microbiología general seminario nro 4seminario nro. 4 ... · aminoácido para formar una amina,...
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Microbiología General Seminario Nro 4Seminario Nro. 4
Aislamiento e identificaciónAislamiento e identificaciónAislamiento e identificación Aislamiento e identificación de Microorganismosde Microorganismos
¿P é i l i i ?• ¿Para qué aislar microorganismos ?
é• ¿Para qué identificar un microorganismo ?
• Caracterización vs. Identificación
1. Pruebas bioquímicas Identificación presuntiva
2. Pruebas Moleculares Identificación final
Aislamiento e identificación de microorganismos
ProcedenciaProcedencia
Características
Tratamiento inicial
Expectativas
Tratamiento inicial
Siembra
Ai l i tMétodos Aislamiento
Identificaciónconvencionales
Métodos molecularesmoleculares
Tratamiento Enriquecimiento Tratamiento inicial (selectivo o no)
Calentamiento
Filt ióFiltración
Homogeneización, etc
Si b
Selección de medios de cultivo
InóculoSiembra Inóculo
Observación microscópica
AislamientoAgotamiento por estrías, dils
seriadas, etc
SubcultivoSubcultivo
MacroscópicosCriterios de pureza
Microscópicos
Cultivo puro
Identificación
MuestrasMuestrasMuestrasMuestras
Microorganismos ColiformesAgua Microorganismos
indicadores P. aeruginosa
Alimentos
Detección de B. cereus en leche en polvo, miel, arroz
Detección de S. aureus en alimentosAlimentos Detección de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda
Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentadosproductos fermentados
Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo
Selección de esporasCalentamiento
EnriquecimientoEnriquecimientoAgotamiento por estrías
Mossel
Colonias aisladas
Man (-), Lecitinasa (+)
RepiqueTinciones
Cultivo puro
Morfología de las colonias
Forma y tamaño de las coloniasIrregular, puntiformeg p
Bordesliso rugosoliso, rugoso.
ElevaciónC l d b d liConvexo, elevado, umbonado, liso.
ColorPigmento, opaca, translucida, brillante.
TexturaTextura Mojada, mucosa, seca.
Bacillus subtilis
Proteus vulgarisKlebsiella pneumoniae
Forma de la colonia y tamaño: irregularBordes: onduladoElevación: umbonadaColor: Blanca crema
Típico movimiento sobre la caja de petri
Textura : seca
Catalasa
Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasacatalasa.
H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reaccionesno enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática deno enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática deradicales superóxido.
Micrococcaceae, Staphylococcus catalasa (+)Streptococcaceae, Streptococcus Enterococcus catalasa (-)
2H2O2 2H2O+ O2Catalasa + +
-
Oxidasa
Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromocitocromo oxidasaoxidasa cc(respiración). Oxidasa negativaoxidasa positiva.
La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donorhacia el aceptor final de la respiración (oxígeno). En este test un donor deelectrones artificial (phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo
doxidasa.
oxidasa (+)oxidasa (+)
Pseudomonas
oxidasa (-)
E. coli
Neisseria
Indol
Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar el indol de la molécula de triptofano
Triptofano Indol + ácido piruvico + amoniotriptofanasa
Triptofano Indol + ácido piruvico + amonio
Indol + p-dimetletilenamino-benzaldehido Rosindol (Rojo)HCl
Alcohol isoamilicoAlcohol isoamilico
Reactivo de Kovacs
Indol
El triptofano se adiciona al medio en una concentración 1%.Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.
Rojo de metilo – Voges Proskauer
Glucosa Piruvato LactatoLactato
SuccinatoSuccinatoCO2
Acetil-CoA Etanol
A t tA t t
SuccinatoSuccinato
+Formiato CO2
AcetatoAcetato
H2
+
2.3Butanodiol2.3Butanodiol + CO2
Glucosa Piruvato
2EtanolEtanolLactatoSuccinatoAcetatoCO2 + H2
Voges-Proskauer (VP) Daniel Voges Bernhard Proskauer
Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3-butanediol como resultado de la degradación de glucosa.
