1 / 29

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice

rostlin

6. RAPD, ISSR apod.

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2011

2 / 29

RAPD – princip

► Random amplified polymorphic DNA (Williams et al. 1990)

► Hledáme polymorfismus DNA pomocí PCR reakce s1 arbitrárním primerem

► Sekvenci primeru volíme „náhodně“:» obvykle dekanukleotid» počet různých dekanukleotidů: 410 = 1048576» volí se primery se zvýšeným (60-70%) obsahem GC

→ stabilnější vazba při PCR (annealing, extenze při 72°C)

► V praxi se sekvence primerů „naslepo“ zkouší:» test většího počtu primerů» výběr těch, které dávají vhodné banding pattern (dost variability

a zároveň jednoznačné vyhodnocení výsledků)

3 / 29

RAPD – princip

► PCR reakce proběhne, pokud:» jsou přítomny komplementární sekvence k primerům na

protilehlých vláknech DNA

» jsou dostatečně blízko u sebe

► separace fragmentů elektroforézou na základě délky

► jsou vzorce na výpočet očekávaného počtu proužků (např. Williams et al. 1993), ale nefungují

nic(orientace)

nic(moc daleko)

4 / 29

RAPD gel

► agarosa (horizontální) nebo polyakrylamid (vertikální)

► barvení EtBr, SYBR green, GelRed apod.» ideálně po proběhnutí ELFO, post-staining

(minimalizace deformací a posunů proužků)

► vyhodnocení: přítomnost / nepřítomnost proužku» dominantní data (0 / 1)

http://pgrc3.agr.ca/

5 / 29

RAPD – vznik varibility

► Mutace v místě nasedání primerů (zánik / vznik místa)

většinou detekovatelný jen kratší produkt

► Inzerce / delece v amplifikovaném úseku

kodominantní

► Inverze apod.

6 / 29

RAPD – metodické problémy

► Metoda velmi citlivá na reakční podmínky PCR» koncentrace a čistota DNA» koncentrace primerů, Mg2+, polymerasy, složení pufru,…» konkrétní průběh teploty (rychlost zahřívání,…) → nutno

používat stejný cykler

► Relativně nízká teplota annealingu (35-45°C)» mismatched priming = amplifikace i z míst, kde primery nesedají

zcela přesně (mírně odlišná sekvence)» zásadních ± 8 nukleotidů na (3’ konci), zbytek nemusí nasedat

přesně» zejména u kratších fragmentů mohou vznikat stabilní smyčky z

daného vlákna DNA (konce mají komplementární sekvenci!) → horší amplifikace

7 / 29

RAPD – metodické problémy

► Neznámá genetická podstata proužků» nejistá homologie» dominance (nepoznáme heterozygoty), ale ne vždy

• až 5% kodominatních proužků (Williams et al. 1990)

» neznámá dědičnost (nukleární vs. organelové)• biperentální vs. uniparentální

» kompetice primerů apod.• ve směsi DNA dvou různých organismů se neamplifikují proužky z

obou stejně (pokud se mírně liší sekvence v místech nasedání primeru)

• mohou vznikat heteroduplexy (2 různě dlouhá vlákna) → jiná mobilita při elfo

• může nastat v genomu hybridů, allopolyploidů,…

» nespecifičnost – amplifikuje jakoukoliv DNA• endofytické houby, epifytické řasy,…

8 / 29

RAPD - standardizace► vyhodnocujeme jako dominantní data (0 / 1)

► intenzita proužků se neuvažuje» mohou být heterozygoti, ale nemusí

► obecně slabé produkty se neuvažují» raději méně spolehlivých znaků než

více, ale nespolehlivých

► krátké fragmenty (< 100 bp) se většinou neuvažují» zvyšuje se nejistota homologie

► podobně i u příliš dlouhých fragmentů» 1700 bp je na agarose téměř nerozlišitelné od 2000 bp

► všechny analýzy provádět stejně a na stejném cykleru

► všechny vzorky 2× (včetně extrakce!) » uvažují se jen pozice, kde jsou opakování shodná

9 / 29

RAPD – srovnání s jinými metodami

Výhody

► není nutná znalost genomu (univerzální metoda)

► relativně málo DNA

► jednoduchost a rychlost

► cena

► fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu

► velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.

