microarray identification de fmrp- associated bian mrnas and altered mrna traslational profiles in...
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Microarray Identification Microarray Identification de FMRP- Associated Bian de FMRP- Associated Bian mRNAs and Altered mRNA mRNAs and Altered mRNA
Traslational Profiles in Traslational Profiles in Fraglie X Sindrome.Fraglie X Sindrome.
Introducción.Introducción. El sindrome de Fragil X es una causa comun del El sindrome de Fragil X es una causa comun del
retraso mental, el cual se debe a una deficiencia retraso mental, el cual se debe a una deficiencia en l proteina FMRP.en l proteina FMRP.
-Fragile X Mental Retardation Protein-.-Fragile X Mental Retardation Protein-.
FMR1 FMRPFMR1 FMRP
Gen ligado al Gen ligado al Cromosoma X. Cromosoma X.
(CGG)n lidera el silenciamiento transcripcional (CGG)n lidera el silenciamiento transcripcional del gen FMR1 del gen FMR1
FMR1 y sus paralogos autosomicos FXR! Y FXR2 FMR1 y sus paralogos autosomicos FXR! Y FXR2 codifican proteinas de union al ADN.codifican proteinas de union al ADN.
Comparten 60% de su identidad de aa.Comparten 60% de su identidad de aa.
FMRP Se une a RNA homopolimerico FMRP Se une a RNA homopolimerico (poly A).(poly A). Se une a un subset de ARN provenienteSe une a un subset de ARN proveniente del cerebro. del cerebro.
Citoplasmatica: incrporada dentro de un Citoplasmatica: incrporada dentro de un complejo complejo
ribonucleoproteico unido a un mensajero – ribonucleoproteico unido a un mensajero – FMRP- mRNP FMRP- mRNP
Purificada posee capacidad intrinseca de union Purificada posee capacidad intrinseca de union al RNA.al RNA.
El complejo FMRP-mRNP esta asociado con El complejo FMRP-mRNP esta asociado con poliribosomas traduccionales.poliribosomas traduccionales.
FMRP
UnaUna MUTACIÓN MUTACIÓN sin sentido en el sin sentido en el segundo dominio KH de FMRP segundo dominio KH de FMRP (1304N) que tiene como resultado un (1304N) que tiene como resultado un fenotipo grave de sindrome genera fenotipo grave de sindrome genera la incapacidad para la asociación con la incapacidad para la asociación con lo polirribosomas.lo polirribosomas.
Hipótesis:Hipótesis: Cuando FMRP está Cuando FMRP está ausente los mRNA normalmente ausente los mRNA normalmente asociados con el complejo FMRP-asociados con el complejo FMRP-mRNP podrían verse desregulados mRNP podrían verse desregulados traduccionalmente; lo cual llevaría a traduccionalmente; lo cual llevaría a deficiencias cognitivas en el cerebro.deficiencias cognitivas en el cerebro.
Objetivos:Objetivos: Microarrays Identificación de mRNAMicroarrays Identificación de mRNA asociados al complejo asociados al complejo FMRP-mRNP en cerebroFMRP-mRNP en cerebro de ratón.de ratón. Identificación de mRNA de celIdentificación de mRNA de cel humanas con el síndrome, que humanas con el síndrome, que polirribosomas anormales por polirribosomas anormales por
la la ausencia de FMRP ausencia de FMRP
Se obtendrá un subset de ARNm que se asocian Se obtendrá un subset de ARNm que se asocian a FMRP- mRNP in vivo que poseen pefil a FMRP- mRNP in vivo que poseen pefil polirribosómico anormal.polirribosómico anormal.
InmunoprecipitaciónInmunoprecipitación
Resultados:Resultados:
Aislamiento e identificación de mRNAs Aislamiento e identificación de mRNAs asociados con FMRP conteniendo asociados con FMRP conteniendo partículas de mRNP.partículas de mRNP.
Estrategia: inmunoprecipitar especificamente Estrategia: inmunoprecipitar especificamente FMRP conteniendo partículas de FMRP conteniendo partículas de mRNP e identificar los mRN mRNP e identificar los mRN coinmunoprecipitados usando coinmunoprecipitados usando microarrays. microarrays.
