métodos microbiológicos rápidos adriana bugno instituto adolfo lutz encontro abrasp 2011
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Métodos Métodos Microbiológicos Microbiológicos
RápidosRápidos
Adriana BugnoAdriana BugnoInstituto Adolfo Instituto Adolfo
LutzLutz
Encontro ABRASP 2011Encontro ABRASP 2011
Métodos microbiológicosMétodos microbiológicos
Não eram mentes investigativas conscientemente em busca Não eram mentes investigativas conscientemente em busca
de desenvolver novos métodos para um novo campo da de desenvolver novos métodos para um novo campo da
ciênciaciência
Exploradores guiados Exploradores guiados
pelo acaso ou pela curiosidade pelo acaso ou pela curiosidade
por problemas do dia-a-dia, para os quais não por problemas do dia-a-dia, para os quais não
se se
tinham respostastinham respostas
por imensa compaixão pelo sofrimento por imensa compaixão pelo sofrimento
humanohumano
A história da Microbiologia é uma estória de pessoas A história da Microbiologia é uma estória de pessoas
comuns e indivíduos peculiares, de zeladores, donas de comuns e indivíduos peculiares, de zeladores, donas de
casa, químicos, médicos, botânicos em buscas de casa, químicos, médicos, botânicos em buscas de
descobertas.descobertas.
Métodos microbiológicosMétodos microbiológicos
É uma história de eventos e fenômenos para os quais não se É uma história de eventos e fenômenos para os quais não se
tinham explicação, seguidos de observações para as quais não se tinham explicação, seguidos de observações para as quais não se
tinham aplicações óbvias, de eventual associação de causa e tinham aplicações óbvias, de eventual associação de causa e
efeito, tudo em um vasto campo de investigação. efeito, tudo em um vasto campo de investigação.
Porém, não foi o sofrimento humano que inicialmente motivou os Porém, não foi o sofrimento humano que inicialmente motivou os
investigadores, mas os estudos básicos e aplicados dos processos investigadores, mas os estudos básicos e aplicados dos processos
industriais, os quais abriram caminho para as aplicações médicasindustriais, os quais abriram caminho para as aplicações médicas
As Eras da MicrobiologiaAs Eras da Microbiologia
Alguns pesquisadores dividem a história da Microbiologia em Eras:Alguns pesquisadores dividem a história da Microbiologia em Eras:
5000 a.C.5000 a.C.Sécu
lo 17
Século 17
Século
18
Século
18
Século
19
Século
19
Sécu
lo 2
0
Sécu
lo 2
0
Sécu
lo 2
1
Sécu
lo 2
1
Era d
a
Era d
a
Espec
ulação
Espec
ulação
Era d
o
Era d
o
Cultivo
CultivoEra
da
Era d
a
Observ
ação
Observ
ação
Era d
e Estu
dos
Era d
e Est
udos
Fisiol
ógico
s e
Fisiol
ógico
s e
Molecu
lares
Molecu
lares
Era dosEra dosMMRMMR
Era da EspeculaçãoEra da EspeculaçãoOs micro-organismos interagem com o homem e seu ambiente desde o início Os micro-organismos interagem com o homem e seu ambiente desde o início
da humanidade, de forma positiva ou negativa. da humanidade, de forma positiva ou negativa.
Eventos e fenômenos para os quais não se Eventos e fenômenos para os quais não se
tinham explicação ocorriamtinham explicação ocorriam
Se não adicionar porções de pão ou bebida fermentada no próximo lote de Se não adicionar porções de pão ou bebida fermentada no próximo lote de
produção, o pão não crescia e as uvas não fermentavam.produção, o pão não crescia e as uvas não fermentavam.
Pessoas ficavam Pessoas ficavam
doentes sem que doentes sem que
houvesse qualquer houvesse qualquer
pista sobre a pista sobre a
natureza ou a causa natureza ou a causa
de seus males de seus males
castigo dos deusescastigo dos deuses
542 d.C.: epidemia atingiu Constantinopla e se 542 d.C.: epidemia atingiu Constantinopla e se
espalhou pela Europa e Ásia.espalhou pela Europa e Ásia.
Século 14: a mais famosa das epidemias, a Peste Século 14: a mais famosa das epidemias, a Peste
Negra, causou a morte de 30-50% da população da Negra, causou a morte de 30-50% da população da
Europa e de ~ 40 milhões no mundo.Europa e de ~ 40 milhões no mundo.