Nevýhody

► citlivost na reakční podmínky, nesrovnatelnost mezi laboratořemi → někteří recenzenti zamítají publikace založené na RAPD...

► dominantní data

► nejistá homologie fragmentů atd.

► neznámá dědičnost fragmentů

10 / 29

ISSR

► Inter-simple sequnce repeats (Zietkiewicz 1994)

► podobný princip jako RAPD

► jako primery slouží mikrosatelitové sekvence» mikrosatelit (= simple sequence repeat, SSR) je jeden z typů

repetitivních sekvencí - několikanásobné opakování krátkého (2-6 bp) sekvenčního motivu za sebou

► amplifikují se úseky mezi dvěma mikrosatelity stejné sekvence a opačné orientace

flanking sequence CACACACACACACACACA flanking sequence

nic(orientace)

nic(moc daleko)

11 / 29

ISSR► menší citlivost na reakční podmínky než RAPD

► primery delší (cca 18-20 bazí) než u RAPD» vyšší teplota annealingu (~45-60°C) → přesnější amplifikace

(menší intenzita mismatched priming)

► primery zahrnující několik bazí flanking sequence = anchored („ukotvené“, např. GAGAGAGAGAGAGAGAYC) vs. unanchored (GAGAGAGAGAGAGAGA)» anchored primers neamplifikují vždy („selektivní báze“)

► někdy používán touch-down postup» vyšší teplota annealingu v prvních cyklech PCR → specifičtější

amplifikace, i když menší výtěžek» v dalších cyklech nižší teplota → vyšší výtěžek, specifita zajištěna

předešlými cykly

12 / 29

ISSR - gely

► separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza:» dlouhé gely (aspoň ~40x40 cm); agarosa 1-1.5% w/v, 80V

přes noc

» post-staining

13 / 29

ISSR - gely11 1312 24 25 47 48 49

T

26 50 52 T

53 T

111

113

T

114

T

123

124

125

131

132

159

160

164

112

KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR

► separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x

Carex, Jan Košnar1st run

14 / 29

ISSR - gely

► separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x

11 1312 24 25 47 48 49 T

26 50 52 T

53 T

111

113

T

114

T

123

124

125

131

132

159

160

164

112

KOR KAR BAL KEP SAF RYL SKA SKR

Carex, Jan Košnar2nd run

15 / 29

ISSR – fragmentační analýza

► separace fragmentů v sekvenátoru → fragmentační analýza

► fluorescenčně značené primery» pozn.: optimalizace – značený a neznačený primer stejné sekvence

se může lišit v požadavcích na jednotlivé parametry PCR

► separace fragmentů kapilární elekroforézou v sekvenátoru» vzorky nemigrují v čase lineárně, proto přidáván velikostní

standard (směs fragmentů DNA o známé délce)

» možnost kombinovat několik primerů značených různou barvou

» v naší laboratoři až 4 barvy (6FAM, VIC, NED, PET) + 5 barva size standard (LIZ)

16 / 29

ISSR – fragmentační analýza

Centaurea, J. Karásek & P. Koutecký

17 / 29

ISSR – srovnání s jinými metodami

► jako RAPD, ale spolehlivější, méně citlivé na reakční podmínky

Výhody► není nutná znalost genomu

(univerzální metoda)► relativně málo DNA► jednoduchost a rychlost► cena► fragmenty (teoreticky)

rozmístěny po celém genomu

► velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.