Inmunoprecipitación del complejo FMRP-mRNP.
A- Analisis de Western blot competitivo. Testear el anticuerpo
Para FMRP de ratón, se utilizan anticuerpos monoclonales (mAb 7G1.1) por inmunización de ratones knockout Fmr1 con FMRP. El epítope reconocido fue mapeado en una región de no homología con las proteínas Fxr1 y Fxr2.
Inmunoprecipitación del complejo FMRP-mRNP.
A- Anlisis de Western blot competitivo. Testear el anticuerpo
Western blot obtenido de SDS PAGE 7.5%
IP de FMRP con mAb7G1-1: Ig: Ac, none: nada, M2: proteína inerte, 7G1-1#1: péptido específico. Revelado con Ac 1C3
Inmunopresipitación de Inmunopresipitación de complejos FMRP-mRNPcomplejos FMRP-mRNP
Este Ac inmunopresipita al menos tres isoformas de FMRP.KO: no presenta FMRPa: isoformasd: Aclysate: lisado totalflow thru: lo que queda luego de IP.
B- Inmunoprecipitacion con mAb 7G1-1 y probadoo con anti- anticuerpo C13.
Western blot para Parálogos FXR2P y FXR1P revelados con: a: antiFMRP (1C3), b: antiFXR2P (A42), c: antiFxr1, d: Ig.
Extracción de RNA, obtención de cDNA y visualizado por autorradiografía.Observación de ARN poly A.
• Permiten analizar simultáneamente Permiten analizar simultáneamente la expresión de genes.la expresión de genes.
• La técnica consiste en fijar miles de La técnica consiste en fijar miles de fragmentos de DNA ordenados, a fragmentos de DNA ordenados, a una superficie sólida, generalmente una superficie sólida, generalmente de cristal.de cristal.
• Cada secuencia corresponde a un Cada secuencia corresponde a un gen diferente.gen diferente.
• El mARN es tomado de una célula El mARN es tomado de una célula o tejido particular, se realiza RT-o tejido particular, se realiza RT-PCR y se marca para generar una PCR y se marca para generar una muestra etiquetada. Esta muestra muestra etiquetada. Esta muestra es “hibridizada” sobre los “probes” es “hibridizada” sobre los “probes” del microarreglo.del microarreglo.
• La muestra marcada se encontrará La muestra marcada se encontrará con su secuencia complementaria. con su secuencia complementaria.
• La cuantificación de la expresión La cuantificación de la expresión génica se da por el procesamiento génica se da por el procesamiento de las imágenes obtenidas de los de las imágenes obtenidas de los microarreglos. microarreglos.
• Se puede utilizar mas de un Se puede utilizar mas de un fluorocromo para distintas muestrasfluorocromo para distintas muestras
MicroarreglMicroarreglososcDNA clones
(probes)
PCR product amplificationpurification
printing
microarrayHybridise target to microarray
mRNA target)
excitation
laser 1laser 2
emission
scanning
analysis
overlay images and normalise
0.1nl/spot
Se utilizaron matrices de oligonucleótidos, Se utilizaron matrices de oligonucleótidos, Affimetrix Murine Genome (MG-U74) y Affimetrix Murine Genome (MG-U74) y Murine 19K (MU19k).Murine 19K (MU19k).
Se prepararon lisados de wt y KO. Del 20% Se prepararon lisados de wt y KO. Del 20% se aisló el ARN total (imput-RNA) y al resto se aisló el ARN total (imput-RNA) y al resto se le resalizó una imnunoprecipitación con se le resalizó una imnunoprecipitación con 7G1-1mAb,y se aisló el ARN del precipitado 7G1-1mAb,y se aisló el ARN del precipitado (ARN-IP)(ARN-IP)
Se generaron ARNc de las muestras de wt-Se generaron ARNc de las muestras de wt-ARN-IP, KO-ARN-IP y ARN-imput, y fueron ARN-IP, KO-ARN-IP y ARN-imput, y fueron hibridadas en paralelo con MG-U74.hibridadas en paralelo con MG-U74.
