microarray preprocessing - columbia universityandrews/pub/microarray-data-080729.pdfmicroarray...
TRANSCRIPT
Microarray Preprocessing
by Stuart Andrews with help from Uri-David Akavia & Bo-Juen Chen
1Tuesday, July 29, 2008
Gene Expression
• A key function of all living organisms is the expression of genes
2Tuesday, July 29, 2008
Gene Expression
• mRNA is created from DNA
3Tuesday, July 29, 2008
Gene Expression
• protein is created from mRNA
4Tuesday, July 29, 2008
Microarrays
• High-throughput technology used to measure concentration of mRNA in a sample
5Tuesday, July 29, 2008
Applications
6Tuesday, July 29, 2008
Text
Measurement Process
sources of uncertainty:addition of noise and artifacts
normalizing, filtering, cleaning:removal of noise and artifacts
7Tuesday, July 29, 2008
Goal
• Framework for preprocessing raw microarray data
• Produce reliable gene expressions
• Jeff Settleman’s data
8Tuesday, July 29, 2008
Strategy
• Keep it simple, efficient, easy to modify, and easy to re-run
• Use visualizations to test, communicate, and confirm results
9Tuesday, July 29, 2008
Overview
• Introduction to microarrays
• Probe normalization & summarization
• Batch effects
• Redundant probe set summarization
• From A to Z
• Summary
10Tuesday, July 29, 2008
Micro
11Tuesday, July 29, 2008
Array
12Tuesday, July 29, 2008
Probes, Probe Pairs, & Probe Sets
• Probes are short oligomers e.g. 25-mers
13Tuesday, July 29, 2008
Probes, Probe Pairs, & Probe Sets
• Perfect match & mismatch pairs
14Tuesday, July 29, 2008
Probes, Probe Pairs, & Probe Sets
• 11–20 probe pairs per gene = a probe set
15Tuesday, July 29, 2008
Probes, Probe Pairs, & Probe Sets
• Many genes have redundant probe sets
16Tuesday, July 29, 2008
Chip Design
• Sample preparation & hybridization
• Datasheet.pdf
• Probe sequence & gene auxiliary data
• Annotation file.csv
• Probes locations & gene mappings
• Library file.csv
• Intensity values
• Sample.CEL
17Tuesday, July 29, 2008
Filter Rule #1
• Remove control & garbage probes
• Probes included for quality control
• Probes discovered to encode incorrect sequence, as the Human genome is revised
• Probes discovered to hybridize to antisense strand
• Probes with annotation warnings, etc.
18Tuesday, July 29, 2008
Probe Normalization & Summarization
19Tuesday, July 29, 2008
Each color is a different chip (sample)
Inputs: Probe Intensities
X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL
05
1015
20
log 2
intensity
4 6 8 10 12 14 16
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
log2 intensity
density
20Tuesday, July 29, 2008
• Calculate a single expression value for a transcript from a set of probes
• Remove background chip effects
• Normalize intensity values
• Summarize
Outputs: Transcript Exprs
21Tuesday, July 29, 2008
Algorithms
• MAS5
• local average & PM-MM background correction
• robust Tukey-biweight summarization
• fixed scale
• RMA
• normal-exponential foreground/background model
• linear model of log expression
• Plier, MBEI, FARMS, many others ...
22Tuesday, July 29, 2008
MAS5
Log2 Probe Set Expressions
X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL
05
1015
log 2
expr
0 5 10 15
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
log2 expr
density
X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL0
510
15
log 2
expr
0 5 10 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
log2 expr
density
X42506_01_YT_RO82.W.1.CEL X42506_04_YT_Sci.1.CEL
05
1015
log 2
expr
0 5 10 15
0.00
0.05
0.10
0.15
log2 expr
density
RMA FARMS
MAS5 RMA FARMS
23Tuesday, July 29, 2008
Batch Effects
24Tuesday, July 29, 2008
Batch variations:
Biology, or
artifacts?
