microbiologia de alimentos dra adenilde r nascimento
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA QUÍMICA
CCUU RR SS OO DD EE EESS PPEECC IIAA LLIIZZAA ÇÇ ÃÃ OO
EEMM TTEECC NN OOLLOOGGIIAA DD EE AALLIIMMEENN TTOOSS
MMIICC RR OOBBIIOOLLOOGGIIAA DD EE AALLIIMMEENN TTOOSS
PROF. DRA. ADENILDE RIBEIRO NASCIMENTO
SÃ O LU Í S - MA
2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU
ESPECIALIZAÇÃO EM TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Reitor Fernando Antonio Guimarães Ramos
Pró-Reitor de Pesquisa e Pós-Graduação João Elias Mouchrek Filho
Diretor do Depto. de Pós-Graduação Lauro Gomes de Oliveira
Diretora da Divisão de Cursos de Pós-Graduação Édila de Queiroz Soares
Idealizador do Curso Gilson de Sousa Mendonça
Coordenador do Curso Pedro Jafar Berniz
Chefe do Depto. de Tecnologia Química Victor Elias Mouchrek Filho
Consultores Adenilde Ribeiro Nascimento
Victor Elias Mouchrek Filho
Colaboradores André Gustavo L. de A. Martins
Silvio Carvalho Marinho
tualmente uma das grandes preocupações dos estudiosos e
das organizações não governamentais é a questão da
segurança alimentar, não só em relação à disponibilidade e
possibilidade de acesso da população ao alimento, mas também em função da
qualidade sanitária desse alimento.
AOs profissionais da área de alimentos devem, portanto, estar atentos
aos riscos de transmissão de microrganismos patogênicos causadores de
doenças veiculadas por alimentos.
Este trabalho tem como objetivo fornecer a estudantes e
profissionais da área de alimentos e afins, informações básicas de
microbiologia de alimentos (teoria e prática). O material apresenta conteúdo
moderno, incluindo um texto claro e objetivo (Parte I) e técnicas atualizadas
de análise de alimentos (Parte II).
São Luís, fevereiro de 2005.
Adenilde Ribeiro Nascimento Doutora em Ciência dos Al imentos
Microbiologia de Al imentos
PPAA RR TT EE II :: 9 CCAAPPÍÍTTUULLMMIICCRROOBB1 HISTÓRIA D
2 IMPORTÂNC
3 CLASSIFICA
4 FONTES PRI
5 CAUSAS DA
CCAAPPÍÍTTUULLMMIICCRROORRAALLIIMMEENNTT1 BACTÉRIAS
1.1 MORFOLO
1.1.1 CARACT
1.2 CARACTE
1.3 MEIOS DE
1.3.1 CARACT
1.3.2 CLASSIF
1.4 CICLO DE
1.5 GÊNEROS
2 FUNGOS .....
2.1 BOLORES
2.1.1 CARACT
OO II 1 IIOOLLOOOS MICR
IA DOS
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...........
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GGIIAA DDEE AALLIIMMEENNTTOOSS ORGANISMOS NOS ALIMENTOS...........
MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS....
S MICRORGANISMOS...........................
DE MICRORGANISMOS ENCONTRADAS
MINAÇÃO DOS ALIMENTOS..................
7 ISSMMOOSS IIMMPPOORRTTAANNTTEESS NNAA
77 ............................................................
............................................................
AS MORFOLÓGICAS IMPORTANTES NA
S DOS CULTIVOS IMPORTANTES NA MIC
RA PARA O CULTIVO DE BACTÉRIAS ....
AS DO MEIO DE CULTURA...................
DOS MEIOS DE CULTURA ...................
MENTO MICROBIANO...........................
TÉRIAS IMPORTANTES NA MICROBIOLO
............................................................
............................................................
AS GERAIS..........................................
1
........................................................1........................................................1
........................................................2
NOS ALIMENTOS .............................2
........................................................6
MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA DDEE
........................................................7
........................................................7
MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS ...8
ROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ........11
......................................................11
......................................................12
......................................................12
......................................................13
GIA DE ALIMENTOS.......................13
......................................................19
......................................................20
......................................................20
2.1.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE BOLORES DE INTERESSE EM ALIMENTOS.....................................21
3 LEVEDURAS............................................................................................................................22
3.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS...................................................................................................22
3.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE LEVEDURAS DE INTERESSE EM ALIMENTOS ...................................24
CCAAPPÍÍTTUULLOO II II II 26 PPAARRÂÂMMEETTRROOSS IINNTTRRÍÍNNSSEECCOOSS EE EEXXTTRRÍÍNNSSEECCOOSS DDOOSS AALLIIMMEENNTTOOSS QQUUEE AAFFEETTAAMM OO CCRREESSCCIIMMEENNTTOO MICROBIANO261 FATORES INTRÍNSECOS ...........................................................................................................26
1.1 EFEITOS DO PH ....................................................................................................................27
1.2 ATIVIDADE DE ÁGUA (AW) ...................................................................................................29
1.3 POTENCIAL DE OXI-REDUÇÃO ..............................................................................................32
1.4 NUTRIENTES ........................................................................................................................33
1.5 CONSTITUINTES ANTIMICROBIANOS ....................................................................................34
1.6 ESTRUTURAS BIOLÓGICAS OU SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS ....................................................35
2 FATORES EXTRÍNSECOS ..........................................................................................................36
2.1 TEMPERATURA AMBIENTAL.................................................................................................36
2.2 UMIDADE RELATIVA ............................................................................................................38
2.3 PRESENÇA E CONCENTRAÇÃO DE GASES DO AMBIENTE........................................................39
3 COMBINAÇÃO DOS PARÂMETROS INTRÍNSECOS E EXTRÍNSECOS .............................................40
CCAAPPÍÍTTUULLOO IIVV 41 AA FFLLOORRAA MMIICCRROOBBIIAANNAA DDOOSS AALLIIMMEENNTTOOSS EE MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS DDEETTEERRIIOORRAANNTTEESS 411 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM NEGATIVOS..........................................................43
2 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS NÃO-FORMADORES DE ESPOROS .........44
3 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS FORMADORES DE ESPOROS .................44
4 BOLORES E LEVEDURAS DETERIORANTES ...............................................................................44
5 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS ................................................................................46
6 DETERIORAÇÃO DE CARNE BOVINA E AVES ............................................................................47
7 DETERIORAÇÃO DE PESCADOS................................................................................................48
8 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL..............................................................49
9 DETERIORAÇÃO DE CEREAIS E PRODUTOS DERIVADOS............................................................52
10 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO ..................................................................52
11 DETERIORAÇÃO DE ALIMENTOS DOCES.................................................................................53
12 INDICADORES DA VIDA DE PRATELEIRA ................................................................................53
CCAAPPÍÍTTUULLOO VV 55 DDOOEENNÇÇAASS DDEE OORRIIGGEEMM AALLIIMMEENNTTAARR 55 1 BREVE HISTÓRICO...................................................................................................................55
2 TAMANHO DO PROBLEMA DAS DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR ..........................................56
3 INTOXICAÇÕES ALIMENTARES ................................................................................................59
4 CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS ...................................................................60
4.1 PROGRAMA DE VIGILÂNCIA .................................................................................................60
5 CAUSAS DA CONTAMINAÇÃO DE ALIMENTOS..........................................................................61
6 DOSE INFECTANTE ..................................................................................................................62
6.1 VARIÁVEIS DO HOSPEDEIRO.................................................................................................63
7 MICRORGANISMOS CAUSADORES DE ENFERMIDADES DE ORIGEM ALIMENTAR .......................64
7.1 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: BACTÉRIAS ...............................................................64
7.2 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: EUCARIOTOS .............................................................74
7.3 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: VÍRUS ........................................................................78
7.4 INTOXICAÇÕES CAUSADAS POR FRUTOS DO MAR E MOLUSCOS.............................................80
CCAAPPÍÍTTUULLOO VVII 84 MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS IINNDDIICCAADDOORREESS 84 1 INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO FECAL OU DA QUALIDADE HIGIÊNICO-SANITÁRIA DO
ALIMENTO..................................................................................................................................86
1.1 COLIFORMES TOTAIS ...........................................................................................................87
1.2 ENTEROCOCOS.....................................................................................................................88
2 INDICADORES GERAIS DE CONTAMINAÇÃO DO ALIMENTO.......................................................89
3 CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS (CONTAGEM PADRÃO EM
PLACAS).....................................................................................................................................90
4 CONTAGEM DE BACTÉRIA PSICROTRÓFICAS E TERMÓFILAS ....................................................91
5 CONTAGEM DE BACTÉRIAS ANAERÓBIAS ................................................................................91
6 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS ..................................................................................91
7 OUTROS INDICADORES............................................................................................................92
PPAARRTTEE IIII :: 94 CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIII 95 MMÉÉTTOODDOOSS DDEE AANNÁÁLLIISSEESS 95 1 CUIDADOS NA INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS..................................................................96
2 AMOSTRAGEM ........................................................................................................................97
3 PREPARO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE MICROBIOLOGICA.......................................................98
3.1 COLETA DA AMOSTRA .........................................................................................................98
3.2 RETIRADA DA AMOSTRA ......................................................................................................98
3.3 PREPARO DAS DILUIÇÕES.....................................................................................................99
3.4 SOLUÇÕES DILUENTES .........................................................................................................99
CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIIIII 101 EESSTTIIMMAATTIIVVAA DDAA PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO DDEE CCOOLLIIFFOORRMMEESS TTOOTTAAIISS ,, AA 4455ººCC EE EESSCCHHEERRIICCHHIIAA CCOOLLII AATTRRAAVVÉÉSS DDOO NNÚÚMMEERROO MMAAIISS PPRROOVVÁÁVVEELL ((NNMMPP)) 10111 MMÉÉTTOODDOO CCOOLLIIFFOORRMMEESS TTOOTTAAIISS ..............................................................................................102
CCAAPPÍÍTTUULLOO IIXX 106 CCOONNTTAAGGEEMM PPAADDRRÃÃOO EEMM PPLLAACCAASS ((CCPPPP)) DDEE MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS AAEERRÓÓBBIIOOSS MMEESSÓÓFFIILLOOSS VVIIÁÁVVEEIISS 1061 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................106
CCAAPPÍÍTTUULLOO XX 109 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE SSTTAAPPHHYY LLOOCCOOCCCCUUSS AAUURREEUUSS 109 1 TÉCNICA DE ANÁLISES..........................................................................................................110
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXII 112 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBAACCIILLLLUUSS CCEERREEUUSS 112 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................112
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIII 115 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE CCLLOOSSTTRRÍÍDDIIOOSS SSUULLFFIITTOO RREEDDUUTTOORREESS 115 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................116
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIIIII 118 PPEESSQQUUIISSAA DDEE SSAALLMMOONNEELLLLAA SSPPPP .. 118 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................118
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIVV 121 CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBOOLLOORREESS EE LLEEVVEEDDUURRAASS 121 1 TÉCNICA DE ANÁLISE............................................................................................................121
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXVV 122 TTEESSTTEE DDEE EESSTTEERRIILLIIDDAADDEE CCOOMMEERRCCIIAALL 122 1 MÉTODOS .............................................................................................................................123
AAPPÊÊNNDDIICCEESS .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 125 RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS ....................................................................... 139
PP AA RR TT EE II ::
1
CCAAPPÍÍTTUULLOO II
MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA DDEE AALLIIMMEENNTTOOSS
1 HISTÓRIA DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS
tualmente sabemos que os microrganismos são encontrados
praticamente em todos os lugares. Antes da invenção do
microscópio, os microrganismos eram desconhecidos dos
cientistas. Havia epidemias devastadoras, cujas causas não se conhecia. Os
alimentos estragavam freqüentemente e não se podia controlar esse processo;
famílias inteiras morriam.
ANa Idade Média, milhares de pessoas morriam de ergotismo sem que
se soubesse que se tratava de um fungo (Claviceps purpurea). Possivelmente
a primeira pessoa a sugerir a existência da relação entre os microrganismos e
a deterioração dos alimentos foi A. Kircher (1658), que examinou carne, leite
e outras substâncias e verificou a presença de “vermes” invisíveis a olho nu.
Contudo suas observações não foram aceitas. Em 1765, L. Lpallanzanii
derrubou a teoria da geração espontânea com os seus experimentos.
Apesar da importância das contribuições mencionadas, foi o médico
francês L. Pasteur, o primeiro cientista a compreender o papel dos
microrganismos nos alimentos. Em 1857, ele mostrou que o azedamento do
leite cru era devido ao crescimento de microrganismos e em 1860, empregou o
calor para destruí-los, processo hoje chamado de Pasteurização.
2 IMPORTÂNCIA DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS
As interações entre os microrganismos e alimentos implicam em
modificações enzimáticas e conseqüentemente em sabores e odores
desagradáveis.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
2
O advento de alimentos preparados tem ocasionado problemas
relacionados com doenças transmitidas pelos alimentos. A deterioração é
devido à conservação inadequada dos alimentos.
3 CLASSIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS
Os microrganismos são classificados em três grupos distintos,
dependendo do tipo de interação existente entre microrganismos e alimentos,
conforme descrito a seguir.
1) Os microrganismos nos alimentos são causadores de alterações
químicas prejudiciais resultando na deterioração microbiana. Essas alterações
são conseqüências da atividade metabólica dos microrganismos.
2) Os microrganismos presentes nos alimentos podem representar
riscos à saúde patogênicos doenças de origem alimentar infecção ou
intoxicação.
3) Os microrganismos presentes nos alimentos causam alterações
benéficas em um alimento, modificando suas características originais de
forma a transformá-lo em um novo alimento microrganismos utilizados na
fabricação de alimentos fermentados.
4 FONTES PRIMÁRIAS DE MICRORGANISMOS ENCONTRADAS NOS ALIMENTOS
Gêneros e espécies mais importantes presentes nos produtos
alimentícios são encontrados em oito fontes, descritas a seguir.
a) Solo: O solo contém a maior variedade de microrganismos
procedentes de todas as fontes de contaminação. Organismos do solo entram
na atmosfera pela ação dos ventos e depois nos corpos d’água que são
arrastados para alcançar o interior ou a superfície dos alimentos.
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3
São especialmente importantes alguns bolores, leveduras e algumas
espécies dos gêneros bacterianos Bacillus , Clostridium , Enterobacter ,
Escherichia , Micrococcus , Alcaligenes , Flavobacterium , Chromobacterium ,
Pseudomonas , Proteus , Streptococcus , Leuconostoc , Acetobacter .
b) Água: As águas naturais não só contêm sua própria microbiota,
como também microrganismos procedentes do solo e possivelmente de
microrganismos procedentes de animais e de águas residuais. As espécies
bacterianas existentes nas águas naturais são principalmente espécies dos
gêneros Pseudomonas , Chromobacterium , Proteus , Micrococcus , Bacillus ,
Enterococcus , Enterobacter e Escherichia coli . É provável que as três últimas
bactérias sejam contaminantes.
Para a microbiologia de alimentos dois aspectos são importantes: o
aspecto de saúde pública e o aspecto econômico.
c) Águas residuais: Quando são utilizadas águas residuais
domésticas sem tratamento existe a possibilidade de contaminação por
microrganismos patogênicos para o homem (doenças do trato intestinal).
As águas naturais contaminadas com águas residuais aportam os
microrganismos nos mariscos, pescados e outros alimentos de origem
marinha. Bactérias do grupo coliforme, Enterococos , Vibrio , outras bactérias
intestinais e vírus são as principais contaminantes.
d) Ar: A contaminação dos alimentos pelo ar pode ter importância
tanto por razões higiênicas quanto econômicas. Os microrganismos patógenos,
em especial os que são responsáveis por infecções respiratórias podem ser
transmitidos pelo ar que possivelmente contamina os alimentos.
Os microrganismos que alteram os alimentos podem ter sua origem
do ar (fermentações). Os esporos de fungos do ar podem representar um
inconveniente para alguns tipos de alimentos, como por exemplo, queijo,
carnes, pão, leite condensado etc.
Um dos grupos de bactéria que são particularmente bem adaptadas
são Actinomycetos , especialmente aquelas do gênero Streptomyces , produz
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4
esporos que sobrevivem muito bem no ar. Algumas espécies podem ser
responsáveis pelo odor e sabor desagradável em água potável.
e) Animais: Todos os animais saudáveis possuem uma microbiota
complexa, que pode ser transitória (microbiota normal de alguns indivíduos) e
patogênica (capazes de matar seus hospedeiros).
Grande quantidade de microrganismos é freqüentemente encontrada
em:
pele – áreas úmidas especialmente virilha ou entre os dedos;
trato respiratório – nariz e orofaringe;
trato digestivo – boca e intestino grosso;
trato urinário – parte anterior da uretra;
trato genital – vagina;
A superfície da pele dos humanos e outros animais é exposta ao ar,
solo e água que contamina os alimentos e equipamentos.
Os microrganismos são característicos de cada espécie do animal e
nos humanos a microbiota normal da pele predominante são bactérias gram
positiva dos gêneros Staphylococcus , Corynebacterium e Propionibacterium .
Para os animais produtores de carne são predominantes os Micrococos,
Staphylococcus e Enterococos.
O nariz humano e as mãos são habitats primários do Staphylococcus
aureus , eles residem na mucosa do nariz. As secreções nasais contêm um
grande número de bactérias, em algumas pessoas, a maior parte é de
Staphylococcus que contaminam suas mãos.
As fezes e os alimentos de origem animal contaminados podem
conter diversos microrganismos entéricos, inclusive do gênero Salmonella .
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5
f) Manipulação e tratamento: Outras contaminações podem ter
origem no equipamento que entra em contato com os alimentos nos materiais
util izados e nas pessoas.
O pessoal que trabalha nas plantas de indústrias que fabricam
alimentos pode contaminá-los durante sua manipulação e tratamento. Alguns
pesquisadores citam que os seres humanos eliminam de 103 a 104
microrganismos vivos por minuto. O número e tipo de microrganismos
eliminados possuem uma relação íntima com o ambiente de trabalho. A
microbiota das mãos e roupas dos manipuladores de alimentos pode ser
oriunda do solo, água, poeira e outros ambientes. Outras fontes importantes
são as fossas nasais, a boca e a pele. Em condições muito precárias de higiene
também os microrganismos do trato gastrintestinal podem contaminar as mãos
dos manipuladores e, conseqüentemente, os alimentos por eles preparados.
As mãos podem veicular vários microrganismos importantes,
dependendo do tipo de alimento manipulado ou do momento da coleta das
amostras para análise.
Os manipuladores de alimentos têm um importante papel na
prevenção das toxinfecções alimentares e das demais doenças de origem
alimentar.
As mãos raramente estão livres de bactérias, que podem ser
transitórias ou semipermanentes no interior ou na superfície da pele. A
microbiota das mãos geralmente consiste de estafilococos. Eles aderem à
superfície da pele e persistem nos folículos capilares, poros, cavidades e
lesões causadas por rachadura na pele, e eles não são facilmente removidos.
g) Ração animal: Animais confinados, bovinos e suínos, assim como
as aves, estão expostos a infecções provenientes de rações. Parte de amostras
de rações à base de peixes, ossos e carnes apresentam salmonelas. O consumo
pode levar a uma excreção temporária e às vezes a doenças. Rações
produzidas a partir de sobras do comércio de carnes, reciclam as salmonelas
de volta aos animais.
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6
A ingestão de miúdos crus ou inadequadamente tratados pelo calor,
provenientes de ovinos, aves, bovinos e outros animais levará inevitavelmente
à uma infecção por Salmonella .
h) Utensílios – Contaminação cruzada: Utensílios como recipientes,
bandejas, facas, tábuas, moedores etc. , têm papel importante como fonte de
contaminação.
As contaminações cruzadas causam contaminações pós-
processamento do alimento (ou seja, após a etapa de cozimento). Podem ser
evitadas por meio de:
planejamento cuidadoso do ambiente e distribuição de
equipamentos da fábrica;
controle do movimento de pessoal;
hábitos adequados dos manipuladores quanto à higiene.
5 CAUSAS DA CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS
Existe um grande número de fatores que contribuem para tornar um
alimento inseguro, causando toxinfecções àquelas pessoas que o ingerem. As
principais causas podem ser resumidas como:
controle inadequado de temperatura durante o cozimento,
resfriamento e a estocagem;
higiene pessoal insuficiente:
contaminação cruzada entre produtos crus e processados;
monitoramento inadequado dos processos.
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7
CCAAPPÍÍTTUULLOO II II
MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS IIMMPPOORRTTAANNTTEESS NNAA MMIICCRROOBBIIOOLLOOGGIIAA DDEE
AALLIIMMEENNTTOOSS
entre os microrganismos existentes, as bactérias e os
fungos têm interesse para a microbiologia de alimentos
por serem responsáveis por processos de deterioração, por
participarem da elaboração de alimentos ou por serem responsáveis por
toxinfecções alimentares.
D
1 BACTÉRIAS
As características das bactérias em relação à sua origem,
reservatórios e o conhecimento a respeito de sua habilidade em sobreviver e
crescer nos alimentos são fatores importantes no controle tanto das
toxinfecções alimentares como na deterioração dos alimentos. A prevenção
está diretamente relacionada com a destruição da bactéria e com a inibição de
seu crescimento.
1.1 MORFOLOGIA
As bactérias podem ser encontradas sob forma de bacilos (em forma
de bastão), cocos (forma esférica) e espirilos (forma de saca-rolhas ou
curvadas). As bactérias individuais podem formar pares, grupos, cadeias ou
outros agrupamentos; tais formações são usualmente características de um
gênero particular ou de uma espécie de bactéria.
A forma de uma bactéria é determinada por hereditariedade.
Geneticamente, a maioria das bactérias é monomórfica, isto é, elas mantêm
uma única forma. Entretanto, uma série de condições ambientais pode
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
8
modificar sua forma, a qual, quando alterada, dificulta sua identificação.
Algumas bactérias são pleomórficas, o que significa que elas podem ter várias
formas, e não apenas uma.
Invisíveis ao olho humano, as bactérias são normalmente medidas em
micrômetros (µm), que são equivalentes a 1/1000mm (10- 3mm). As células
bacterianas variam em tamanho dependendo da espécie, mas a maioria tem
aproximadamente de 0,5 a 1µm em diâmetro ou largura.
O tamanho, a forma e o arranjo das bactérias constituem sua
morfologia, sua aparência “externa”.
1.1.1 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA
DOS ALIMENTOS
Para identificação das bactérias de um determinado alimento são
necessários sua observação no microscópio com a finalidade para se
determinar a forma, tamanho, tipo de agrupamento, estruturas e reações de
coloração das bactérias existentes nos alimentos. As estruturas de importância
são as seguintes:
Produção de cápsula: O glicocálise bacteriano é um polímero
viscoso e gelatinoso que está situado externamente à parede celular e é
composto de polissacarídeo, polipeptídeo ou ambos. Sua composição química
varia amplamente com as espécies. Na maioria dos casos, ele é produzido
dentro da célula e excretado para a superfície celular.
As cápsulas servem para aumentar a resistência das bactérias às
condições desfavoráveis do meio, como a sua resistência à temperaturas
elevadas e aos agentes químicos. Em certas espécies, as cápsulas são
importantes na virulência bacteriana (o grau com que um patógeno causa
doença). Para o próprio microrganismo podem ser úteis como fonte de
nutriente e reserva.
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9
Produção de endósporos: As bactérias dos gêneros Bacillus e
Clostridium são de importância de grande interesse para a microbiologia de
alimentos, esses gêneros formam células especializadas de repouso
denominadas endósporos, células desidratadas altamente duráveis, com
paredes espessas e camadas adicionais. Eles são formados dentro da
membrana celular bacteriana. Quando liberados no ambiente, podem
sobreviver a temperaturas extremas, falta de água e exposição a muitas
substâncias químicas tóxicas e à radiação.
O processo de formação de endósporos dentro de uma célula-mãe
vegetativa leva várias horas e é conhecido como esporulação.
Os endósporos são importantes do ponto de vista clínico e na
indústria alimentícia, pois são resistentes a processos que normalmente
eliminam as células vegetativas. Estes processos incluem o aquecimento, o
congelamento, a dessecação. Enquanto a maioria das células vegetativas é
eliminada à temperatura acima de 70ºC, os endósporos podem sobrevier em
água fervente por várias horas ou mais. Os endósporos de bactérias
termofílicas podem sobreviver na água fervente por 19 horas. As bactérias
formadoras de endósporos são um problema na indústria de alimentos, pois
podem sobreviver ao subprocessamento e, se ocorrerem condições para o
crescimento, algumas espécies produzirão toxinas e doenças. Alguns métodos
são utilizados para controlar os organismos que produzem endósporos.
