1+ 2+ 0+
0+ 3+ 0+ 2+ 2+ 0+ 4+
1+ 3+ 2+ 2+ 1+ 0+ 0+
0+ 2+ 2+ 2+ 3+ V 4+
4+ 1+ 1+ 2+ 2+ 0+ 4+
1+ 0+ 0+ 1+ 2+ 0+ 4+
Figura 9. Resultados cualitativos del proceso de enraizamiento de brotes regenerados in vitro de L. williamsii.
36
Cuadro 7. Eficiencia relativa de enraizamiento in vitro de brotes de L. williamsii.
6.4. ACLIMATACIÓN
En la etapa de aclimatación se seleccionaron 50 plantas que tuvieran un sistema
radicular bien desarrollado, y con la forma de raíz característica de L. williamsii
(napiforme), a las cuatro semanas se realizó una evaluación. Se utilizó como
sustrato una mezcla de 50% de arena de río y 50% de suelo de labranza. Al
término de las cuatro semanas se tuvo un registro de 44 (88%) plantas
aclimatadas (Figuras 10 y 11).
A las 8 semanas las 44 plantas se mantuvieron en buen estado. En las plantas
que no lograron aclimatarse se apreció la presencia de hongos en el sustrato. Lo
anterior se debió al exceso de humedad, y a que no se aplicó fungicida.
TRATAMIENTO MEDIA
T7 (1/2 MS) 2.4 A
T2 (MS + 0.6 mg/L AIB) 2.2 A
T1 (MS) 2.1 A
T5 (MS + 1.0 mg/L AIA) 1.9 A
T3 (MS + 1.0 mg/L AIB) 1.6 A
T4 (MS + 0.6 mg/L AIA) 1.3 AB
T6 (MS + 2.5g/L de carbón activado) 0.2 B
Nivel de Significancia = 0.05
37
Figura 10. Plántulas micropropagadas de L. williamsii en proceso de aclimatación, bajo cultivo en invernadero.
Figura 11. Planta micropropagada de L. williamsii, después de dos meses de aclimatación.
38
7. DISCUSIÓN
Las cactáceas presentan una estructura particular denominada areola, donde se
encuentra el meristemo, órgano a partir del cual se pueden producir hojas, flores
tallos y espinas (Bravo-Hollis, 1978), consecuentemente las areolas tienen la
capacidad de producir brotes que se desarrollen en plantas completas (Rubluo,
1990). De acuerdo a lo anterior se logró el establecimiento del cultivo in vitro de L.
williamsii, de manera exitosa. La estimulación de brotes in vitro, es un sistema con
una menor eficiencia que la organogénesis y la embriogénesis somática, no
obstante, el procedimiento de proliferación múltiple de brotes permite la
generación de plantas clonadas con relativa facilidad.
El número promedio de brotes de 4.8 en el tratamiento con 1.5mg/L de BA que
fue el tratamiento que mejor respondió para L. williamsii está dentro del rango
que reportan Castro-Gallo y col. (2002) para 10 especies de cactus mexicanos de
2.15 a 17.5 brotes por explante, con de 1 a 2mg/L de BA y KIN de 2 a 4mg/L.
Aunque Starling (1985) obtuvo hasta 25 brotes en Leuchtenbergia principis con10
mg/L de BA sin auxinas. Pérez-Molphe Balch y col. (1998) tuvieron un rango de
brotación de 0.9 a 4.5 brotes por explante con BA y 2iP, en 21 especies de cactos
mexicanos observándose que existen especies que generan pocos brotes por
explante. Los mismos autores, mencionan que ha quedado demostrado que cada
especie responde de manera diferente al cultivo in vitro, por lo que resulta
necesario establecer las condiciones para la multiplicación, enraizamiento y
adaptación a suelo para cada especie de cactácea que se desee micropropagar.
Con respecto al periodo de apreciación de resultados, Rubluo (1990) señala que la
observación y evaluación del proceso de regeneración y micropropagación debe
ser seguida por periodos de entre 1-6 meses, después de establecidos los
cultivos, efectuando subcultivos si es necesario, para nuevamente realizar las
39
observaciones y evaluaciones, hacer comparaciones y determinar si se repiten los
resultados o si hay diferencias en cada subcultivo. En el caso de L. williamsii a
partir de que se incubaron los explantes en los diversos tratamientos, el tiempo
que transcurrió para iniciar el registro de resultados de brotación adventicia fue de
cuatro semanas en el primer experimento, y de 16 semanas para el segundo.
