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GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

MICROBIOLOGA GENERAL

REA MICOLOGA

AO 2011

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TRABAJO PRCTICO N 1

Tema: Elementos a utilizar en el laboratorio de Micologa Tcnicas de siembra y aislamiento.

Objetivos Aislar hongos por los siguientes mtodos: siembra espontnea,

agotamiento en superficie, tcnica del anzuelo queratinoso, diluciones sucesivas y plaqueo directo de granos.

Materiales

Caja de trabajo: ansa, esptula, gancho, hilo, portaobjetos, cubreobjetos, papel de filtro, gasa, colorante Guegun, lquido de montar, KOH 20% P/V, Tinta china (1:2 con agua destilada), pinza, esptula de Driglasky.

Tubos de ensayo estriles. Tubos de centrfuga estriles. Pipetas estriles. Agua destilada y solucin fisiolgica estriles. Tween 80 estril. Cloranfenicol (5% P/V en alcohol etlico). Rosa de bengala (1/150). Embudo y gasa. Acido ctrico al 10%. Ansa calibrada. Pelos de caballo estriles. Tubos con Sabouraud glucosa en plano inclinado y en columna. Tubos con Sabouraud glucosa cloranfenicol en columna. Erlenmeyers estriles. Tubos con Agar Papa Dextrosa (APD) en plano inclinado y en columna. Placas de Petri estriles. Granos, materia fecal, tierra.

Tcnicas

1) Aislamiento de hongos ambientales por siembra espontnea: Se prepararan placas de Petri con medio de Sabouraud glucosa. Se colocan

las placas abiertas en lugares apropiados. Al cabo de 5 minutos se cierran las placas y se incuban a 28C durante una semana. Obse rvar. Efectuar una resiembra (repique) de las colonias de inters en tubos con agar inclinado para obtener un cultivo puro.

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2) Aislamiento y recuento de levaduras por agotamiento en superficie: Se siembran 10l de orina completa, previamente agitada, en la superficie

de placas conteniendo medios de Sabouraud-glucosa y Sabouraud-glucosa-cloranfenicol. Se incuba a 28C durante una semana, realizando el recuento de colonias y el aislamiento para la posterior identificacin de las cepas de inters. Factor para recuento: 100

3) Aislamiento de hongos queratinoflicos por la tcnica del anzuelo queratinoso:

En una placa de Petri estril se coloca una capa gruesa de la tierra en estudio, sobre ella se depositan pelos de caballo estriles y se humecta. Se incuba a 28C durante 15 a 30 das, aislndose lueg o los hongos de inters.

4) Aislamiento y recuento de hongos de suelo y alimentos por diluciones sucesivas:

Se colocan 10 g de suelo cuya poblacin fngica se desea estudiar en un erlenmeyer estril, se agregan a 90 ml de agua destilada y se agita, obteniendo luego una serie progresiva de diluciones (1/100, 1/1000, 1/10000, 1/100000). En placas de petri estriles se mezclan 10 ml de APD con 0,1 ml de rosa de bengala y 0,1 ml de cloranfenicol y se deja solidificar. Sobre las mismas se siembran 0,1 ml de las diluciones 1/1000, 1/10000, 1/100000, dispersndolas con esptula de Driglasky. Se incuba a 28C durante una semana. Se realiza el recuento de colonias (en aquellas placas que contengan entre 30 y 300 colonias) y el aislamiento de las cepas de inters. Esta tcnica puede emplearse tambin para alimento finamente molido sembrando las diluciones correspondientes en medio DRBC y DG18.

5) Plaqueo directo de alimentos particulados: Para el aislamiento de cepas fngicas a partir de alimentos particulados

(granos, semillas, trozos de alimentos) se emplea la tcnica de plaqueo directo. Los granos son desinfectados superficialmente sumergindolos 2 minutos en una solucin de hipoclorito de sodio (0.4 % de cloro activo dilucin 1/10 de lavandina de uso domstico). Despus de escurrirlas, las partculas son colocadas utilizando una pinza estril, a razn de 8-10 granos por placa, directamente sobre placas de medio DRBC (diclorn-rosa de bengala-cloranfenicol-agar) y DG18 (diclorn 18 %-cloranfenicol-agar) que se incuban a 25 C durante 5 das.

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TRABAJO PRCTICO N 2

Tema: Macromorfologa de las colonias fngicas Micromorfologa del desarrollo fngico vegetativo Tcnicas de siembra de cepas fngicas

Objetivos Describir macromorfolgicamente las colonias fngicas. Sembrar hongos para obtener colonias adultas, repicar cepas como parte

del estudio taxonmico. Identificar estructuras micromorfolgicas bsicas del desarrollo fngico. Aplicar la tcnica de cultivo de adhesin.

Materiales

Caja de trabajo. Placas de Petri con desarrollos de hongos filamentosos y levaduriformes

crecidos en distintos medios de cultivo slido. Placas de Petri estriles. Placas de Petri con medio de cultivo Sabouraud. Soportes en V. Agua destilada estril. Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Guegun o

lquido de montar para observacin de su micromorfologa.