Parede celular: A parede celular de uma célula bacteriana é uma
estrutura complexa, semi-rígida, responsável pela forma da célula. A
principal função da parede celular é prevenir a ruptura das células bacterianas
quando a pressão da água dentro da célula é maior que fora dela. A
composição química da parede celular é usada para diferenciar os principais
t ipos de bactérias. A parede celular permite a divisão das bactérias em dois
grupos:
bactérias gram positivas
bactérias gram negativas
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10
Coloração de Gram
Christian Gram, microbiologista, queria visualizar as bactérias e
descobriu o que atualmente o mundo conhece como Coloração de Gram.
Christian Gram notou que as bactérias podiam ser coradas tanto de azul
escuro (violeta) quanto de vermelho. Isso acontecia devido à precipitação do
cristal violeta com o lugol no interior do citoplasma da célula; precipitação
essa que não podia ser extraída de certos organismos (gram positivos) com a
utilização de solventes como o etanol ou a acetona, porém poderia ser
extraída de outros (gram negativos). Por essas últimas células descorarem-se
após a util ização de álcool ou acetona, uma coloração de contraste foi
necessária, util izando safranina ou fucsina.
Os organismos gram positivos possuem uma parede celular grossa
envolvendo a membrana citoplasmática. Essa é composta por peptídeo glicano
e ácidos teicóicos. Os organismos gram negativos possuem uma parede celular
mais fina que é envolvida por uma outra membrana externa. Portanto, os
organismos gram negativos possuem duas membranas.
Membrana plasmática: É uma estrutura fina situada no interior da
parede celular, revestindo o citoplasma da célula constituída de lipídeos,
proteínas e alguns carboidratos. A mais importante função da membrana é
servir como uma barreira seletiva através da qual os materiais entram e saem
da célula. Também são importantes para a digestão de nutrientes e a produção
de energia.
A membrana plasmática é vital para a célula bacteriana, ela é o sítio
de ação de vários agentes antimicrobianos. Além das substâncias químicas
que lesam a parede celular e assim expõem indiretamente a membrana à lesão,
muitos compostos lesam especificamente a membrana plasmática. Estes
compostos incluem certos álcoois e compostos de amônio, usados como
desinfetantes.
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11
1.2 CARACTERÍSTICAS DOS CULTIVOS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE
ALIMENTOS
O crescimento bacteriano tanto no interior como na superfície dos
alimentos apresentam um aspecto desagradável ou prejudicial. As bactérias
que produzem pigmentos modificam a cor da superfície dos alimentos, a
superfície dos líquidos podem ser cobertos por uma película devido ao
crescimento bactérias, também podem apresentar viscosidade, turbidez ou um
sedimento não desejáveis aos alimentos.
Muitos fatores podem ser util izados como uma série de obstáculos
para prevenir o crescimento microbiano. Cada obstáculo representa uma
barreira que deve ser ultrapassada pela bactéria para que ela possa contaminar
e degradar os alimentos. As embalagens com atmosfera modificada, altas
pressões hidrostáticas, luz ultravioleta e bacteriocinas são exemplos de um
método secundário de conservação.
O conceito dos obstáculos deu origem à tecnologia dos obstáculos,
que se baseia na utilização simultânea de mais de uma forma de controle
microbiano nos alimentos, como salga, acidificação, processamento térmico,
adição de conservantes químicos etc. O objetivo é a obtenção de produtos
alimentícios estáveis, de prolongada vida de prateleira, e seguros à saúde dos
consumidores.
1.3 MEIOS DE CULTURA PARA O CULTIVO DE BACTÉRIAS
O meio de cultura é denominado o material nutriente preparado no
laboratório para o crescimento de microrganismos. Algumas bactérias podem
crescer normalmente em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios
especiais e existem aquelas que não são capazes de crescer em nenhum meio
de cultura já desenvolvido. Os microrganismos que crescem e se multiplicam
nos meios de cultura são denominados cultura.
Para o crescimento de microrganismos no laboratório há uma grande
variedade de meios de cultura. Muitos desses meios são disponíveis em forma
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12
comercial e contêm todos os componentes desejados sendo necessário somente
a adição de água para posterior esterilização.
Os meios de cultura estão constantemente sendo desenvolvidos ou
mesmo atualizados para o isolamento e a identificação de bactérias,
principalmente nas áreas de pesquisa de alimentos, água e microbiologia
clínica.
Para permitir o crescimento, o meio de cultura deverá conter uma
fonte de energia, uma fonte de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo e todos
os fatores orgânicos que o organismo não é capaz de sintetizar.
1.3.1 CARACTERÍSTICAS DO MEIO DE CULTURA
O meio de cultura deve ser preparado de acordo com o tipo
nutritivo do microrganismo que se pretende cultivar;
Deverão conter quantidade de água necessária;
pH ajustado;
O meio de cultura deverá inicialmente ser estéril .
1.3.2 CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
I. Quanto à consistência: l íquido caldo; semi-sólido; sólido
agar.
II . Quanto à função: enriquecimento; seletivo; diferencial;
manutenção.
III. Quanto à natureza: sintético quimicamente definido; não-
sintético.
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13
1.4 CICLO DE CRESCIMENTO MICROBIANO
O ciclo de crescimento microbiano é formado por seis fases,
descritas a seguir.
1. Fase lag : As células não estão se multiplicando, mas sintetizando as
enzimas apropriadas para o ambiente.
2. Fase de aceleração : Uma proporção crescente de células está se
multiplicando.
3. Fase exponencial (ou log) : A população está duplicando. O número de
células cresce de maneira tal que, para visualização gráfica, melhor seria
util izar valores exponenciais (logarítmicos). O gráfico logarítmico desta fase
de crescimento é uma linha reta devido a este tempo de geração constante.
Esta fase é o período de maior atividade metabólica da célula. No entanto,
nesta fase de crescimento os microrganismos são particularmente sensíveis às
mudanças ambientais, às radiações ou mesmo muitos dos compostos
antimicrobianos.
4. Fase de desaceleração : Uma crescente proporção de células não está mais
se multiplicando.
5. Fase estacionária: A taxa de nascimento é igual à de morte, resultando em
um número igual de células em um dado tempo. A morte é causada pelo
esgotamento de nutrientes, pela acumulação de produtos finais tóxicos e/ou
outras mudanças no ambiente.
6. Fase de morte : O número de células mortas é maior do que o de células
vivas.
1.5 GÊNEROS DE BACTÉRIAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE
ALIMENTOS
Os gêneros bacterianos importantes para alimentos são agrupados
nestas categorias:
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14
1. Bactérias gram negativas, aeróbias e microaeróbias;
2. Bactérias gram negativas aeróbias estritas;
3. Bactérias gram negativas anaeróbias facultativas;
4. Cocos gram positivos;
5. Bacilos gram positivos produtores de esporos;
6. Bacilos gram positivos não esporulados;
7. Outros.
1. Bactérias gram negativas, aeróbias e microaeróbias:
Neste grupo, apenas o gênero Campylobacter tem importância para
os alimentos. São oxidase positivas, crescem em meios de cultura com baixa
tensão de oxigênio. As espécies importantes são C. jejuni , C. coli e C. lari
que são patógenos causadores de gastrenterites humana.
2. Bactérias gram negativas aeróbias estritas:
Neste grupo são incluídos os seguintes gêneros: Pseudomonas ,
Xanthomonas , Halobacterium , Halococcus , Acetobacter , Gluconobacter ,
Acinetobacter , Alcaligenes , Alteromonas , Brucella , Flavobacterium ,
Moraxella , Paychrobacter e Shewanella .
Gênero Pseudomonas : Algumas espécies de Pseudomonas podem
alterar os alimentos, estas bactérias são amplamente distribuídas na natureza,
podem ser encontradas em alimentos de origem animal e vegetal. Algumas
Pseudomonas são patogênicas para plantas. P. aeruginosa produz substâncias
tóxicas e são patógenos humanos oportunistas. Alguns casos de doença de
origem alimentar foram causados por algumas espécies de Pseudomonas . São
encontradas em alimentos refrigerados e congelados. Devido a sua baixa
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15
resistência térmica, só são encontradas em alimentos processados que
sofreram contaminação pós-processamento.
Gênero Halobacterium: São bactérias halófitas, encontradas
freqüentemente em alimentos salgados, como pescados e carnes, produzem
odor desagradável e coloração vermelha devido ao pigmento.
Gênero Acetobacter : Estas bactérias oxidam o álcool etíl ico a ácido
acético. São encontradas em frutas e hortaliças e são responsáveis pela
deterioração de sucos de frutas e bebidas alcoólicas (vinhos, cervejas).
Gênero Acinetobacter : São bacilos curtos, importantes agentes de
deterioração de alimentos, tanto crus como processados, incluindo carnes e
carcaças de aves.
Gênero Alcaligenes : São largamente distribuídas na natureza, têm
sido causadores de deterioração de alimentos protéicos (leite cru, carnes, ovos
e laticínios). Produz viscosidade no leite.
Gênero Alteromonas : São bactérias marinhas, causam deterioração
em pescados.
Gênero Flavobacterium: As espécies deste gênero são produtoras de
pigmentos amarelos ou vermelho em superfície de carnes, aves, pescados
(mariscos). Algumas espécies são psicrófilas e são encontradas em hortaliças.
Podem ser isoladas de água, solo, animais, humanos e diversos alimentos.
Gênero Brucella: Algumas espécies são patogênicas: B. abortus ,
para o gado bovino e B. suis , patogênica para os suínos. São espécies que
podem causar brucelose no homem. As fontes de infecção são o leite cru,
laticínios, carnes não cozidas ou derivados de carne.
3. Bactérias gram negativas anaeróbias facultativas:
Neste grupo estão incluídas as famílias Enterobacteriaceae e
Vibrionaceae.
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16
Gênero Enterobacter : São bacilos imóveis, fazem parte da
microbiota intestinal do homem e pertencem ao grupo dos coliformes. Estas
bactérias são muito abundantes na natureza, podem causar deterioração dos
alimentos.
Gênero Citrobacter : Pertencem ao grupo dos coliformes, são
bactérias intestinais e podem ser encontradas em muitos alimentos, causam
deterioração nos alimentos.
Gênero Escherichia : A principal espécie é E. coli . Pertence ao
grupo dos coliformes de origem fecal, faz parte da microbiota intestinal do
homem e animais, são indicadoras de contaminação fecal de alimentos e água,
alguns sorotipos são patogênicos para o homem e animais.
Gênero Klebsiella: Fazem parte do grupo dos coliformes. Muitas
bactérias deste gênero são capsuladas, se encontram com freqüência nas vias
respiratórias e no trato intestinal do homem.
Gênero Hafnia : São bacilos móveis, importantes na deterioração de
carnes refrigeradas e vegetais.
Gênero Salmonella: As espécies destes patógenos são entéricos. Seu
principal reservatório é o trato gastrintestinal do homem e de animais,
principalmente aves e suínos. São responsáveis pelas infecções alimentares.
Gênero Proteus : São bacilos móveis. São patógenos de origem
alimentar, importantes na deterioração dos alimentos.
Gênero Shigella: São bacilos não esporulados. São encontrados no
trato gastrintestinal do homem. Sua importância nos alimentos deve-se à sua
patogenicidade. São os agentes causadores da shigelose (desinteria bacilar),
que pode ser de origem alimentar.
Gênero Aeromonas : São bacilos móveis e oxidase e catalase
positivos. São anaeróbios facultativos e podem ser psicrófilos, são bactérias
aquáticas, sendo habitantes naturais do intestino de peixes. A espécie A.
hydrophila é patogênica para o homem e animais aquáticos.
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17
Gênero Vibrio : São bactérias pertencentes à família Vibrionaceae.
São bacilos pequenos curvos ou retos. Algumas espécies são incapazes de
multiplicar na ausência de NaCl. As espécies V. cholerae , V. vulnificus e V.
parahaemolyticus são patógenos importantes em alimentos. V. cholerae é
encontrado no trato gastrintestinal de humanos, na água e ocasionalmente em
alimentos.
4. Cocos gram positivos:
Neste grupo estão incluídas as bactérias aeróbias e anaeróbias
facultativas da família Micrococcaceae (Micrococcus e Staphylococcus) e os
cocos pertencentes aos gêneros Aerococcus , Enterococcus , Lactococcus ,
Leuconostoc , Streptococcus , Pediococcus e Vagococcus .
Gênero Micrococcus : São células bacterianas esféricas. São
comumente encontradas no solo, água, pó e pele do homem e dos animais.
Algumas espécies são termodúricas, resistem ao tratamento de pasteurização,
outras com freqüência nos utensílios e nos equipamentos utilizados pelos
manipuladores dos alimentos insuficientemente lavados e sanitizados.
Gênero Enterococcus : O enterococcos são um grupo de
micorganismos que vêm-se destacando nos últimos anos como patógenos
oportunistas. A distribuição de enterococos na natureza é ampla e eles fazem
parte da microbiota normal do homem e de animais, particularmente, do trato
intestinal. A maioria é relativamente resistente ao congelamento. As espécies
mais encontradas em alimentos são Enterococcus faecalis e E. faecium .
Gênero Staphylococcus : Uma das causas mais freqüentes dos surtos
de intoxicações está relacionada com a presença de toxinas produzidas por
espécies de Staphylococcus aureus . Os S. aureus são encontrados em lesões
de pele e nas vias nasais do homem, sendo facilmente transferidos para os
alimentos.
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18
5. Bacilos gram positivos produtores de esporos:
Neste grupo estão os gêneros Bacillus , Clostridium e
Desulfotomaculum , que apresentam a característica comum de produzir
esporos.
Gênero Bacillus : As diferentes espécies podem ser mesófilas ou
termófilas. Pode ser encontrado no solo, água, material fecal e diversos
alimentos. Este grupo abriga espécies patogênicas como B. cereus , que
causam gastrenterites de origem alimentar, numerosas espécies capazes de
deteriorar os alimentos (B. subtilis , B. coagulaus) e espécies empregadas na
produção de alimentos.
Gênero Clostridium: A principal fonte de clostrídio é o solo. São
encontrados no trato intestinal do homem e de animais e nos alimentos. Este
gênero contém duas espécies patogênicas que podem ser veiculadas pelos
alimentos: C. botulinum e C. perfringens .
6. Bacilos gram positivos não esporulados:
Pertencem a este grupo as bactérias do gênero Brochothrix ,
Carnobacterium , Kurthia , Lactobacillus e Listeria .
Gênero Listeria : A espécie mais importante deste gênero é a
Listeria monocytogenes associada com doença de origem alimentar devido a
sua patogenicidade, esta espécie causa a listeriose, que pode apresentar
diversas manifestações clínicas: septicemia, que pode resultar em aborto,
endocardite, conjuntivite, meningite etc.
Gênero Lactobacillus : São bactérias que fermentam carboidratos
produzindo ácido lático, podendo ser homo ou heterofermentativos. Devido a
essa propriedade, os lactobacilos pode ser bastante úteis na produção de
alimentos, mas podem causar também a sua deterioração.
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19
7. Outras bactérias de interesse:
Mycobacterium;
Propionibacterium;
Brevibacterium;
Corynebacterium .
2 FUNGOS
Os organismos do Reino dos Fungos podem se unicelulares ou
multicelulares. Os fungos multicelulares grandes, tais como cogumelos,
podem parecer algumas vezes como plantas, mas não são capazes de realizar a
fotossíntese, como a maioria das plantas. Os fungos verdadeiros possuem
parede das células composta principalmente de uma substância chamada de
quitina.
As formas unicelulares dos fungos, as leveduras, são
microrganismos ovais, maiores que as bactérias. Os fungos mais típicos são
os bolores.
Ao longo dos últimos dez anos, a incidência de infecções
importantes causadas por fungos tem aumentado. Estas infecções estão
ocorrendo como infecções nosocomiais e em indivíduos com sistema
imunológico comprometido.
Os fungos também são benéficos, são utilizados pelos homens como
alimentos (cogumelos), para a produção de comida (pão) e drogas (álcool).
Das mais de 100.000 espécies conhecidas de fungos, apenas cerca de 100 são
patogênicas dos homens e dos animais. O estudo dos fungos é chamado de
micologia.
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20
Os fungos têm sido utilizados na biotecnologia há muitos anos.
Também podem ser usados pela engenharia genética, no controle biológico de
pragas.
2.1 BOLORES
2.1.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS
Os bolores formam uma massa visível (chamada de micélio,
composta de longos filamentos – as hifas) que se ramificam e se expandem. O
crescimento semelhante a algodão, algumas vezes encontrado sobre o pão e as
frutas, são micélios de fungos. Eles obtêm seus alimentos absorvendo
soluções de matéria orgânica de seu ambiente que pode ser o solo, a água do
mar, a água doce, um animal ou uma planta hospedeira.
O aspecto macroscópico de todo bolor que cresce na superfície de
um alimento pode indicar a classe e a ordem a que pertence.
Em geral a maioria dos bolores necessita de uma menor quantidade
de umidade disponível. Pode ser calculada a quantidade total de umidade de
um determinado alimento que limita o crescimento dos bolores, por exemplo
14 a 15% nas farinhas e alguns frutos secos impedirá ou retardará o
crescimento dos bolores.
Os bolores, a maioria, são considerados mesófilos (25-30ºC), alguns
podem crescer entre 35-37ºC ou a temperaturas superiores. Alguns são
psicrófilos, crescem em temperaturas de refrigeração, -5 a -10ºC.
São aeróbios, necessitam de oxigênio para crescer (crescem na
superfície dos alimentos).
Quase todos os bolores são capazes de crescer dentro de um amplo
intervalo de pH (entre 2 e 8,5), ainda que a maioria cresça melhor em pH
ácido.
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21
Eles util izam muitos tipos de alimentos, desde o mais simples até o
mais complexo.
Alguns bolores produzem substâncias que inibem outros
microrganismos. Determinados compostos químicos se comportam como
micostáticos por inibir o crescimento de bolores (como por exemplo, o ácido
sórbico, os propionatos e os acetatos), outros são especificamente fungicidas
por destruir os bolores.
O início do crescimento dos bolores é lento quando comparado com
as bactérias e as leveduras.
2.1.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE BOLORES DE INTERESSE EM ALIMENTOS
Gênero Aspergillus : São bolores muito abundantes, compreendem
mais de 100 espécies. Algumas espécies como A. glaucus e A. repens , são
importantes agentes de deterioração de alimentos. Muitas espécies como A.
orizae e A. soyae , são utilizados na produção de alimentos. A. niger é
util izado para produção comercial de ácidos cítrico, glucônico etc. Algumas
espécies, como A. flavus e A. parasiticus , são produtoras de micotoxinas
(aflatoxinas, ocratoxina A).
Gênero Mucor : Esse gênero de bolor pode ser encontrado no solo,
esterco, frutas, vegetais, grãos e outros alimentos. Muitas espécies de Mucor
são utilizadas na produção de queijos e alimentos fermentados orientais. As
espécies mais encontradas nos alimentos são M. pusillus , M. racemosus e M.
rouxii .
Gênero Alternaria: Os bolores deste gênero são, com freqüência,
causadores de deteriorações nos alimentos (tomates, pimentões, maçãs e
frutas cítricas), causando o escurecimento dos tecidos. São encontrados
também em carnes vermelhas; algumas espécies são produtoras de
micotoxinas.
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22
Gênero Neurospora : A espécie N. crassa produz esporos que
permanecem viáveis no ambiente por muitos anos; a espécie N. sitophila
produz pigmentos de coloração rósea e é comum em pães, crescem também em
bagaço de cana-de-açúcar e diferentes alimentos.
Gênero Penicill ium: Este gênero de bolores é freqüente e possuem
incidência de grande importância para os alimentos. Várias espécies como P.
expansum , P. digitatum e P. italicum são responsáveis pelos processos
degradativos de frutas cítricas, as espécies P. cyclopium e P. viridicatum
causam deterioração de grãos e cereais. Muitas espécies de Penicill ium são
empregadas na produção de alimentos, especialmente queijos. A espécie P.
camembertii , util izado para fabricação de queijos camembert e brie e a
espécie P. roquefortii , empregado na fabricação dos queijos roquefort e
gorgonzola. Algumas espécies são produtoras de antibióticos e outra de
micotoxinas.
Gênero Fusarium: Os bolores pertencentes a este gênero crescem
com freqüência na superfície dos alimentos com aspectos algodonosos nas
frutas cítricas, abacaxis e figos. Algumas espécies são produtoras de
micotoxinas.
Gênero Rhizopus : São agentes deteriorantes comuns em alimentos
de origem vegetal, por serem termorresistentes, estas enzimas não são
eliminadas durante o processamento térmico dos vegetais, o que pode causar a
podridão mole pós-processamento.
3 LEVEDURAS
3.1 CARACTERÍSTICAS GERAIS
As leveduras são fungos unicelulares, não-filamentosos,
caracteristicamente esféricos ou ovais, são amplamente distribuídos na
natureza: são freqüentemente encontradas como um pó branco cobrindo frutas
e folhas.
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23
As leveduras que se encontram nos alimentos podem ser benéficas
ou prejudiciais. As fermentações produzidas pelas leveduras intervêm da
elaboração dos alimentos como pão, cerveja, diferentes tipos de vinhos,
vinagre e os queijos maturados. As leveduras são prejudiciais quando
produzem alterações nos sucos de frutas, xarope, melaço, mel, carnes, vinhos,
cerveja e outros alimentos.
As leveduras se classificam principalmente baseada nas suas
características morfológicas, ainda que para a microbiologia dos alimentos,
suas propriedades fisiológicas têm maior importância.
As características morfológicas das leveduras são determinadas
mediante observação microscópica. A forma pode ser desde esférica a ovóide,
alimonada, cilíndrica e triangular.
O crescimento das leveduras se verifica através de um véu na
superfície do meio líquido e produção de um pigmento carotenóide. O aspecto
do crescimento desse microrganismo tem importância quando este produz
pigmento na superfície dos alimentos.
Nos cultivos em Agar é difícil diferenciar as colônias de leveduras
de colônias de bactérias, a observação microscópica dos microrganismos é a
única forma segura que existe para a diferenciação. A maioria das colônias
jovens das leveduras é úmida e mucosa, são colônias brancas, cremes ou
rosadas.
São oxidativas, fermentativas. Na superfície de um líquido, as
leveduras oxidativas podem crescer em forma de película, de véu, ou de
espuma; são denominadas leveduras formadoras de película. As leveduras
fermentativas crescem em toda massa do líquido e produzem dióxido de
carbono.
A maioria das leveduras cresce em substratos com elevadas
concentrações de açúcar e de sal, necessitam de mais umidade do que os
bolores. O intervalo de temperaturas de crescimento da maioria das leveduras
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24
é semelhante dos bolores com a temperatura ótima em torno de 25-30ºC e uma
temperatura máxima de 35-47ºC.
Algumas espécies são capazes de crescer à temperatura de 0ºC ou
inferiores. Uma reação ácida próxima de pH 4 a 4,5 estimula o crescimento da
maioria das leveduras.
As leveduras crescem melhor em aerobiose; algumas espécies do
tipo fermentativo são capazes de crescer, lentamente em anaerobiose.
Em geral, os açúcares são fontes de energia mais apropriada para as
leveduras, mesmo as oxidativas.
3.2 PRINCIPAIS GÊNEROS DE LEVEDURAS DE INTERESSE EM ALIMENTOS
Gênero Candida : Algumas espécies crescem em película e são
capazes de alterar os alimentos com acidez e concentração de sal elevada, são
mais encontradas em carnes, manteiga, margarinas. Estas leveduras têm sido
envolvidas em processos de deterioração de vários tipos de alimentos: como
frutas frescas, vegetais, bebidas alcoólicas e refrigerantes.
Gênero Torulopsis : Estas leveduras fermentativas causam problemas
nas fábricas de cervejas e alteram vários tipos de alimentos. A espécie T.
sphaerica fermenta a lactose, capaz de alterar os produtos lácteos. Outras
espécies são capazes de alterar leite condensado, frutas e os alimentos ácidos.
Gênero Pichia: Estas leveduras crescem em superfície dos líquidos
(cervejas e vinhos) em forma de película.
Gênero Rhodotorula : Estas leveduras de cor vermelha, rosa ou
amarelo podem produzir manchas na superfície dos alimentos, manchas de
diferentes cores na superfície de carnes.
Gênero Debaromyces : As espécies de Debaromyces têm elevada
tolerância ao sal (18-20%) e pertencem ao grupo das leveduras formadoras de
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25
películas na superfície de alimentos salgados ou mantidos em salmoura.
Também crescem nos queijos e embutidos.
Gênero Schizosaccharomyces : Essas leveduras têm intensa atividade
fermentativa, requerendo vitaminas para sua multiplicação. Têm sido
associadas à deterioração de frutas e vinhos. Algumas espécies são
xerotolerantes, crescendo em mel, balas, caldo de cana etc.
Gênero Saccharomyces : A espécie do tipo S. cerevisae é muito
empregada na indústria de alimentos, com várias finalidades: fermentação de
pães, bebidas (cervejas, vinhos), fermentação de álcool, glicerol e outras
aplicações em processos tecnológicos. As leveduras de superfície são
fermentadoras muito ativas e crescem rapidamente a 20ºC.