Século 15: a Europa foi atingida por uma epidemia de Século 15: a Europa foi atingida por uma epidemia de
sífilis.sífilis.
Século 16: epidemia de sarampo causou a morte de Século 16: epidemia de sarampo causou a morte de
100 milhões de pessoas no mundo.100 milhões de pessoas no mundo.
Era da ObservaçãoEra da Observação
A humanidade compreendeu que um mundo desconhecido e A humanidade compreendeu que um mundo desconhecido e
invisível estava ao seu redor. A partir do século 17, tem início a invisível estava ao seu redor. A partir do século 17, tem início a
busca por enxergar este mundo e aprender a lidar com ele.busca por enxergar este mundo e aprender a lidar com ele.
Em meados do século 17, Anton van Leeuwenhoek preparou lentes muito Em meados do século 17, Anton van Leeuwenhoek preparou lentes muito
melhores que as de seu tempo, sem qualquer intenção de encontrar melhores que as de seu tempo, sem qualquer intenção de encontrar
fontes de vida, mas somente movido pela curiosidade de poder ver fontes de vida, mas somente movido pela curiosidade de poder ver
pequenas coisas: insetos, tecidos, poeiras. Até que, por algum motivo, pequenas coisas: insetos, tecidos, poeiras. Até que, por algum motivo,
resolveu ver a água da chuva e encontrou “pequenas criaturas”resolveu ver a água da chuva e encontrou “pequenas criaturas”
Esta foi a era dos avanços no campo da microscopiaEsta foi a era dos avanços no campo da microscopia
Lazzaro Spallanzani – conceito de autoclavação, Lazzaro Spallanzani – conceito de autoclavação,
anaerobioseanaerobiose
Giovanni Battista Amici – lentes objetivas acromáticasGiovanni Battista Amici – lentes objetivas acromáticas
Carl ZeissCarl Zeiss
Ernst Abbe – lentes de imersão em óleoErnst Abbe – lentes de imersão em óleo
Era do cultivoEra do cultivo
Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a
microbiologia emergiu do período da simples observação. microbiologia emergiu do período da simples observação.
Apesar das descobertas feitas até então, a causa das doenças infecciosas Apesar das descobertas feitas até então, a causa das doenças infecciosas
continuava sendo totalmente desconhecida. continuava sendo totalmente desconhecida.
Louis Pasteur: em 1857, interessa-se por desvendar as razões dos Louis Pasteur: em 1857, interessa-se por desvendar as razões dos
processos de fermentação que transformavam açúcar de beterraba em processos de fermentação que transformavam açúcar de beterraba em
álcool, mas algumas vezes em ácido. Somente após compreender o papel álcool, mas algumas vezes em ácido. Somente após compreender o papel
dos micro-organismos no processo de fermentação, sua atenção se volta dos micro-organismos no processo de fermentação, sua atenção se volta
ao estudo das doenças infecciosas. ao estudo das doenças infecciosas. Joseph Lister: iniciou as práticas de antissepsia para prevenir a Joseph Lister: iniciou as práticas de antissepsia para prevenir a
contaminação microbiana durante cirurgias e partos.contaminação microbiana durante cirurgias e partos.
Robert Koch: “detetive de micróbios” durante uma epidemia de cólera. Em Robert Koch: “detetive de micróbios” durante uma epidemia de cólera. Em
1873 começou os estudos com 1873 começou os estudos com anthraxanthrax e deduziu que os micro-organismos e deduziu que os micro-organismos
eram a causa da morte de animais. Também fez as primeiras eram a causa da morte de animais. Também fez as primeiras
fotomicrografias de bactériasfotomicrografias de bactérias
Era do cultivoEra do cultivo
Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a Com algumas ferramentas básicas e alguns conceitos, a
microbiologia emergiu do período da simples observação. microbiologia emergiu do período da simples observação.
