microbio 1 informe

7/27/2019 MICROBIO 1 INFORME

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“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD

ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N°1

TÍTULO: ‘Preparación de una muestra fija de

bacterias para tinción’ y ‘Tinción simple con

colorantes básicos’

Integrantes:

Colquehuanca Mejía, Eliana Elsye Flores Calderón, Elvis Norabuena Damian, Juan Tantahuillca Landeo, Pat Teresa

Mesa N°5

Grupo: Miércoles de 3 a 5 pm

2013



1. Introducción

La microbiología es el estudio de los organismos microscópicos (celulares ysubcelulares), principalmente de aquellos que se encuentren por debajo delpoder de resolución del ojo humano, estos seres tienen un rango de tamaño de10-5 a 10 mm, por ende es necesario el manejo experimental para observar,describir su morfología y taxonomía. Para ello se debe tener habilidades demanejo de los instrumentos de laboratorio (principalmente el microscopio),saber las técnicas básica de preparación de una muestra fija de bacteria paratinción, que es un procedimiento preliminar a la mayoría de métodos de tincióna bacterias.Se aprenderá a realizar el método de tinción simple con colorantes básicos encual consiste en destacar el microorganismo completo para que se vean lasformas y las estructuras básicas.

2. Marco teórico

La gran mayoría de microorganismos son casi incoloros cuando se les observaa través de un microscopio óptico estándar, para una visualización de bacteriasde manera adecuada y de sus estructuras internas, se requieren tincionesbiológicas. La introducción de tinciones a mediados del siglo XIX influyó muchosobre los principales avances en microbiología. En tamaño y forma lasbacterias de importancia médica son microorganismos muy pequeños que sepresentan en tres formas generales: esféricos designados como cocos,organismos en forma de bastón designados como bacilos, y de formasespirilas, dentro de estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otrosmicroorganismos que adoptan variantes morfológicas designadas como formaspleomórficas.Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u orgánicas de colorantes ogrupos de colorantes que proporcionan una variedad de colores a losmicroorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras sustancias deimportancia biológica (Koneman, 2008).

2.1. Los colorantesSe pueden clasificar según su origen o según su comportamientoquímico.Según su origen:

a. Naturales. Son los colorantes extraídos de animales y sobretodo de plantas. Por ejemplo la hematoxilina

b. Artificiales. Son los colorantes preparados en mayor parte dealquitrán de hulla.



Según su comportamiento químico:Los colorantes son las sales compuestas por un ion positivo y un ionnegativo, uno de los cuales esta coloreado y se conoce comocromóforo. (Tortora, 2007).

a. Ácidos o aniónicos.El color de los colorantes ácidos, está en elion negativo. Son los colorantes citoplasmáticos. Estos no sonatraídos por la mayor parte de los tipos de bacterias porque lasuperficie bacteriana con carga negativa repele los ionesnegativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo en lugar de la estructura bacteriana. Es ejemplo de colorante acido lafucsina ácida

b. Básicos o catiónicos. El color de los denominados colorantesbásicos esta en el ion positivo. En un pH de 7 las bacteriaspresentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el ion

positivo coloreado en un colorante básico es atraído hacia lacélula bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicosentre los que se encuentran el azul de metileno y el cristalvioleta o violeta de genciana, se utilizan con más frecuenciasque los colorantes ácidos.

c. Neutros. Son sales compuestas de un color ácido y un color básico. Por ejemplo cosinato

d. Indiferentes. Son los colorantes insolubles en agua y solubles enalcohol donde no predomina ni la carga positiva ni la carganegativa. Pero no tienen carácter neutro, colorantes de los

lípidos, por ejemplo el Sudan III, negro Sudán.(Granados, 1997)

2.2. Fijación

Todas las técnicas de tinción exigen una preparación previa antes de proceder a la tinción en sí. Hay que seguir tres pasos: extensión, desecación y fijación.De estos depende la calidad de las tinciones (García, 1994).

a. ExtensiónConsiste en formar una película de la muestra sobre un portaobjetosperfectamente limpio y desengrasado (conservado en alcohol). La

deposición de la muestra debe ocupar aproximadamente una superficiede 1cm2 .los portaobjetos suelen flamearse antes de su uso paraeliminar los restos de grasa y suciedad.La forma de realizar la extensión depende del estado físico en que seencuentre la muestra: para muestras líquidas basta con depositar unagota en el centro del portaobjetos y extenderla con un asa; paramuestras sólidas, o colonias procedentes de un cultivo, se deposita conantelación sobre el portaobjetos una pequeña gota de agua, o mejor desolución salina, en la que se efectúa una emulsión.



b. DesecaciónSiempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando eportaobjetos sobre el calor suave de una llama de un mechero, perotomando precauciones para no forzar el proceso de secado.

c. Fijación

El proceso de fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos ysu adherencia al portaobjetos por su coagulación de sus proteínas plasmáticasmediante calor. También preserva diversas partes de los microorganismos ensu estado natural con distorsión mínima. Se aplica el colorante, se lo lava conagua y se lo seca con papel absorbente. Si no se realizara la fijación elcolorante podría arrastrar los microorganismos del portaobjetos (Tortora, 2007)

2.3. Técnicas de tinciónLas principales ventajas de la técnica de tinción son:

Observar más adecuadamente su morfología. Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo

que permitirá diferenciar distintos tipos morfológicos. Establecer una información completaría sobre sus estructuras

internas y/o externas que no podrían ser observadas por examen en fresco.

Conocer sus características tintoriales orientándonos hacia ungrupo taxonómico u otro en la clasificación bacteriana.

Las tinciones pueden ser:a. Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de

que las células tienen una composición química diferente a la desu entorno, de modo que ambos se comportan de formadiferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azulde metileno, safranina) o no (nigrosina).

b. Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos decélulas tienen distinta composición química, y por lo tantoreaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que

permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos,según su capacidad de tinción. En este apartado están dostinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción deGram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estastinciones utilizan más de un colorante.

c. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructurascelulares tienen distinta composición química, de modo que setiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplo: tinción deesporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculosmetacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.



2.4. Técnica de tinción simpleEsta es una técnica que utiliza un colorante, todas las células seobservan del color del colorante empleado. Aunque los diferentescolorantes se unen de forma específica a las distintas partes de lascélulas el propósito principal de una tinción simple es destacar el

microorganismo completo para que se vean las formas y las estructurascelulares básicas. El colorante se aplica al extendido fijado por untiempo determinado, se lava, se seca y examina.

2.5. Factores que afectan a toda técnica de tinción Pureza del colorante

Concentración del colorante El pH del colorante Conservación del colorante

Elaboración del colorante Técnica empleada

Temperatura Cantidad de muestra Realizar correctamente el frotis

Tiempo de tinción Soluciones mordientes

2.6. Observación de los microorganismos con microscopio de alto poder

amplificador Se usa mayormente ocular que aumentan de 10 y objetivo deinmersión, dispositivos que brindan amplificaciones de casi 1000diámetros. Es sabido que el vidrio y el aire no tienen la mismarefracción, se emplea aceite de inmersión para que no exista aire entrela preparación y el objetivo. Se procede entonces a descender elobjetivo hasta la gota de aceite de manera que no quede aire entre elportaobjetos y la lente (Witton, 1965)

3. Parte experimental

EJERCICIO N. 1 PREPARACION DE UNA MUESTRA FIJA DEBACTERIAS PARA TINCIÓN

Previo al desarrollo de una técnica de tinción, el material al ser observadodebe ser fijado, es decir adherido a una lámina de vidrio sobre la cual ha derealizarse la tinción. Si la preparación no es fijada, la muestra tiende a

perderse durante el procedimiento de tinción. El procedimiento de fijación mataal microorganismo, coagula el protoplasma celular y provoca su adhesión a la



lámina de vidrio. Un agente de fijación ideal preserva la estructura de la célulaen la forma y posición normal sin causar la aparición de artefactos (estructurasno presentes en la célula viviente). Aunque el calentamiento es el agente defijación de uso más común, el alcohol y otros agentes químicos tambiénpueden ser usados satisfactoriamente.

MATERIALES.- Muestra conteniendo bacterias- Asa de kôlle- Lamina porta objetos- Mechero de alcohol- Piseta con agua

PROCEDIMIENTO

1) Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlo con papel seda.2) Prender el mechero y esterilizar el asa kòlle en la flama del mecherohasta que se ponga al rojo vivo.3) Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra losmicroorganismos sean destruidos, después acercar al mechero el tubo decultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo.4) Colocar una gota de agua destilada sobre una lámina porta objetocompletamente limpia. Con ayuda del asa de kòlle coloque sobre la gota unapequeña porción de la muestra a fijar. Si la muestra que contiene almicroorganismo es líquida puede aplicarse directamente sin la gota de agua.