Análisis de los ARNm Análisis de los ARNm residentes en el complejo residentes en el complejo
FMRP-RNPm por microarreglosFMRP-RNPm por microarreglos
Análisis de los ARNm residentes en el Análisis de los ARNm residentes en el complejo FMRP-RNPm por complejo FMRP-RNPm por
microarreglosmicroarreglos
La identificación de los ARNm coinmunopresipitados con el complejo FMRP-ARNm se realizó mediante microarreglos de oligonucleótidos de “Affymetrix Murine Genome U74” (MG-U74) y “Murine 19K” (Mu19K). Se analizaron 25181 ARNs del la base de datos UniGene y 19021 mensajes de la base de datos TIGR.
Input: chip MG-U74 hibridizado con ARNc generado del ARN total de lisado wtWT-IP: wt ARN coIP con FMRPKO-IP: ARN IP de Fmr-1 KO.
ARN-imput muestra fluorescencia ARN-imput muestra fluorescencia intensaintensa
Menos del 0.05% del ARN total cambió Menos del 0.05% del ARN total cambió al comparar wt vs KO (no mostrado)al comparar wt vs KO (no mostrado)
En wt-IP se vé pérdida sustancial de En wt-IP se vé pérdida sustancial de intensidadintensidad
En KO-IP hay mayor pérdida. Las En KO-IP hay mayor pérdida. Las señales probablemente se debieron a señales probablemente se debieron a interacciones de fondo con la matriz de interacciones de fondo con la matriz de anticuerpos independientes de FMRP anticuerpos independientes de FMRP
De 25181 genes de la matriz, 11064 (44%) De 25181 genes de la matriz, 11064 (44%) estaba presente en wt-imputestaba presente en wt-imput
Se comparó el perfil de ARN-wt-IP con el Se comparó el perfil de ARN-wt-IP con el perfil del ARN-KO-IP, y luego el perfil de perfil del ARN-KO-IP, y luego el perfil de ARN-wt-IP con el perfil del ARN-imput.ARN-wt-IP con el perfil del ARN-imput.
Primero se identifica los ARN Primero se identifica los ARN independientes de FMRP, asociados con la independientes de FMRP, asociados con la matriz de anticuerpos y luego se identifica matriz de anticuerpos y luego se identifica los ARNm presentes en el wt-IP relativos al los ARNm presentes en el wt-IP relativos al wt-imput, descartando los que tengan alta wt-imput, descartando los que tengan alta abundancia en el wt-imput, ya que podría abundancia en el wt-imput, ya que podría ser responsable de su presencia en el wt-ser responsable de su presencia en el wt-IP. IP.
Análisis de los ARNs Análisis de los ARNs coinmunopresipitados coinmunopresipitados
con FMRP-mRNPcon FMRP-mRNPLa intersección de
432 (3.9%) sugiere que casi el 4% de los mensajeros se encuentran asociados a FMRP.
Diagrama de Venn de los ARNs asociados con el complejo FMRP-ARNmCuadro: genes disponibles en el MG-U74Blanco: genes detectados en el lisado total wt.Rojo: genes enriquecidos (4 veces o más) en el wt-IP comparado con el KO-IP.Verde: genes enriquecidos en el wt-IP versus el lisado total.Amarillo: genes enriquecidos en el wt-IP en ambos casos.
RNAs mensajeros asociados con RNAs mensajeros asociados con Fmrp-mRNP en cerebro de Fmrp-mRNP en cerebro de
ratón.ratón.
En la tabla 1 se muestran los 80 ARNm mas enriquecidos. El orden se estableció se por la suma: (wt-IP versus KO-IP) + (KO-IP versus input). El mayor enriquecimiento fue para el ARNm KIAA0763 relacionado con Sec7, identificado por homología como el factor intercambiador del nucleótido de guanina.
Se realizó otro experimento Se realizó otro experimento independiente de IP que se analizó en independiente de IP que se analizó en la matriz MU19Kla matriz MU19K
Usando los mismos criterios de Usando los mismos criterios de comparación:comparación:
36 de 80 genes no estaban en la 36 de 80 genes no estaban en la matrizmatriz
Se confirmó el enriquecimiento para 28 Se confirmó el enriquecimiento para 28 de los 44 que sí lo estaban.de los 44 que sí lo estaban.