Essas espécies estão freqüentemente envolvidas em alterações
indesejáveis em muitos alimentos como frutas, laticínios (leite, manteiga etc)
maioneses, mel, vinagres e produtos fermentados. A espécie S. cerevisae é
uma mistura de inúmeras linhagens, muito especialmente selecionadas e
exploradas para fins industriais.
A maioria das leveduras que é util izada na indústria de alimentos
pertence ao gênero Saccharomyces .
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26
CCAAPPÍÍTTUULLOO II II II
PPAARRÂÂMMEETTRROOSS IINNTTRRÍÍNNSSEECCOOSS EE EEXXTTRRÍÍNNSSEECCOOSS DDOOSS
AALLIIMMEENNTTOOSS QQUUEE AAFFEETTAAMM OO CCRREESSCCIIMMEENNTTOO MMIICCRROOBBIIAANNOO
xistem muitos fatores que afetam o crescimento bacteriano
e, portanto, podem aumentar a probabilidade de ocorrência
de enfermidades transmitidas por alimentos. Esses fatores
podem estar relacionados às características do alimento (intrínsecos) ou ao
ambiente em que este alimento se encontra (extrínsecos).
E
1 FATORES INTRÍNSECOS
Esses fatores são aqueles relacionados com as características
próprias do alimento que podem estimular ou retardar o crescimento
microbiano.
Esses fatores são os seguintes:
pH;
Atividade de água;
Potencial de oxi-redução;
Nutrientes;
Constituintes antimicrobianos;
Estruturas biológicas;
Cada microrganismo tem um pH mínimo, ótimo e máximo de
crescimento.
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27
Em geral, as leveduras e os bolores toleram melhor a acidez do que
as bactérias. O pH intrínseco dos alimentos é diferente em cada um deles,
mesmo que a maioria tenha um pH neutro ou ácido. Os alimentos cujo pH é
baixíssimo (valores inferiores a 4,5) não são alterados facilmente pelas
bactérias, sendo mais sensíveis às alterações por leveduras e bolores. Todo
alimento que tem um pH intrinsecamente baixo tende a ser mais estável, do
ponto de vista microbiológico do que um alimento neutro.
Os bolores são capazes de crescer dentro de uma escala mais ampla
de valores de pH do que as leveduras e as bactérias. O crescimento das
leveduras fermentativas é estimulado por um pH de aproximadamente 4,0 a
4,5. O crescimento da maioria das bactérias é estimulado por um pH próximo
da neutralidade, embora algumas como os acidificantes cresçam em pH médio,
enquanto que outras, como por exemplo as bactérias com atividade
proteolítica, são capazes de crescerem em pH elevado (básico), as bactérias
da clara dos ovos armazenados.
1.1 EFEITOS DO PH
O efeito adverso do pH tem pelo menos dois aspectos:
afeta principalmente a respiração dos microrganismos por ação
em suas enzimas e no transporte de nutrientes para dentro da
célula microbiana.
o pH desfavorável provoca um aumento na fase lag da
multiplicação microbiana.
A membrana citoplasmática dos microrganismos é relativamente
impermeável aos íons H+ e OH-.
De acordo com o pH, os alimentos são subdivididos em três grupos:
alimentos de baixa acidez, que têm pH superior a 4,5.
alimentos ácidos, têm pH entre 4,0 e 4,5;
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28
alimentos muito ácidos, têm pH inferior a 4,0.
Os alimentos de baixa acidez (pH > 4,5) são os mais sujeitos à
multiplicação microbiana espécies patogênicas e deteriorantes.
Para os alimentos ácidos (pH entre 4,0 e 4,5), há predominância de
crescimento de leveduras, bolores e de algumas poucas espécies bacterianas,
como as bactérias lácticas e algumas espécies de Bacillus .
Já para os alimentos muito ácidos (pH < 4,0), o desenvolvimento
microbiano fica restrito quase que exclusivamente a bolores e leveduras
(Figura 1 e Tabela 1).
pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bolores
Leveduras
Alicyclobaci l lus spp.
Salmonel la spp.
Acetobacter spp.
Lis ter ia monocytogenes
Yersin ia enterocol i t ica
Escherichia col i
Clos tr id ium botul inum
Baci l lus cereus
Campylobacter spp .
Shigel la spp.
Vibrio parahaemolyt icus
Vibrio cholerae
Clostr id ium perfr ingens
Fonte : Jay (2000)
Figura 1 . pH aproximado para o crescimento de alguns microrganismos de
origem alimentar.
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29
Tabela 1 . Valores de pH de diversos alimentos.
Faixa de pH Alimento pH
Baixa acidez (pH 7,0-5,5)
Leite
Carne vermelha
Peixe
Pão
Manteiga
6,3-6,5
6,2-5,4
6,6-6,8
5,3-5,8
6,1-6,4
Média acidez (pH 5,3-4,5)
Vegetais fermentados
Queijo Cottage
Bananas
Vagem
5,1-3,9
4,5
4,5-5,2
4,6-5,5
Ácido (pH 4,5-3,7) Maionese
Tomates
4,1-3,0
4,0
Muito ácido (<pH 3,7)
Picles em conserva e
Sucos de fruta
Chucrutes
Frutas cítricas
Maçãs
3,9-3,5
3,3-3,1
3,5-3,0
2,9-3,3
Fonte: Forsythe (2002)
1.2 ATIVIDADE DE ÁGUA (A W)
Um dos métodos mais antigos de preservação dos alimentos é a
secagem. A preservação dos alimentos pela secagem é uma conseqüência
direta da remoção da água sem os quais os microrganismos não crescem.
A quantidade exata de água necessária para o crescimento dos
microrganismos é variável.
Define-se atividade de água de um alimento ou de uma solução
qualquer como sendo a relação existente entre a pressão de vapor da água
contida na solução ou no alimento.
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30
Para a água pura a atividade de água é 1,00. Os microrganismos não
se multiplicam em água pura, o limite máximo para o crescimento microbiano
é ligeiramente menor do que 1,00.
A atividade de água da maioria dos alimentos frescos é acima de
0,99. Os valores mínimos para o crescimento de alguns microrganismos nos
alimentos são apresentados na Tabelas 2 e 3.
Tabela 2. Principais grupos de alimentos e seus valores de aw.
Valores de aw Alimentos
≥0,98
Carne e pescado frescos
Frutas e hortaliças frescas
Leite
Hortaliças enlatadas em salmoura
0,93-0,98
Estrato de tomate
Carnes curadas enlatadas
Embutidos fermentados
Queijo submetido a tratamento industrial
0,85-0,93
Embutidos secos ou fermentados
Leite condensado
Queijo
0,60-0,85
Frutas secas
Farinha
Cereais
Compotas e geléias
≤0,60
Chocolate
Mel
Biscoito
Batata inglesa
Ovos e hortaliças desidratados
Leite em pó
Fonte: Frazier e Westhoff (2003)
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31
Tabela 3 . Valores de aw para multiplicação de microrganismos importantes
em alimentos.
Microrganismos aw
Pseudomonas spp. 0,97
Escherichia coli 0,96
Enterobacter aerogenes 0,95
Clostridium botulinum t ipos A e B 0,94
Vibrio parahaemolyticus 0,94
Mucor spinosus 0,93
Rhizopus spp. 0,93
Candida spp. 0,90
Staphylococccus aureus 0,86
Aspergillus spp. 0,70
Fonte: Frazier e Westhoff (2003)
Geralmente, as bactérias possuem valores mais altos de aw para o
crescimento do que os fungos.
Nas bactérias, a aw ótima e seu limite inferior para o seu
crescimento, são distintos para cada espécie, variando também em função do
tipo de alimento, da temperatura, do pH e da presença de oxigênio e de
inibidores, seus valores são menores para as bactérias capazes de crescer em
meios com elevadas concentrações de açúcar e de cloreto de sódio.
Os efeitos da baixa aw exercem influência sobre:
diminuição da velocidade de multiplicação;
diminuição da produção máxima de células;
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32
quanto mais desfavorável é a aw do substrato, tanto menor é a
demora (fase lag) com que se inicia o crescimento dos
microrganismos ou a germinação dos esporos.
1.3 POTENCIAL DE OXI-REDUÇÃO
O poder oxidante e redutor do próprio alimento influi no tipo de
microrganismo e nas modificações que ocorrem. O potencial de oxi-redução
de um alimento é definido pela capacidade de compensação do alimento, é
afirmar sua resistência a modificar seu potencial pela pressão do oxigênio da
atmosfera existente em torno do alimento.
Os microrganismos são classificados em: aeróbios – quando
necessitam de oxigênio livre, anaeróbios – quando crescem melhor na
ausência de oxigênio livre – e facultativos – quando crescem bem tanto em
aerobiose quanto em anaerobiose. Os bolores são aeróbios; a maioria das
leveduras cresce melhor em anaerobiose, enquanto que as bactérias das
diferentes espécies podem ser aeróbias, anaeróbias ou facultativas.
Do ponto de vista do potencial de oxi-redução, um potencial
elevado (oxidante) favorece o crescimento dos microrganismos aeróbios,
ainda que permita o crescimento dos facultativos, enquanto que um potencial
baixo (redutor) favorece o crescimento tanto dos microrganismos anaeróbios
como os facultativos.
O crescimento de um determinado microrganismo pode modificar o
potencial de oxi-redução de um alimento o suficiente, como para impedir que
cresçam outros. É possível que os anaeróbios, reduzam o potencial de oxi-
redução até um valor que iniba o crescimento aeróbio.
O potencial de oxi-redução (Eh) pode ser medido com instrumentos
sendo expresso em milivolts (mV). Um substrato muito oxidado tende a um Eh
positivo, enquanto que o Eh de um substrato reduzido será negativo.
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33
A maioria dos alimentos frescos, tanto os de origem vegetal quanto
os de origem animal, têm em seu interior um potencial de oxi-redução baixo e
bem equilibrado – os de origem vegetal porque contêm substâncias redutoras
(por exemplo, ácido ascórbico e açúcares redutores) e os tecidos animais
porque contêm radicais sulfídrico (–SH) e outros grupos redutores.
1.4 NUTRIENTES
A quantidade de nutrientes existentes no alimento é de grande
importância para o crescimento dos microrganismos e os principais são:
água
fonte de energia
fonte de nitrogênio
vitaminas
minerais
A importância da água para o crescimento dos microrganismos
segue em ordem, os bolores (necessitam de menor quantidade), leveduras e
bactérias.
Como fonte de energia os microrganismos podem utilizar açúcar,
álcool e aminoácidos. Poucos microrganismos são capazes de utilizar
carboidratos complexos, como os amidos e celulose, como fonte de energia,
primeiro eles degradam esses compostos para açúcar simples, as gorduras são
usadas também pelos microrganismos como fonte de energia, esses compostos
são ligados, portanto, apenas pequenos números de microrganismos nos
alimentos.
As fontes de nitrogênio mais importantes para os microrganismos
são os aminoácidos, mas uma grande variedade de outros compostos
nitrogenados também pode ser util izada por vários tipos de microrganismos,
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34
por exemplo, são capazes de metabolizar nucleotídeos e aminoácidos, outros
são capazes de utilizar peptídeos e proteínas.
As vitaminas são importantes fatores de crescimento de
microrganismos, uma vez que fazem parte de diversas coenzimas envolvidas
em várias reações metabólicas. Entre as vitaminas, as mais importantes são as
do complexo B, biotina e o ácido patotênico. Entre os microrganismos,
verifica-se que as bactérias gram positivas são mais exigentes em suas
necessidades de vitaminas que as bactérias gram negativas, que juntamente
com os bolores, são capazes de sintetizar todos os seus fatores de
crescimento, conseqüentemente esses dois grupos de microrganismos podem
ser encontrados nos alimentos com baixo teor de vitamina B.
Embora necessários em quantidades muito reduzidas, os minerais
são indispensáveis para o crescimento dos microrganismos, pois estão
envolvidos em muitas reações enzimáticas. Entre esses minerais, destacam-se
o sódio, potássio, cálcio e magnésio. Outros como ferro, cobre, manganês,
zinco, cobalto, fósforo e enxofre podem ser igualmente importantes.
1.5 CONSTITUINTES ANTIMICROBIANOS
A estabilidade de alguns alimentos contra ao ataque dos
microrganismos é devido à presença de algumas substâncias naturalmente
presentes nos alimentos com atividade antimicrobiana, com a capacidade de
retardar ou até mesmo impedir a multiplicação dos microrganismos.
Algumas espécies de plantas são conhecidas por apresentarem
compostos antimicrobianos (óleos essenciais) como, por exemplo, os
condimentos, são um bom exemplo, pois vários óleos essenciais com atividade
antimicrobiana, eugenol no cravo, alicina no alho, t imol no orégano etc.
O ovo, em especial a clara tem diversos agentes antimicrobianos
naturais; é rica em lisozima, enzima capaz de destruir a parede celular
bacteriana, sendo especialmente ativa em bactérias gram positivas.
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35
O leite bovino também contém numerosas substâncias
antimicrobianas naturais, que podem agir especificamente ou não. Entre os
compostos de ação específica estão as imunoglobulinas, o fator complemento,
os macrófagos e os linfócitos.
A lactoferrina do leite também possui atividade antimicrobiana.
Trata-se de uma proteína que inibe a multiplicação através da retirada de íons
ferro do leite. Outras substâncias como a lisozima, naturalmente presente no
leite e a nisina, produzida por bactérias lácticas no leite, também são
importantes no controle do desenvolvimento microbiano.
Os derivados do ácido hidroxicinâmico, encontrados em frutas e
vegetais, são importantes agentes antimicrobianos, com ação
predominantemente sobre bactérias e alguns fungos, assim como os taninos
presentes em frutas e sementes. As frutas contêm ácidos orgânicos e óleos
essenciais importantes na inibição da multiplicação microbiana.
1.6 ESTRUTURAS BIOLÓGICAS OU SUBSTÂNCIAS INIBIDORAS
A cobertura natural de alguns alimentos é responsável pela
excelente proteção contra a entrada e subseqüente perda causada pelos
organismos deteriorantes. Estas estruturas funcionam como barreiras
mecânicas para a penetração de microrganismos, impedindo o crescimento de
determinadas espécies.
Nessa categoria estão a casca de nozes, das frutas e dos ovos, a pele
de animais e película que envolve as sementes.
Todo microrganismo que cresce em um alimento pode produzir uma
ou mais substâncias inibidoras para outros microrganismos, como por
exemplo, ácidos, álcoois, peróxidos, antibióticos.
O ácido propiônico produzido pelas bactérias propiônicas no queijo
suíço, inibe os bolores.
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36
A nisina produzida por determinadas cepas de Streptococcus lactis ,
pode inibir os clostrídios.
Cada um dos fatores próprios da composição dos alimentos, aw, pH,
potencial de oxi-redução etc. , podem influenciar de forma importante no tipo
da microbiota resultante. Alguns destes fatores podem interagir entre si .
Com a finalidade de impedir ou retardar o crescimento dos microrganismos,
podemos manipular vários desses fatores em vez de ajustar apenas um.
2 FATORES EXTRÍNSECOS
Os fatores extrínsecos dos alimentos são aquelas propriedades
ambientais de armazenamento que afetam os alimentos e os microrganismos.
São os seguintes:
temperatura ambiental;
umidade relativa;
presença e construção de gases do ambiente.
2.1 TEMPERATURA AMBIENTAL
O fator ambiental mais importante que afeta a multiplicação dos
microrganismos é a temperatura.
Os microrganismos podem multiplicar-se em uma faixa bastante
ampla de temperatura, sendo -34ºC a menor temperatura e 110ºC a maior.
Os microrganismos são classificados de acordo com as
temperaturas:
psicrófilos;
psicrotróficos;
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37
mesófilos;
termófilos (termódicos).
Os microrganismos psicrófilos -0º e 20ºC temperatura ótima de
crescimento 10º e 15ºC.
Os microrganismos psicrotrófilos -0º e 7ºC como nem todos os
psicrotrófilos crescem na mesma temperatura eles foram classificados em:
europsicrotrófilos e estenopsicrotrófilos:
europsicrotrófilos são aqueles que tipicamente não formam
colônias visíveis entre 6 a 10 dias a 0ºC e 7ºC (por exemplo,
Enterobacter cloacae , Hafnia alvei e Yersinia enterocolitica);
estenopsicrotrófilos são aqueles que tipicamente formam colônias
visíveis em 5 dias nessa faixa de temperatura (por exemplo,
Pseudomonas fragi e Aeromonas hydrophila – crescem muito bem
até 7ºC em 3-5 dias, mas não crescem a 40ºC)
As espécies de bactérias e cepas que podem crescer a 7ºC ou abaixo
dessa temperatura são largamente distribuídas entre as gram negativas e bem
distribuídas entre as gram positivas.
A menor temperatura registrada de crescimento dos microrganismos
nos alimentos é -34ºC (leveduras e bolores), devido a atividade de água.
Para as bactérias tem sido registrado o crescimento em torno de -
20ºC.
Os alimentos que provavelmente suportam o crescimento
microbiano a essas temperaturas são: suco de frutas concentrado, bacon,
sorvete e certos tipos de frutos.
Os microrganismos psicrófilos e psicrotrófilos multiplicam-se bem
em alimentos refrigerados, sendo os principais agentes de deterioração de
carnes, pescado, ovos, frangos etc. Nesse grupo podem ser incluídos os
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38
seguintes gêneros: Pseudomonas , Alcaligenes , Flavobacterium , Micrococcus e
outros.
Microrganismos mesófilos: temperatura ótima de multiplicação
entre 25º e 40ºC, mínima entre 5º e 25ºC e máxima entre 40º e 50ºC.
Os microrganismos mesófilos correspondem à grande maioria de
importância em alimentos, incluindo a maior parte dos patógenos de interesse.
Microrganismos termófilos: temperatura ótima de multiplicação
entre 45º e 65ºC, mínima entre 35º e 45ºC e máxima entre 60º e 90ºC.
A maioria das bactérias termófilas importantes em alimentos
pertencem aos gêneros Bacillus e Clostridium , incluindo tanto espécies
deteriorantes (Bacillus coagulaus , Clostridium thermosaccharolyticum),
quanto espécies patogênicas (Clostridium botulinum , Clostridium
perfringens).
Alguns membros do grupo Archaea apresentam uma temperatura
ótima de crescimento em torno ou superior a 80ºC. estas bactérias são
denominadas termodúricas, ou, algumas vezes de hipertermófilos. A maioria
destes organismos vive em fontes de águas quentes associadas à atividade
vulcânica. A temperatura mais alta conhecida que suporta o crescimento
bacteriano é de 100ºC.
2.2 UMIDADE RELATIVA
A umidade relativa influencia diretamente a atividade de água do
alimento. Se um alimento com baixa atividade de água está armazenado em
um ambiente com alta umidade relativa, a atividade de água deste alimento
aumenta, permitindo a multiplicação de microrganismo.
A combinação entre umidade relativa e temperatura não pode ser
desprezada. Geralmente, quanto maior a temperatura de armazenagem, menor
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39
a umidade relativa, e vice-versa. Alterando o gás da atmosfera é possível
retardar a multiplicação de microrganismos sem diminuir a umidade relativa.
Alimentos que passam por processos de deterioração causados por
bolores, leveduras e certas espécies de bactérias devem ser estocados sob
condições de baixa umidade relativa.
2.3 PRESENÇA E CONCENTRAÇÃO DE GASES DO AMBIENTE
A composição gasosa do ambiente que envolve um alimento pode
determinar os tipos de microrganismos que poderão predominar. A presença
de oxigênio favorecerá a multiplicação de microrganismos aeróbios, enquanto
que sua ausência favorecerá aos anaeróbios, embora haja bastante variação na
sensibilidade dos anaeróbios ao oxigênio.
Modificações na composição gasosa são capazes de causar
alterações na microbiota que sobrevive ou que se multiplica em determinado
alimento.
Atmosferas modificadas correspondem a ambientes nos quais o
oxigênio total ou parcialmente substituído por outros gases, são empregadas
como recurso tecnológico para aumentar a vida útil dos alimentos.
Embalagens contendo diferentes combinações entre oxigênio, nitrogênio e gás
carbônico são as mais empregadas industrialmente, embora outros gases
possam também ser utilizados (monóxido de carbono, óxido nitroso e dióxido
de enxofre). A embalagem a vácuo é também bastante empregada em especial
para carnes.
O dióxido de carbono (CO2) é o gás atmosférico mais importante
usado para o controle de microrganismos nos alimentos. O efeito
antimicrobiano depende de inúmeros fatores. O mais importante é a
temperatura, sendo que o efeito é mais intenso quanto mais baixa for a
temperatura. Portanto, o armazenamento do alimento em temperatura
inadequada pode cancelar a ação biostática do CO2. Além disso, a ação do
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40
CO2 é dependente do pH e da aw do alimento, dos tipos e das condições
metabólicas dos microrganismos presentes e da concentração do CO2.
Atmosferas contendo 10% de CO2 são utilizadas, há muito tempo,
para prolongar o tempo de armazenamento de frutas, especialmente maçãs e
pêras. Atmosferas contendo CO2 vêm sendo empregadas também para
prolongar o tempo de armazenamento de carnes vermelhas.
Ozônio (O3) É outro gás atmosférico que tem propriedades
antimicrobianas, e tem sido usado para prolongar a vida útil de certos
alimentos e tem sido efetuado contra uma variedade de microrganismo.
3 COMBINAÇÃO DOS PARÂMETROS INTRÍNSECOS E EXTRÍNSECOS
O conhecimento dos fatores intrínsecos e extrínsecos que agem
sobre determinado alimento permite prever sua vida de prateleira, sua
estabilidade microbiológica, conhecer a capacidade de crescimento e/ou
produção de toxinas por microrganismos patogênicos.
Vários fatores ou técnicas são empregados para controlar os efeitos
dos microrganismos nos alimentos; barreiras tecnológicas, combinação de
métodos de preservação.
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41
CCAAPPÍÍTTUULLOO IIVV
AA FFLLOORRAA MMIICCRROOBBIIAANNAA DDOOSS AALLIIMMEENNTTOOSS EE
MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS DDEETTEERRIIOORRAANNTTEESS
s alimentos deteriorados são aqueles que têm sabor e odor
desagradáveis. A deterioração é resultado do crescimento
indesejável de microrganismos produtores de compostos
voláteis durante seu metabolismo, os quais o olfato e o paladar humano
podem detectar. Esses microrganismos não causam intoxicações.
O Os termos deteriorados e não-deteriorados são subjetivos – a
aceitação do alimento depende do consumidor e não está relacionada com a
segurança alimentar. Por exemplo: o leite azedo utilizado na fabricação de
doces é inaceitável para beber. A produção de ácido acético durante a
estocagem de vinhos é inaceitável.
A deterioração dos alimentos pode ocorrer devido a diversos
fatores:
danos causados por insetos;
danos físicos devido a batidas, pressão, congelamento, secagem e
radiação;
atividades de enzimas dos próprios tecidos animais e vegetais;
alterações químicas que não são induzidas por microrganismos ou
por enzimas de ocorrência natural;
atividade de bactérias, fungos e leveduras.
Os alimentos podem ser contaminados com uma grande variedade de
microrganismos durante a colheita, o processamento e manipulação.
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42
Durante a distribuição e estocagem, as condições serão favoráveis
para a multiplicação de microrganismos específicos, ocasionando a
deterioração.
Essas deteriorações dependem dos parâmetros intrínsecos e
extrínsecos dos alimentos.
A deterioração pode ser retardada por meio da diminuição da
temperatura de estocagem. Para alimentos frescos, as principais alterações na
qualidade podem ocorrer devido:
ao crescimento e metabolismo bacteriano, resultando em
possíveis alterações do pH e formação de compostos tóxicos,
odores desagradáveis e formação de gás e camadas limosas;
à oxidação de lipídeos e pigmentos contidos em alimentos
gordurosos, resultando na liberação de sabor indesejável e na
formação de compostos que possuem efeitos biológicos adversos
ou que favoreçam a descoloração.
a vida de prateleira é dependente do crescimento da microbiota
contaminante, que pode ser inibida por meio de estocagem a frio
ou técnicas de embalagem (embalagem à vácuo e embalagens com
atmosfera modificada).
Quanto maior a carga da microbiota inicial, menor a vida de
prateleira devido ao aumento das atividades microbianas.
Uma grande variedade de microrganismos pode estar presente nos
alimentos se as condições forem favoráveis.
De acordo com a facilidade com que se deterioram os alimentos eles
podem ser classificados em:
1) Alimentos estáveis ou não perecíveis – São grupos de alimentos
que não se deterioram a não ser que sejam manipulados sem o devido cuidado,
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43
estão incluídos: açúcar e farinhas, que são produtos que possuem baixa
atividade de água;
2) Alimentos semiperecíveis – Quando os alimentos são
manipulados e conservados de forma apropriada, permanecem sem
deterioração durante bastante tempo; as batatas, maçãs etc;
3) Alimentos perecíveis – Este grupo de alimentos são aqueles mais
importantes para o consumo cotidiano, os quais se deterioram com facilidade
a não ser que sejam utilizados métodos de conservação específicos. Exemplos:
as carnes, o pescado, a maioria das frutas e hortaliças, ovos e leites.