Nevýhody► dominantní data► nejistá homologie

fragmentů atd.► neznámá dědičnost

fragmentů► do jisté míry citlivost na

reakční podmínky, nepřenositelnost pro jiné studie, nutnost optimalizace primerů

18 / 29

Další podobné metody

► DNA amplification fingerprinting (DAF)» velmi krátké primery (5 nukleotidů)» různé teploty annealingu (vysoké i nízké)

► Arbitrarily primed PCR (AP-PCR)» delší primery (≥ 20 nukleotidů)» na začátku několik cyklů s nízkou t annealingu (mismatch), následně

cykly s vysokou t annealingu (přesná amplifikace)

► Sequence-characterised amplified regions (SCAR)» osekvenování vybraných RAPD proužků (vyříznutí, klonování)» specifické primery (≥ 20 nukleotidů) komplementární ke koncům» primery jsou specifické pro daný lokus – lze rozlišit i kodominantní

varianty» delší primery = vysoká reprodukovatelnost

19 / 29

Další podobné metody

► random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)» kombinace 5‘-anchored ISSR primeru a RAPD primeru

» složité PCR cykly (primery mají různé teploty annealingu –střídání v různých cyklech)

» ISSR primer značený (fluorescenčně n. radioaktivně) → produkty amplifikované obou stran RAPD primerem nejsou vidět

► … a mnoho dalších metod využívajících jako primery:» specifické sekvence různých typů transpozonů

» kombinace retrotranspozonů a mikrosatelitů

» kombinace s restrikčním štěpením fragmentů

20 / 29

ISSR - aplikace

► populační genetika (diverzita, fragmentace,…)» ochranářská

» invazní

► klonální a prostorová struktura populací

► hybridizace

► rozmnožovací systémy

► taxonomie (vymezení a podobnost taxonů,…)

► (fylogeografie)

► (mezidruhové vztahy, fylogeneze)

21 / 29

Populační a ochranářská genetika

Crema et al. 2009, Plant Syst. Evol. 280: 29–36

► Primula apennina, endemit► 6 populací „v řadě“, 9 primerů / 164 lokusů

► relativně velká variabilita – He,, Shanon. index(sexuál, hetorostylie, daleko létající opylovač)

► souvislost s pozicí populací (nejmíň na kraji,nejvíce v prostřední populaci)

► tři genetické skupiny (BAPS), zřetelný tok mezi populacemi► potvrzeno i Mante-

lovým testem(mírná pozitivní korelace)

www.primulaworld.com

22 / 29

Populační genetika / invaze

Ma et al. 2011, Weed Research 51: 363-372

► Flaveria bidentitis (Asteraceae) v Číně(pův. v jižní Africe)

► 26 populací, 10 primerů / 55 lokusů

► gen. diverzita v populacích (nejstarší popul.trochu bohatší, žádná korelace s velikostí,…)

► 2 větší skupiny populací, zhruba korelují s 2 hlavními silnicemi

► jinak rozdíly slabé, žádná další geografická struktura► interpretace: několikanásobné zavlečení, diverzita udržovaná

migrací mezi populacemi (má to hodně semen, dobře klíčí,…)

23 / 29

Taxonomie

Jiménez et al. 2009, Folia Geobot. 44: 145-158

► Narcissus sect. Pseudonarcissi, Španělsko

► spousta „podezřelých“ endemických druhů► 6 primerů – 89 lokusů + ITS sekvence► PCoA, NJ strom, (+ parsimonie pro ITS)

► 3 výrazné skupiny v PCoA► nesoulad s morfologií► některé druhy nelze rozlišit► podpořeno také ITS► návrh revize taxonomie

(spojení některých druhů)

24 / 29

Hybridizace

Ducarme et al. 2010, Folia Geobot. 45: 387-405

► Rhinanthus minor, R. angustifolius► test 100 RAPD a 100 ISSR primerů, výběr 8

druhově specifických lokusů (4 pro každý druh) ► hybridní index: čisté druhy -4 a 4,