Confirmación de la asociación Confirmación de la asociación entre FMRP-mRNP y los ARNm entre FMRP-mRNP y los ARNm
identificados por identificados por microarreglosmicroarreglos
Con el fin de demostrar Con el fin de demostrar independientemente que los ARNm en independientemente que los ARNm en la Tabla 1 están asociados a FMRP-la Tabla 1 están asociados a FMRP-RNPm.RNPm.
Se realizaron IP en presencia de Se realizaron IP en presencia de competidores:competidores:
ARNt de levadura y HeparinaARNt de levadura y Heparina
No alteraron la asociación especificaNo alteraron la asociación especifica
Se IP del lisado wt y KO, con una RNP Se IP del lisado wt y KO, con una RNP
nuclear pequeña (snRNP), U1-70K con AC nuclear pequeña (snRNP), U1-70K con AC
anti U1-70K mAb, simultáneamente con anti U1-70K mAb, simultáneamente con
FMRP-RNPm.FMRP-RNPm.
El Ac anti U1-70K precipitó eficientemente a El Ac anti U1-70K precipitó eficientemente a
este RNP del lisado wt y KO, mientras que este RNP del lisado wt y KO, mientras que
el AC anti FMRP el mAb 7G1-1 solo lo el AC anti FMRP el mAb 7G1-1 solo lo
precipita a este del wt como era esperado.precipita a este del wt como era esperado.
Western blot
Izq: IP con Ac anti U1-70K y revelado con AC anti proteína U1-70K.
Der: IP con AC anti FMRP 7G1 y revelado con AC anti 1C3 de FMRP
Lysate : lisado total
Paréntesis : Ac
El ARN recuperado de cada El ARN recuperado de cada precipitación fue purificado y precipitación fue purificado y
analizado por RT-PCR.analizado por RT-PCR.
Se realiza este ensayo con 8 ARNm Se realiza este ensayo con 8 ARNm previamente identificados, como previamente identificados, como enriquecidos en las IP de MicroArrays enriquecidos en las IP de MicroArrays del wild type.del wild type.
También para un set de ARNm También para un set de ARNm nono enriquecidos por la IP del wild type enriquecidos por la IP del wild type en los ensayos de MicroArrays.en los ensayos de MicroArrays.
Electroforesis en PAGE de los productos de RT-PCR.
Tot. ARN: ARN total de cerebro de ratón (0.1µg).U1: IP anti U1-70KF: IP anti FMRPIzq: marcador de peso molecular
ENRIQUECIDOS en MicroArrays
NO ENRIQUECIDO
ARNm:
RNP:
Para confirmar los datos del Para confirmar los datos del microarreglo, se realizó LightCycler RT-microarreglo, se realizó LightCycler RT-PCR cuantitativo (PCR en tiempo real) PCR cuantitativo (PCR en tiempo real)
del IP-wt y el lisado total wt.del IP-wt y el lisado total wt.El LightCycler permite la automatización de la PCR, cuantificando en tiempo real la amplificación de una secuencia blanco, mediante el uso de curvas estándar.
El fundamento de esta tecnología es la utilización de aire para el ciclo de calentamiento-enfriamiento al que se someten las muestras durante la corrida.
La cuantificación de los productos amplificados se realiza utilizando un micro-fluorímetro acoplado al aparato.En una corrida normal, 20 milisegundos son suficientes para medir una muestra.
Se realiza un análisis de Se realiza un análisis de LightCycler RT-PCR cuantitativoLightCycler RT-PCR cuantitativo a a 3 ARNm que 3 ARNm que nono se encontraban se encontraban enriquecidos en el wt-IP en relación enriquecidos en el wt-IP en relación con el input-IP.con el input-IP.
Simultáneamente se realiza este Simultáneamente se realiza este ensayo a 3 ARNm enriquecidos en el ensayo a 3 ARNm enriquecidos en el wt-IP en relación con el input-IP. wt-IP en relación con el input-IP.
Verificación de los datos de Verificación de los datos de microarreglos usando microarreglos usando
LightCycler Real-Time PCRLightCycler Real-Time PCR
En la tabla 2 se ve que de 3 ARNm testados que no se encontraron enriquecidos en los microarreglos de wt-IP, todos presentaron un pequeño incremento luego la RT-PCR.