A maioria dos alimentos se enquadra em um dos grupos citados,
alguns se encontram bem próximo ao limite que separa uns dos outros,
portanto, chega a ficar difícil a classificação.
1 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM NEGATIVOS
As Pseudomonas , Alteromonas e Aeromonas spp. deterioram
produtos lácteos, carne vermelha, carne de frango, peixe e ovos durante a
estocagem a frio. Esses alimentos possuem atividade de água alta e pHs
neutros, além de serem estocados sem atmosfera modificada (isto é, com
níveis normais de oxigênio).
Existem diversos mecanismos de deterioração incluindo a produção
de proteases e lipases termoestáveis, as quais produzem aromas e sabores
desagradáveis no leite mesmo após a morte dos microrganismos pela
pasteurização.
Eles produzem pigmentos na deterioração de ovos. A Erwinia spp. e
várias Pseudomonas spp são responsáveis por aproximadamente 35% das
deteriorações vegetais.
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44
2 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS NÃO-FORMADORES DE
ESPOROS
As bactérias ácido-lácticas são bastonetes gram positivos que
causam deteriorações típicas em carnes estocadas em embalagens com
atmosfera modificada ou embalagens a vácuo. Acetobacter e Pediococcus spp
podem produzir uma camada limosa espessa em cervejas. Esses
microrganismos podem produzir, ainda ácido láctico em vinhos, causando
gosto amargo. Acetobacter produz ácido láctico em cerveja, também
resultando em sabor amargo ao produto.
3 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS FORMADORES DE
ESPOROS
Os microrganismos formadores de esporos tais como Bacillus spp. e
Clostridium spp. podem ser importantes deteriorantes de alimentos
processados termicamente, uma vez que seus esporos podem sobreviver ao
processamento.
Os B. cereus podem crescer em leite pasteurizado a 5ºC e produzem
coalho doce. O B. stearothermophilus causa a deterioração ácida sem
estofamento ( f lat sour) em alimentos enlatados. Ele cresce no interior da lata,
produzindo ácidos, isto é, sem produção de gás e, portanto, a lata não incha.
O Clostridium thermosacharolyticum deteriora alimentos enlatados,
produzindo gases e, portanto, a lata estufa. O Desulfotomaculum nigrificans
produz sulfito de hidrogênio, o qual causa estufamento de latas e mau cheiro.
Esse fenômeno é conhecido como deterioração com cheiro de enxofre.
4 BOLORES E LEVEDURAS DETERIORANTES
Os bolores e leveduras são mais resistentes a baixas atividades de
água e pHs ácidos do que as bactérias. Deterioram alimentos como vegetais e
produtos de panificação. Produzem enzimas pectínólicas, que amaciam os
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tecidos vegetais, causando putrefação. Estima-se que 30% da deterioração de
frutas ocorre devido ao fungo Penicill ium . O pão é deteriorado por Rhizopus
nigricans (bolor preto, manchas pretas), Penicill ium (bolor verde).
As leveduras são capazes de crescer em altas concentrações de
açúcar (65-70%) e deterioram geléias, xaropes e mel. Os fungos podem
produzir também diversos tipos de deterioração de carnes devido aos
microrganismos Mucor , Rhizopus (Tabela 4).
Tabela 4 . Fungos deteriorantes de alimentos.
Microrganismos Produtos tipicamente afetados
Aspergillus versicolor Pão e produtos lácteos
A. flavus Cereais e castanhas
A. niger Temperos
Fusarium oxysporum Fruta
Mucor spp Carne
Neurospora sitophila Pão
Penicillium roqueforti Carne, ovos e queijos
P. expansum Fruta e vegetais
P. discolor Queijo
Penicill ium spp Pão
Rhizopus nigricans Pão
Rhizopus spp Carne
Saccharomyces spp Refrigerantes, geléias, xaropes e mel
Trichoderma harzianum Margarina
Fonte: Forsythe (2002)
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46
Os métodos de preservação usualmente empregados para controlar o
crescimento de fungos são:
altas temperaturas;
conservantes ácidos fracos (ácido sórbico);
antibióticos.
OBS: Alguns fungos já desenvolveram resistência ao ácido sórbico,
produzindo pentadieno, de odor desagradável.
5 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS LÁCTEOS
O leite é um meio ideal para o crescimento de bactérias, deve
sempre ser mantido sob refrigeração. A deterioração do leite é conseqüência
de microrganismos psicrófilos, que produzem lípases e proteases que não são
desnaturadas durante a pasteurização. Os microrganismos que produzem essas
enzimas são: Pseudomonas , Aeromonas , Serratia e Bacillus spp.
Essas enzimas hidrolisam as proteínas do leite, produzindo
peptídeos que azedam o produto. Portanto, altas contagens microbianas antes
da pasteurização são indesejáveis. Entre as bactérias indesejáveis podemos
mencionar os Estreptococos lácticos, as bactérias do grupo coliforme, os
bacilos psicrófilos gram negativos e as bactérias termodúricas. Quando o leite
contém quantidade mínima de microrganismo, sobretudo aqueles que crescem
com facilidade, sua qualidade ou conservação é melhor. O tipo de
microrganismo existente no leite é extremamente importante, em geral, quanto
menor é a sua carga microbiana inicial, melhor é a sua qualidade de
conservação. O número de bactérias presentes no leite é indicativo das
condições higiênicas adotadas, assim como os cuidados empregados na
manipulação durante a sua obtenção.
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6 DETERIORAÇÃO DE CARNE BOVINA E AVES
As carnes são produtos altamente perecíveis com atividade de água
suficiente para o crescimento da maioria dos microrganismos. Por ser um
produto nutritivo, a carne pode ser deteriorada rapidamente por causa do
crescimento de microrganismos e até ser prejudicial à saúde devido à
contaminação de patógenos. A carne por si só, é estéril quando no corpo do
animal. Entretanto, pode ser contaminada facilmente durante o abate, a
evisceração, a manipulação no processamento e estocagem inadequada.
Como conseqüência das distintas procedências dos microrganismos
são muitas as espécies microbianas que provavelmente contaminam as carnes.
Sendo as mais importantes: Pseudomonas , Acinetobacter , Micrococcus ,
Sarcina , Leuconostoc , Lactobacillus , Proteus , Bacillus , Clostridium ,
Alcaligenes , Escherichia , Campylobacter e Salmonella .
Muitas destas bactérias são capazes de crescer a temperaturas de
refrigeração. Também existe a possibilidade da contaminação por
microrganismos patógenos para o homem (bactérias entéricas).
A pele de aves pode carregar diversos organismos deteriorantes:
Pseudomonas spp., Enterobacter spp. etc. O patógeno C. jejuni também pode
estar presente na pele e, conseqüentemente, ser transferido para a superfície
de trabalho. Os patógenos como Salmonella Enteritidis podem infectar os
ovários e os ovodutos de galinha e conseqüentemente, os ovos, principalmente
durante a formação da casca. As cascas dos ovos tornam-se contaminadas com
bactérias intestinais durante a passagem pela cloaca e com o contato com a
superfície das incubadoras.
As bactérias encontradas em carne de frango incluem: S. aureus , L.
monocytogenes e Cl. botulinum do tipo C (não patogênico para adultos
saudáveis). As linhagens de S. aureus encontradas em aves não são
patogênicas ao homem. Os alimentos à base de frango com Staphylococcus
são normalmente contaminados após cocção por manipuladores infectados.
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As carcaças, em temperaturas maiores que 20ºC, serão prontamente
deterioradas por bactérias provenientes do intestino dos animais, as quais
contaminam a carne durante a evisceração. A microbiota deteriorante é
dominada por microrganismos mesófilos tais como Escherichia coli ,
Aeromonas spp., Proteus spp.
Em temperaturas abaixo de 20ºC, a microbiota deteriorante será
constituída por psicrófilos como Pseudomonas spp. A temperatura de
refrigeração de 5ºC ou menor a microbiota deteriorante será predominante de
Pseudomonas . Essas bactérias são aeróbias e, portanto, somente crescem na
superfície dos alimentos até uma profundidade de 3 a 4mm.
7 DETERIORAÇÃO DE PESCADOS
O termo “pescado” se refere a todas as espécies comestíveis de água
doce e marinha, compreendendo os peixes, crustáceos, moluscos, anfíbios e
quelônios. A variedade de produtos derivados do pescado é muito ampla e
inclui alimentos preparados por vários métodos tecnológicos tradicionais e
modernos.
Como os pescados são de grande importância para a nutrição
humana mundial, muitos países os util izam na sua dieta como parte principal
de proteínas de alto valor biológico, uma vez que estas possuem todos os
aminoácidos essenciais, especialmente lisina.
A carne do pescado é um excelente substrato para o crescimento da
maioria das bactérias heterotróficas. De acordo com Jay (2000), as bactérias
responsáveis pela deterioração do pescado são, principalmente, as gram
negativas, tais como as Pseudomonas , capazes de crescer a menos 3ºC.
A maioria do pescado é tanto mais rica em espécies microbianas
quanto mais poluídas forem as águas das quais advém. Outro ponto importante
a ser considerado é a espécie do pescado, pois sua composição química
também determinará a predominância de diferentes espécies de
microrganismos.
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49
A temperatura da água é outro fator significativo no número e
espécie de bactérias na superfície do pescado, a carga microbiana do pescado
após a captura está relacionada às condições ambientais, qualidade
microbiológica da água, temperatura, teor residual de sal, distância entre a
localização da captura e áreas poluídas com dejetos humanos e animais,
origem dos alimentos consumidos pelo pescado e suas condições de
resfriamento.
As bactérias patogênicas associadas a pescados são caracterizadas
em três grupos:
1) as que normalmente estão presentes em ambientes marinhos e
estuarinos (bactérias do gênero Vibrio , Listeria monocytogenes , Clostridium
botulinum e Aeromonas hydrophila);
2) as enterobactérias (devido a contaminação fecal);
3) as bactérias que contaminam o produto durante o processamento.
O consumo de moluscos bivalves está freqüentemente associado a
elevado número de doença de origem alimentar em função de suas
propriedades fil tradoras e, conseqüentemente, bioacumuladores de
microrganismos.
Pertencentes à família Vibrionaceae, o Vibrio alginolyticus , V.
cholerae não O1, V. parahaemolyticus e V. vulnificus estão entre os principais
patógenos associados com ostras, sururus encontrados em ambientes marinhos
poluídos.
8 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL
As alterações das hortaliças e de frutas frescas podem ser
conseqüência de causas físicas, atividade de suas próprias enzimas, atividades
de microrganismos, ou de combinações de todos esses fatores.
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50
As condições ambientais inadequadas durante sua colheita,
transporte, armazenamento e comercialização, podem favorecer sua alteração.
As enfermidades ou defeitos das hortaliças e das frutas podem ser
devido a multiplicação de um microrganismo que obtém seus nutrientes.
As alterações microbianas das frutas e das hortaliças podem ser
devidas:
à microrganismos patógenos que atuam sobre os talos, folhas,
flores ou raízes da planta, frutos ou ainda em determinadas partes
da planta, util izadas como alimento. Por exemplo: raízes ou
tubérculos, ou sobre várias destas partes da planta.
microrganismos saprófitas os quais são ditos invasores, penetram
nas frutas e hortaliças sadias, como é o caso dos diferentes tipos
de podridão.
Um dos gêneros mais freqüentemente envolvidos com a deterioração
de vegetais é a Erwinia . A podridão mole bacteriana é causada por Erwinia
carotovora , Pseudomonas spp., Xanthomonas , Clostridium e Bacillus . Os
microrganismos hidrolisam a pectina provocando o amolecimento do vegetal,
produzindo odor desagradável e aparência úmida. Alguns dos vegetais
atacados são aspargo, cebola, alho, cenoura, alface, salsão, batata, espinafre,
repolho, melancia, pepino, brócolis, couve-flor.
O gênero Erwinia pertence à família Enterobacteriaceae. São
capazes de crescer a 10ºC e são microrganismos produtores de protopectinase.
Além disso, muitas espécies de Erwinia são capazes de fermentar açúcares e
álcoois existentes em certos vegetais, como ramanose, celobiose e manitol;
esses são compostos que não são utilizados pelas bactérias mais comuns.
Os agentes fúngicos são mais importantes do que as bactérias na
deterioração de alimentos de origem vegetal. Os principais gêneros são:
Rhizopus , Botrytis , Aspergillus , Cladosporium , Fusarium , Alternaria etc.
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51
A composição das frutas e das hortaliças influi no provável tipo de
alteração. Portanto, a podridão ocasionada pelas bactérias acontece com maior
freqüência nas hortaliças cuja acidez não é muito elevada e nas frutas
aparecem somente naquelas que não são muito ácidas.
A deterioração fúngica dos vegetais freqüentemente resulta em áreas
de amolecimento, enquanto que as podridões fúngicas de frutas secas, como
maçãs e pêssegos, mostram áreas marrons ou de cor creme, devido ao
crescimento do micélio do bolor. Alguns tipos de fungo apresentam área
infectada seca, dura e freqüentemente descolorida.
Os bolores são mais comuns em frutas e vegetais ácidos, deficientes
em vitamina B e que apresentam superfície moderadamente seca.
Os sucos das frutas e hortaliças possuem uma variação de pH 2,4
para o suco de limão, até 4,2 para o de tomate, e todos eles apresentam
açúcares com variação entre 2% a 17%. O alto teor de água favorece o
crescimento de leveduras e bactérias; os bolores são capazes de crescer na
superfície quando em contato com o ar.
O desenvolvimento das leveduras e bactérias dependerá mais da
temperatura de armazenamento do que da composição do suco. A temperatura
entre 15 e 35ºC favorece o crescimento das leveduras.
As alterações que ocorrem em sucos de frutas armazenadas à
temperatura ambiente são decorrentes da fermentação alcoólica, por leveduras
formadoras de película ou por bolores que crescem na superfície, ou da
oxidação do álcool a ácido acético quando bactérias acéticas estão presentes.
Os concentrados de sucos de frutas e hortaliças, devido a acidez e
teores de açúcares elevados, favorecem a multiplicação das leveduras e das
espécies acidotolerantes e sacarotolerantes dos gêneros Leuconostoc e
Lactobacillus .
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52
9 DETERIORAÇÃO DE CEREAIS E PRODUTOS DERIVADOS
A microbiota do trigo, centeio, milho, farinha e outros produtos é
formada por espécies de bolores dos gêneros Aspergillus e Penicill ium e
algumas espécies de bactérias do gênero Bacillus , Sarcina , Serratia e do
grupo coliforme. A contaminação pode ser formada do solo, do ambiente no
qual são armazenados e aquelas adquiridas durante o processamento. Alguns
microrganismos aeróbios formadores de esporos, como os Bacillus , são
produtores de amilase, o que permite que utilizem farinhas e derivados como
fonte de energia, desde que a umidade seja suficiente.
Do ponto de vista de saúde pública, a contaminação por bolores nos
grãos de cereais e dos produtos derivados têm merecido muito interesse
devido a produção de micotoxina. O isolamento freqüente das espécies de
bolores como Aspergillus flavus e A. parasitucus produtores de aflatoxinas,
avalia a necessidade da redução da contaminação.
10 DETERIORAÇÃO DE PRODUTOS DE PANIFICAÇÃO
Os bolores constituem a causa mais importante de alteração do pão
e da maioria dos seus produtos. As temperaturas elevadas durante a cocção
geralmente são suficientes para eliminar os esporos dos bolores no interior e
na superfície do pão, de forma que os bolores que ocasionalmente contaminam
chegam à superfície ou penetram no interior depois da cocção. Os bolores
procedem do ar durante o esfriamento e posteriormente da manipulação ou das
embalagens.
Os principais bolores responsáveis pelas alterações são Rhizopus
stolonifer (aspecto algodonoso, de cor branca e negra), Penicillium expansum
(de cor verde) e Aspergillus niger (de cor negra, produz pigmento amarelo).
Os produtos de panificação, manuseados de maneira adequada,
raramente são afetados por microrganismos, uma vez que apresentam baixa
umidade.
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53
11 DETERIORAÇÃO DE ALIMENTOS DOCES
A maioria dos alimentos doces raramente está exposta às alterações
microbianas devido seu elevado teor de açúcar e sua umidade relativamente
baixa; e assim, quando preparados, processados e armazenados com os
devidos cuidados.
As bactérias contaminantes mais importantes dos açúcares de cana
pertencem aos gêneros Bacillus e Clostridium . A deterioração ocorrerá caso
os açúcares sejam armazenados sob condições de extrema umidade, sendo os
microrganismos mais envolvidos: Torula spp. e cepas de Saccharomyces spp.,
que provoca a inversão do açúcar.
Entre as balas, confeitos, bombons e outros produtos recheados com
creme, podem sofrer deteriorações caracterizadas por explosões causadas por
bactérias pertencentes ao gênero Clostridium , principalmente C. sporogenes .
A contaminação por essa bactéria ocorre através do açúcar, amido e,
provavelmente, outros ingredientes.
12 INDICADORES DA VIDA DE PRATELEIRA
O tempo de vida de prateleira é um atributo importante de todos os
alimentos. Pode ser definido como o tempo que se passa desde a produção e a
embalagem do produto até o ponto em que ele se torna inaceitável para o
consumo. É relacionado, então, com a qualidade total do alimento e
diretamente ligado ao planejamento da produção, às especificações dos
ingredientes, ao processo de manipulação e à estocagem (no varejo e na casa
do consumidor). A vida de prateleira depende do alimento (Tabela 5) e é
essencial que os produtores identifiquem os parâmetros intrínsecos e
extrínsecos que limitam esse período.
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54
Tabela 5 . Produtos alimentícios e seus tempos de prateleira.
Produtos alimentícios Vida de prateleira esperada
Pão Até 1 semana à temperatura ambiente
Molhos, temperos 1 a 2 anos à temperatura ambiente
Pepino 2 a 3 anos à temperatura ambiente
Alimentos resfriados Até 4 meses entre 0 e 8ºC
Alimentos congelados 12 a 18 meses no congelador
Alimentos enlatados Latas não-envernizadas, 12 a 18 meses
Latas envernizadas, 2 a 4 anos
Fonte: Forsythe (2002)
A vida de prateleira pode ser determinada pela combinação de
análises microbiológicas e químicas de amostras dos alimentos.
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55
CCAAPPÍÍTTUULLOO VV
DDOOEENNÇÇAASS DDEE OORRIIGGEEMM AALLIIMMEENNTTAARR
1 BREVE HISTÓRICO
ntigamente, acreditava-se que as doenças, infecções e até
mesmo indisposições físicas eram causadas por “maus
espíritos”.
Segundo registros encontrados, há cerca de 2000 a.C., Moisés
elaborou leis para proteger seu povo contra doenças infecciosas. As mãos
deveriam ser lavadas após o sacrifício dos animais e antes das refeições. Leis
foram estabelecidas para animais comestíveis de todos os tipos. Animais eram
proibidos os quais incluíram os suínos, hoje conhecidos como freqüentes
excretores de salmonelas, assim como reservatórios de parasitas, como a
Trichinella spiralis e Taenia solium e pequenas criaturas como macacos,
ratos, lagartos, cobras e caracóis, todos conhecidos hospedeiros de
salmonelas.
A
A descrição de intoxicações alimentares registradas na história
antiga está geralmente associada a toxinas químicas.
As bactérias causadoras de intoxicações alimentares foram
primeiramente descritas por Gaertner em 1888. Elas foram isoladas do
organismo de um homem que havia morrido durante um surto de gastrenterites
que atingiu 59 pessoas na Alemanha. Em 1896, E. van Ermengem, na Bélgica,
descreveu o Clostridium botulinum , o organismo responsável pelo botulismo.
Entre os anos 1909 e 1923 muitas das bactérias hoje conhecidas
como responsáveis por um grande número de intoxicação alimentar.
Apesar dos extensivos ensinamentos sobre a higiene dos alimentos
para a prevenção de doenças de origem alimentar a incidência de surtos e
casos esporádicos continua a crescer.
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56
2 TAMANHO DO PROBLEMA DAS DOENÇAS DE ORIGEM ALIMENTAR
Muitos casos de doenças ou enfermidades causadas por alimentos
não são notificados, pois seus sintomas são geralmente parecidos com gripes.
É sabido que apenas um pequeno número de casos de enfermidades
causadas por alimentos é notificado aos órgãos de inspeção de alimentos, de
controle e às agências de saúde. Isso se deve, em parte, ao fato de que muitos
patógenos presentes em alimentos causam sintomas brandos, e a vítima não
busca auxílio médico. Portanto, o número de casos notificados pode ser
definido como a ponta do iceberg , tendo em vista o número real de
toxinfecções causadas por alimentos (Figura 2).
Casos notificados
Casos avaliados por médicos de hospitais, mas não notificados.
Doentes que não procuram aconselhamento médico.
Enfermidade branda ou assintomática.
Fonte : Forsythe (2002)
Figura 2 . Pirâmide que ilustra a notificação dos casos: ponta do iceberg .
A quantidade de produtos disponíveis no mercado oferece ao
consumidor a oportunidade de ampla escolha. Entretanto, apesar do progresso
na medicina, na ciência e tecnologia de produção de alimentos, as
enfermidades causadas por patógenos alimentares continuam apresentando
problemas significativos para a saúde e para a economia.
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57
As estatísticas brasileiras não são definidas, portanto, acredita-se
que incidência de doenças ou enfermidades microbianas de origem alimentar
em nosso país seja bastante elevada.
Vários agentes causadores de doenças no homem podem ser
transmitidos pelos alimentos:
produtos químicos (metais pesados, pesticidas);
toxinas naturais de plantas e animais (alcalóides, histamina);
parasitas (amebas, helmintos);
bactérias patogênicas;
fungos toxigênicos.
A ocorrência de toxinfecções de origem bacteriana depende do
conjunto de circunstâncias peculiares e de alguns ou todos os seguintes
fatores:
1) o organismo infectante (agente causador) em gêneros
alimentícios, nos manipuladores de alimentos e nos animais;
2) as mãos dos manipuladores de alimentos transmitindo os
organismos dos alimentos crus para os alimentos cozidos e para os
equipamentos, roupas e outros utensílios de cozinha, ou, provavelmente, do
próprio manipulador de alimento para os alimentos cozidos;
3) superfícies contaminadas por alimentos crus;
4) alimentos favoráveis ao crescimento bacteriano;
5) condições favoráveis para estocagem à temperaturas mornas por
um período de 2 horas ou mais;
6) pessoas susceptíveis.
A Organização Mundial de Saúde define enfermidade transmitida
por alimento como sendo aquela de natureza tóxica ou infecciosa causada por
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58
agentes que invadem o organismo por meio da ingestão de alimentos
contaminados.
As enfermidades de origem alimentar ocorrem quando uma pessoa
contrai uma doença devido à ingestão de alimentos contaminados com
microrganismos ou toxinas indesejáveis. Essa condição é, freqüentemente,
denominada como toxinfecção alimentar.
Toxinfecções alimentares ou enfermidades transmitidas por
alimentos compreendem:
infecções alimentares;
intoxicações alimentares.
As infecções alimentares são decorrentes da ingestão de alimentos
contaminados com agentes infecciosos com reações provocadas pela sua
presença e seus metabólitos.
As infecções alimentares são divididas em dois tipos:
1) aquelas em que os microrganismos patógenos não
necessariamente se multiplicam no alimento; o alimento só atua como
veiculador. Exemplo: microrganismos patógenos como os que produzem a
tuberculose, a difteria, as disenterias, a febre tifóide, a cólera, hepatite
infecciosa etc;
2) aquelas em que os alimentos podem servir de meio de cultura
para que os microrganismos patógenos se multipliquem e alcancem níveis
capazes para ocorrer uma infecção nos consumidores de alimentos. Exemplo:
enfermidades produzidas por Salmonella , Vibrio parahaemolyticus ,
Escherichia coli .
É provável que os surtos de infecções alimentares do segundo tipo
sejam mais severos que os surtos originados por outros patógenos intestinais.
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59
3 INTOXICAÇÕES ALIMENTARES
As intoxicações alimentares são causadas pela ingestão de toxinas
pré-formadoras nos alimentos devido à multiplicação dos microrganismos.
Estas toxinas são produzidas durante a intensa proliferação dos
microrganismos patogênicos no alimento. Pertencem a este grupo:
Clostridium botulinum , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus e fungos
produtores de micotoxinas.
Essas doenças podem ocorrer de forma individual ou em surtos,
quando um grande número de pessoas é acometido por sintomas semelhantes.