Desenvolvimento das técnicas de coloração:Desenvolvimento das técnicas de coloração:
Ferdinand Cohn: coloração de cortes histológicos com corantes Ferdinand Cohn: coloração de cortes histológicos com corantes
vegetaisvegetais
Robert Koch: técnica de fixação de bactérias e coloração com Robert Koch: técnica de fixação de bactérias e coloração com
azul de azul de metilenometileno
Erlich: técnica de diferenciação de bacilos da tuberculose por Erlich: técnica de diferenciação de bacilos da tuberculose por
coloraçãocoloração
Gram: técnica de diferenciação de bactériasGram: técnica de diferenciação de bactériasAvanços em imunologia, com a descoberta e produção de vacinasAvanços em imunologia, com a descoberta e produção de vacinas
Início dos estudos sobre insetos vetores e do desenvolvimento da Início dos estudos sobre insetos vetores e do desenvolvimento da
quimioterapiaquimioterapia
Era dos estudos fisiológicos e molecularesEra dos estudos fisiológicos e moleculares
O século 20 testemunhou grandes avanços: metabolismo microbiano, O século 20 testemunhou grandes avanços: metabolismo microbiano,
genética microbiana, biologia molecular, terapia antimicrobiana, genética microbiana, biologia molecular, terapia antimicrobiana,
desenvolvimento de meios de cultura seletivos e diferenciais, desenvolvimento de meios de cultura seletivos e diferenciais,
virologia, ...virologia, ...
Além dos conhecimentos básicos de bioquímica microbiana, os estudos do Além dos conhecimentos básicos de bioquímica microbiana, os estudos do
metabolismo microbiano tornaram possíveis o desenvolvimento de muitos metabolismo microbiano tornaram possíveis o desenvolvimento de muitos
métodos diagnósticos para selecionar ou diferenciar micro-organismos; métodos diagnósticos para selecionar ou diferenciar micro-organismos;
A taxonomia microbiana deixou de ser baseada puramente em A taxonomia microbiana deixou de ser baseada puramente em
características morfológicas e passou a considerar as características características morfológicas e passou a considerar as características
metabólicas;metabólicas;
Reclassificação de espécies e gêneros resultou do estudos de biologia Reclassificação de espécies e gêneros resultou do estudos de biologia
molecular;molecular;
O papel e a natureza do DNA nasceu de estudos para compreender a O papel e a natureza do DNA nasceu de estudos para compreender a
variação microbiana e a resistência a antibióticos - Em 1983, o DNA variação microbiana e a resistência a antibióticos - Em 1983, o DNA
transformou-se em ferramenta quando Karry Mullis desenvolveu a técnica transformou-se em ferramenta quando Karry Mullis desenvolveu a técnica
de PCR, que tornou possível a amplificação de DNAde PCR, que tornou possível a amplificação de DNA
Métodos microbiológicosMétodos microbiológicos
Todo conhecimento adquirido é o fundamento dos métodos Todo conhecimento adquirido é o fundamento dos métodos
analíticos utilizados até hojeanalíticos utilizados até hoje
E....E....
Os Os métodos microbiológicos clássicos ou de referência métodos microbiológicos clássicos ou de referência são:são:
Amplamente acessíveis;Amplamente acessíveis;
Harmonizados;Harmonizados;
Aceitos por agências regulatórias;Aceitos por agências regulatórias;
DemandamDemandam grande quantidade de materiaisgrande quantidade de materiais
alta capacitação técnicaalta capacitação técnica
tempo longo tanto na execução analítica como tempo longo tanto na execução analítica como
para para obtenção dos resultadosobtenção dos resultados
Custos relativamente altosCustos relativamente altos
Exigem crescimento microbiano da ordem de 10Exigem crescimento microbiano da ordem de 1066 células para ser células para ser
macroscopicamente visívelmacroscopicamente visível
Métodos microbiológicosMétodos microbiológicos
Ofereceu a base para o desenvolvimento de novas aplicações da Ofereceu a base para o desenvolvimento de novas aplicações da
ciência e de tecnologias inovadoras com potenciais vantagens ciência e de tecnologias inovadoras com potenciais vantagens
sobre os métodos clássicossobre os métodos clássicos
Os Os métodos microbiológicos rápidos métodos microbiológicos rápidos são desenvolvidos para:são desenvolvidos para:
Obter resultados analíticos confiáveis que assegurem de forma mais Obter resultados analíticos confiáveis que assegurem de forma mais