F1 hybrid má 0, zpětní kříženci něco mezi

► 2 přírodní populace + 1 umělá

► vznik hybridů v umělé populaci► většina zpětných kříženců k Rh. angustifolius

vysvětlováno chováním opylovačů a většíautogamie u Rh. minor

► drobné meziroční fluktuace

25 / 29

Hybridizace

Lo 2010, J. Evol. Biol. 23: 2249–2261► mangrove rodu Rhizophora, 3 základní

druhy a 3 předpokládaní hybridi (morfologie, neklíčivost semen)

► 12 ISSR primerů (+ITS, cpDNA)

► privátní alely zákl. druhů; hybridi 0, ale celkově víc alel (součet rodičů)

► STRUCTURE identifikuje vždyhybrida (směs) i jeho rodiče

► NewHybrids: všechno F1 hybridi

► každá lokalita svůj ISSR genotyp → opakovaný vznik hybridů

► ITS, cpDNA: ukazuje naobousměrnou hybridizaci

jedna z lokalit, 3 druhy + hybrid

26 / 29

Rozmnožovací systémy

Han et al. 2009, Plant Syst. Evol. 277: 13–20

► Lotos nucifera v Číně► sběr semen (9-20) z 20 rostlin

+ dospělé rostliny, 10 populací► 5 / 12 primerů (28 / 173 lokusů)► porovnání potomstva a mateřský r.

v programu MLTR

► velká míra cizoprášení (>90%)► skoro žádný inbreeding (f ~ 0)► mírná autokorelace (podobné zdroje

pylu u blízkých mateřských rostlin)

+ obvyklá studie populací (AMOVA, Mantel test,…)

27 / 29

Identifikace klonů

Spagnuolo et al. 2009, J. Plant Res. 122: 161–170► invazní mech Pleurochaete squarrosa► identifikace klonů na ploše 35x40 cm

a na lokalitě řádu stovek metrů► studie variability v mediteránu

a sekundárním areálu► 5 primerů – 34 lokusů (+ trnL intron)

► multilokusové genotypy → velká klonální diverzita (viz obr.)

► zároveň velká vazba mezi lokusyjako indikace nepohlavního rozm.→ časté somatické mutace

► zřetelné odlišení vzdálených popu-lací → žádný tok genů

28 / 29

Prostorové závisloti (něco jako fylogeografie)

Belluci et al. 2011, Plant Biol. 13: 381-390► Tripodion tetraphyllum (= Anthyllis

tetraphylla) v sev. Africe► sucho, včetně intenzivních pastvin► 36 lokalit Maroko-Tunisko, z každé

semena, z nich ale jen 2-3 kytky (celk. 94)► 5 ISSR primerů / 32 lokusů (+ cpSSR + 1 morfol. znak)

► zřetelně klesající variabilita od západu k východu► 2 extrémní genotypy (STRUCTURE) na okrajích gradientu západ-východ,

plynulý přechod (klinální variabilita)► relativně velké rozdíly mezi „populacemi“ (autogamie)► zřetelné autokorelace na škále <400 km► asi migrace od záp. k východu a selekce ve prospěch určitého genotypu

na V okraji gradientu

29 / 29

Prostorová struktura populace

Matesanz et al. 2011, J. Ecol . 99: 838-848► společná populace Thymus vulgaris (hojný)

+ Th. loscosii (endemit) na ploše 10 m2

► prostorové rozmístění jedinců v 1m2 plochách + faktory prostředí (vlhkost, půda, pokryvnost,…)

► genetická variabilita (5 ISSR primerů pro druh)

► obecně shlukovité rozmístění obou druhů a negativní vztah mezi nimi

► u Th. vulgaris žádné klony, u Th. loscosii 79 genotypů ze 100)

► korelace mezi genetickou podobností Th. loscosii a abundancí Th. vulgaris – asi selekce genotypů Th. loscosii specializova-ných na určitou míru kompetice Th. vulgaris