As doenças alimentares de origem microbiana são consideradas
como o mais sério problema no mundo contemporâneo e, conseqüentemente,
como uma causa importante na redução econômica da produtividade.
O grupo de indivíduos mais afetado pelas Doenças Veiculadas por
Alimentos (DVAs) são as crianças, mulheres grávidas, idosos e pessoas com
sistema imunológico imunodeprimido, como nos casos de pacientes com Aids,
câncer, diabetes ou os que estão sob tratamentos com quimioterápicos.
Segundo a Organização Panamericana de Saúde (OPS, 2003), a
segunda causa mais comum de óbitos em crianças de 0 a 5 anos, no mundo
todo, é a diarréia, com estimativa de 12% dos óbitos.
Nas últimas décadas, a epidemiologia de doenças de origem
alimentar sofreu mudanças com o aparecimento de novos importantes
microrganismos e patógenos emergentes que em alguns casos não oferecem
riscos para os indivíduos, porém, em outros, ameaça-lhes a vida. Essas
mudanças podem ser atribuídas a vários fatores:
estatística populacional;
estilo de vida dos consumidores;
desenvolvimento do processamento de alimentos;
preparação e práticas de manipulação dos alimentos.
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60
Dados do ano de 2003 da OPS confirmam que mais de 70% dos
casos de enfermidades transmitidas pelos alimentos têm origem no seu
manuseio inadequado pelo consumidor final.
A contaminação cruzada pelos patógenos microbianos pode ter um
importante papel nos casos esporádicos de doenças epidêmicas de origem
alimentar. Durante a manipulação e preparação, as bactérias podem ser
transferidas dos alimentos crus para os manipuladores e, subseqüentemente
para outras superfícies pelas mãos contaminadas. As mãos são também um
ponto crítico para contaminação cruzada.
4 CONTROLE DA CONTAMINAÇÃO DOS ALIMENTOS
Os microrganismos patogênicos estão presentes no solo e,
conseqüentemente, nas colheitas, no gado, nas aves e nos peixes. Portanto, é
inevitável que produtos crus util izados como ingredientes carreguem
contaminação patogênica. Dessa forma, para evitar toxinfecções alimentares,
os patógenos de ingredientes devem ser identificados e controlados. Os
programas de controle devem ser implantados, sendo monitorados quanto à
sua eficácia, além de serem revisados e modificados, sempre que necessário.
4.1 PROGRAMA DE VIGILÂNCIA
Um programa de vigilância para enfermidade de origem alimentar é
parte essencial de um programa de segurança alimentar.
A vigilância se refere à coleta sistemática e util ização de
informações epidemiológicas para o planejamento, a implementação e a
avaliação do controle de enfermidades.
A vigilância global de problemas de doenças de origem alimentar
pode ter um papel importante na detecção precoce e na advertência, assim
como na rápida investigação e controle dos problemas.
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61
5 CAUSAS DA CONTAMINAÇÃO DE ALIMENTOS
Existe um grande número de fatores que contribuem para tornar um
alimento inseguro, causando toxinfecções àquelas pessoas que os ingerem.
As principais causas podem ser resumidas como:
controle inadequado da temperatura durante o cozimento, o
resfriamento e estocagem;
higiene pessoal insuficiente;
contaminação cruzada entre produtos cruz e processados;
monitoramento inadequado dos processos.
Esses fatores podem ser reduzidos consideravelmente por meio de
treinamento adequado da equipe e implementação do sistema APPCC
combinado com a avaliação de riscos (Tabela 6).
Tabela 6 . Fatores que contribuem para a ocorrência de surtos de doenças de
origem alimentar*.
Fatores de contribuição Percentagema
Fatores re lacionados ao crescimento microbiano Estocagem à temperatura ambiente Resfr iamento inadequado Preparação do a l imento muito longe do lugar onde será servido Espera em ambiente e temperatura inadequada Uti l ização de sobras Descongelamento inadequado e es tocagem subseqüente imprópr iaProdução de a l imento em excesso
43 32 41 12 5 4
22 Fatores re lacionados à sobrevivência microbiana
Aquecimento imprópr io Cozimento inadequado
17 13
Fatores re lacionados à contaminação Manipuladores de a l imentos Alimentos processados contaminados não-enlatados Alimentos cruz contaminados Contaminação cruzada Limpeza inadequada dos equipamentos Fontes duvidosas Alimentos enlatados contaminados
12 19 7
11 7 5 2
a A percentagem excede o to ta l de 100, pois os fa tores que normalmente contr ibuem para a ocorrência de enfermidades de or igem al imentar são múlt ip los .
Fonte : Forsythe (2002)
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62
A chave para a produção de alimentos seguros é produzir alimentos
microbiologicamente estáveis. Isto quer dizer que nenhum microrganismo do
alimento vai se multiplicar até doses infecciosas. De maneira ideal, é
importante que estejam inativados e que não haja toxinas.
6 DOSE INFECTANTE
A dose infectante refere-se ao número de microrganismos
necessários para causar a enfermidade, mas, para a maioria das bactérias, a
questão sobre a dose infectante mínima não pode ser respondida facilmente.
Em primeiro lugar, deve-se ter em mente que os consumidores existem grupos
especiais de risco – crianças, idosos, mulheres grávidas e pessoas
imunodeprimidas – que podem adoecer quando expostas a um número menor
de microrganismos patogênicos do que o necessário para causar enfermidade
em um adulto sadio (Tabela 7).
Tabela 7 . Resposta clínica de adultos a diferentes doses de desafio com
patógenos entéricos.
Organismo Dose de desafio (células)
Shigella dysenteriae 101-104
Shigella flexneri 102-109
Vibrio cholerae 103-109
Salmonella Typhi 104-109
Salmonella spp. 105-101 0
Escherichia coli patogênica 106-101 0
Clostridium perfringens 108-109
Yersinia enterocolitica 109
Fonte: HACCP (2001)
Além disso, há vários fatores fisiológicos que influenciam a dose
infectante mínima, como grau de acidez gástrica, conteúdo gástrico,
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63
microbiota intestinal, e, não menos importante, o estado imunológico da
pessoa. Este estado, por sua vez, é influenciado pela imunidade de infecções
prévias, pelo estado nutricional e pelo estresse.
6.1 VARIÁVEIS DO HOSPEDEIRO
Idade;
Estado geral de saúde;
Gravidez;
Uso de medicamentos – com ou sem prescrição médica;
Distúrbios metabólicos;
Alcoolismo, cirrose, hemocromatose;
Quantidade de alimento ingerido;
Variação de acidez gástrica: uso de antiácidos, variação natural,
acloridria;
Distúrbios genéticos;
Estado nutricional;
Imunocompetência;
História pregressa cirúrgica;
Ocupação.
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64
7 MICRORGANISMOS CAUSADORES DE ENFERMIDADES DE ORIGEM ALIMENTAR
7.1 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: BACTÉRIAS
1 Campylobacter jejuni, C. coli .
Os Campylobacter são bastonetes gram negativos, reconhecidos
como patógenos animais, sendo considerados como patógenos humanos
somente há 15 ou 20 anos. São encontrados em aves domésticas, gado, suínos,
ovinos, roedores e pássaros. As rotas da infecção passam pela água
contaminada, leite e carne. Os fungos são as maiores fontes potenciais de
Campylobacter infeciosos.
As características de enterites causadas por Campylobacter são:
doença semelhante à gripe, dores abdominais, febre e diarréia.
O período de incubação é de 2 a 10 dias, perdurando por cerca de
uma semana.
O Campylobacter pode facilmente causar contaminação cruzada em
alimentos processados. A dose infecciosa é de apenas mil células. O C. jejuni
é rapidamente destruído por um cozimento a 55 a 60ºC, por vários minutos.
2 Salmonella spp.
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae. São
gram negativos, anaeróbios facultativos, não formam esporos e têm forma de
bastonetes curtos. A temperatura ótima de crescimento é de aproximadamente
38ºC e a temperatura mínima é de 5ºC. Como não formam esporos, são
relativamente termosensíveis, podendo ser destruídos a 60ºC por 15 a 20
minutos.
Existem mais de 2.5001 sorotipos de salmonelas, dentre os quais
1.478 pertencem à subespécie I, incluindo Salmonella sorotipo Typhi.
Mudanças significativas ocorrem na nomenclatura e taxonomia das salmonelas
nos últimos anos, baseadas, principalmente, nas suas características
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65
bioquímicas. O gênero Salmonella está dividido em duas espécies Salmonella
enterica e Salmonella bongori , sendo a primeira subdividida em seis
subespécies.
Essas enterobactérias são transmitidas ao homem, principalmente,
por meio de consumo de alimentos contaminados por fezes de animais ou
humanas.
Os sintomas característicos de doenças de origem alimentar
causadas por Salmonella são: diarréia, náuseas, febre branda e calafrios,
algumas vezes, vômitos, dor de cabeça e fraqueza.
O período de incubação antes da doença é de cerca de 16 a 72 horas.
A enfermidade é, normalmente, autolimitante e persiste durante 2 a 7 dias. A
pessoa infectada excretará grandes quantidades de Salmonella pelas fezes
durante o período da doença.
A dose infecciosa varia de acordo com a idade e a saúde da vítima,
com o alimento e ainda com a linhagem da Salmonella . As doses infecciosas
podem variar de 20 até 106 células.
Uma ampla variedade de alimentos contaminados é associado às
salmoneloses, incluindo carne bovina crua, aves domésticas, ovos, leite e
derivados, peixes, camarões, perna de rã, fermentos, cocos, molhos, temperos
para salada etc.
A contaminação do alimento ocorre devido ao controle inadequado
de temperatura, de práticas de manipulação ou por contaminação cruzada de
alimentos crus com alimentos processados. O microrganismo se multiplica no
alimento até atingir a dose infecciosa.
3. Shigella spp.
A Shigella é uma bactéria altamente contagiosa que coloniza o trato
intestinal. É bastante similar a E. coli , mas pode ser diferenciada por não
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produzir gás a partir de carboidratos e por ser lactose negativa. A Shigella se
propaga por contato direto e indireto com indivíduos infectados. O alimento
ou a água podem ser contaminados por contato direto ou indireto com
material fecal de pessoas infectadas. A Shigella causa surtos freqüentemente
em creches e asilos.
Os principais sintomas da shigelose são: diarréia branda ou grave,
aquosa ou sanguinolenta, febre, náuseas, podem ocorrer vômitos e dores
abdominais.
Os sintomas aparecem dentro de 12 até 96 horas após exposição à
Shigella; o período de incubação é de, normalmente uma semana. O número
necessário de microrganismos para causar a infecção em adulto é de 10 a 102.
As medidas de controle e prevenção da shigelose de origem
alimentar estão relacionadas com a boa higiene pessoal e educação dos
manipuladores de alimento. A contaminação de alimentos ou água com
Shigella spp indica contaminação recente com fezes humanas, devido a
fragilidade desse microrganismo.
4 Escherichia coli
Escherichia coli é a espécie predominante entre os diversos
microrganismos anaeróbios facultativos que fazem parte da microbiota
intestinal de animais de sangue quente. Pertence à família Enterobacteriaceae
e entre suas principais características destacam-se: bacilos gram negativos
não esporulados, capazes de fermentar glicose com produção de ácido e gás.
A maioria fermenta também a lactose, com produção de ácido e gás.
As linhagens patogênicas de E. coli são divididas de acordo com os
sintomas clínicos nos seguintes grupos.
E. coli enterotoxigênica (ETEC)
E. coli enteropatogênica (EPEC)
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E. coli enterohemorrágica (EHEC)
E. coli enterogregativa (EAggEC)
E. coli enteroinvasora (EIEC)
E. coli difusamente adesiva (DAEC)
A importância da E. coli como patógeno humano tem sido
reconhecida desde seu descobrimento, 1885, pelo Dr. Theodor Escherich. Está
relacionada com casos de diarréias, principalmente infantil , com colites
hemorrágicas, disenterias, infecções da bexiga, dos rins, infecções de feridas
cirúrgicas, septicemia, síndrome urênico-hemolítica. Algumas destas
enfermidades terminam em óbitos.
Recentemente, a importância da E. coli foi relacionada com a
presença de cepas produtoras de citotoxina Vero (VTEC), do sorotipo O1 5 7:H7
que tem ocasionando surtos de toxinfecções alimentares com morbilidade e
mortalidade.
A E. coli O1 5 7:H7 é uma cepa entero-hemorrágica (EHEC) implicada
em surtos de DVAs, quando se ingerem alimentos mal cozidos e por
transmissão de pessoa a pessoa.
Os principais sintomas da enfermidade são dores abdominais,
diarréia sanguinolenta, edema da mucosa do cólon, após um a dois dias de
incubação. A enfermidade dura aproximadamente oito dias.
O gado é um reservatório natural de EHEC, razão pela qual os
alimentos de origem animal, principalmente a carne bovina, parecem ser o
principal veículo desse patógeno. Diversos surtos de colite hemorrágica
ocorridos nos Estados Unidos, Canadá e Japão foram claramente associados
com consumo de hambúrgueres.
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5 Listeria monocytogenes
A Listeria é uma bactéria gram positiva, que não forma esporos,
cresce entre 0 e 42ºC. A pasteurização é suficiente para destruir o organismo.
O gênero é dividido em oito espécies, dentre as quais a L. monocytogenes é a
que causa maior preocupação com enfermidades causadas por alimentos. Já
foi encontrada em uma variedade de alimentos, tanto crus como processados,
onde pode sobreviver e se multiplicar rapidamente durante a estocagem. Entre
esses alimentos, incluem-se leite e queijo supostamente pasteurizados, carnes,
vegetais crus, frutos do mar e peixes.
Sua capacidade de crescer em temperaturas tão baixas quanto 3ºC
permite multiplicação em alimentos refrigerados.
A L. monocytogenes é responsável por infecções oportunistas,
infectando, mulheres grávidas, recém-nascidos e idosos.
Os sintomas da listeriose são: meningite, encefalite e septicemia;
pode levar ao aborto, nascimento de feto morto ou prematuro quando a mulher
grávida é infectada no segundo e terceiro trimestres.
A dose infectiva de L. monocytogenes é desconhecida. O período de
incubação é excessivamente longo: de 1 a 90 dias.
6 Staphylococcus aureus
A espécie Staphylococcus aureus é um microrganismo muito
conhecido pela sua patogenicidade ao homem e outros animais. Foi estudada
pela primeira vez por Denys em 1894 e, posteriormente por Barber, em 1914.
Somente em 1930 foi definitivamente reconhecida a importância dos
estafilococos na intoxicação alimentar.
O gênero Staphylococcus possui mais de trinta espécies. A produção
de enterotoxina está associada principalmente à espécie S. aureus , embora
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outras espécies como S. intermedius e S. hyicus também tenham sido
reconhecidas como produtoras.
O S. aureus é um dos agentes patogênicos mais comuns, e é
responsável por severas infecções em humanos. Está amplamente distribuído
na natureza e os humanos e os animais são seus principais reservatórios.
São cocos gram positivos, pertencentes à família Micrococaceae.
São facultativos anaeróbios, com maior crescimento sob condições aeróbias,
quando então, produzem catalase.
S. aureus causa intoxicação provocada pela ingestão do alimento
que apresenta a toxina pré-formadora. O período de incubação de um surto
varia, geralmente, de 30 minutos a oito horas, sendo a média de duas a quatro
horas, após a ingestão do alimento contaminado.
Os principais sintomas são: náuseas, vômitos, cãibras abdominais
(geralmente bem dolorosas), diarréias e sudorese, dores de cabeça, calafrios e
a queda de pressão arterial.
Os Staphylococcus estão presentes nas vias nasais e na garganta,
além do cabelo e pele. Apesar dos manipuladores de alimentos serem
normalmente as principais fontes de contaminação dos alimentos, quando há
surtos, os equipamentos e as superfícies também podem ser a fonte das
contaminações. Os alimentos normalmente associados às intoxicações são
carnes e produtos de carne, frangos e produtos de ovos, saladas como as de
atum, galinha, batata e macarrão, produtos de panificação como creme, tortas
de creme, leite ou produtos lácteos.
7 Clostridium perfringens
O Clostridium perfringens é um bastonete anaeróbio, gram positivo,
formador de esporos. É amplamente distribuído no ambiente e freqüentemente
encontrado no intestino de humanos e de animais.
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As características de intoxicações causadas por Cl. perfringens são:
dor abdominal, náusea, diarréia aguda, sintomas que aparecem de 8 a 12 horas
após a ingestão do microrganismo.
A forma mais comum da intoxicação é caracterizada por dores
abdominais intensas e diarréias que iniciam 8 a 12 horas após o consumo do
alimento contendo grande quantidade do microrganismo, o qual produz as
toxinas causadoras da enfermidade.
As carnes, os produtos cárneos e os molhos são alimentos mais
freqüentemente implicados. Os esporos germinam e a bactéria se multiplica
até níveis causadores de enfermidades durante os períodos de refrigeração e
estocagem.
O controle desse microrganismo é atingido principalmente por meio
de cocção e do resfriamento.
8 Clostridium botulinum
O Clostridium botulinum é um bastonete gram positivo, anaeróbio
estrito. Causa uma doença de origem alimentar denominada botulismo.
Trata-se de uma intoxicação alimentar causada pela ingestão de
neurotoxinas pré-formadoras. O microrganismo é encontrado por toda a
natureza. Existem quatro espécies clinicamente importantes: Cl. botulinum ,
Cl. perfringens causam enfermidades relacionadas à ingestão de alimentos.
Existem sete tipos basicamente pela antigenicidade da toxina. Os
tipos A, B, E e F são os principais causadores de botulismo humano (tipos C e
D em animais). Várias neurotoxinas foram identificadas e estão entre as
toxinas mais potentes conhecidos pelo homem. O microrganismo forma
esporos, os quais podem ser transmitidos pelo ar e contaminar jarras abertas
ou latas. Uma vez fechadas, as condições anaeróbias favorecem o crescimento
dos esporos e a produção de toxinas.
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71
Os sintomas do botulismo são: visão dupla, náusea, vômito, fadiga,
tonturas, dor de cabeça, garganta e nariz secos, falhas respiratórias.
O botulismo é associado com alimento enlatado de baixa acidez
(principalmente aquele de produção caseira), vegetais, peixe e produtos de
carne. Também é associado com mel. O botulismo infantil é mais brando do
que a versão adulta. Essa bactéria não pode crescer em alimentos ácidos ou
acidificados com pHs menores que 4,6.
9 Bacillus cereus
O B. cereus é um patógeno alimentar formador de esporos que foi
isolado pela primeira vez em 1887. Os esporos podem sobreviver a muitos
processos de cocção. O microrganismo cresce bem em alimentos cozidos
devido à inativação da microbiota competidora. O B.cereus é um bastonete
gram positivo, aeróbio facultativo, é encontrado por toda a natureza, sendo
isolado do solo, da vegetação, água e dos pêlos de animais. É comumente
encontrado em baixos níveis nos alimentos (<102 UFC/g), os quais são
considerados aceitáveis. As intoxicações alimentares iniciam quando o
alimento é sujeito a abusos de tempo-temperatura, propiciando que um nível
baixo de organismos se multiplique até níveis (>105 UFC/g) significativos
(necessários para intoxicação).
Existem dois tipos reconhecidos de intoxicações alimentares
causadas por B. cereus : o diarréico e o emético. Ambos são autolimitantes e a
recuperação ocorre dentro de 24 horas. O B. cereus produz toxinas diarréicas
durante o crescimento no intestino delgado humano, enquanto as toxinas
eméticas são pré-formadoras no alimento.
Os sintomas da intoxicação alimentar causada por B. cereus são:
náuseas, vômitos, dores abdominais e possível diarréia.
Uma grande variedade de alimentos, incluindo carnes, leite,
vegetais e peixes, foi associada ao tipo diarréico de intoxicação. Os surtos do
tipo emético são geralmente associados com produtos de arroz, no entanto,
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72
outros alimentos ricos em amido, como batatas, massas e produtos de queijos.
As misturas para alimentos como molhos, pudins, sopas, massas folhadas e
saladas, são freqüentemente relacionadas a surtos alimentares. A presença de
um grande número de B. cereus (>106 organismos/g) em alimentos é um
indicativo do crescimento ativo e proliferação do microrganismo e é um
perigo potencial à saúde.
10 Vibrio parahaemolyticus
Este microrganismo foi isolado pela primeira vez em 1951. É
atualmente reconhecido como o maior causador de gastrenterites de origem
alimentar no Japão. Isso porque o microrganismo é associado com o consumo
de alimentos marinhos.
Os sintomas típicos de doenças alimentares causadas por V.
parahaemolyticus são: diarréias, dores abdominais, náuseas, vômitos, dores
de cabeça, febre e tremores.
O organismo está presente, normalmente, em quantidade inferior a
103 UFC/g em peixes e frutos do mar, exceto em águas mornas, onde a
contagem pode aumentar para 106 UFC/g. As infecções causadas por esse
microrganismo foram associadas ao consumo de peixes e frutos do mar crus,
mal cozidos ou cozidos e recontaminados. A refrigeração inadequada de
frutos do mar contaminados com esse microrganismo permite a sua
proliferação, o que aumenta a possibilidade da infecção. O organismo é
bastante sensível ao calor, e os surtos devem-se, freqüentemente, a processos
de manipulação inadequados e a abusos de temperaturas. O controle desse
microrganismo pode ocorrer por meio da prevenção da sua multiplicação após
a pesca pelo resfriamento (25ºC) e pela cocção com temperatura interna maior
do que 65ºC. O isolamento de qualquer espécie de Vibrio a partir de alimentos
cozidos indica práticas de higiene inadequadas, já que o microrganismo é
destruído rapidamente pelo calor.
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73
11 Vibrio vulnificus
O V. vulnificus foi relatado pela primeira vez em 1976 como víbrio
lactose positivo. O V. vulnificus significa causador de feridas, o que reflete a
habilidade do microrganismo em invadir e destruir. O microrganismo é,
portanto, associado com infecções que originam feridas e septicemias fatais.
Os sintomas típicos da doença alimentar são: febre, tremores, náuseas, lesões
da pele.
O início dos sintomas ocorre cerca de 24 horas (a partir de 12 horas
até vários dias) após a ingestão de frutos do mar cruz contaminados
(especialmente ostras) por pessoas vulneráveis. Os indivíduos mais
susceptíveis às infecções incluem idosos, pessoas imunocomprometidos e
aqueles que sofrem de distúrbios crônicos do fígado e de alcoolismo crônico.
A mortalidade ocorre em 40 a 60% dos casos.
O V. vulnificus é isolado a partir de moluscos e águas li torâneas. O
microrganismo é raramente isolado de águas do mar com temperaturas
inferiores a 10 a 15ºC, mas os números aumentam quando a temperatura da
água é superior a 21ºC. A principal rota de infecção é a ingestão seguida de
feridas e septicemia. A principal forma de prevenção é evitar o consumo de
moluscos crus, em particular ostras, por indivíduos imunocomprometidos.
12 Brucella melitensis , Br. Abortus e Br. suis
A Brucella é um cocobacilo gram negativo, estritamente aeróbio, o
qual causa a brucelose. Esse microrganismo encontra-se em animais e causa
infecções acidentais em humanos. As quatro espécies que causam infecções
em humanos são denominadas a partir do animal em que são comumente
isoladas: Br. abortus (gado), Br. suis (suíno), Br. melitensis (bodes) e Br.
canis (cães). O gado e as indústrias de laticínios são a principal fonte de
contaminação. A Brucella pode entrar no corpo pela pele ou pelos tratos
respiratório ou digestivo.
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74
No mundo, a brucelose mantém-se como uma das principais fontes
de distúrbios em humanos e animais domésticos.
A prevenção da brucelose depende da sua erradicação ou do
controle em animais hospedeiros, precauções higiênicas para limitar a
exposição a infecções por meio de atividades ocupacionais e tratamento
térmico de produtos lácteos e outros alimentos potencialmente contaminados.
13 Aeromonas hydrophila , A. caviae e A. sobria
Essas espécies estão presentes em ambientes de água doce e em
águas salgadas. Têm sido freqüentemente encontradas em peixes e frutos do
mar e em amostras de carne vermelha (gado, porco e ovelha) e de frango no
mercado. Crescem em temperaturas que variam de 0º a 45ºC, sendo que
espécies eu determinam patogenia humana (mesófilos) crescem entre 10º e
42ºC.
Algumas espécies são capazes de causar doenças em peixes e
anfíbios, bem como em humanos, os quais adquirem infecções através de
feridas abertas ou pela ingestão de organismos presentes em alimentos ou
água, podem causar gastrenterites em indivíduos saudáveis de septicemia em
indivíduos com o sistema imunológico debilitado.
Os sintomas gerais de gastrenterites causadoras são: diarréias, dores
abdominais, náuseas, tremores e dores de cabeça, doenças similares a
disenteria, colite, sintomas adicionais que incluem septicemia, meningite,
endocardite e úlceras córneas.