eficaz a eficaz a segurança do produto segurança do produto
Reduzir o tempo de detecçãoReduzir o tempo de detecção
Melhorar o isolamento, enumeração e caracterização de micro-Melhorar o isolamento, enumeração e caracterização de micro-
organismos, organismos, além de melhorar o fluxo para análise de múltiplas amostrasalém de melhorar o fluxo para análise de múltiplas amostras
Possibilitar automação, miniaturização e de intervenção durante o Possibilitar automação, miniaturização e de intervenção durante o
processo processo de fabricação – real timede fabricação – real time
Produtos estéreisProdutos estéreis
O controle de produtos estéreis visa assegurar a ausência de O controle de produtos estéreis visa assegurar a ausência de
Micro-organismos Micro-organismos viáveisviáveis
Toxinas microbianasToxinas microbianas
Substância pirogênicaSubstância pirogênica
PirogênioPirogênio
Endotoxina bacteriEndotoxina bacterianaana
Teste do PirogênioTeste do Pirogênio
Método Método in vivoin vivo
Alto custoAlto custo Manutenção de biotérioManutenção de biotério
Alta capacitação técnicaAlta capacitação técnica Analistas capacitados na técnica Analistas capacitados na técnica
analíticaanalítica
Habilidade para o manuseio de animaisHabilidade para o manuseio de animais
Demanda tempo excessivoDemanda tempo excessivo Preparação do testePreparação do teste
Obtenção de resultados (3 horas)Obtenção de resultados (3 horas)
Ensaio limiteEnsaio limite
Método clássico, oficializado em 1942 na USP XIIMétodo clássico, oficializado em 1942 na USP XII
Endotoxinas bacterianasEndotoxinas bacterianas
O teste do LAL é o primeiro MMR implantado na indústria O teste do LAL é o primeiro MMR implantado na indústria
farmacêutica para avaliação de produtos estéreis (1974)farmacêutica para avaliação de produtos estéreis (1974)
Método Método in vitroin vitro
Menor custoMenor custo
Menor capacitação técnica dos analistasMenor capacitação técnica dos analistas
Demanda menor tempo para a preparação do teste e para obtenção Demanda menor tempo para a preparação do teste e para obtenção
de resultados (1 hora)de resultados (1 hora)
Maior eficiência, especificidade, sensibilidade, exatidãoMaior eficiência, especificidade, sensibilidade, exatidão
Ensaios: qualitativos (formação de gel) e quantitativos (cinético)Ensaios: qualitativos (formação de gel) e quantitativos (cinético)
Portable Test SystemPortable Test System
Nova tecnologia para quantificação de endotoxinas Nova tecnologia para quantificação de endotoxinas
bacterianas, baseada no teste cinético do LALbacterianas, baseada no teste cinético do LAL
Maior facilidade analíticaMaior facilidade analítica
Menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de Menor tempo para a preparação do teste e para obtenção de
resultados resultados
(15 minutos)(15 minutos)
Possibilidade de monitoramento durante processo produtivoPossibilidade de monitoramento durante processo produtivo
Fonte: www.criver.comFonte: www.criver.com
Teste de EsterilidadeTeste de Esterilidade
Verificar a presença de micro-organismos viáveis em produtos Verificar a presença de micro-organismos viáveis em produtos
que tenham sido submetidos a algum processo esterilizante, que tenham sido submetidos a algum processo esterilizante,
pela inoculação em meio de cultura nutriente, que permite a pela inoculação em meio de cultura nutriente, que permite a
detecção de bactérias, bolores e leveduras, incubado por detecção de bactérias, bolores e leveduras, incubado por
temperatura e tempos adequadostemperatura e tempos adequados
Oficializado:Oficializado:
em 1932 na British em 1932 na British
Pharmacopeia e Pharmacopeia e em 1936 USP XIem 1936 USP XI
Teste de EsterilidadeTeste de Esterilidade
19361936
InoculaçãoInoculaçãodiretadireta
19381938
19401940
19421942
19441944
19461946
19481948
19501950
19601960
19701970
19801980
InoculaçãoInoculaçãoindiretaindireta
InoculaçãoInoculaçãoIndireta em Indireta em
sistema fechadosistema fechado
Fonte: www.millipore.comFonte: www.millipore.com
Teste de EsterilidadeTeste de Esterilidade
19361936
InoculaçãoInoculaçãodiretadireta
19381938
19401940
19421942
19441944
19461946
19481948
19501950
19601960
19701970
19801980
InoculaçãoInoculaçãoindiretaindireta