Batches
1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
34
56
7
log 2
intensity
Technician & Date25Tuesday, July 29, 2008
1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
34
56
7
log 2
intensity
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
34
56
7
log 2
intensity
CEL Intensities
1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
−20
24
68
10
log 2
expression
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16
−20
24
68
10
log 2
expression
MAS5 Expressions
Technician and date
Tissue
Batches
26Tuesday, July 29, 2008
Caveat
Problem:
Batch variations are not removed by linear models when computed batch-by-batch
Solution:
Use global linear model with batch factors
1 3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
02
46
8
log 2
expression
RMA expressions computed batch-by-batch
27Tuesday, July 29, 2008
• Conclusions
• Small variations exist among the technician & date batches
• Likely to be artifactual and not biologically meaningful
• Normalization of batch MEAN AND VARIANCE is recommended
Batch Effects
28Tuesday, July 29, 2008
Redundant Probe Set Summarization
29Tuesday, July 29, 2008
Redundant Profiles
5 10 15 20 25 30
6
6.5
7
7.5
8
8.5
9
9.5
10
number=7, ncbi=14
log2 expression
NCBI 143 probe sets
Batch 1 (samples 1–7)
Batch 2 (samples 8–33)
30Tuesday, July 29, 2008
5 10 15 20 25 30
8.5
9
9.5
10
10.5
11number=15, ncbi=23
log2 expression
5 10 15 20 25 30
7
8
9
10
11
12
13
14
15number=47, ncbi=71
log2 expression
5 10 15 20 25 30
−1
0
1
2
3
4
5
6
7
number=24, ncbi=32
log2 expression
5 10 15 20 25 30
2
4
6
8
10
12
number=11, ncbi=19
log2 expression
31Tuesday, July 29, 2008
Redundant Profile Summarization
• Previous methods
• Take average profile
• Use most variant
• Use biologically motivated outlier filtering
32Tuesday, July 29, 2008
• Profiles that are consistently low are indistinguishable from noise and should be removed
• Set inconsistenly low values to NaN
• “Specs of Dust”
Filtering Example
33Tuesday, July 29, 2008
• Care must be taken to avoid the introduction of additional batch effects
Filtering Example
34Tuesday, July 29, 2008
corr filt.gene
~low&corr filt.gene
~low&~noisy&sample corr
filt.gene
~low&~noisy&corr filt.gene
~low&~noisy&cluster&corr filt.gene
~low&~noisy&cluster&singleton filt.gene
~low&~noisy&cluster&~noisy&corr filt.gene
~low&~noisy&cluster&~noisy&sample corr
filt.gene
Outlier Detection
[low]
[~low&~noisy&cluster&~noisy&~corr] filt.gene
singleton filt.gene
[~low&noisy] filt.gene
~low&singleton filt.gene
[~low&~noisy&~cluster] filt.gene
[~low&~noisy&cluster&noisy] filt.gene
[low] filt.gene
Occam’s Razor- difficult to choose parameters- not enough data to test all possibilities
Over 10 tunable parameters
35Tuesday, July 29, 2008
• Summarization by weighted median
• Robust and biologically motivated
• Weights
• Profile mean expression
• Profile variance
• Profile eigen-centrality
• All weights combined
Alternative Solution
36Tuesday, July 29, 2008
Weighted Median Summarization
37Tuesday, July 29, 2008
38Tuesday, July 29, 2008
39Tuesday, July 29, 2008
From A to Z
1. Remove invalid probes
2. Normalize & summarize probes
3. Normalize batch mean & variance
4. Construct probe set profiles
5. Remove consistently noisy profiles
6. Compute weighted median of redundant profiles
... Validate and improve
40Tuesday, July 29, 2008
Summary
• Presented a framework for processing raw microarray data
• Batch effects identified and documented
• Introduced weighted median probe set summarization
41Tuesday, July 29, 2008
The End
42Tuesday, July 29, 2008
Redundant Profiles Correlations Distributions
−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
redundant gene profile correlation distribution
[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles
−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10
0.05
0.1
0.15
redundant gene profile correlation distribution
[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles
−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
redundant gene profile correlation distribution
[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles
−1 −0.8 −0.6 −0.4 −0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 10
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
redundant gene profile correlation distribution
[0 3] redundant profiles[4 6] redundant profiles[7 9] redundant profiles
max corr(i,j)all corr(i,j)min corr(i,j)
For each NCBI gene, compute correlation matrix corr(i,j) for redundant profiles
43Tuesday, July 29, 2008
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Caveat 2
small variation moderate variation large variation
MAS5 by tissue MAS5 RMA
44Tuesday, July 29, 2008