Tcnicas

1) Siembra de cepas fngicas para obtencin de colonias adultas: Preparar placas de Petri con medio Agar Papa Dextrosa u otros medios

adecuados. Sembrar por un toque en el centro de la placa la cepa fngica (a partir de un cultivo puro). Incubar a 28C entre 5 7 das. Observar. Describir.

2) Descripcin macromorfolgica de colonias fngicas: Observar distintas colonias fngicas ya desarrolladas en los medios de

cultivo apropiados. Describir sus caractersticas macromorfolgicas como color, forma, aspecto, consistencia, velocidad de crecimiento, etc. como parte del estudio taxonmico de un hongo.

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3) Observacin microscpica de desarrollos fngicos: Observar microscpicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones

montadas con Guegun o lquido de montar de desarrollos vegetativos de hongos levaduriformes y filamentosos (tabicados y no tabicados) hialinos y dematiceos. Relacionar las caractersticas micromofolgicas con la macromorfologa que presentan las colonias fngicas.

2) Cultivo de adhesin: En una placa de petri estril, colocar un soporte en V y un portaobjetos

previamente flameados. Depositar sobre el portaobjetos 3 cuadrados de 1 cm de lado de un medio de cultivo apropiado. Sembrar los medios con el hongo en estudio y cubrir con cubreobjetos previamente flameados y enfriados. Colocar sobre la base de la caja de Petri agua destilada estril e incubar a 28C el tiempo necesario. Para su observacin retirar el cubreobjetos y colocarlo sobre un portaobjetos limpio en el que previamente se ha depositado una gota del lquido de montaje adecuado.

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CARACTERSTICAS MACROMORFOLOGICAS DE COLONIAS FNGICAS

COLOR ANVERSO REVERSO produccin de pigmento difusible

SUPERFICIE LISA ACUMINADA CRATERIFORME RADIADA UMBILICADA CEREBRIFORME

BORDE LISO RADIADO FESTONEADO LOBULADO

CONSISTENCIA BLANDA FILANTE ADHERENTE LEOSA

ASPECTO CREMOSO YESOSO CEREBRIFORME ALGODONOSO AFELPADO ATERCIOPELADO

DESARROLLO POBRE REGULAR ABUNDANTE

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TRABAJO PRCTICO N 3

Tema: Reproduccin asexual. Conidiognesis tlica.

Objetivos Reconocer micromorfolgicamente las formaciones de esporas asexuales y

conidios ms comunes de la reproduccin asexuada tlica Observar la micromorfologa de levaduras utilizando el medio de agar

harina de maz.

Materiales

Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maz). Caja de trabajo. Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Guegun o

lquido de montar para observacin de su micromorfologa.

Tcnicas

1) Observacin microscpica de elementos de conidiacin tlica: Observar microscpicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones

montadas con Guegun o lquido de montar de esporas asexuales y elementos de reproduccin tlica: clamidoconidios, macroconidios, microconidios, artroconidios (holo y enterortricas), tratando de caracterizar los elementos observados de acuerdo a los criterios de clasificacin.

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TRABAJO PRCTICO N 4

Tema: Reproduccin asexual. Conidiognesis blstica.

Objetivos Reconocer micromorfolgicamente las formaciones de conidios ms

comunes de la reproduccin asexuada blstica.

Materiales

Placas de Petri con medio de cultivo AHM (agar harina de maz) Caja de trabajo Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Guegun o

lquido de montar para observacin de su micromorfologa

Tcnicas

1) Observacin microscpica de elementos de conidiacin blstica: Observar microscpicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones

montadas con Guegun o lquido de montar de elementos de reproduccin blstica: holo o enteroblsticas a partir de clulas conidiognicas determinadas o indeterminadas, tratando de caracterizar los elementos observados de acuerdo a los criterios de clasificacin.

2) Siembra de levaduras en AHM: Dividir una placa de Petri conteniendo medio de cultivo AHM en cuatro

secciones. En cada cuadrante sembrar con ansa una levadura a partir de un cultivo puro. Efectuar la siembra realizando tres estras paralelas, con una separacin de 5mm aproximadamente y con un largo mayor a 20 mm. Colocar sobre ellas un cubreobjetos previamente flameado y enfriado. A las 48 hs. observar las caracteristicas micromorfolgicas del desarrollo.

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TRABAJO PRCTICO N 5

Tema: Reproduccin sexuada.

Objetivos Reconocer micromorfolgicamente las estructuras de reproduccin

sexuada

Materiales

Caja de trabajo Preparados de cultivos de diferentes hongos montados con Guegun o

lquido de montar para observacin de su micromorfologa

Tcnicas

1) Observacin microscpica de elementos de reproduccin sexuada: Observar microscpicamente (con objetivos de 10x y 40x) preparaciones

montadas con Guegun o lquido de montar de elementos de reproduccin sexuada: cleistotecios, peritecios, apotecios, ascos desnudos.

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TRABAJO PRCTICO N 6

Tema: Dimorfismo fngico

Objetivos Reconocer las caractersticas macro y micromorfolgicas de algunas

hongos dimrficos.