InoculaçãoInoculaçãoIndireta em Indireta em
sistema fechadosistema fechado
Caldo Caldo peptonadopeptonado
Caldo Caldo peptonado peptonado + gelatina + gelatina
+ solução de Litmus+ solução de Litmus
MeioMeioTioglicolatoTioglicolato
Caldo Caldo peptonado peptonado
+ mel+ mel
Caldo Caldo SabouraudSabouraud
Caldo Caldo Caseína Caseína de sojade soja
Teste de EsterilidadeTeste de Esterilidade
19361936
InoculaçãoInoculaçãodiretadireta
19381938
19401940
19421942
19441944
19461946
19481948
19501950
19601960
19701970
19801980
InoculaçãoInoculaçãoindiretaindireta
InoculaçãoInoculaçãoIndireta em Indireta em
sistema fechadosistema fechado
Caldo peptonadoCaldo peptonado Caldo peptonado Caldo peptonado + gelatina + gelatina
+ solução de Litmus+ solução de Litmus
Meio Meio TioglicolatoTioglicolato
Caldo peptonado + Caldo peptonado + melmel
Caldo Caldo SabouraudSabouraud
Caldo Caseína de Caldo Caseína de sojasoja
5 dias5 dias 07 dias07 dias14 dias14 dias
10 dias10 dias
A partir de 2000, 14 diasA partir de 2000, 14 dias
14 dias14 dias
Limitações do Teste de esterilidadeLimitações do Teste de esterilidade
Quanto aos aspectos analíticos, observa-se uma evolução na Quanto aos aspectos analíticos, observa-se uma evolução na
metodologia do Teste de Esterilidade, porém persistem algumas metodologia do Teste de Esterilidade, porém persistem algumas
limitações no que diz respeito à segurança de informaçõeslimitações no que diz respeito à segurança de informações
A falta de certeza absoluta quanto a esterilidade de todas as unidades do A falta de certeza absoluta quanto a esterilidade de todas as unidades do
lote, considerando que a análise é realizada em uma amostra lote, considerando que a análise é realizada em uma amostra
representativa (limitação estatística)representativa (limitação estatística)
Escopo limitado à detecção de bactérias e fungosEscopo limitado à detecção de bactérias e fungos – não adequado à – não adequado à
detecção de vírus, micobactérias, micoplasmas, micro-organismos detecção de vírus, micobactérias, micoplasmas, micro-organismos
psicrófilos ou termófilospsicrófilos ou termófilos
Além disso:Além disso:
DemandamDemandam quantidades expressivas de material e equipamentosquantidades expressivas de material e equipamentos
tempo longo para detecção (visual) do crescimento tempo longo para detecção (visual) do crescimento
microbianomicrobiano
capacitação técnicacapacitação técnica
Métodos microbiológicos rápidos aplicáveis aoMétodos microbiológicos rápidos aplicáveis aoTeste de esterilidadeTeste de esterilidade
Crescimento microbianoCrescimento microbiano
Correspondem:Correspondem: à automação de métodos existentes à automação de métodos existentes ou ou
estão baseados em tecnologias novasestão baseados em tecnologias novas
Objetivo de oferecer melhorias significativas em termos de rapidez, Objetivo de oferecer melhorias significativas em termos de rapidez,
exatidão, precisão e especificidadeexatidão, precisão e especificidade
Viabilidade microbianaViabilidade microbiana
RMM baseado no crescimento microbianoRMM baseado no crescimento microbiano
Medida de parâmetros bioquímicos ou fisiológicos que refletem Medida de parâmetros bioquímicos ou fisiológicos que refletem
o crescimento microbianoo crescimento microbiano
Fonte: www.biomerrieux.comFonte: www.biomerrieux.com
Fonte: www.celsis.comFonte: www.celsis.com
Bioluminescência do ATPBioluminescência do ATP
Detecção colorimétrica da produção de Detecção colorimétrica da produção de
COCO22
Bioluminescência do ATPBioluminescência do ATP
Fonte: www.celsis.comFonte: www.celsis.com
ATP é um conhecido marcador de viabilidade celular e o ATP é um conhecido marcador de viabilidade celular e o
potencial de seu uso para detecção de bactérias foi potencial de seu uso para detecção de bactérias foi
inicialmente descrito por Levin e Chapelle, em 1968inicialmente descrito por Levin e Chapelle, em 1968
O processo depende de reação enzimática aeróbica entre luciferina, O processo depende de reação enzimática aeróbica entre luciferina,
luciferase e ATP, que emite luz, entre outros produtos, a qual é medida por luciferase e ATP, que emite luz, entre outros produtos, a qual é medida por
um luminômetro ou por câmara com dispositivo de carga acoplada.um luminômetro ou por câmara com dispositivo de carga acoplada.