5) Distribuya la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar unapelícula delgada luego seque la lámina al aire o a una razonable distanciasobre la llama del mechero.6) Cuando la película este seca, pase la lámina a través de la llama delmechero unas 2 a 3 veces para así fijarlo con calor, cuidando que la películaeste hacia arriba y que la lámina no se recaliente. La sobre exposición al calor puede alterar la forma y estructura del microorganismo.

EJERCICIO NRO. 02 TINCION SIMPLE CON COLORANTES BASICOS

La tinción simple constituye una técnica sencilla y directa que a través del usode un colorante, nos permite constatar y diferenciar los microorganismos desu entorno.Los colorantes básicos, los cuales se utiliza más comúnmente para teñir microorganismos, difieren en el grado de reactividad con las células, estasgeneralmente tiene una superficie cargada negativamente cuando el pH delmedio es cercano a la neutralidad, entonces se aplica el azul de metileno ( ionpositivo) que reacciona con la pared celular por medio de enlaces iónicosdébiles que están cargadas negativamente a la tasa más baja, tomando de 50

a 60 segundos para teñir apropiadamente una preparación microbiana. Elcristal violeta es más reactivo y generalmente requiere solo 10 segundos. La



carbolfucsina es un colorante aún más rápido, requiriendo solo 5 segundos. Sureactividad es tan grande que ciertamente puede dificultar una tinciónapropiada, sobre todo cuando la muestra contiene abundante materiaorgánica.

MATERIALES.- Laminas fijadas de microorganismos- Aceite de inmersión- Vaso de precipitados de 100 ml- Colorantes básicos- Azul de metileno- Cristal violeta- Carbol-fucsina- Papel secante- Piseta de agua

- Soporte para tinción

PROCEDIMIENTO1) Coloque las láminas fijadas de microorganismos sobre el soporte paratinción.2) Agregue 5 a 6 gotas de cada colorantes dejando que actúen por untiempo de 60 segundos para el azul de metileno; 10 segundos para que elcristal violeta; y 5 segundos para la carbolfucsina.3) Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lámina conagua destilada.

4) Seque las láminas al aire o dentro del papel secante.5) Examine las preparaciones teñidas bajo el objetivo de inmersión(100X) de un microscopio compuesto.6) Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias entamaño forma, y agrupaciones que se presenten.

4. ObservacionesDespués de haber preparado las muestras en los portaobjetos (frotis) seobtuvieron los siguientes resultados:

4.1. Género: Staphylococcus sp. Forma: cocos Agrupación: racimoColorante: azul de metiloGA: 1000X



4.2. Género: Bacillus sp.

Forma: bastón

Agrupación: estreptobacilo

Colorante: fucsina

GA: 1000X

4.3. Género: Echerichia coli

Forma: cocobacilo

Agrupación: no tiene

Colorante: cristal violeta

GA: 1000X

5. Discusión Según Koneman (2008) como la mayoría de las bacterias carecen de

coloración, es importante teñirlas para poder observarlas al microscopio

y determinar su tamaño, morfología y disposición relativa, por tal motivose utilizó azul de metilo como colorante para la Staphylococcus sp, aunque no se trató de un colorante rápido su uso dificultó una tinción

apropiada, dando como resultado una baja nitidez.

Según Granados (1997) existen distintos factores que afectan a lastécnicas de tinción, como el no realizar correctamente el frotis o variar eltiempo de tinción, estos factores pudieron haber afectado laobservación de Staphylococcus.



Según Madigan (2004) a las bacterias esférica u ovoide se lesdenomina cocos, a las de forma cilíndrica bacilos. Para el caso de laStaphylococcus se observó en forma de cocos, para la E. Coli se tratade una forma ovoide, que también incluye la forma cocobacilo. En elcaso del Bacillus obtuvimos una forma de bastón.