Glucosa Piruvato Acetoina 2.3-butanediolO2+
α - naphtol
+
40% KOH
Barritt's A Barritt's B Diacetilo + Creatina (Rojo)
Alcohol
Barritt s A Barritt s B Diacetilo + Creatina (Rojo)
α - naphtolen etanol absoluto
KOH 40%
Rojo de metilo
Rojo de metilo (MR) Para identificar bacterias que producen fermentación mixta de la glucosa y liberan ácidosácidos establesestables.
Este medio de cultivo incluye, peptona, glucosa, y buffer fosfato. El indicador de pH j d til di i lti id 48 h P d b j d 4 4 l i di drojo de metilo se adiciona a un cultivo crecido 48 hs. Por debajo de 4.4, el indicador
cambia a rojo (positivo).Amarillo con pH por encima de 6.0 (negativo)
Citrato
Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar Citrato comoúnica fuente de carbono.
Ci d S di A id i i A id l i COCitrato permeasa
Citrato de Sodio Acido piruvico + Acido oxalacetico + CO2
p
Citrasa
Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3
(liberado luego de usar el citrato)(Alcalino --> pH)
Citrato
Agar Citrato de Simmon: Es un medio
definidodefinido que contiene Citrato de Sodio
como única fuente carbonada y amonio
como única fuente de nitrógeno Un MOcomo única fuente de nitrógeno. Un MO
que utiliza citrato como fte de C también
utiliza las sales de amonio como su únicautiliza las sales de amonio como su única
fte de N dando como resultado amoníaco
que alcalinizan el medio. El indicador de
pH , azul de bromofenol, cambia de
verde a pH neutro (6.9) a azul a pH
mayores que 7.6.
TTree SSugar IIron Agar (TSI)
Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosay/o sacarosa, y para producir sulfuro de Hidrogeno.Se usa para distinguir entre bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Qued á d f l d á d d f lademás son capaces de fermentar glucosa y producir ácidos como producto final.
Azúcar Productos ácidos pH (Amarillo)Azúcar Productos ácidos pH (Amarillo)
Peptonas Amoniaco (NH3) pH (Rojo)
Fermentación (medio ácidomedio ácido) + Tiosulfato de Sodio SH2 (gas)
SH2 + iones férricos Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)
Triple Sugar Iron Agar (TSI)
Fermentación Utilización de Las peptonasp p
Producción de gas
Producción de SH2
Resultados (Tubo/Base) Símbolo Interpretación
Rojo/Amarillo K/A Solo fermenta la Glucosa, y luego utiliza las peptonasj utiliza las peptonas
Amarillo/Amarillo A/A Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa
Rojo/Rojo K/K No hay fermentación, Solo se l lRojo/Rojo K/K utilizan las Peptonas
Rojo/sin cambio K/NCNo hay fermentación, Solo se utilizan las Peptonas aeróbicamente
Amarillo/Amarillo con disrupción del agar A/A,G
Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa con producción de gas
Rojo/Amarillo con disrupción del Solo fermenta la Glucosa conagar K/A,G Solo fermenta la Glucosa, con producción de gas
Rojo/Amarillo con disrupción del agar y PP negro K/A,G, H2S Solo fermenta la glucosa con
producción de gas y H2S
Rojo/Amarillo y PP negro K/A, H2S Solo fermenta la glucosa y produce H2S
Amarillo/Amarillo y PP negro A/A, H2SFermentación de glucosa, lactosa y / o Sacarosa con producción de H2S
Sin cambio/ Sin cambio NC/NC No hay crecimiento
Fermentación de carbohidratos (Caldo - rojo fenol)(Caldo - rojo fenol)
Se adiciona un azúcar al medio: Lactosa, sacarosa, glucosa, etc.
Propósito: Se usa para determinar fermentación de ciertos azúcares yproducción de gases. Se usa para identificar bacterias entéricas Gramnegativasnegativas.
1- Control sin inocular
2 A ill Utili ió d l ú d ió d á id2- Amarillo: Utilización del azúcar, producción de ácidosin gas.
3- Amarillo y producción de gas.
4- Fermentación negativa. Oscurecimiento del mediode cultivo producto de utilización de peptonas yliberación de amonio.
