micelle come nano-contenitori per sensori fluorescenti
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Micelle come nanoMicelle come nano--contenitori per sensori contenitori per sensori fluorescenti fluorescenti autoassemblatiautoassemblati..
Luca Pasotti
un contributo del Dipartimento di Chimica Generale dell’Università di Pavia, in collaborazione con l’ Institut de Chimie Moléculaire de l'Université de Bourgogne, Dijon e il Dipartimento di Chimica e Tecnologie Farmaceutiche, Università degli Studi di Palermo,
Un approccio molto efficace nella costruzione di Un approccio molto efficace nella costruzione di dipositividipositivi molecolari:molecolari:
utilizzare le micelle come strutture utilizzare le micelle come strutture autoassemblateautoassemblate per contenere molecole per contenere molecole che svolgono funzioni complesse.che svolgono funzioni complesse.
Diverse molecole Diverse molecole lipofilichelipofiliche possono possono inserirsi all’interno inserirsi all’interno della micella e della micella e interagire tra loro.interagire tra loro.
Approccio multicomponente
Sopra la CMC (critical micelle concentration)
Core Core idrofobicoidrofobico
Strato Strato idrofilicoidrofilico
= acqua= acqua
_ Sistema dinamico che permette diffusione al suo interno e scam_ Sistema dinamico che permette diffusione al suo interno e scambio con bio con l’esternol’esterno
_ Scarsa idratazione dovuta all’ambiente idrofobico_ Scarsa idratazione dovuta all’ambiente idrofobico
L’inclusione in micella influenza molto le proprietà L’inclusione in micella influenza molto le proprietà termodinamiche osservate delle molecoletermodinamiche osservate delle molecole
= SO3-=
N
logKlogK = 7.84= 7.84 logKlogK = 11.51= 11.51
N logKlogK = 10.77 in acqua= 10.77 in acqua
La micella di La micella di TritonTriton XX--100100
CMC = 2 x 10CMC = 2 x 10--44 M M
AN AN ~ 110/140~ 110/140
Aumentata concentrazione locale dovuta alla confinazione delle specie idrofobiche in un volume molto piccolovolume molto piccolo
Raggio medio 4.6 Raggio medio 4.6 nmnm
Volume medio 410 nmVolume medio 410 nm33
Tirando le somme
_lavoriamo in acquaacqua anche con molecole poco solubilipoco solubili
_il confinamento in un volume confinamento in un volume nanometriconanometrico e la scarsa idratazionescarsa idratazione all’interno della micella permettono l’approccio l’approccio multicomponentemulticomponente
Vedremo in particolare il funzionamento di due dispositivi molecolari:
Un sensore per H+ a finestra di pH
Un misuratore di lipofilicità
Sensori a finestra di pHSensori a finestra di pH
Sono dispositivi molecolari in grado di segnalare quando il pH si sposta da un’intervallo scelto.
Possono essere usati come indicatori fluorescenti che ci dicono quando, in un microambiente, il pH si sposta da un valore che sappiamo essere la situazione normale.
Sono facilmente regolabili sul range di pH richiesto.
Sensori a finestra di pHSensori a finestra di pH
fluoroforo Quencher pH dipendenti
logKlogK = 3.90= 3.90
logKlogK = 7.84= 7.84
Spostamento delle finestreSpostamento delle finestre
La costanti di La costanti di protonazioneprotonazione cambiano cambiano coco--micellizzandomicellizzando un un tensioattivo carico negativamente che stabilizza le forme tensioattivo carico negativamente che stabilizza le forme protonateprotonate..
Aumenta SDS
11.5011.5011.8811.8811.7311.7311.2011.2010.4210.429.909.909.139.138.518.517.847.84DNMeDNMe22
7.127.127.267.266.706.706.306.305.865.865.435.434.944.944.394.393.903.90DPiridDPirid..
110.90.90.80.80.70.70.50.50.30.30.20.20.10.100X SDSX SDS
SO3-
Micelle di Triton X-100 non sono biocompatibili e hanno scarsa stabilità alla diluizione.
Per questo scopo sono, invece, preferibili micelle micelle polimerichepolimeriche.
Poliaspartamide funzionalizzate: bassa CMC, alta stabilità alla diluizione, alta compatibilità biologica.
La carica negativa di SDS sposta la finestra a pH maggiori.
La carica positiva di CTABr (cetiltrimetilammonio bromuro) destabilizza le specie protonate e sposta la finestra a pH minori.