7.2 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: EUCARIOTOS
1 Cyclospora cayetanensis
Esse parasita ocorre em águas tropicais no mundo todo e causa uma
diarréia aquosa e explosiva em humanos. Os primeiros casos reportados em
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humanos ocorreram em 1979. Inicialmente, esse agente foi associado à água
contaminada, mas também foi associado ao consumo de alface, framboesa e
manjericão fresco. O período de incubação é de uma semana após o consumo
do alimento infectado. O Cyclospora infecta o intestino delgado.
Os sintomas típicos de intoxicações causadas por Cyclospora são:
diarréia aquosa, perda de apetite, substancial perda de peso, inchaço, aumento
de flatulência, dores abdominais, náuseas, vômitos, dores musculares, febre
baixa e fadiga.
2 Cryptosporidium parvum
O modo de transmissão do patógeno é pela rota fecal-oral, incluindo
alimentos e água. Os hospedeiros incluem humanos e animais domésticos,
inclusive o gado. Podem sobreviver no ambiente por longos períodos, onde
permanecem infecciosos e resistem a químicos usados para purificar água
para uso humano. Podem, contudo, ser removidos do sistema de água tratada
por meio de fil tragem. Os principais sintomas em humanos são febre, diarréia,
dores abdominais e anorexia. A doença, geralmente, ocorre por menos de 30
dias, mas pode se prolongar em indivíduos imunodeficientes e levar à morte.
3 Taenia saginata e T. solium
As infecções por vermes achatados em humanos são causadas devido
à ingestão de vermes na carne de boi (Taenia saginata) e na carne de porco
(T. solium). Ambos os organismos são, obrigatoriamente, parasitas do
intestino humano. Tais vermes têm um ciclo de vida complexo. A forma larval
é ingerida através de carnes de boi ou porco infectado e se desenvolve até a
forma adulta (podendo alcançar vários metros de comprimento).
Interromper o ciclo de vida do organismo é a principal medida de
controle, o que pode ser feito pela inspeção completa da carne e do cozimento
adequado (>60ºC).
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4 Toxoplasma gondii
O T. gondii é o agente causador da toxoplasmose que pode ser
encontrado em carnes mal cozidas e cruas tais como porco, cordeiro, carne de
boi e de aves. Os hospedeiros primários são os gatos, sendo que a infecção
humana se dá quando há contato com as suas fezes. A infecção também ocorre
pela ingestão de carne mal cozida ou crua de hospedeiros intermediários tais
como roedores, suínos, gado, cabra, galinha e pássaros. O microrganismo
causa hidrocefalia e cegueira em crianças, enquanto, em adultos, os sintomas
são menos graves. Em indivíduos imunodeprimidos, pode causar hepatite,
miocardite ou combinações dessas doenças. O cozimento apropriado das
carnes destrói o microrganismo.
5 Micotoxinas
As micotoxinas são produtos tóxicos de certos fungos microscópicos
os quais, em algumas circunstâncias, desenvolvem-se sobre ou em produtos
alimentícios de origem animal ou vegetal. Centenas de micotoxinas foram
identificadas e são produzidas por cerca de 200 variedades de fungos.
As micotoxinas são metabólitos secundários que foram responsáveis
por grandes epidemias em humanos e animais. As micotoxinas são produzidas
pelos gêneros de fungos Aspergillus , Fusarium e Penicill ium . Esses fungos
são encontrados no ambiente e fazem parte da flora normal das plantas.
Há quatro tipos de toxicidade:
Aguda, resultando em danos aos rins ou fígado;
Crônica, resultando em câncer de fígado;
Mutagênica, causando danos no DNA;
Teratogênica, causando câncer em crianças por nascer.
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Aflatoxinas: As aflatoxinas são compostos tóxicos que são
produzidos por certas linhagens dos fungos Aspergillus flavus e Aspergillus
parasiticus sob condições favoráveis de temperatura e umidade. Esses fungos
crescem em certos alimentos e rações, resultando na produção de aflatoxinas.
Têm sido encontradas em nozes, amendoins e outras sementes oleosas, milho
e semente de algodão.
As aflatoxinas de maior interesse são caracterizadas como B1, B2,
G1 e G2. A aflatoxina B1 é a mais comumente encontrada e é a mais tóxica.
As aflatoxinas produzem necrose aguda, cirrose e carcinoma no
fígado em diversas espécies animais. A toxicidade pode ser influenciada por
fatores ambientais, nível de exposição e duração à exposição, idade, saúde e
estado nutricional.
Ocratoxinas: As ocratoxinas são produzidas por Penicillium
verrusocum e Penicillium viridicatum . São encontradas principalmente nos
cereais, porém níveis significativos de contaminação podem ocorrer em suco
de uva, vinho tinto, café, cacau e frutas secas.
As ocratoxinas são potencialmente nefróticas e carcinogênicas,
sendo a sua potência variável de acordo com as espécies e o sexo.
Fumosina: As fumosinas são um grupo de micotoxinas produzidas
pelo Fusarium , as quais têm ocorrência mundial no milho e produtos
derivados. As fumosinas são bastante estáveis durante o processamento de
alimentos.
Zearalenona: A zearalelona é um metabólito fúngico produzido
principalmente por Fusarium graminearium e F. culmorum , os quais
colonizam milho, cevada, trigo, aveia e sorgo. Estes compostos podem causar
graves problemas de reprodução infertil idade em animais, especialmente em
suínos.
O controle de micotoxina é muito difícil , uma vez que se deve
prevenir a invasão através das sementes pelo fungo, do solo ou mesmo do ar
antes da colheita. A secagem e a estocagem adequadas são processamentos
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muito úteis, mostrando boas práticas de gerenciamento dos locais de
produção. A seleção de grãos com luz ultravioleta (para evidenciar as
aflatoxinas) é utilizada na produção de milho, semente de algodão e figo.
Príons: As encefalopatias espongiformes transmissíveis em animais
e humanos são causadas por príons (partícula de proteína infecciosa). Os
príons são formas modificadas de uma proteína norma. Essas proteínas
acumulam-se no cérebro, causando buracos ou placas e os subseqüentes
sintomas clínicos, levando à morte.
Na encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca) há
evidências de que o agente infeccioso se trata de um príon.
7.3 PATÓGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: VÍRUS
1 Vírus Norwalk e semelhantes ao Norwalk
Os vírus Norwalk e os semelhantes causam diarréia e vômitos. São
patógenos humanos.
As gastrenterites devidas aos vírus Norwalk são autolimitantes e
moderadas.
As características dessas gastrenterites são: náuseas, vômitos,
diarréias, dores abdominais, também podem ocorrer dores de cabeça, febre,
tremores, dores musculares e fraquezas.
A dose infecciosa é desconhecida, mas é presumivelmente
pesqueira. Um moderado e curto mal-estar geralmente se desenvolve dentro
de 24 a 48 horas após a ingestão de alimentos ou água contaminada e dura de
24 a 60 horas.
As gastrenterites devidas aos vírus Norwalk são transmitidas por via
fecal-oral através de água e alimentos contaminados. A água é a fonte mais
comum de surtos, que podem ser provenientes de origem municipal, poços,
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lagos de recreação e piscinas. Os moluscos e os ingredientes para salada são
os alimentos mais comumente infectados.
O controle é feito evitando que alimentos sejam contaminados com
água contaminada e manipuladores infectados.
2 Hepatite A
O vírus da hepatite A (HAV) tem sido isolado e coletado de várias
partes do mundo. O período de incubação para o HAV varia de 10 a 50 dias
(com média de 30 dias). O período de comunicabilidade se estende do começo
da incubação até por volta de uma semana do início do desenvolvimento de
icterícia. O maior perigo de transmissão da doença ocorre durante a metade
do período de incubação até bem antes dos primeiros sintomas.
Sintomas típicos da hepatite A são: febre, arrepios, mal-estar, perda
de apetite, náuseas, icterícia, urina de cor escura, fezes de cor mais clara,
dores abdominais na área do fígado.
O HAV é excretado nas fezes de pessoas infectados e poder produzir
doença quando indivíduos susceptíveis consomem alimentos ou água
contaminados. As frutas e suco de frutas, leite e produtos lácteos, vegetais,
saladas, moluscos e as saladas são as fontes mais freqüentes.
A contaminação de alimentos por intermédios de manipuladores
infectados é comum. O HAV possui uma distribuição mundial, ocorrendo
tanto de maneira epidêmica quanto esporádica. É transmissível principalmente
por meio de contato pessoa-pessoa por contaminação fecal, porém também
podem ocorrer fontes epidêmicas como alimentos ou águas contaminadas.
As condições higiênico-sanitárias deficientes e a superpopulação
facilitam a transmissão. Os surtos de HAV são comuns em instituições, casas
superlotadas e prisões.
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3 Rotavírus
Os rotavírus são classificados como pertencentes à família
Reoviridae. Seis grupos sorológicos foram identificados, três dos quais (A, B
e C) infectam humanos. As gastrenterites causadas por rotavírus são
autolimitantes, variam de brandas a graves e são caracterizadas por vômitos,
diarréia aquosa e febre baixa. Resume-se que a dose infecciosa deva ser de 10
a 100 partículas virais infecciosas. Como uma pessoa com diarréia causada
por rotavírus excreta grandes quantidades de vírus (108-101 0 partículas
infecciosas/mL de fezes), doses infecciosas podem ser facilmente adquiridas
pelo contato com mãos, objetos e utensílios contaminados.
Os rotavírus são transmitidos por rota fecal-oral. A contaminação
pessoa-pessoa é disseminada por mãos contaminadas e, provavelmente, é o
meio mais importante pelo qual esse vírus é transmitido em pequenas
comunidades tais como clínicas geriátricas e pediátricas, berçários e
residências. Os manipuladores contaminados podem contaminar alimentos que
não serão posteriormente cozidos como, por exemplo, saladas, frutas e
aperitivos. Os rotavírus são bastante estáveis no ambiente e têm sido
encontrados em amostras estuarinas.
A incidência de infecção de rotavírus é similar em países com níveis
altos e baixos de padrões de saúde.
Os rotavírus do grupo A são endêmicos no mundo inteiro. Ele é o
causador de diarréias graves em crianças e inclui cerca da metade dos casos
que necessitam de hospitalização.
7.4 INTOXICAÇÕES CAUSADAS POR FRUTOS DO MAR E MOLUSCOS
Existem muitas intoxicações originadas a partir do consumo de
frutos do mar e moluscos. Podem ser causadas por ciguatera, uma toxina
proveniente de microalgas, as quais ficam acumuladas na carne do peixe.
Outro caso é a intoxicação escombróide, que se deve ao consumo de carne de
peixe contendo altos níveis de histamina. Esse composto é proveniente da
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ação da histidina desidrogenase bacteriana de peixes como a cavala. As
bactérias envolvidas são Morganella morganis , Proteus spp., Hafnia e
Klebsiella pneumoniae .
As enfermidades relacionadas aos moluscos são causadas por um
grupo de toxinas produzidas por algas (dinoflageladas), na maioria dos casos,
da qual os moluscos se alimentam. As toxinas são acumuladas e, algumas
vezes, metabolizadas pelos moluscos.
A ingestão de moluscos contaminados resulta em uma ampla
variedade de sintomas que dependem das toxinas presentes, das suas
concentrações no molusco e da quantidade consumida do molusco
contaminado. As intoxicações paralisantes por molusco são melhor
caracterizadas do que as intoxicações diarréicas. Todos os moluscos
(alimentados por fil tração) são potencialmente tóxicos. As do tipo paralisante
são geralmente associadas a mexilhões, moluscos e vieiras.
1 Intoxicações Causadas por Ciguatera
Esse tipo de intoxicação caracteriza-se por: irritação nos lábios,
l íngua e garganta, dor de cabeça, dor forte nos braços, pernas e olhos, visão
dupla, lesões na pele (bolhas, coceiras e eritema).
A maioria dos casos apresenta recuperação que leva de dias a semanas, sendo
a mortalidade baixa.
2 Intoxicações Escombróide
Os sintomas desse tipo de enfermidade são: gosto metálico, picante
ou agudo na boca, dor de cabeça intensa, tonturas, náuseas e vômitos, suor
facial e vermelhidão, dor epigástrica, pulsação rápida e fraca, coceira na pele,
queimação na garganta e dificuldade para engolir.
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Normalmente a recuperação ocorre dentro de 12 horas. As
fatalidades são raras e, geralmente, são devidas a outros fatores de
predisposição.
3 Intoxicações Paralisantes Causadas por Moluscos
Os sintomas desse tipo de intoxicação são principalmente
neurológicos e incluem formigamentos, queimação, sonolência, fala
incoerente e paralisia respiratória. A intoxicação paralisante causada por
moluscos se deve a 20 toxinas produzidas por dinoflagelados.
4 Intoxicações Diarréicas Causadas por Moluscos
Essa intoxicação é, normalmente, um distúrbio gastrintestinal
brando, caracterizado por náuseas, vômito, diarréia e dor abdominal seguida
por tremores, dor de cabeça e febre. Seu início pode ocorrer entre 30 minutos
até três horas, dependendo da dose da toxina ingerida. Os sintomas podem
durar de 2 a 3 dias. A recuperação é completa, sem efeitos posteriores, sendo
que a doença, geralmente, não impõe riscos à vida do infectado.
5 Intoxicações Neurotóxicas Causadas por Moluscos
Esse tipo de intoxicação causa sintomas tanto neurológicos quanto
intestinais, incluindo formigamentos e entorpecimento dos lábios, l íngua e
garganta, dores musculares, tonturas, sensações intercaladas de calor e frio,
diarréia e vômitos. O início dos sintomas pode ocorrer desde alguns minutos
até poucas horas. A duração da enfermidade é razoavelmente pequena, de
algumas horas a vários dias. A recuperação é completa com poucos efeitos
posteriores: nenhuma fatalidade foi registrada. A intoxicação ocorre devido à
exposição a poliésteres chamados de brevetoxinas, produzidas por
dinoflagelados.
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6 Intoxicação Amnésica Causada por Moluscos
Esse tipo de intoxicação é caracterizado por desordens
gastrintestinais (vômitos, diarréia, dores abdominais) e problemas
neurológicos (confusão e perda de memória, desorientação, coma). Os
sintomas gastrintestinais ocorrem dentro de 24 horas, enquanto os de caráter
neurológico ocorrem em 48 horas.
A toxinose é particularmente séria em pacientes idosos, incluindo
sintomas remanescentes à Doença de Alzheimer. Todas as fatalidades, até
agora, envolveram pacientes idosos. A intoxicação é causada pela presença de
um aminoácido incomum, o ácido dimóico, o qual contamina os moluscos por
meio de diatomáceas.
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CCAAPPÍÍTTUULLOO VVII
MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS IINNDDIICCAADDOORREESS
termo microrganismo indicador pode ser aplicado a
qualquer grupo taxonômico, fisiológico ou ecológico de
microrganismos, cuja presença ou ausência proporciona
uma evidência indireta referente a uma característica particular do histórico
da amostra.
O Normalmente, são associados a microrganismos de origem
intestinal. Outros grupos podem ser usados como indicadores em
determinadas situações. Por exemplo, a presença de bactérias gram negativas
em alimentos tratados termicamente é um indicativo de tratamentos térmicos
inadequados.
Microrganismos indicadores vêm sendo utilizados na avaliação da
qualidade microbiológica da água há longo tempo e mais recentemente na de
alimentos devido às dificuldades encontradas na detecção de microrganismos
patogênicos, como, por exemplo, Salmonella .
Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de
microrganismos, que, quando presentes em um alimento, pode fornecer
informações sobre a ocorrência da contaminação de origem fecal, sobre a
provável presença de patógenos ou sobre a deterioração do alimento, além de
poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento,
produção ou armazenamento.
O temo microrganismo indicador foi sugerido por Ingram, em 1977,
para um organismo marcador cuja presença indicasse a possível presença de
um patógeno.
Os microrganismos indicadores são mais comumente utilizados para
avaliar a segurança e a higiene alimentar do que a qualidade.
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De forma ideal, um indicador de segurança alimentar deve
apresentar certas características importantes:
ser detectável de forma fácil e rápida;
ser facilmente distinguível de outros membros da microbiota do
alimento;
possuir um histórico de associações constantes com o patógeno
cuja presença visa a indicar;
estar sempre presente quando o patógeno de interesse estiver
presente;
não deve estar presente como contaminante natural do alimento,
pois assim sua detecção não indicará, necessariamente, a
presença de matéria fecal ou dos patógenos;
estar ausente dos alimentos que são livres de patógenos, com
exceção, talvez, de números mínimos;
possuir características e taxas de crescimento equivalentes às do
patógeno.
No entanto, nem sempre todas essas características são observadas.
Os microrganismos indicadores usualmente utilizados são:
coliformes, Escherichia coli , enterobactérias, enterococos.
Os coliformes são bactérias gram negativas, anaeróbias facultativas
em forma de bastonetes. Os critérios util izados para identificação são a
produção de gás proveniente da glicose e outros açúcares e a fermentação da
lactose até a produção de ácido e gás em período de 24 a 48 horas a 37ºC. o
grupo dos coliformes inclui espécies do gênero Escherichia , Klebsiella ,
Enterobacter e Citrobacter , além de E. coli .
Os coliformes foram historicamente util izados como
microrganismos indicadores para servir como uma medida de contaminação
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fecal e, assim medir a presença potencial de patógenos entéricos em água.
Contudo, como a maioria dos coliformes é encontrada no meio ambiente,
essas bactérias possuem limitada relevância higiênica. Devido ao fato de os
coliformes serem destruídos com certa facilidade pelo calor, sua contagem
pode ser útil em testes de contaminações pós-processamento.
1 INDICADORES DE CONTAMINAÇÃO FECAL OU DA QUALIDADE HIGIÊNICO-
SANITÁRIA DO ALIMENTO
O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminação de
origem fecal presente em água foi proposto em 1892, uma vez que esse
microrganismo tem seu habitat no trato intestinal de humanos e animais.
Muitas cepas da bactéria são inofensivas, contudo algumas são patogênicas e
causam doenças diarréicas.
Atualmente, seis t ipos principais de E. coli são classificados em
grupos específicos baseados nos fatores de virulência, mecanismos de
patogenicidade, síndrome clínica e distintos sorotipos O:H. Essas categorias
são E. coli enteropatogênica (EPEC), enterotoxigênicas (ETEC),
enteroinvasiva (EIEC), difuso aderente (DAEC), enteroagregativa (EAEC) e
entero-hemorrágica (EHEC).
Recentemente, a importância da E. coli foi relacionada com a
presença de cepas produtoras de citotoxina Vero (VTEC), do sorotipo O1 5 7:H7
que tem ocasionado surtos de toxinfecções alimentares com morbilidade e
mortalidade.
O indicador ideal de contaminação fecal deveria preencher, além
dos requisitos anteriormente citados, os seguintes:
ter como habitat exclusivo o trato intestinal do homem e outros
animais;
deveria ocorrer em números muito altos nas fezes;
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deveria haver técnicas rápidas, simples e precisas para a sua
detecção e/ou contagem.
1.1 COLIFORMES TOTAIS
Este grupo é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae ,
são capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a
35º-37ºC por 24-48 horas. São bacilos gram negativos não esporulados.
Fazem parte desse grupo as bactérias do gênero Escherichia ,
Enterobacter , Citrobacter e Klebsiella , além de serem encontrados nas fazes,
também podem persistir longos períodos e se multiplicar em ambientes não
fecais, como vegetais, solo. A presença de coliformes totais no alimento não
indica, necessariamente, contaminação fecal recente. O índice de coliformes
totais é util izado para avaliar as condições higiênicas, sendo que as altas
contagens significam contaminação pós-processamento, l impezas e
sanificações deficientes, tratamentos térmicos ineficientes ou multiplicação
durante o processamento ou estocagem.
Coliformes a 45ºC e Escherichia coli as bactérias pertencentes a
este grupo correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade
de continuar fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas à
temperatura de 45ºC. Nessas condições, em torno de 90% das culturas de E.
coli são positivas. O índice de coliformes a 45ºC ou de E. coli nos alimentos
é empregado como indicador de contaminação fecal, ou seja, condições
higiênico-sanitárias, visto que se estima que a população deste grupo é
constituída de uma alta proporção de E. coli , que tem seu habitat exclusivo no
trato intestinal do homem e de outros animais. Assim, sua presença pode
indicar a possibilidade de ocorrerem outros microrganismos entéricos na
amostra.
Em alimentos como vegetais frescos, o único indicador válido de
contaminação fecal é a E. coli , já que os demais indicadores de contaminação
fecal são encontrados naturalmente nesse tipo de alimento. Em alimentos
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frescos de origem animal, a ocorrência de números elevados de
Enterobactérias pode indicar manipulação sem cuidados de higiene e/ou
armazenamento inadequado.
Em alimentos processados, a presença de um número considerável
de coliformes ou de Enterobactérias pode indicar:
processamento inadequado e/ou recontaminação pós-
processamento, sendo as causas mais freqüentes aquelas
provenientes da matéria-prima, equipamento sujo ou manipulação
sem a devida higiene;
proliferação microbiana que poderia permitir a multiplicação de
microrganismos patogênicos.
Diferenciação dos coliformes
A enumeração dos coliformes pode ser efetuada utilizando métodos
convencionais e métodos rápidos.
O método convencional ainda muito empregado é o método dos
tubos múltiplos que pode ser util izado para estimar o número de coliformes
pela técnica do Número Mais Provável (NMP). Para diferenciação entre os
coliformes fecais dos não-fecais são necessários testes bioquímicos para
identificação das espécies. Esses testes são coletivamente designados como
reações IMVic I indol; M vermelho de metila; Vi reação de
Voges-Proskauer e C citrato. Outros testes também são sugeridos como os
carboidratos e aminoácidos.
1.2 ENTEROCOCOS
A distribuição de Enterococos na natureza é ampla e eles fazem
parte da microbiota normal do homem e de animais, particularmente, do trato
intestinal. São freqüentemente util izados como “indicadores complementares”
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
89
do grupo de coliformes na determinação de contaminação fecal. A relação
existente entre as contagens de coliformes fecais e enterococos fecais pode
indicar se a contaminação recente é de origem humana ou animal.
Apesar das amplas aplicações dos coliformes como indicadores de
poluição fecal, existem controvérsias sobre sua utilização e estudos
epidemiológicos sugerem a contagem de Enterococos como uma alternativa,
principalmente pelo fato destes microrganismos resistirem a várias condições
adversas como salinidade elevada, desidratação, detergentes e desinfetantes,
congelamento, pH ácido e tratamento térmico moderado.
Os enterococos são um grupo de microrganismos que vêm se
destacando nos últimos anos como patógenos oportunistas. Sua biologia e
taxonomia têm passado por alterações significativas ao longo do tempo.
O gênero foi criado em 1984, com a transferência de Streptococcus
faecalis e S. faecium para Enterococcus faecalis e E. faecium .
Os enterococos são cocos gram positivos, anaeróbios facultativos.
As espécies mais encontradas em alimentos são Enterococcus faecalis e E.
faecium .
Apesar das limitações do uso desses microrganismos como
indicadores de contaminação fecal, sua presença em números elevados em
alimentos indica práticas sanitárias inadequadas ou exposição do alimento a
condições que permitiram a multiplicação dos microrganismos.
Para determinação de Enterococcus é usada a técnica dos tubos
múltiplos e contagem em placa.
2 INDICADORES GERAIS DE CONTAMINAÇÃO DO ALIMENTO
São grupos de microrganismos que, quando presentes em números
elevados nos alimentos poderão causar a deterioração e/ou a redução da vida
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
90
de prateleira. Essas contagens fornecem informações gerais sobre as
condições durante o processamento do alimento.
As contagens de bactérias viáveis baseiam-se no número de
bactérias que se desenvolvem em placa com meios de cultura nos quais foram
inoculadas quantidades previamente conhecidas do alimento diluído e,
posteriormente, inoculadas sob determinadas condições ambientais.
3 CONTAGEM PADRÃO DE BACTÉRIAS AERÓBIAS MESÓFILAS (CONTAGEM
PADRÃO EM PLACAS)
Esta contagem detecta, em um alimento, o número de bactérias
aeróbias ou facultativas e mesófilas presentes tanto sob forma vegetativa
quanto esporulada.
A contagem padrão em placas (PCA) tem sido usada como indicador
da qualidade higiênica dos alimentos, fornecendo também idéia sobre seu
tempo útil de conservação. Sua presença em grande número indica:
matérias-primas excessivamente contaminadas;
l impeza e desinfecção de superfícies inadequadas;
higiene inadequada na produção;
condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção
ou a conservação dos alimentos, ou uma combinação destas
circunstâncias.