Detecção colorimétrica do CODetecção colorimétrica do CO22
Detecção do CODetecção do CO22 produzido pelo metabolismo ativo dos micro- produzido pelo metabolismo ativo dos micro-
organismosorganismos
Frascos de cultura contém um sensor colorimétrico Frascos de cultura contém um sensor colorimétrico
de COde CO22, recoberto por uma membrana permeável , recoberto por uma membrana permeável
apenas ao COapenas ao CO22
Fonte: www.biomerrieux.comFonte: www.biomerrieux.com
COCO22 gerado atravessa a membrana e atinge o gerado atravessa a membrana e atinge o
sensor, que saturado com solução sensível ao pH, sensor, que saturado com solução sensível ao pH,
tem a cor alterada de verde para amarelo a tem a cor alterada de verde para amarelo a
medida que o nível de COmedida que o nível de CO2 2 aumenta. Os detectores aumenta. Os detectores
produzem sinal proporcional à intensidade de cor produzem sinal proporcional à intensidade de cor
e à concentração de COe à concentração de CO22 e os transdutores e os transdutores
eletrônicos mudem as mudanças de pressão eletrônicos mudem as mudanças de pressão
positivas ou negativas provocadas pela produção positivas ou negativas provocadas pela produção
ou consumo do gás durante o crescimento ou consumo do gás durante o crescimento
microbianomicrobiano
Fonte: www.biomerrieux.comFonte: www.biomerrieux.com
RMM baseado na viabilidade celularRMM baseado na viabilidade celular
Detecção microbiana através do uso de marcadores de Detecção microbiana através do uso de marcadores de
viabilidade (substrato de viabilidade)viabilidade (substrato de viabilidade)
Citometria de fase sólidaCitometria de fase sólida
Fonte: www.aeschemunex.comFonte: www.aeschemunex.com
Independe da proliferação microbianaIndepende da proliferação microbiana
Baseia-se no uso de corantes vitais dos componentes bioquímicos de Baseia-se no uso de corantes vitais dos componentes bioquímicos de
células microbianas viáveiscélulas microbianas viáveis
A amostra é escaneada por um detector laser e o número de células A amostra é escaneada por um detector laser e o número de células
marcadas (fluorescentes) é obtidomarcadas (fluorescentes) é obtido
Métodos microbiológicos rápidos na indústria Métodos microbiológicos rápidos na indústria farmacêuticafarmacêutica
Entre as vantagens dos MMRs podemos citar:Entre as vantagens dos MMRs podemos citar:
Confiabilidade e especificidadeConfiabilidade e especificidade
Rapidez e agilidade na liberação de resultadosRapidez e agilidade na liberação de resultados
Diminuição do número de etapas de trabalhoDiminuição do número de etapas de trabalho
Diminuição do erro analíticoDiminuição do erro analítico
Melhoria da qualidade dos processosMelhoria da qualidade dos processos
Redução de custosRedução de custos
A área clínica e a indústria de alimentos estão a frente na A área clínica e a indústria de alimentos estão a frente na
aplicação de MMR em relação à indústria farmacêutica, aplicação de MMR em relação à indústria farmacêutica,
provavelmente por uma regulamentação mais restritiva que provavelmente por uma regulamentação mais restritiva que
exige demonstrar a equivalência aos métodos de referência exige demonstrar a equivalência aos métodos de referência
e o atendimento dos parâmetros de validação analíticae o atendimento dos parâmetros de validação analítica
Validação de MMRValidação de MMR
Pode ser realizada segundo procedimentos descritos na USP Pode ser realizada segundo procedimentos descritos na USP
(Capítulo <1223>) e demais compêndios farmacopeicos ou no (Capítulo <1223>) e demais compêndios farmacopeicos ou no
documento PDA documento PDA Technical ReportTechnical Report 33 33
Parâmetros de Parâmetros de validaçãovalidação
Teste Teste QualitativoQualitativo
Teste Teste QuantitativoQuantitativo