Según Madigan (2004) son las características físicas y químicas que unmicroorganismo necesita para su favorable crecimiento las que generanlas comunidades microbianas o agrupaciones donde realizan susprocesos metabólicos. Se observó que la E. Coli no se formaagrupaciones porque su tendencia a permanecer unidas es bastantebaja.

Los Staphylococcus forman en agrupaciones de racimos, es por eso

que en la muestra teñida de azul de metilo se observó varias coloniasde estos microorganismos en grupos con forma de racimos.

.

6. Conclusión

Los colorantes son muy importantes para la observación demicroorganismos ya que proporciona contraste entre el este y el medioque lo rodea, permitiendo diferenciar su morfología.

Aunque se había recomendado usar el colorante azul de metilo para latinción de la Staphylococcus sp, se tuvo dificultad para una observaciónnítida.

La técnica de tinción simple nos ayuda a ser visibles las formas,tamaños y agrupaciones variadas que presentan las bacterias.



7. Bibliografía

AGUILAR P., J. y F. SENENT. 1986. Cuestiones físicas. RevertéEditorial. Primera Edición. Sevilla.

COVADONGA. 2010. Técnicas básicas de Microbiología. Observaciónde bacterias. Madrid. Disponible en: www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/download/819/834consultada el 01 de setiembre del 2013.

GARCIA, P; FERNANDEZ, M y PAREDES, F. 1994. Microbiologíaclínica práctica. 2ª edición. Editorial Universidad de Cádiz servicio depublicaciones. Cádiz.

GRANADOS, R; VILLAVERDE, C. 1997. Ciencia de la SaludMicrobiología. Editorial Paraninfo. España

KONEMAN, E; ALLEN, S y JANDA. 2008. Diagnostico Microbiológico.

Texto y Atlas en color. 6ª edición. Panamericana Editorial. Buenos Aires. MADIGAN, M. et al . 2004. Biología de los microorganismos. Brock.

Pearson-Prentice Hall Editorial. 10a edición. Madrid. PRESCOTT, L. et al . 2002. Microbiología. Mc Graw Hill Editorial. 5ta

edición. Madrid. TORTORA, G. et al . 2007. Introducción a la microbiología.

Panamericana Editorial. 9ª edición. Buenos Aires.

WITTON. 1997. Microbiología. Primera edición. Compañía EditorialContinental, SA. México.

http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/download/819/834

http://www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/download/819/834



CUESTIONARIO1. ¿Cuáles son las asociaciones más frecuentes en bacterias?

Las células de muchos procariotas se mantienen juntas después de la división celular

formando grupos, y estas asociaciones frecuentes son características de diferentes

organismos.

Los cocos que después de la división permanecen unidos en pares se denominan

diplococos y los que permanecen unidos en forma de cadena se denominan

estreptococos. Los cocos que se dividen en dos planos y permanecen unidos en

grupos de cuatro se conocen con el nombre de tétradas, los que se dividen en tres

planos y permanecen unidos en grupos de configuración cúbica se llaman sarcinas y

los que se dividen en planos múltiples y forman grupos similares a racimos de uva o

láminas amplias se denominan estafilococos.

Los bacilos se dividen exclusivamente a través de sus ejes menores, de manera que lacantidad de grupos de bacilos es menor que la de cocos. La mayoría de bacilos se

observan como bastones aislados. Los diplobacilos permanecen unidos en pares

después de la división, mientras que los estreptobacilos forman cadenas. Otros

bacilos son ovalados y se parecen mucho a los cocos, por lo que recibieron el nombre

de cocobacilos.

Fuente: Tortora et al (2007)

Figura 1: Disposición de cocos y bacilos según las agrupaciones más comunes.



Figura 2: Muestra de tamaños comparativos entre distintos procariotas

2. ¿En qué rango se definen las bacterias?

En conjunto el grupo bacteriano también varía en tamaño tanto como en forma. Las

más pequeñas (como del género Mycoplasma) tienen aproximadamente 0.3 µm de

diámetro. Las nanobacterias un diámetro aproximado de entre 0.2 µm y menos de 0.05µm. Otro ejemplo es de la Escherichia coli , bacilo de tamaño medio, mide 1.1 – 1.5 µm

de ancho y 2.0 – 6.0 µm de largo. Algunas bacterias son bastante grandes; la

cianobacterias Oscillatoria tiene un diámetro de casi 7 µm, y algunas espiroquetas

pueden alcanzar ocasionalmente una longitud de 500 µm.