Controllo delle finestreControllo delle finestre
Misuratore di Misuratore di LipofilicitàLipofilicità
IUPAC - Lipophilicity “represents the affinity of a molecule or a moiety for a lipophilic environment”
Questa grandezza è biologicamente rilevante :
È uno dei parametri di cui tenere conto nel design di farmaci perché influenza la farmacocinetica: solubilità, assorbimento, metabolismo, distribuzione ed solubilità, assorbimento, metabolismo, distribuzione ed escrezioneescrezione sono fortemente influenzate dalla lipofilicità.
I metodi di valutazione comunemente usati sfruttano la ripartizioni delle molecole neutremolecole neutre attraverso sistemi bifasici: distribuzione liquidodistribuzione liquido--liquidoliquido(ottanolo-acqua, LogPLogP), distribuzione liquidoliquido--solidosolido (cromatografie su colonne a fase inversa)
Con questo metodo sfruttiamo la ripartizione tra le due pseudofasi micellamicella--acquaacqua, cercando di mimare l’interfaccia tra acqua e membrana cellulare a pH7.4 (lavoriamo con molecole carichemolecole cariche).
Le micelle non solo promuovono l’interazione tra sensore e substrato,
ma intervengono attivamente discriminando la molecole che possono entrare e interagire con il recettore
da quelle che non possono entrare e non provocano cambiamento nel segnale
OO
NNN
N
OO
O
O
NNNN
O
OO
O
Un sensore per spostamentoUn sensore per spostamento
Misuratore di Misuratore di lipofilicitàlipofilicitàsistema ONsistema ON--OFFOFF
[Zn(DTMCyc)(H2O)]2+ [Zn(DTMCyc)(OH)]+ FluorescenteFluorescente Scarsamente Scarsamente fluorescentefluorescente
LcZnLcZn::
NNN
NZnZn2+2+
O
O
O
OH
A pH 7.4
Molar concentration of added Zn complex
0.0 5.0e-6 1.0e-5 1.5e-5 2.0e-5 2.5e-5
If
100
200
300
400
500
600
700
wavelength, nm380 400 420 440 460 480
If0
50
100
150
200
pH 7.4 Aggiungo LcZn a una soluzione di PyCOO-
In acqua e In acqua e TritonTriton l’interazione è promossal’interazione è promossa
In acqua non c’è interazione, la In acqua non c’è interazione, la fluorescenza rimane a livello inizialefluorescenza rimane a livello iniziale
NNN
NZnZn2+2+
O
O
pH2 4 6 8 10 12
% o
f sp
ecie
s
0
20
40
60
80
100
I f%
(39
0 n
m)
50
100
150
200
250
300
PC
OO
H
[(C
12-M
e3C
ycle
n)Z
n(P
CO
O)]
+ PC
OO
-
Formazione del complesso LcZn-PyCOO-
Formazione del complesso LcZn-OH-
Scalzando Scalzando PyCOOPyCOO-- la fluorescenza si spegnela fluorescenza si spegne
fluorescenza del PyCOO- da solo
concentration of added CH3(CH2)nCOOH, molL-1
0 2e-5 4e-5 6e-5 8e-5
I f%
(39
0 n
m)
20
40
60
80
100 nn tra 0 e 3
nn tra 4 e 9
nn tra 10 e 15
condizioni: TX-100 10-2 M
Pyrene-COOH 8×10-7 M
Aggiungendo acidi carbossilici lineari [CH3(CH2)[CH3(CH2)nnCOOCOO--] ] alla soluzione di sensore si ottiene una variazione del segnale che dipende dalla lunghezza della catena
OO
O
O
NNNN
OO
NNN
N
OO
NNN
N
OO
OO
OO
OO
OO
OO
OO
OO O
O
OO
OO
OO
OO
NNN
N
O
O
NNNN
O
O
NNNN
n in CH3(3(CH2)nCOOH
0 2 4 6 8 10 12 14 16If a
t 4.