Fermentación de glucosa Fermentación de lactosaFermentación de sacarosa
orgamismos
1 Control Negative
resultados
Fermentación de glucosa
organismos resultados
1 Control Negative
Fermentación de lactosa
organismos resultados
1. Control Negative
Fermentación de sacarosa
1. Control Negative
2. S. aureus Acid
3. P. vulgaris Acid, Gas
1. Control Negative
2. S. aureus Acid
3. P. vulgaris Negative
. Co t o Negat ve
2. S. aureus Acid
3. P. vulgaris Acid, Gas
4 P i N ti 4. P. aeruginosa Negative
5. E. coli Acid, Gas
4. P. aeruginosa Negative
5. E. coli Acid, Gas
4. P. aeruginosa Negative
5. E. coli Negative
Reducción de nitrato
Muestra la capacidad de un m.o de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2) u otroscomponentes del nitrógeno como (N2), usando la enzima nitratonitrato ReductasaReductasa.
NO3 + 2 H + 2e- NO2 + H2Onitrato reductasa
Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso porrespiración anaerobia o por denitrificación. El medio de cultivo contiene nitrato depotasio como sustratopotasio como sustrato.
NO NH NNO2 NH3 N2
Reducción de nitrato
Acido Sulfanilico + NN dimetil-1-naftalenamina + inoes nitratoinoes nitrato
(Reactivo A) (Reactivo B)
+ inoes nitratoinoes nitrato
Sulfobenzeno azo-NN dimelethylen-1-naptalenamino(rojo)
Si l d l ti A BSi luego de agregar los reactivos A y B no aparececoloración se agrega Zn.El Zn es capaz de formar un complejo coloreado con elNitrato. Por lo tanto si no aparece coloración este fueputilizado y entonces el MO es capaz de reducir el Nitrato
- +
Prueba de decarboxilación de aminoácidos
Muestra la capacidad de un microorganismo para decarboxilar un aminoácido para formar una amina, con al consiguiente alcalinidad.
Indicador de pH: púrpura de bromocresolIndicador de pH: púrpura de bromocresol.Se coloca aceite mineral para crear un ambiente de anaerobiosis para promover lafermentación. Se necesita un ambiente ácido porque la enzima solo funciona enestas condiciones.
Aceite mineralAceite mineral
Arginina Ornitina Lisina Control( - ) ( + ) ( + )
Prueba de fenilalanina-desaminasa
óSe utiliza para identificar acción de la enzima phenilalaninaphenilalanina--deaminasadeaminasa. Usadopara distinguir Morganella, Providencia, y Proteus (Positivos) de otros grupos comoEnterobacteriaceae (negativos).
El medio contiene el aminoácido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) ylibera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por ladi ió d t id t (Cl F i l 10%) U bi d l l dadición de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%). Un cambio de color al verde
indica una reacción positiva.
Negativo PositivoNegativo Positivo
Prueba de ureasa
Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasaureasa
Urea + 2 H2O CO2 + H2O + 2 NH3 (NH4) CO3
ureasa
1. No inoculado
2. Proteus vulgaris: Positivo
3. Escherichia coli: Negativo
Prueba de hidrólisis de caseina
D t i l id d d d i i t ili dDeterminar la capacidad de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla caseína
S aureus (-)S. aureus (-)
E. Coli (-)
B ill btilli ( )Bacillus subtillis (+)
Prueba de licuefacción de Gelatina
Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipoDeterminar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preotelítico (gelatinasasgelatinasas) que licuan gelatina
Proteína + H O PolipéptidosProteína + H2O Polipéptidos
Polipéptidos + H2O Aminoácidos individualesGelatinasas
-
+
Prueba de hidrólisis de Almidón
Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón mediante enzimas del tipo amilasasamilasas
ilAlmidón dextrinas + maltosa + glucosa
α-amilasa
polisacáridos disacárido monosacáridoH2O
Lugol
(-) (+)( ) ( )
Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo
Selección de esporasCalentamiento
EnriquecimientoEnriquecimientoAgotamiento por estrías
Mossel
Colonias aisladas
Man (-), Lecitinasa (+)
Identificación y caracterización
RepiqueTinciones
Catalasa
Fermentación de azúcares
Cultivo puroHemólisis
Detección de genes de virulencia (toxinas-PCRvirulencia (toxinas PCR hblA, B, C, D.)
API 50 CH
Se utiliza para Bacterias del ácido lácticoPatrón de fermentación de 49 fuentes de carbono
API Staph Para StaphilococcusAPI Staph Para Staphilococcus
API 20NE Para bacterias gram no entéricasAPI 20NE Para bacterias gram - no entéricas