A deterioração de alimentos pode ser causada pelo crescimento de
microrganismos que levariam a alterações organolépticas. Neste caso,
números elevados são esperados e variam com o tipo de alimento e
microrganismo presente. A maioria dos alimentos apresenta, quando essas
alterações são detectáveis, números superiores a 106UFC/g ou mL do
alimento.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
91
4 CONTAGEM DE BACTÉRIA PSICROTRÓFICAS E TERMÓFILAS
Essas contagens avaliam o grau de deterioração de alimentos
refrigerados ou daqueles submetidos a tratamento térmico.
5 CONTAGEM DE BACTÉRIAS ANAERÓBIAS
Alguns sistemas para contagem de bactérias anaeróbias,
desenvolvidos recentemente, ajudaram essas contagens. Entre esses sistemas,
pode-se citar as jarras especiais que comportam várias placas de Petri em uma
atmosfera livre de oxigênio (anaerobiose).
A presença de bactérias anaeróbias é indicativa de que houve
condições favoráveis para a multiplicação, como por exemplo, por
Clostridium botulinum e Clostridium perfringens .
6 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
O crescimento de bolores e leveduras é mais demorado do que o de
bactérias em alimentos de baixa acidez e alta atividade de água. Portanto,
dificilmente serão responsáveis pela deterioração desses alimentos. Em
alimentos ácidos e de baixa atividade de água, no entanto, o crescimento de
fungos é maior, provocando deterioração com grande prejuízo econômico em
frutas frescas, vegetais e cereais. São também responsáveis pela deterioração
de sucos de frutas, queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva
como picles, quando armazenados em condições inadequadas.
A presença de fungos filamentosos (bolores) e leveduras em índice
elevado nos alimentos pode fornecer várias informações:
condições higiênicas deficientes de equipamentos;
multiplicação no produto em decorrência de falhas no
processamento e/ou estocagem;
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
92
matéria-prima com contaminação excessiva.
A presença desses microrganismos pode tornar-se um perigo à saúde
pública devido à produção de micotoxinas pelos bolores.
Algumas medidas devem ser tomadas por manipuladores de
alimentos suscetíveis a essa contaminação, na tentativa de reduzir ou elimina-
la:
boas práticas de higiene levam à redução da carga de esporos;
esses alimentos devem chegar o mais rapidamente possível ao
consumidor;
o armazenamento de alimentos congelados deve ser a
temperaturas inferiores a -12ºC;
eliminar ou reduzir o contato com o ar através de embalagens,
por exemplo;
adicionar ácidos ou conservadores químicos como benzoatos ou
sorbatos, para retardar o crescimento fúngico.
Baixas contagens de bolores e leveduras são normais em alimentos
frescos e congelados, não sendo, portanto, significativas. Somente quando o
crescimento de bolor for visível ou o alimento apresentar um número elevado
de leveduras, o consumidor será capaz de reconhecer a deterioração. Esta
deterioração por leveduras não é prejudicial à saúde.
7 OUTROS INDICADORES
Staphylococccus a presença de números elevados de S. aureus é
uma indicação de perigo potencial à saúde pública, esse microrganismo
produz uma enterotoxina nos alimentos, chamada de enterotoxina
estafilocócica.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
93
Clostrídios esses microrganismos foram sugeridos como
indicadores de contaminação fecal, mas não são específicos de fezes humanas.
Por serem formadores de esporos, podem persistir nos alimentos quando a
maioria dos microrganismos entéricos foi destruída. Contudo, C. perfringens
e C. botulinum são importantes em toxinfecções de origem alimentar.
Contagem de esporos de termófilos é usada como indicadora da
eficiência de sanificação de certos vegetais.
Contagem de bolores em equipamentos tem sido usada como
indicadora da sanificação de operações de processamento de alimentos. Esses
bolores crescem rapidamente em alimentos que aderiram à superfícies dos
equipamentos e contaminam os alimentos que passam por esse local
contaminado.
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94
PP AA RR TT EE II II ::
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
95
CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIII
MMÉÉTTOODDOOSS DDEE AANNÁÁLLIISSEESS
nalisar amostras de alimentos quanto à presença de
bactérias patogênicas ou deteriorantes, fungos e toxinas é
uma prática padrão para garantir a segurança e a qualidade
do alimento.
AA análise dos alimentos para se verificar quais e quantos
microrganismo estão presentes é fundamental para se conhecer as condições
de higiene em que esse alimento foi preparado, os riscos que esse alimento
pode oferecer à saúde do consumidor e se o alimento terá ou não a vida útil
pretendida. Além disso, a análise laboratorial permitirá determinar o agente
etiológico mais provável no caso de um surto de toxinfecção alimentar. Essa
análise é indispensável também para verificar se os padrões e especificações
microbiológicas, nacionais ou internacionais, estão sendo atendidos
adequadamente.
A análise microbiológica de um produto alimentício pode ser
conduzida para investigar a presença ou a ausência de microrganismo nesse
produto, para qualificar os microrganismos presentes e para identificar e
caracterizar as diferentes espécies microbianas Inúmeras métodos
laboratoriais de análises podem ser util izados em cada um desses métodos são
comumente divididos em métodos convencionais e métodos rápidos.
Os métodos devem ser confiáveis e certificados e são encontrados
em varias fontes consideradas de referencia, internacionalmente aceitas.
Esses métodos estão descritos:
Association of Official Analytical Chemist, Bacteriological
Analytical Manual (AOAC), 1992);
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96
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods (Vanderzant & Splittstoesser , 1992);
Pratical Food Microbiology (Rorberts et al . , 1995);
Microorganisms in foods → their significance and methods of
enumeration, publicado pela International Commission on
Microbiological Specification for Foods (ICMSF).
1 CUIDADOS NA INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
1. Os microrganismos estão em um ambiente dinâmico no qual a
multiplicação e a morte de diferentes espécies ocorrem em taxas diversas.
Isso significa que os resultados de um teste são válidos apenas para o
momento da amostragem;
2. As contagens das células viáveis por meio de plaqueamento de
diluições de alimentos em um meio agar podem ser mal conduzidos, não
permitindo o crescimento de microrganismos;
3. A homogeneidade de um alimento é rara especialmente com
alimento sólidos, portanto, os resultados para uma amostra podem não ser
representativos para o lote inteiro. Com tudo, não é possível submeter um lote
inteiro de alimentos à análise microbiológica, porque não haveria produto
restante para vender;
4. As contagens de colônias são válidas apenas dentro de certas
faixas e têm limites de confiança;
5. Existem diversas questões relacionadas à recuperação de
microrganismos de alimentos que devem ser mencionadas em qualquer
procedimento de isolamento:
a) No caso de alimentos sólidos, deve ser feita a homogeneização
por meio de liquidificação para fins de diluição;
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
97
b) O organismo – alvo normalmente esta em minoria na população
microbiana;
c) O organismo - alvo está presente em pequenas quantidades;
d) O organismo - alvo pode estar física e metabolicamente lesado;
e) O organismo – alvo pode não estar uniformemente distribuído no
alimento;
f) O alimento pode não apresentar composição homogênea.
2 AMOSTRAGEM
A obtenção correta das amostras, seu transporte para o laboratório e
sua preparação para análise são etapas fundamentais para o sucesso de uma
análise microbiológica.
Seguir as seguintes etapas:
A amostra deve ser representativa, os produtos prontos para
consumo devem ser coletados em suas embalagens originais
fechadas, com especificações de dados que o identifique como,
número do lote, data de fabricação, etc. Quando embalagens
abertas precisam ser analisados, é importante que sejam
acondicionadas adequadamente para evitar contaminação com
outros alimentos, manipuladores, e com o ambiente.
Os produtos acondicionados em embalagens, de difícil transporte
para o laboratório podem ser amostrados “in loco”, com a
máxima assepsia.
Alimentos perecíveis refrigerados devem ser mantidos entre O e
44ºC até o início da análise. Quando se tratar de alimentos
congelados, as amostras devem ser descongeladas somente para a
realização da análise. Como regra geral, toda amostra deve ser
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
98
analisada até 36 horas após sua obtenção. Produtos perecíveis que
não puderem ser analisados nesse período podem ser refrigerados
ou ainda congelado, dependendo do tipo de produto, objetivo da
análise e tipo de microrganismo a ser pesquisado.
O número de unidades a serem coletadas para análise e dos
critérios adotados para aprovação ou reprovação de um produto
define um plano de amostragem.
3 PREPARO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE MICROBIOLOGICA
3.1 COLETA DA AMOSTRA
Técnicas assépticas devem ser util izadas em todas as etapas;
Deve-se proceder à limpeza e a desinfecção da embalagem do
alimento a ser analisado com álcool a 70%;
A quantidade analisada do alimento é muitas vezes na faixa de
25g (ou mL) 50g
A mostra precisa ser homogeneizada com diluente apropriado, a
escolha do diluente depende do tipo do produto e dos
microrganismos a serem pesquisados;
A homogeneização das amostras com o diluente pode ser feita em
liquidificadores ou homogeneizadores de laboratório
denominados stomacher .
3.2 RETIRADA DA AMOSTRA
A operação de retirada da amostra deve ser efetuada,
preferencialmente, dentro de uma capela de fluxo laminar, ou próxima de um
bico de Bunsen, com a chama a meia altura.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
99
As embalagens devem ser desinfetadas antes de sua abertura que
deverá ocorrer de maneira asséptica. Amostras de alimentos líquidos devem
ser retirados com pipeta estéril , e os alimentos sólidos ou semi-sólidos devem
ser pesados assepticamente.
3.3 PREPARO DAS DILUIÇÕES
No preparo das diluições sucessivas, podem ser util izados diversos
diluentes; solução salina-peptonada, salina a 0,85% ou água estéril e outros.
Para obtenção da diluição inicial (1/10) procede-se do seguinte modo:
a) Retirar assepticamente porções de 25g ou 25 mL da amostra,
colocando–se em homogeneizadores esterilizados ;
b) Adicionar 225 mL do diluente;
c) Homogeneizar por alguns minutos em velocidade reduzida, para
não danificar as células microbianas.
d) A partir da diluição inicial (1/10), proceder às diluições
seguintes (1/100); (1/1000), etc. (Apêndice A).
3.4 SOLUÇÕES DILUENTES
a) Solução salina peptonada
Cloreto de Sódio.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8.5g
Peptona.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1,0g
Água destilada.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1000mL
Dissolver os componentes em água destilada. Distribuir em tubos de
ensaio (9mL).Esterilizar em autoclave a 121°C/15min.
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100
b) Solução salina 0,85%
Cloreto de Sódio.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .0,85g
Água destilada.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100mL
Dissolver o cloreto de sódio em água destilada. Distribuir em tubos
de ensaio e esterilizar em autoclave a 121ºC/15min.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
101
CCAAPPÍÍTTUULLOO VVIIIIII
EESSTTIIMMAATTIIVVAA DDAA PPOOPPUULLAAÇÇÃÃOO DDEE CCOOLLIIFFOORRMMEESS TTOOTTAAIISS ,, AA
4455ººCC EE EESSCCHHEERRIICCHHIIAA CCOOLLII AATTRRAAVVÉÉSS DDOO NNÚÚMMEERROO MMAAIISS
PPRROOVVÁÁVVEELL ((NNMMPP))
radicionalmente, as bactérias do grupo coliformes têm sido
consideradas como indicadoras de poluição fecal em
alimentos e águas. São bastonetes gram negativos, não
esporulados, de metabolismo aeróbio ou facultativo anaeróbio, da família das
Entenobacteriaceae. O grupo dos coliformes totais (CT) apresenta a
característica de fermentar a lactose com produção de gás dentro de 48 horas
a 35ºC. Mais de 20 espécies de bactérias podem ser classificadas como
coliformes, originárias tanto do trato gastrintestinal do homem e de animais,
como também de outros ambientes.
T
O grupo de coliformes a 45ºC é formado pelos coliformes que
fermentam lactose, com produção de gás dentro de 24-48 horas, em
temperatura de 45ºC, normalmente em caldo EC. Podem ser Citrobacter
freundi , Enterobacter ssp, (incluindo E. aerogenes e E. cloacae), Kleblsiella
etc. Entretanto, Escherichia coli é a única espécie cujo habitat é o trato
gastrintestinal do homem e de animais. Enterobacter , Klebsiella e Citrobacter
podem desenvolver-se fora do trato intestinal tal como nos vegetais e no solo.
Quando se determina a população dos coliformes a 45ºC, 90% corresponde á
população de Escherichia coli .
A técnica mais usada nos laboratórios para determinação de
coliformes (totais e a 45ºC) é a do número mais provável (NMP) dos tubos
múltiplos, onde se estima quantitativamente este grupo, util izando-se a Tabela
de Hoskins (Apêndice B).
Outras técnicas são utilizadas para determinação de coliformes
como membrana fil trante e simplate .
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102
11 MM ÉÉ TT OO DD OO CC OO LL II FF OO RR MM EE SS TT OO TT AA II SS
Prova Presuntiva
Visa detectar a presença de microrganismos fermentadores de
lactose, especialmente o grupo coliforme. Células estressadas por tratamentos
térmicos, pelo congelamento ou outro motivo, podem ser recuperados nessa
fase.
Procedimento
Selecionar três diluições adequadas da amostra e inocular uma série
de três tubos de ensaio contendo, em cada tubo, 10 mL de caldo lauril sulfato
e tubos de Durhan invertidos com cada uma das diluições decimais
preparadas. Colocar, em cada tubo com o caldo lauril , 1,0 mL de do inoculo.
Incubar em estufa de bacteriologia a 35-37ºC por 24 a 48 horas. Após as 48
horas, retirar os tubos de ensaio da estufa. São considerados positivos aqueles
que apresentarem turvação do meio e presença de gás (bolhas de ar) no
interior dos tubos de Durhan. Em seguida contar o número de tubos positivos
correspondentes a cada diluição (Apêndice C).
Prova Confirmatória (Coliformes totais)
O meio utilizado, o caldo verde brilhante Lactose Bile 2%, contém
dois inibidores (Bile e Verde Brilhante) do crescimento da microbiota
acompanhante, especialmente bactérias gram-positivas. Assim, a produção de
gás nos tubos, nas condições do teste, indica que houve desenvolvimento ou
bactérias gram-negativas que fermentaram lactose, características do grupo
coliforme.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
103
Procedimento
Riscar os tubos de ensaio positivos no caldo lauril sulfato para os
tubos de caldo verde brilhante a 35-37ºC por 24 a 48 horas. Os tubos
positivos apresentam turvação e formação de bolhas de gás nos tubos de
Durhan. Anotar os resultados de consulte a tabela para NMP (número mais
provável) para coliformes totais por grama ou mL.
Coliformes a 45ºC
Para a qualificação dos coliformes a 450 risque os tubos de ensaio
positivos no caldo lauril sulfato e/ ou dos tubos positivo do caldo verde
brilhante para os tubos de caldo EC e coloque no banho-maria por 24 ou 48
horas. Os tubos positivos apresentam positividade semelhante nos caldo lauril
e verde brilhante.
Anotar os resultados consultando a tabela do NMP para coliformes a
45ºC por grama ou mL.
Identificação de Escherichia coli
A parti de cada tubo de ensaio positivo com caldo EC riscar
(estriar) placas de Petri para agar EMB (Eosina Azul de metileno) com auxilio
de alça de níquel cromo e incubar a 35ºC por 18 a 24 horas. Ter o cuidado
de, durante a inoculação, não colocar muito material da amostra, afim de não
superlotar as placas, proporcionando às colônias crescimento isolado,
transcorrido este tempo, verificar o crescimento de colônias com
características de E. coli , ou seja, 2 a 3 cm de diâmetro, com brilho metálico
esverdeado ou com centro escuro (Apêndice D).
De cada placa correspondente a cada tubo, repicar de 2 a 3 colônias
características para tubo com Agar Triptona de Soja (TSA) inclinado e
incubar por 18-24 horas a 35-37ºC.
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104
Efetuar em cada cultura em TSA, as provas bioquímicas descritas a
seguir.
1 Produção de indol
A partir das culturas em TSA inclinado inocular tubos contendo o
meio SIM (meio Sulfeto Indol Motilidade) ou água triptonada e incube a 35°C
por 24 horas. Para o teste do indol, acrescentar de 0,2 a 0,3mL de reagente
Kovacs. O aparecimento de um anel vermelho indica positividade do teste.
O meio SIM é usado também para prova de motilidade e, portanto, a
inoculação deve ser feita com agulha, introduzindo-a e retirando-a em linha e
sem tocar o fundo do tubo de ensaio. Interpretar a prova de motilidade antes
da adição do reagente de Kovacs, observando se há crescimento difuso a
partir da linha de inoculação.
2 Teste de Voges-Proskauer
A partir das culturas em TSA inclinado, inocular tubos de ensaio
com MR-VP e incube a 35°C com 48horas. Transferir 1mL do crescimento
para um tubo de ensaio, acrescente 0,6mL de uma solução de α-naftol e 0,2ml
de uma solução de KOH a 40%. Agitar vigorosamente após a adição de cada
reagente. Deixar em repouso por até 2 horas. O teste é positivo com o
surgimento de uma coloração vermelha ou rósea.
3 Teste de Vermelho de Metila
Reincubar os tubos de ensaio com MR-VP por mais 48 horas e
realizar o teste após 96 horas de incubação. Adicionar 4 gotas de uma solução
de Vermelho de Metila. O desenvolvimento de uma cor vermelha indica que o
teste é positivo.
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105
4 Teste de Citrato
A partir das culturas em TSA inclinado estriar a superfície inclinada
dos tubos com Agar Citrato de Simmons e proceder a incubação a 35°C por 96
horas. O desenvolvimento de uma cor azul indica a positividade do teste.
Para evitar resultados falso-positivos, o Agar Citrato deve ser
estriado primeiro, para impedir a transferência de proteínas ou carboidratos
dos outros meios. Se um inóculo for muito pesado, após a morte bacteriana,
compostos da parede celular poderão liberar carbono e nitrogênio suficiente
para também produzir resultados falso-positivos.
5 Interpretação dos resultados
Este grupo de testes é denominado IMViC.
Considerar a cultura positiva para E.coli , quando forem obtidos os
seguintes resultados para o IMViC (Tabela 8).
Tabela 8 . IMVic
Indol VM VP Citrato Tipo
+ + - - E. coli t ípica
- + - - E. coli atípica
OBS:
1- Outros testes bioquímicos podem ser adicionados, como os testes
de carboidratos e aminoácidos.
2- Tabela do NMP (Apêndice B).
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
106
CCAAPPÍÍTTUULLOO IIXX
CCOONNTTAAGGEEMM PPAADDRRÃÃOO EEMM PPLLAACCAASS ((CCPPPP)) DDEE
MMIICCRROORRGGAANNIISSMMOOSS AAEERRÓÓBBIIOOSS MMEESSÓÓFFIILLOOSS VVIIÁÁVVEEIISS
método da Contagem Padrão em Placas (CPP), estima o
número de células viáveis contidas em um alimento
qualquer. Entretanto, é um método passível de erros, uma
vez que células estressadas podem não se desenvolver no meio, mesmo
estando presente no alimento. É uma metodologia muito usada para indicar a
qualidade higiênica dos alimentos, fornecendo também idéias sobre o seu
tempo útil de conservação. Sua presença em grande número indica:
O a) Matérias-primas excessivamente contaminadas;
b) Limpeza e desinfecção de superfícies inadequadas;
c) Higiene inadequada na produção;
d) Condições inadequadas de tempo/temperatura durante a produção
ou a conservação dos alimentos ou uma combinação destas
circunstâncias.
As técnicas util izadas para se quantificar as bactérias são: “Pour
Plate”, “Spread Plate”. O método CPP baseia-se na premissa de que cada
célula viável, isolada, homogeneizada em um meio sólido (agar), dará origem
a uma colônia uma vez que é teoria biológica que uma colônia provém de uma
única célula microbiana.
1 TÉCNICA DE ANÁLISE
Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar diluições
sucessivas.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
107
Pipetar alíquotas de 1mL de cada diluição para placa de Petri
esteril izadas;
Adicionar a cada placa 15-20mL de agar padrão para contagem,
previamente fundido e resfriado a temperatura de 45ºC.
Homogeneizar em movimentos suaves em forma de oito (cerca de
dez vezes) e deixar a temperatura ambiente, até a completa solidificação do
Agar;
Após a solidificação, incubar as placas em posição invertida a 35-
37ºC/48 horas (Apêndice E).
Resultados
Transcorrido o tempo de incubação, considerar para contagem,
somente as placas da mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias;
o resultado deve ser expresso seguindo a formula:
Nº de unidades formadoras de colônias/mL ou g = Nº de colônias x
diluição.
Sempre que quiser trabalhar com segurança, o método CPP exige o
uso de placas de Petri em duplicatas. Muitos erros podem ser cometidos na
execução do método: erros de pesagem, erros da amostra, erros na medida dos
volumes dos diluentes e nas alíquotas a serem distribuídas nas diluições, erros
no espalhamento do inoculo, contaminação nas operações e erros na
homogeneização das amostras.
A contagem padrão poderá expressar números de unidades
formadoras de colônias (UFC) de diferentes microrganismos que crescem em
diferentes temperaturas. Por exemplo: psicrófilos, mesófilos, psicrotrófilos e
termófilos. Para isto é necessário que a temperatura de incubação favoreça
estes diferentes grupos de microrganismos. Assim, para bactérias psicrófilas,
é recomendada uma incubação de dez dias a temperaturas de 7ºC para “Pour
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
108
Plate”, ou sete a oito dias a 7ºC para “Spread Plate”; para psicrófilas,
incubação de cinco dias nas temperaturas de 23-25°C; para mesófilas, o tempo
de incubação é menor, de 24-48 horas em temperaturas entre 35-37ºC e para
termófilas, incubação a 24 horas a 55ºC.
A técnica de semeadura em superfície é mais adequada para
microrganismos psicrótroficos do que a semeadura em profundidade. Esta
ultima poderá causar injurias ou morte das células se a temperatura do agar
vertido nas placas for maior que 45ºC. Prepare previamente as placas e
estoque a 5ºC por vários dias ou semanas, desde que, acondicionadas em
sacos plásticos bem fechados, para prevenir a desidratação do meio.
No resultado, informe o grupo de microrganismos pesquisados e as
condições de incubação. Por exemplo:
Contagem de bactérias = 36; Diluição = 10- 3; Nº UFC = 36 x 103
UFC/g ou mL ou 36000 = 3,6 x 104 UFC/g ou mL.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
109
CCAAPPÍÍTTUULLOO XX
CCOONNTTAAGGEEMM DDEE SSTTAAPPHHYY LLOOCCOOCCCCUUSS AAUURREEUUSS
ma das causas mais freqüentes dos surtos de intoxicações
está relacionada com a presença de toxinas produzidas
por cepas de Staphylococcus aureus . Estas exotoxinas
são termoresistentes, isto é, suportam temperaturas de ebulição por até 30
minutos.
U A origem das cepas toxigênicas é o homem manipulador de
alimentos, o qual abriga essa bactéria em suas fossas nasais, garganta, cabelo
e pele. Muitos de nós podemos ser portadores de S. aureus .
A determinação de S. aureus em alimentos pode ser feita pelo
método de contagem direta em placa ou pelo método de Número Mais
Provável (NMP). Geralmente utiliza-se a Contagem Padrão em Placas (CPP).
Para contagem em placas, o meio de cultura util izado é o agar Baird
Parker (BP), no qual as colônias típicas de S. aureus assumem coloração
negra, são brilhantes, apresentando zona de precipitação em torne de sua
borda, a qual é circulada por um halo claro.
Para a identificação de S. aureus são necessários, além da
observação de suas características morfológicas e tintoriais, testes
bioquímicos tais como: coagulase, termonuclease, catalase, util ização
anaeróbica de glicose e manitol. Entretanto, a atual legislação para alimentos
(ANVISA, 2001), estabelece apenas o teste de coagulase positiva.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
110
1 TÉCNICA DE ANÁLISES
Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL, e preparar diluições
decimais sucessivas.
Retirar de cada diluição alíquotas de 0,1mL e semear pela técnica
“Spread Plate” em placas de Petri com BP, previamente secas com auxílio da
alça de Drigalsky.
Inverter as placas e incuba-las por 48horas a 35ºC.
Verificar a presença de colônias típicas com as seguintes
características: circular, com 2 a 3mm de diâmetro, de coloração negra,
geralmente com borda brilhante, circundada por dois halos apresentando uma
zona opaca mais próxima à colônia e outra zona, mais externa, transparente.
Selecionar placas com 20 a 200 colônias e contar as colônias típicas
de S. aureus . Eventualmente, colônias atípicas podem apresentar-se cinzentas,
sem um ou ambos halos típicos.
Isolamento: Transferir cada colônia suspeita para tubos de ensaios
com 0,3mL de BHI e inocular uma alçada desta suspensão em tubo com TSA
inclinado, para manutenção da cultura. Inocular os tubos com BHI e TSA por
24horas a 35ºC.