00 X
10-5
M C
H3(
CH
2)n
CO
OH
at
pH
7.4
20
40
60
80
100
esclusioneesclusione ripartizioneripartizione inclusioneinclusione
condizioni: TX-100 10-2 M
Zn(C12Me3Cy)]2+ 1.667×10-5 M
Pyrene-COOH 8×10-7 M
N
S
O
R
OO
NH2
O
NH
N NH
NH
O
NH
O
ON
N
O NH
O
O
NH
O
Ampicillin
Azlocillin
Mecillinam
Penicillin V
Nafcillin
OH
NH2
O
NH
O
NH
O
NH
ON
O
NH
ONCl
O
NH
ONCl
Cl
Amoxicillin Penicillin G
Oxacillin Cloxacillin Dicloxacillin
conc of added RCOOH
0 2e-4 4e-4 6e-4 8e-4
Flu
ore
scen
ce I
nte
nsi
ty
40
50
60
70
80
90
100
[C1-COOH][C4-COOH][C5-COOH]
[C6-COOH][C7-COOH][C8-COOH]
LogP
I f, r
elat
iva
Con lo stesso principio è possibile realizzare Con lo stesso principio è possibile realizzare anche un sistema OFFanche un sistema OFF--ONON
N O O
O
O
N NN
NCuCu2+2+
Cumarina 343Cumarina 343
Fluorescente su tutto il Fluorescente su tutto il rangerange di pHdi pH
LcCuLcCu
[Cu(DTMCyc)(H2O)]2+ [Cu(DTMCyc)(OH)]+
Abbiamo ottenuto un nuovo sistema funzionante spostato in una diversa regione spettrale (molte molecole biologiche assorbono nell’ultravioletto)
nm
pH2 4 6 8 10 12
0
20
40
60
80
100
If%
, (48
5 n
m)
0
20
40
60
80
100
% o
f sp
ecie
s
Co
um
CO
OH
[(C
12-M
e 3Cyc
len
)Cu
(Co
um
CO
O)]
+
Co
um
CO
O-
pH 7.4
Aggiungo il complesso a una soluzione 8x10-7 M di Cumarina 343
Formazione del complesso
LcCu-Cum
Formazione del complesso
LcCu-OH-
Scalzando la Scalzando la cumarina 343 la cumarina 343 la fluorescenza si fluorescenza si accendeaccende
Molar concentration of added Cu complex
0.0 5.0e-5 1.0e-4 1.5e-4 2.0e-4 2.5e-4
If, r
elat
ive
scal
e
0
20
40
60
80
100
120
wavelenght, nm
460 480 500 520 540 560 580
If
0
100
200
300
400
nn tra10 e 14
nn tra 4 e 9
nn tra 0 e 3
Ora aggiungendo gli acidi carbossilici lineari di varie lunghezze [CH3(CH2)[CH3(CH2)nnCOOCOO--] ] vedo una riaccensione
Concentration M
0 2e-4 4e-4 6e-4
I f %
100
150
200
250
300
350
OO
N
OO
OO
NNNN
N
OO
O
O
O
O
NN NN
N
OO
O
O
N
OO
O
O
OO
OO
OO
OO
N
OO
OO
NNNN
N
OO
OO
NNNN
OO
OO
OO
OO
OO
OO
O
O
NNNN
O
O
NN NN
condizioni: TX-100 10-2M
Cu(C12Me3Cy)]2+ 3.5×10-4M
Cumarina 343 8×10-7 M
esclusioneesclusione ripartizioneripartizione inclusioneinclusione
Concentration M
0 2e-4 4e-4 6e-4
I f %
100
150
200
250
300
350 [Ibuprofen] [Tolmetin] [Naproxen][Flurbiprofenen][Flufenamic acid][Diclofenac][Mefenamic Acid]
Delta If% (min = 100)
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
logP
lite
ratu
re
1
2
3
4
5
6
Antiinfiammatori non steroidei
OH
O O
OH
O
N
Cl
Cl
O
OH
O
OH
F
N
OHO
N
OHO
F3C
N
O
OHO
IbuprofenNaproxen
Diclofenac Flurbiprofen
Mefenamic acid Flufenamic acid
Tolmetin
ConcludendoConcludendo:
Abbiamo realizzato un sensore per pH facilmente controllabile, sfruttando il confinamento e il trasporto da parte delle micelle
Abbiamo realizzato un misuratore per lipofilicità sfruttando la capacità delle micelle di discriminare le molecole organiche.
Ringraziamenti:Ringraziamenti:
P.PallaviciniP.Pallavicini
Yuri Diaz FernandezYuri Diaz Fernandez
il LabFab e il NanoLab Generaleil LabFab e il NanoLab Generale
Giuseppe Chirico, Maddalena Collini, Laura D’Alfonso Giuseppe Chirico, Maddalena Collini, Laura D’Alfonso (Dipartimento di Fisica “G. Occhialini”, Università Milano Bicocca, Piazza della Scienza, 3, 20126, Milano)
Franck Denat, Franck Denat, YoanncRousselinYoanncRousselin, Nicolas , Nicolas SokSok ((Institut de ChimieMoléculaire de l'Université de Bourgogne, UMR CNRS 5260, 9 avenue AlainSavary - BP 47870 - 21078 DIJON cedex – France)