Por otro lado, tres genes que si estaban enriquecidos en los microarreglos de wt-IP relativo al lisado total, se vieron altamente enriquecidos en el IP luego de la RT-PCR.
Estos resultados confirman los resultados de los microarreglos.
NO enriquecido
Enriquecido
Perfiles polirribosomales Perfiles polirribosomales alterados de ARNm en alterados de ARNm en
ausencia de FMRP ausencia de FMRP Se quiere definir algún atributo funcional Se quiere definir algún atributo funcional
de esta asociación. de esta asociación. Se realiza centrifugación en gradiente de Se realiza centrifugación en gradiente de
sacarosa, que separa los ARNm según su sacarosa, que separa los ARNm según su asociación relativa a los ribosomas.asociación relativa a los ribosomas.
Se busca observar cambios en los Se busca observar cambios en los perfiles de la fracción de polirribosomas perfiles de la fracción de polirribosomas para un sub-set de ARNm.para un sub-set de ARNm.
.
Fracción Polirribosomas
Espectro de
Absorción
Con las fracciones 9 a 11, se preparo Con las fracciones 9 a 11, se preparo ARNc para hibridar en Microarreglos.ARNc para hibridar en Microarreglos.
Se comparo perfiles de ARNm de Se comparo perfiles de ARNm de fracciones polirribosomales de cepa fracciones polirribosomales de cepa normal y con Fragile-X.normal y con Fragile-X.
Dendrograma de genes con cambios significativos en los perfiles de la fracción polirribosomal de las células Genes que están presentes en mayor nivel están representados con color rojo aquellos que presentan menor presencia frente al paciente se ven en verde aquellos con igual representación se ven en. FMR1 gen, se ve en menor intensidad tanto en la fracción total como en las fracciones poli ribosómicas
Para confirmar mas los datos, se examinó las distribuciones de NAP- 22 y MKPX en fracciones frescas degradiente de sacarosapor Northern blot
Ambos disminuyeron en las fracciones Ambos disminuyeron en las fracciones polirribosomales de las células de polirribosomales de las células de Fragil X, aunque no hubo diferencia Fragil X, aunque no hubo diferencia en el Arn citoplasmático total.en el Arn citoplasmático total.
Se revela un cambio más notable en Se revela un cambio más notable en el perfil traduccional de las células el perfil traduccional de las células Fragil XFragil X
GADPH fue el control, no mostrando GADPH fue el control, no mostrando diferencias a lo largo del graciente.diferencias a lo largo del graciente.
Se confirma el cambio selectivo en el Se confirma el cambio selectivo en el perfil traduccional de un subgrupo de perfil traduccional de un subgrupo de ARNm en ausencia de FMRPARNm en ausencia de FMRP
DISCUSIÓNDISCUSIÓN Diversos estudios han caracterizado el Diversos estudios han caracterizado el
comportamiento de unión al ARN de comportamiento de unión al ARN de FMRP .FMRP .
Aquí se identifica el repertorio de ARNs Aquí se identifica el repertorio de ARNs asociados in vivo con el complejo asociados in vivo con el complejo endógeno FMRP.endógeno FMRP.
Se muestran los cambios del perfil Se muestran los cambios del perfil traduccional en ausencia de FMRPtraduccional en ausencia de FMRP
Identificaión a gran escala de Identificaión a gran escala de ARNm asociados a FMRP-mRNPARNm asociados a FMRP-mRNP Se encontró que el complejo FMRP-mRNP se Se encontró que el complejo FMRP-mRNP se
relaciona con el 4% de los genes expresados relaciona con el 4% de los genes expresados en el cerebro de ratón.en el cerebro de ratón.
Mensaje de Fmr1:no está entre estos Mensaje de Fmr1:no está entre estos mensajes a pesar que estudios in vitro mensajes a pesar que estudios in vitro muestran la asociación de FMRP con su muestran la asociación de FMRP con su propio ARNm.propio ARNm.