Materiales

Caja de trabajo Tubos de hemlisis con suero estril Colonias y preparados de cultivos de diferentes hongos dimrficos

Tcnicas 1) Produccin de tubos germinativos

Inocular 0,5 ml de suero estril con una pequea cantidad de levadura con aguja. Incubar a 37C, observar microscpicamente u na gota de la suspensin cada 30 minutos, hasta las 3 horas. La presencia de tubos germinativos permite la identificacin rpida de Candida albicans y Candida dubliniensis.

2) Observacin macro y micromorfolgica de cultivos de hongos dimrficos:

Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum

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LQUIDOS DE MONTAJE DE PREPARACIONES MICROSCPICAS

COLORANTE GUEGUN (Azul de algodn) cido lctico.............................................100 g Sudn III..................................................0.10 g Azul de algodn.......................................0.10 g Solucin alcohlica de Yodo..............10-20 gotas.

LQUIDO DE MONTAR Glicerina....................................................40 g cido lctico..............................................20 g Fenol cristalizado......................................20 g Agua destilada..........................................20 ml

MEDIOS DE CULTIVO

AGAR SABOURAUD GLUCOSA Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y mantenimiento de la gran mayora de los hongos patgenos

Peptona......................................................10 g Glucosa......................................................20 g Agar-agar...................................................20 g Agua destilada........................................1000 ml

Ajustar el pH a 5.6. Esterilizar durante 15 minutos a 121C.

Para preparar Sabouraud Glucosa Cloranfenicol agregar a la preparacin anterior 100 ml de solucin de cloromicetina (cloranfenicol) 0.5 %P/V (en etanol) antes de esterilizar.

AGAR PAPA DEXTROSA Extracto de papa......................................500 ml Glucosa......................................................20 g Carbonato de calcio..................................0.2 g Sulfato de magnesio heptahidratado........0.2 g Agar-agar...................................................15 g Agua destilada.........................................500 ml

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Extracto de papa: Pelar la papa y cortarla en trozos pequeos. Poner a hervir con 500 ml de agua destilada. Filtrar a travs de una gasa y reponer el volumen anterior. Aadir los otros componentes. Disolver por calentamiento. Esterilizar durante 15 minutos a 121C.

DICLORAN ROSA DE BENGALA CLORANFENICOL AGAR (DRBC)

Glucosa.....................................................10 g Peptona.......................................................5 g KH2PO4.....................................................1 g MgSO4.7H2O.............................................0.5 g Agar-agar................................................15 g Rosa de Bengala......................................25 mg (soluc. 5% p/v en agua, 0.5 ml) Diclorn.......................................................2 mg (soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml) Cloranfenicol............................................100 mg Agua destilada..............................................1 l

Despus de agregar todos los ingredientes, esterilizar por autoclavado a 121 C durante 15 minutos. PH final entre 5.5 5.8. Al macenar el medio ya preparado lejos de la luz ya que fotoproductos del rosa de bengala son altamente inhibitorios de algunos hongos, especialmente levaduras. En la oscuridad el medio es estable por ms de un mes a 1-4 C. Las soluciones stock de rosa de bengala y cloranfenicol no necesitan esterilizacin y tambin son estables por largos perodos.

DICLORAN 18% GLICEROL AGAR (DG18)

Glucosa.....................................................10 g Peptona.......................................................5 g KH2PO4.....................................................1 g MgSO4.7H2O.............................................0.5 g Agar-agar................................................15 g Glicerol......................................................220 g Diclorn.......................................................2 mg (soluc. 0.2% p/v en etanol, 1 ml) Cloranfenicol............................................100 mg Agua destilada..............................................1 l

Agregar los componentes minoritarios y el agar a aproximadamente 800 ml de agua destilada. Calentar para disolver el agar y completar a 1 litro con agua

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destilada. Agregar el glicerol. Notar que la concentracin final del glicerol es 18% p/p. Esterilizar por autoclavado a 121 C duran te 15 minutos. PH final 5.5 5.8, Aw: 0.955.

AGAR HARINA DE MAZ

Harina de maz amarillo.............................40 g Agar-agar...................................................15 g Agua destilada........................................1000 ml

Disolver la harina de maz en 500 ml de agua destilada. Calentar hasta disolucin completa. Filtrar a travs de gasa y reconstituir el volumen anterior. Aadir el agar disuelto en los 500 ml de agua destilada restantes. Volver a calentar hasta disolver todos los componentes. Filtrar hasta obtener un lquido transparente. Esterilizar durante 15 minutos a 121C.

AGAR SEMILLAS DE GIRASOL

Extracto de semillas de girasol...............200 ml Glucosa.....................................................10 g Agar-agar..................................................20 g Agua destilada........................................800 ml

Autoclavar 15 minutos a 121 C. Preparacin de extracto de semillas de girasol: Moler a polvo 70 g de semillas de girasol con cscara, agregar 350 ml de agua destilada. Autoclavar 15 minutos a 121 C y filtrar a travs de gasa estril .