Prova de coagulase: Adiconar a cada tubo de ensaio com BHI,
0,25mL de plasma de coelho e agitar. Incubar a 35ºC e examinar a formação
de coágulo periodicamente durante 6 horas. Considerar positivo um coágulo
firme e compacto, que não se despende quanto o tubo é inclinado ou invertido
(Apêndice F).
Coloração de Gram
A partir de cultura de 24 horas em TSA inclinado realizar a
coloração de Gram.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
111
Devem ser identificadas bactérias gram positivas em forma de
cocos, arranjados caracteristicamente em forma de cacho de uva.
Cálculo do resultado: Calcular o número de UFC/g ou mL em
função do número de colônias típicas contadas, diluição inoculada e
percentagem de colônias confirmadas. Por exemplo: Diluição 10- 2, 30
colônias típica, 5 submetidas à confirmação, 3 confirmadas (60%):
UFC/g ou mL = 30 x 102 x 10 x 0,6 = 1,8 x 104.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
112
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXII
CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBAACCIILLLLUUSS CCEERREEUUSS
contagem de Bacillus cereus em alimentos pode ser feita
pelo método de plaqueamento direto. O meio utilizado é o
Agar manitol gema de ovo polimixina (MYP), que combina
a polimixina como agente seletivo, a gema de ovo e o manitol como agentes
diferenciais.
AA colônia é caracterizada por um grande halo de precipitação. A
confirmação das colônias típicas inclui duas séries de provas bioquímicas; a
primeira objetivando verificar se a cultura isolada pertence ao grupo do B.
cereus ( teste de util ização anaeróbia da glicose, teste de decomposição da
tirosina, teste de VP e teste de nitrato, com provas opcionais de hidrólise da
gelatina e resistência à lisozima) e a segunda objetivando diferencias B.
cereus dos demais bacilos do grupo (verificação da produção de cristais de
toxinas intracelulares, que distingue B. Thuringiensis , verificação da
característica de motilidade, que diferencia B. antrhacis).
1 TÉCNICA DE ANÁLISE
Retirar assepticamente 25g ou 25mL e preparar as diluições
sucessivas. Pipetar, de cada diluição, alíquotas de 0,1mL e colocar nas placas
contendo o meio Agar seletivo para B. cereus . Semear o inóculo com alça de
Drigalsk. Incubar as placas invertidas a 30ºC por 24horas. Após a incubação,
contar as colônias típicas de B. cereus e transferir algumas destas colônias (3
a 4) para Agar triptona de soja (TSA) e incubar a 30ºC por 24horas (Apêndice
G).
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113
Realizar as seguintes provas bioquímicas: caldo nitrato, caldo
carboidrato vermelho de fenol, Agar amido, Agar gelatina e Voges-Proskauer
(Apêndice H).
Teste de redução de nitrato (caldo nitrato)
Inocular uma alçada com inoculo da cultura nos tubos de caldo
nitrato e incubar a 35ºC por 24 horas. Após incubação adicionar aos tubos de
cultura 0,25mL de cada um dos reagentes para teste de nitrato.
Solução A (solução de ácido sulfanílico); solução B (solução de α-
naftol). Observar o desenvolvimento de uma cor avermelhada em no máximo
10 minutos (teste positivo) e, em caso negativo, a cor do meio fica inalterada.
Teste de utilização anaeróbia da glicose (caldo vermelho de fenol 1%
glicose)
Inocular uma alçada da cultura no meio previamente desaerado
(fervura por 15 minutos em banho, e em seguida resfriar imediato em banho
de gelo). Cobrir a superfície do caldo com óleo mineral ou vaselina líquida
estéril e incubar a 35ºC por 24 horas. Observar se há ocorrência de viragem
ácida do indicador, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo (teste
positivo) ou se o meio permanecer com a cor inalterada (teste negativo). As
cepas de B. cereus util izam a glicose anaerobicamente.
Teste de hidrólise de amido
Transferir uma alçada da cultura para as placas de Agar amido,
fazendo duas estrias na superfície do meio. Incubar a 30ºC por 24 horas. Após
a incubação adicionar gotas de lugol na superfície das estrias.
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114
O resultado é positivo quando aparecem zonas claras ao redor do
inoculado não corado pelo iodo; o resultado é negativo quando há ausência
destas zonas claras.
Teste de Voges-Proskauer
Inocular uma alçada com inoculo da cultura nos tubos de caldo
MRVP e incubar a 35ºC por 48 horas. Adicionar para cada tubo contendo a
cultura 0,6mL de solução de α-naftol 5%, 0,2mL de solução de KOH 40%.
Agitar, deixar em repouso e observar periodicamente por até 1 hora o
aparecimento de uma coloração vermelha no meio de cultura (teste positivo).
A permanência do meio na cor amarela indica teste negativo. As cepas de B.
cereus são VP positivas.
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115
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIII
CCOONNTTAAGGEEMM DDEE CCLLOOSSTTRRÍÍDDIIOOSS SSUULLFFIITTOO RREEDDUUTTOORREESS
s bactérias do gênero Clostridium estão amplamente
distribuídas na natureza, podendo ser encontradas no solo,
ar, poeira, água, alimentos e até no trato intestinal do
homem e de animais.
AEstas bactérias têm sido freqüentemente associadas a surtos de
DVAs, quando uma população de, no mínimo 1 milhão de bactérias,
contamina estes alimentos.
A detecção de clostrídios sulfito redutores se faz por contagem em
placas, em meio contendo sulfito de sódio e sais de ferro, além de antibiótico.
A redução de sulfito, produzindo sulfeto, é detectada por sua reação com
ferro, provocando o aparecimento de colônias negras, dentre aquelas
redutoras de sulfito. Podem ser util izados dois meios seletivos, o Agar
seletivo sulfito polimixina sulfadiazina (SPS) e o Agar triptose sulfito
cicloserina (TSC) com emulsão de gema de ovo, usado para plaqueamento em
profundidade.
Uma outra bactéria sulfito redutora de grande importância é. C.
botulinum que, se presente, será igualmente detectada.
Muitos casos de surtos de toxinfecções relacionados a bactérias
produtoras de toxinas de elevada potência em conservas enlatadas têm sido
relatados.
A pesquisa de determinadas espécies, como C. perfringens ou C.
botulinum , se faz a partir da estimativa em meio de cultura, pela amostragem
de colônias suspeitas e pelas respectivas provas bioquímicas.
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116
1 TÉCNICA DE ANÁLISE
Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL da amostra e preparar
diluições sucessivas. Pipetar alíquotas de 1mL de dada diluição em placas
com Agar (SPS) ou TSC, previamente fundido e resfriado a 50ºC. Após a
absorção do inoculo, adicionar uma sobrecamada cerca de 10mL do meio
fundido e resfriado e permitir mais uma vez a sua solidificação. Incubar em
jarra anaeróbica a 46ºC por 24 horas permitir mais uma vez a sua
solidificação.
Contar o número total de colônias negras, observando o limite entre
20 e 200 colônias negras com ou sem halo por placa. Contar todas as colônias
negras e calcular a média das duas placas (Apêndice I).
Confirmação das colônias típicas de clostrídios sulfito redutores
Selecionar várias colônias típicas e transferir para tubos de caldo
infusão cérebro coração (BHI), previamente desaerados. Incubar os tubos
inoculados a 35ºC/24 horas, preparar um esfregaço da cultura para coloração
de gram e utilizar o caldo remanescente para teste de catalase.
Teste de catalase
Adicionar ao tubo de BHI 1,0mL de peróxido de hidrogênio 3% e
observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não (teste
negativo). Os clostrídios sulfito redutores são bastonetes gram positivos,
catalase negativos.
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117
Cálculo dos resultados
Considerar como confirmadas todas as culturas de bastonetes gram
positivos catalase negativos. Calcular o número de UFC/g ou mL em função
do número de colônias típicas, diluição inoculada e percentual de colônias
confirmadas. Por exemplo, para plaqueamento em profundidade, diluição 10- 2,
25 colônias típicas, 10 submetidas à confirmação, 8 confirmadas (80%)
UFC/g ou mL = 2,5 x 102 x 0,8 = 2,0 x 103.
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118
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIIIII
PPEESSQQUUIISSAA DDEE SSAALLMMOONNEELLLLAA SSPPPP..
almonella é um gênero da família Enterobacteriaceae, gram
negativo, não esporulado. Várias espécies são patogênicas ao
homem e aos animais. Habitando o trato intestinal de
animais, Salmonella é eliminada pelas fezes. A possibilidade de contato de
fezes contaminadas com águas, superfícies e manipuladores, torna iminente a
sua veiculação por alimentos.
SExistem vários métodos para o isolamento de Salmonella , nenhum é
completamente satisfatório para isolar todos os sorotipos presentes em
qualquer alimento. Eles compreendem as seguintes etapas: pré-
enriquecimento, enriquecimento seletivo, isolamento em Agar seletivo e
diferencial e seleção de colônias suspeitas, com as quais realizam-se provas
bioquímicas, sorologia e fagotipagem, que definirão, finalmente, o sorotipo.
1 TÉCNICA DE ANÁLISE
A) Pré-enriquecimento: Pesar 25 g ou medir 25 mL da amostra e
adicionar 225mL de caldo lactosado ou água peptonada tamponada. Incubar a
35-37ºC por 24 horas.
B) Enriquecimento seletivo: Agitar o caldo pré-enriquecimento e
inocular 0,1mL em 10mL do meio Rapapport e 1,0mL em 10mL do caldo
tetrationato. Incubar os meios a 37ºC e 42ºC/24 horas.
C) Plaquemento em meio seletivo e diferencial: Agitar os tubos de
caldo Rapapport e tetrationato e estriar uma alçada de cada cultura em placas
nos seguintes meios de cultura: Agar Hektoen, Agar Rambac e Agar XLD,
identificando a origem das culturas (Rapapport e tetrationato). Incubar as
placas invertidas a 35ºC por 24 horas.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
119
D) Seleção de colônias suspeitas: Transcorrido o período de
incubação do plaqueamento seletivo, observar as colônias suspeitas de
Salmonella com auxílio de manuais especializados (Apêndice J).
E) Provas bioquímicas de triagem: Transferir duas ou mais colônias
suspeitas de cada placa para tubos inclinados, contendo Agar TSI e LIA. Com
auxílio de agulha de inoculação, tocar levemente o centro da colônia, estriar
na superfície inclinada (ápice) do TSI e dar uma picada na base. Sem flambar
a agulha, dar duas picadas na base do meio LIA e estriar na superfície.
Rotular os tubos, identificando a origem das culturas e incubar a 35ºC por 24
horas.
Reações típicas de Salmonella nos tubos de TSI e LIA, são as
seguintes:
TSI ápice alcalino (vermelho) e base ácida (amarela), com ou
sem produção de gás (bolha) e de H2S (escurecimento do meio).
LIA base alcalina (púrpura), a maioria produz H2S. Coloração
vermelho-tijolo no ápice do meio LIA não é tipo de Salmonella .
Submeter todas as culturas com reações típicas no meio LIA (base
alcalina) e/ou no meio TSI (alcalina/ácida) a testes bioquímicos e
sorológicos. Descartar apenas as culturas ápice/base ácidas no meio TSI e
aquelas com base ácida no meio LIA (Apêndice K).
Provas bioquímicas de confirmação
Teste da urease: Inocular com alça, tubos de ensaio com caldo uréia.
Incubar a 35ºC por 24 horas. Reação positiva: alteração da cor do meio para
rosa escuro, pela viragem alcalina do indicador. A maioria das cepas de
Salmonella é urease negativa (não altera a coloração do meio).
Para os testes posteriores, renovar as culturas urease negativas em
meio TSI inclinado e incubar a 35ºC por 24 horas.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
120
Teste de fermentação do dulcitol: Inocular uma alçada em tubos de
ensaio com caldo púrpura de bromocresol com 0,5% de dulcitol. Incubar a
35ºC por 48 horas. Reação positiva: acidificação do meio (amarelo). Reação
negativa: coloração púrpura do meio. A maioria das cepas de Salmonella
fermenta dulcitol.
Teste de util ização do malonato: Inocular cultura para tubos de
ensaio com caldo malonato e incubar a 35ºC por 48 horas, mas examinar após
24 horas. Incubar um tubo controle não inoculado. A maioria dos sorotipos de
Salmonella é malonato negativo (coloração verde). malonato positivo
(alteração de cor verde para azul).
Os testes de indol, vermelho de metila, Voges-Proskauer e citrato de
Simmons, já foram descritos para identificação de Escherichia coli .
As culturas de Salmonella spp. apresentam o seguinte quadro:
Teste Resultado
Citrato de Simmons +
Malonato -
Vermelho de metila +
Voges-Proskauer -
Indol _
Urease -
Lisina +
Açúcares; lactose -
Açúcares; glicose +
Açúcares; dulcitol +
Motilidade (meio SIM) +
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121
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXIIVV
CCOONNTTAAGGEEMM DDEE BBOOLLOORREESS EE LLEEVVEEDDUURRAASS
s bolores são fungos com estruturas filamentosas. As
leveduras são fungos unicelulares de forma esférica,
ovóide, cilíndrica. Os fungos são talvez a causa mais
comum de deterioração de alimentos estocados em ambientes domésticos,
além disso, alguns bolores produzem micotoxinas.
O
1 TÉCNICA DE ANÁLISE
Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar as
diluições sucessivas. Pipetar alíquotas de 1mL de cada diluição para placas de
Petri , fazendo de cada diluição placas em duplicatas. Adicionar a cada placa
15mL do agar batata dextrose, previamente fundido, resfriado a 45ºC e
acidificado com o ácido tartárico. Homogeneizar com movimentos em forma
de oito. Deixar solidificar a temperatura ambiente. Incubar as placas a 25ºC
por 3 a 5 dias.
Resultados
Após o período de incubação, considerar para contagem somente as
placas da mesma diluição que apresentarem de 30 a 300 colônias. Em seguida,
multiplicar a média das duas placas pelo fator de diluição correspondente,
expressando o resultado em Unidades Formadoras de Colônias por grama ou
milili tros (UFC/g ou mL) (Apêndice L).
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122
CCAAPPÍÍTTUULLOO XXVV
TTEESSTTEE DDEE EESSTTEERRIILLIIDDAADDEE CCOOMMEERRCCIIAALL
teste de esterilidade comercial tem por objetivo
comprovar a ausência de microrganismos viáveis em
alimentos enlatados em condições normais.
Microrganismos viáveis podem, normalmente, ser recuperadores de alimentos
processados pelo calor e comercialmente esterilizados sob três condições
gerais:
O 1) quando são termófilos obrigatórios, formadores de esporos e a
temperatura de estocagem do produto está abaixo da faixa termofílica;
2) quando são ácido-tolerantes, podendo estar presentes, mas são
incapazes de crescerem pelas condições ácidas impostas ao produto, ou seja,
pH < 4,6;
3) quando são termofílicos e mosofílicos, formadores de esporos,
podendo ser recuperados de alimentos enlatados nos quais foram usados
processos combinados de calor e atividade de água, para prevenir as
conseqüências da deterioração. É normal encontrar microrganismos nessas
três condições e o produto é considerado comercialmente esterilizado.
O ponto de inibição de pH do crescimento de Clostridium botulinum
é de 4,6, razão pela qual os enlatados devem estar abaixo deste pH.
O teste de esterilidade comercial deve ser feito nos enlatados
aparentemente normais, por meio da observação dos recipientes incubados e
por determinação do vácuo, odor e pH do produto.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
123
1 MÉTODOS
Pré-incubação
Incubar as amostras seguindo um plano de amostragem
representativa para o lote, por 14 dias a 35ºC, sobre papel de fil tro para
verificar se há vazamentos. Se qualquer das latas apresentar sinal de
anormalidade, anotar este fato. Retirar as embalagens da estufa, quando
apresentarem sinais externos de crescimento microbiano, visualizado pelo
vazamento ou estufamento. Após a incubação abrir a embalagem e observar se
há odor anormal, alteração na consistência e formação de espuma. Determinar
o pH. Não deve ser usado papel de pH.
Comparar com as embalagens controle e observar se há alguma
anormalidade. Em caso positivo, isto significa que o produto não está
normalmente esterilizado.
Pesquisa de anaeróbios
Usar ambiente o mais asséptico possível, quando proceder a
abertura das latas. Lavá-las com água quente e sabão. Secá-las. Limpar a
superfície das latas com a solução de iodo e álcool e depois enxugar com
toalha de papel. Nunca flambar as latas.
Inoculação: Homogeneizar o conteúdo da embalagem e retirar, do
centro da massa de alimento, porções de aproximadamente 2g ou 2mL e
inocular em quatro tubos de ensaio contendo caldo de carne cozida aquecido a
100ºC e resfriado rapidamente. Inocular os tubos em profundidade e fechar
fortemente as tampas. Também inocular quatro tubos com caldo púrpura de
bromocresol. Incubar os dois primeiros tubos de caldo de carne cozida em
35ºC e os outros dois em 55ºC. Nos primeiros, observar o crescimento após
um período de 96 a 120 horas e nos segundos, de 24 a 72 horas. Incubar os
quatro tubos de caldo púrpura de bromocresol nas mesmas temperaturas
anteriores (35 e 55ºC) e incubar por 24 a 48 horas e 96 a 120 horas,
respectivamente.
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
124
Leitura dos resultados: Após a incubação, observar todos os tubos
inoculados quanto à ocorrência de crescimento (turvação do meio), formação
de película superficial e/ou produção de gás. Os tubos de caldo de púrpura de
bromocresol também devem ser observados quanto à produção de ácido
(alteração da cor do meio para amarelo).
Interpretação dos resultados: 1) Ausência de alteração em todos os
tubos inoculados produto comercialmente estéril; 2) ocorrência de
crescimento e/ou alteração em qualquer dos tubos inoculados pode ser
indicativa da ausência de esterilidade comercial de contaminação da amostra
no laboratório (Apêndice M).
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125
AAPPÊÊNNDDIICCEESS
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126
Apêndice A . Esquema das diluições sucessivas.
Diluição
Alimento (25g)
Homogeneizar
225mL de H2O peptonada, 0,85%
10-2 10-3
1mL
1mL
10-1
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127
Apêndice B . Tabela do Número Mais Provável (NMP), para séries de três
tubos (NMP/g ou mL).
Número de tubos positivas nas diluições Número de tubos positivos nas diluições
10-1 10-2 10-3 NMP 10-1 10-2 10-3 NMP
0 0 0 3 2 0 0 9.1 0 1 0 3 2 0 1 14 0 0 2 6 2 0 2 20 0 0 3 9 2 0 3 26 0 1 0 3 2 1 0 15 0 1 1 6.1 2 1 1 20 0 1 2 9.2 2 1 2 27 0 1 3 12 2 1 3 34 0 2 0 6.2 2 2 0 21 0 2 1 9.3 2 2 1 28 0 2 2 12 2 2 2 35 0 2 3 16 2 2 3 42 0 3 0 9.4 2 3 0 29 0 3 1 13 2 3 1 36 0 3 2 16 2 3 2 44 0 3 3 19 2 3 3 53 1 0 0 3.6 3 0 0 23 1 0 1 7.2 3 0 1 39 1 0 2 11 3 0 2 64 1 0 3 15 3 0 3 95 1 1 0 7.3 3 1 0 43 1 1 1 11 3 1 1 75 1 1 2 15 3 1 2 120 1 1 3 19 3 1 3 160 1 2 0 11 3 2 0 93 1 2 1 15 3 2 1 150 1 2 2 20 3 2 2 210 1 2 3 24 3 2 3 290 1 3 0 16 3 3 0 240 1 3 1 20 3 3 1 460 1 3 2 24 3 3 2 1100 1 3 3 29 3 3 3 2400
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128
Apêndice C . Enumeração de coliformes totais e a 45ºC.
1ml 1ml 1ml
10-1 10-2 10-3
Caldo Lauryl(CL)
ESTUFA35ºC/24-48h
2 alçadas
Teste Confirmativo coliformes a 45ºC
(Caldo E.C.)
2 alçadas
Teste Confirmativo coliformes totais
(Caldo VB)
BANHO-MARIA 45ºC/24h
ESTUFA 35ºC/24-48h
Gás (+) Presença de
coliformes a 45ºC
Gás (-) Ausência de
coliformes a 45ºC
Gás (+) Presença de
coliformes totais
Gás (-) Ausência de
coliformes totais
TESTE BIOQUÍMICO Teste API-20E
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129
Apêndice D . Identificação de Escherichia coli .
Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB) com crescimento de E. coli .
Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)
Caldo E.C., presença de gás (+) para coliformes a 45ºC.
INDOL
E. coli (+)
Série Bioquímica
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130
Apêndice E . Esquema da técnica de análise de Contagem Padrão em Placas de
bactérias mesófilas.
1mL
1mL 1mLAmostra
(25g)
10-2 10-3 10-4 10-1
1mL 9 mL sol. salina 0,85% NaCl
225mL solução salina estéril
Plate Count Agar (PCA)
1mL 1mL1mL
Incubação 37ºC/48h
Contagem das placas contendo 30 a 300 colônias
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131
Apêndice F . Contagem de Staphylococcus coagulase positiva.
Agar Baird Parker (Agar BP)
1ml 9 ml solução salina
225ml solução salina estéril
10-2 10-3 10-410-1
1ml 1ml
0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml
ALIMENTOS 25g ou 25 ml
ESTUFA 35ºC/24 horas
Agar Tripticase Soja (Agar TSA)
Caldo Infusão Cérebro Coração (BHI)
ESTUFA 35ºC/24 horas Agar BP com crescimento de Staphylococcus spp.
(-) (+) (+)
Teste de Coagulase Teste de Catalase
TESTES BIOQUÍMICOS
(-)
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132
Apêndice G . Contagem de Bacillus spp.
Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)
Contagem das colônias típicas
TESTES BIOQUÍMICOS
9 ml sol. salina1ml
225ml soluçãosalina estéril
10-2 10-3 10-4 10-1
1ml 1mlALIMENTO 25g ou 25ml
Espalhamento (alça de Drigaslk)
ESTUFA 35ºC/48 horas
0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml
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133
Apêndice H . Identificação de Bacillus cereus .
Voges - Proskauer
Hidrolise do Amido
Fermentação da Glicose
Hidrolise da Gelatina
Agar TSA (Cultura)
(+)(-)
(+) (-)
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134
Apêndice I . Contagem de Clostridium spp.
Contagem das colônias típicas de Clostridium spp. em Agar SPS
Isolamento em Agar Tripticase Soja (Agar TSA)
1ml 1ml 1ml 1ml
9 ml sol. salina 1ml
225ml soluçãosalina estéril
10-2 10-3 10-410-1
1ml 1mlALIMENTO 25g ou 25ml
ESTUFA 46ºC/48 horas(Em Anaerobiose)
TESTES BIOQUÍMICOS
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135
Apêndice J . Pesquisa de Salmonella spp.
Estrias
225ml de Água Peptonada Tamponada
ESTUFA A 35ºC/24 horas
ENRIQUECIMENTO
0,1mL 1mL
10mL de Caldo Tetrationato
10mL de Caldo Rapapport
ESTUFA A 35ºC/24 horas
Agar Tripcase Soja
Testes Bioquímicos
Agar Hektoen Agar Rambach
INCUBAÇÃO 35ºC/24H
ALIMENTO 25g ou 25ml
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136
Apêndice K . Identificação de Salmonella spp.
Citrato de Simmons
Uréia Agar LIA Agar TSI
a
Testes Preliminares ( 1 Etapa )
Vogues-Proskauer Vermelho de Metila
Indol
Testes Finais ( 2a Etapa )
Fermentação de Lactose Fermentação de Sacarose Caldo Malonato
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137
Apêndice L . Contagem de Bolores e Leveduras.
225ml soluçãosalina estéril
Agar Batata Dextroseadicionado Ácido Tartárico
9 ml sol. salina
1ml
10-2 10-3 10-410-1
1ml 1ml
1ml 1ml 1ml 1ml
ALIMENTOS 25g ou 25 ml
ESTUFA B.O.D. 25ºC/ 5 dias
Contagem das placas que contenhamentre 30 e 300 colônias (UFC/g ou ml)
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138
Apêndice M . Esterilidade Comercial.
Caldo Púrpura de Bromocresol
Caldo de Carne Cozida
ESTUFA 55ºC/24 a 72h
ESTUFA 35ºC/96 a 120h
ESTUFA 35ºC/96 a 120h
ESTUFA 55ºC/24 a 72h
INOCULAÇÃO
Abertura Asséptica (Lavagem com água quente e sabãoou desinfetar com álcool a 70%)
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS:
1. Ausência de alterações em todos os tubos inoculados → produto
comercialmente estéril;
2. Ocorrência de crescimento e/ou alteração em qualquer dos tubos inoculados
→ pode ser indicativa da ausência de esterilidade comercial de contaminação
da amostra no laboratório.
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139
RREEFFEERRÊÊNNCCIIAASS
Especialização em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
140
ADAMS, M. R.; MOSS, M. O. Food microbiology . 2. ed. Cambridge: Royal
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