Se detectó a nivel moderado en el lisado Se detectó a nivel moderado en el lisado cerebral del wt (diferencia de 144 con cerebral del wt (diferencia de 144 con imput) y no se detectó (como se esperaba) imput) y no se detectó (como se esperaba) en el lisado imput-KO.en el lisado imput-KO.
En comparación, 32% de los genes En comparación, 32% de los genes expresados tienen intensidades de expresados tienen intensidades de señal mayor que la de FMr1 en el señal mayor que la de FMr1 en el lisado imput.lisado imput.
Incremento moderado de 4,2 veces Incremento moderado de 4,2 veces en el transcripto FMR1 al comparar el en el transcripto FMR1 al comparar el ARN-wt-IP con el ARN-KO-IP, pero no ARN-wt-IP con el ARN-KO-IP, pero no se encontró enriquecimiento al se encontró enriquecimiento al compara el ARN-wt-IP con el ARN-wt-compara el ARN-wt-IP con el ARN-wt-inputinput
Aunque el transcripto Fmr1 podría ser un Aunque el transcripto Fmr1 podría ser un ligando de FMRP, según los datos ligando de FMRP, según los datos presentados, es probable que hayan otros presentados, es probable que hayan otros mensajeros con mayor avidez para el mensajeros con mayor avidez para el complejo mRNP.complejo mRNP.
En contraste con Fmr1, otros ARNm fueron En contraste con Fmr1, otros ARNm fueron detectados a nivele muy bajos en el lisado de detectados a nivele muy bajos en el lisado de cerebro wt input, mientras que estaban cerebro wt input, mientras que estaban enriquecidos en el complejo FMRP-mRNP.enriquecidos en el complejo FMRP-mRNP.
KIAA0561-like proteinKIAA0561-like protein
Prot. De intercambio GDP/GTP Rab Prot. De intercambio GDP/GTP Rab 33
Celera ARNm hCT25324Celera ARNm hCT25324
RT-PCR cuantitativo LightCycler RT-PCR cuantitativo LightCycler confirmó que el grupo de transcriptos confirmó que el grupo de transcriptos que se enriquecieron en los datos de que se enriquecieron en los datos de microarreglos también estaban de 30 a microarreglos también estaban de 30 a 60 veces enriquecidos en el wt-IP en 60 veces enriquecidos en el wt-IP en comparación con el lisado input comparación con el lisado input (incluye transcriptos de tabla 1)(incluye transcriptos de tabla 1)
Presencia de falsos negativos Presencia de falsos negativos
Ejemplo: caso del transcripto Ejemplo: caso del transcripto NAP-22NAP-22
Transcripto NAP-22Transcripto NAP-22
Microarreglo Mu 19K: Enriquecido en Microarreglo Mu 19K: Enriquecido en wt IPwt IP
Microarreglo MG-U74: No se detectóMicroarreglo MG-U74: No se detectó Muestra un cambio en su perfil Muestra un cambio en su perfil
traduccional en ausencia de FMRPtraduccional en ausencia de FMRP El RT-PCR cuantitativo mostró que se El RT-PCR cuantitativo mostró que se
enriquecía 63 veces en el wt-IP en enriquecía 63 veces en el wt-IP en relación con el lisado de cerebro total.relación con el lisado de cerebro total.
El microarreglo MG-U74 presenta El microarreglo MG-U74 presenta distintos oligonucleotidos que los de distintos oligonucleotidos que los de Mu 19K, es probable que los dos estén Mu 19K, es probable que los dos estén evaluando distintas isoformas o evaluando distintas isoformas o distintos miembros de la familia de distintos miembros de la familia de algunos genes.algunos genes.
Esta discrepancia, junto con el alto Esta discrepancia, junto con el alto nivel de rigurosidad utilizado en el nivel de rigurosidad utilizado en el análisis, sugiere que podrían haber análisis, sugiere que podrían haber subestimado el número de transcriptos subestimado el número de transcriptos asociados con FMRP-mRNPasociados con FMRP-mRNP
Asociación polorribosómica Asociación polorribosómica alterada de ARNm`s en alterada de ARNm`s en
ausencia de FMRPausencia de FMRP H. FMRP es incorporada al complejo H. FMRP es incorporada al complejo
mRNP con sus ARNm`s ligados mRNP con sus ARNm`s ligados asociándose con polirribosomas asociándose con polirribosomas traductores modulando la traducción de traductores modulando la traducción de los ARNm ligados.los ARNm ligados.