Se ha descubierto una bacteria enorme en el intestino del pez cirujano Acanthurus

nigrofuscus. La bacteria Epulopiscium fishelsoni presenta un tamaño de 600 por 800

µm. más recientemente se ha descubierto una aún más grande en sedimentos

oceánicos, Thiomargarita namibiensis.

En general, las procariotas presentan tamaños que van desde 0.1 – 0.2 µm de ancho a

más de 50 µm de diámetro.

Fuente: Madigan et al (2004)



3. ¿Cuáles son las formas bacterianas más frecuentes?

Aunque es cierto que muchas bacterias tienen una morfología similar, existen

importantes variaciones. La mayoría de las bacterias conocidas presentan forma de

coco o de bacilo.

Los cocos son células casi esféricas, que existen individualmente o en agrupacionescaracterísticas que son útiles frecuentemente para identificar a las bacterias; en cuanto

a los bacilos, son bacterias de forma cilíndrica. Otras formas adquiridas por las

bacterias son una forma semejante a bacilos largos retorcidos como espirales o

hélices, denominados espirilos si son rígidos, y espiroquetas cuando son flexibles.

4. ¿Qué diferencia a una tinción directa de una tinción negativa?

La tinción directa o simple permite observar la forma, el tamaño y los agrupamientos de

las bacterias usando un único colorante (normalmente básico), pues estos

microorganismos absorben el colorante. Mientras que en la tinción negativa, uso de

colorantes neutros o ácidos, la célula bacteriana no absorbe el colorante quedando

incolora y transparente, sólo se tiñe el fondo. Y debido a que no necesitan del calor, las

morfologías de las células no son alteradas.

Figura 3: Bacterias representativas; observación con el microscopio óptico en bacterias teñidas

(a) Staphylococcus aureus; obsérvense lascélulas esféricas en racimos irregulares (x1000). (b) Enterococcus faecalis;obsérvense las cadenas de cocos (x 200).(c) Bacillus megaterium, bacteria en formade bacilo formando cadenas (x 600). (d) Rhodospirillum rubrum (x 500). (e) Vibrio

cholerae; bacilos curvados com flagelospolares (x 1000).

Fuente: Prescott et al (2002)



5. ¿Qué importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los

colorantes empleados?

Las técnicas de tinción nos permiten observar microorganismos en función de

la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias

colorantes (de acuerdo a la composición en sus paredes celulares), lo que

depende de la carga de la célula y del colorante, por ejemplo los catiónicos

penetran en el interior de la célula y las tiñen. Las bacterias, en su mayoría

tienen afinidad por los colorantes de carácter básico.

Azul de metileno Reacciona con las células cargadas

negativamente.

Cristal violetaReacciona con células cargadas

negativamente.

CarbolfucsinaPara micobacterias de cápsula gruesa y

cerosa son resistentes a la tinción, son

llamadas ácidos resistentes

6. ¿Cuál es la función del aceite de cedro?

La función del aceite de cedro es restringir el movimiento de la muestra, además de

evitar el rozamiento entre porta-objetos con muestra y el objetivo, generalmente se usa

cuando se va a observar con el objetivo 100x. Otra función es evitar que la luz se

desvíe.

El índice de refracción del aceite de cedro y del vidrio es el mismo de la primera lenteobjetivo del microscopio, consiguiendo así que los rayos pasen sin sufrir refracción,

Figura 4: Tinción simpe con cristalvioleta de Staphylococcus aureus.

Figura 5: Tinción negativa con cristalvioleta de Staphylococcus aureus.

Fuente: Covadonga (2010) Fuente: Covadonga (2010)



Figura 6: Objetivos secos y de inmersión

eliminando de esta forma reflexiones totales (figura 6) y mejorando la luminosidad de

la imagen. De no tener aceite de cedro, se puede reemplazar con agua, monobromuro

de naftaleno entre otros.

7. ¿Cuál es la función del lente de inmersión?

La lente de inmersión es usada para lograr un mayor aumento (1 000 x) con buenaresolución, para lo que el objetivo es pequeño. Si no se utiliza aceite de inmersión conun objetivo de inmersión la imagen se toma borrosa, con mala resolución.

Fuente: Aguilar y Senent (1986)

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