ExatidãoExatidão NãoNão SimSim
PrecisãoPrecisão NãoNão SimSim
EspecificidadeEspecificidade SimSim SimSim
Limite de detecçãoLimite de detecção SimSim SimSim
Limite de quantificaçãoLimite de quantificação NãoNão SimSim
LinearidadeLinearidade NãoNão SimSim
FaixaFaixa NãoNão SimSim
RepetibilidadeRepetibilidade SimSim SimSim
RobustezRobustez SimSim SimSim
EquivalênciaEquivalência SimSim SimSim
Validação de MMR para Teste de EsterilidadeValidação de MMR para Teste de Esterilidade
Gram +Gram +
Gram –Gram –
LeveduraLevedura
Fungo filamentosoFungo filamentoso
AnaeróbioAnaeróbio
EsporuladoEsporulado
PDA Technical Report 33, PDA Technical Report 33,
20102010
Micro-organismos Micro-organismos
testeteste
Nível de Nível de
contaminaçãocontaminação20 UFC/mL20 UFC/mL
2 UFC/mL2 UFC/mL
0,2 UFC/mL0,2 UFC/mL
0,02 UFC/mL0,02 UFC/mL
ReplicatasReplicatas
50 a 100 testes 50 a 100 testes
pelo pelo
método método
convencionalconvencional
50 a 100 testes 50 a 100 testes
pelo pelo
método alternativométodo alternativo
Validação de MMR aplicado ao Teste de Validação de MMR aplicado ao Teste de EsterilidadeEsterilidade
Nível de Nível de inóculoinóculo
Proporção esperada deProporção esperada de N resultados N resultados positivos em positivos em
N=100N=100negativosnegativos positivospositivos
2020 < 0,001< 0,001 >0,999>0,999 100100
22 0,1350,135 0,8650,865 8787
0,20,2 0,8190,819 0,1810,181 1818
0,020,02 0,9800,980 0,0200,020 22
Avaliação estatísticaAvaliação estatística
Os métodos são equivalentes quando a proporção Os métodos são equivalentes quando a proporção
de resultados positivos e negativos obtidos em de resultados positivos e negativos obtidos em
cada um deles não apresenta diferença cada um deles não apresenta diferença
estatisticamente significativaestatisticamente significativa
Dificuldades na implantação de MMRDificuldades na implantação de MMR
Apesar das vantagens, devem ser consideradas algumas dificuldades Apesar das vantagens, devem ser consideradas algumas dificuldades
na utilização de MMR:na utilização de MMR:
Custo inicial de aquisição das tecnologiasCusto inicial de aquisição das tecnologias
Disponibilidade limitada de alguns insumos específicosDisponibilidade limitada de alguns insumos específicos
Necessidade de revisão dos critérios regulatórios por Necessidade de revisão dos critérios regulatórios por
agências como agências como FDA, ANVISAFDA, ANVISA
TreinamentoTreinamento
Necessidade de recursos suficientes e Necessidade de recursos suficientes e expertiseexpertise tecnológica tecnológica
para para realização dos estudos de validação e equivalênciarealização dos estudos de validação e equivalência
Considerações finaisConsiderações finais
A utilização de MMR corresponde a novas oportunidades na A utilização de MMR corresponde a novas oportunidades na
garantia da qualidade e segurança de uso de produtos garantia da qualidade e segurança de uso de produtos
farmacêuticosfarmacêuticos
Uma variedade de novas possibilidades estão sendo disponibilizadas, com Uma variedade de novas possibilidades estão sendo disponibilizadas, com
vantagens e dificuldades que devem ser consideradas na escolha da vantagens e dificuldades que devem ser consideradas na escolha da
tecnologia mais adequada à finalidade pretendida.....tecnologia mais adequada à finalidade pretendida.....
..... facilidades, praticidade, ..... facilidades, praticidade,
rapidez....rapidez....
..... Porém nenhuma tecnologia será tão perfeita que irá prescindir da ..... Porém nenhuma tecnologia será tão perfeita que irá prescindir da
avaliação dos dados por um avaliação dos dados por um microbiologistamicrobiologista! !
Adriana BugnoCentro de Medicamentos, Cosméticos e
SaneantesInstituto Adolfo Lutz
Av. Dr. Arnaldo, 355 – Cerqueira Cesar São Paulo/SP
Tel/Fax: 11 [email protected]