Microarreglo: Identificaron un grupo de Microarreglo: Identificaron un grupo de ARNm alterados en la fracción ARNm alterados en la fracción polirribosomal de alto PM en células X-polirribosomal de alto PM en células X-fragilfragil
Esto podría implicar unaEsto podría implicar una alteración en la regulación de alteración en la regulación de la traducción en ausencia de la traducción en ausencia de
FMRPFMRP
ARNm´s especificos de FMRP y ARNm´s especificos de FMRP y estructura de cuarteto de G´sestructura de cuarteto de G´s
Encontraron que sólo el 2% de los Encontraron que sólo el 2% de los genes expresados testeados genes expresados testeados mostraron un cambio en el perfil mostraron un cambio en el perfil traduccional en ausencia de FMRP.traduccional en ausencia de FMRP.
Problemas.Problemas.1)1) IP a partir de lisado de cerebro de IP a partir de lisado de cerebro de
ratón (Ac 7G1-1)ratón (Ac 7G1-1)2)2) Estudios en células humanas no Estudios en células humanas no
cerebrales.cerebrales.
Existen limitaciones al comparar los Existen limitaciones al comparar los sets de datos debido a expresión sets de datos debido a expresión tejido-especifico y a microarreglos tejido-especifico y a microarreglos especie-específicos.especie-específicos.
Sin embargo, los datos respaldan la Sin embargo, los datos respaldan la idea de que los complejos FMRP-idea de que los complejos FMRP-mmRNP reconocen ARNm específicos mmRNP reconocen ARNm específicos y regulan su traducción.y regulan su traducción.
H: Las proteínas de unión al ARN en los H: Las proteínas de unión al ARN en los complejos interactúan con elementos de complejos interactúan con elementos de regulación en cis específicos dentro de un regulación en cis específicos dentro de un grupo de ARNm, esto permite que los grupo de ARNm, esto permite que los transcriptos sean regulados a nivel post-transcriptos sean regulados a nivel post-transcripcional.transcripcional.
Tienen que existir elementos estructural Tienen que existir elementos estructural comunes entre el grupo de ARNm comunes entre el grupo de ARNm encontrados en los complejos FMRP-mRNP.encontrados en los complejos FMRP-mRNP.
Cuarteto de G`sCuarteto de G`s
Estas observaciones indican que la Estas observaciones indican que la estructura de cuarteto de G`s es relevante estructura de cuarteto de G`s es relevante
desde el punto de vista biológico en el desde el punto de vista biológico en el síndrome de x frágil.síndrome de x frágil.
ARNm`s ligados a FMRP y ARNm`s ligados a FMRP y patogénesis del síndrome x patogénesis del síndrome x
frágil.frágil.
Seria sólo un pequeño grupo de Seria sólo un pequeño grupo de ARNm`s ARNm`s
( los de mayor afinidad con FMRP) los ( los de mayor afinidad con FMRP) los que se ven influenciados por la que se ven influenciados por la ausencia de FMRP.ausencia de FMRP.
Consecuencias de la ausencia Consecuencias de la ausencia de FMRP.de FMRP.
Efecto tisular sutil: afecta regiones Efecto tisular sutil: afecta regiones de síntesis localizada de proteínas de síntesis localizada de proteínas (procesos neuronales), transcriptos (procesos neuronales), transcriptos reportados codifican proteínas reportados codifican proteínas involucradas en función neuronal.involucradas en función neuronal.
DESAFÍOSDESAFÍOS
Determinar cual de los ARNm Determinar cual de los ARNm candidatos es más critico en el candidatos es más critico en el síndrome X frágil.síndrome X frágil.
Fenotipo X frágil y otros trastornos Fenotipo X frágil y otros trastornos neuropsiquiatricos: los ARNm neuropsiquiatricos: los ARNm identificados aquí deben ser identificados aquí deben ser considerados como genes candidatos considerados como genes candidatos también en otros trastornos.también en otros trastornos.