En cuanto a los reguladores del crecimiento vegetal todos los autores revisados
concuerdan en que hay que incorporar estas fitohormonas al medio de nutritivo, de
preferencia citocininas, especialmente BA, KIN y 2-iP en un rango de
concentración de entre 1-10 mg/L, para inducir la proliferación de brotes. Respecto
a las auxinas se recomienda el uso de AIA y AIB, pero en rangos de concentración
mucho más bajos, entre 0.02-2mg/L (Rubluo, 1990).
Con base a las consideraciones antes mencionadas, en los experimentos de
brotación adventicia de L. williamsii en el medio de cultivo se usaron 2 citocininas:
BA y KIN en concentraciones de 0.5-2.0 y 0.2 de AIB y se pudo confirmar que el
BA sin auxinas es suficiente para estimular la brotación de las yemas axilares
como lo mostró el experimento previo donde sólo se utilizó BA y en el experimento
definitivo donde la media del número de brotes más alta fue en el tratamiento que
contenía solamente 1.5mg/L de BA. Esto coincide con los resultados obtenidos
por Escobar (1986), Starling (1985), Martínez-Vázquez y Rubluo (1989) y Clayton
y col. (1990). Aunque el tratamiento con 2 mg/L de BA y 0.2 mg/L de AIB fue la
segunda media más alta y un explante con mayor cantidad de brotes (10) se
presentó en este balance hormonal, y esto concuerda con Mauseth (1977) quien
menciona que el crecimiento óptimo de plantas in vitro ocurre en presencia de
auxinas y citocininas. Sin embargo es conveniente señalar que los brotes
obtenidos cuando se usó 1.5 mg/L BA sin auxina, se apreciaron con menor vigor,
respecto a cuando se usó la combinación 2 mg/L de BA y 0.2 mg/L de AIB.
En lo referente a la diferencia entre el número de brotes inducidos en explantes
apicales y basales, nuestro experimento previo nos muestra que el segundo tipo
40
de explante genera mayor cantidad de brotes. Esto se pude deber según Infante
(1992) a la carencia de la zona principal de producción de auxinas (zona apical)
reduciendo la dominancia apical de manera que hay una mejor respuesta a la
citocinina exógena; aunque por otra parte se observó que al tener mayor área de
contacto a través del corte con el medio se genera una mayor tendencia a la
vitrificación y a la necrosis de manera particular en L. williamsii.
Observando los trabajos de micropropagación la mayoría coinciden en que una
relación aproximada de 10:1 entre una citocinina y una auxina respectivamente
augura los mejores resultados para brotación múltiple. Esto coincide con nuestros
resultados 2:0.2 de BA y AIB como segunda media más alta en cuanto al número
de brotes.
Diversos autores entre ellos Pérez- Molphe y col. (1999), señalan la utilidad de
agregar alguna auxina o carbón activado al medio de cultivo para el
enraizamiento. Escobar y col. (1986), mencionan que aunque obtuvieron
resultados óptimos de enraizamiento utilizando AIB, basta con la auxina endógena
para tener buenos resultados en este proceso. Asimismo, Vyskot y Jára (1984)
trabajando con Mammillaria carmenae y Astrophytum miryostigma utilizaron
indistintamente un medio suplementado con AIA (1mg/L) o un medio sin hormonas
para este mismo fin, no obteniendo diferencias significativas en ambos
tratamientos.
Los resultados obtenidos en la presente investigación coinciden con lo anterior, ya
que las raíces más vigorosas se obtuvieron en el tratamiento que no contenía
auxinas, sin embargo, para el caso de L. williamsii el 30% de los brotes no tuvo
respuesta. También es conveniente señalar que el tratamiento con 0.6 mg/L de
AIB produjo raíces en el 100% de los brotes, aunque no tan vigorosos como en el
primer caso.
41
Finalmente, el 88 % de supervivencia obtenido en la fase de aclimatación se
encuentra dentro del rango que reportan Vyskot y Jára (1984), aunque como se
mencionó en los resultados, es posible aumentarlo, mediante el uso de algún
agente fungicida que evite la proliferación de hongos en las dos primeras semanas
a partir de iniciado el proceso de aclimatación.
42
8. CONCLUSIONES
Se logró desarrollar un sistema de regeneración in vitro y por consiguiente la
micropropagación de Lophophora williamsii vía activación de yemas axilares.
El promedio más alto de brotes (4.87) fue obtenido en explantes apicales de
plántulas cultivadas in vitro de Lophophora williamsii, en MS con 1.5mg/L de
benciladenina.
El enraizado de los brotes se consiguió al cultivarlos en medio nutritivo MS con la
mitad de la concentración de sales correspondientes a los macronutrimentos y sin
reguladores de crecimiento. Bajo este tratamiento se indujo la formación de raíces
tipo napiforme.
Se logró un 88% de supervivencia en las plantas micropropagadas de
Lophophora williamsii al cultivarse en condiciones de vivero.
43
9. LITERATURA CITADA
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