capítulo II páginas: 13-48REPR'DUCID. .'NFINES D'.ENTES Métodos en patología

Raimundo Carcía del Moral

Introducción

Auto p sio clínica y mé diurf or e nseAutopsia médicolegalAutopsia clínica

Patología quirúrgicaExamen macroscópico de biopsiasProcesamiento de los tejidos para su observación

microscópica

Citopatología

Métodos de coloracíón en anatomía patológica

Microscopía de luz polarizada

Histoquímica

Métodos de microsco pía electrónica

Métado s inmunohistoq uímrcosFluorescencialnmunohistoquÍmica

Cito me tría y c i to Íluoro me tríaAspectos básicos sobre citometría de flujo

Bibliografia

Introducción

Se designa como material anatornopatológ¡co todasaquellas muestras procedentes de individuos enfer-mos utilizadas para el diagnóstico o investigaciónetiológica de la enfermedad que padecen. De igualmodo, bajo la denominación de ffisrotecnología seincluye el estudio de los fundamentos técnicos ysecuencia metodológica necesaria para que puedallevarse a cabo el análisis anatomopatologíco.

I'NIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALAFACULTAD DE CIENCIAS MEDICASCLIRSO DE PATOLOCÍE_ TNNCER AÑO, FASE IIRaimundo García del Moral

CAPíTULO il

En este sentido, los departamentos de anatomípatológica han pasado de ser un páramo tecnolÓgco, cuya eficacia dependía principalrnente de la habliclad manual de los técnicos de laboratorio, a un conplejo mutrdo de procedimientos de laboratorio c¡:tfacilita la preparación de los teiidos no sólo para sestudio microscópico, sino también para su análisiinmunohistoquÍmico Y molecular.

El estuclio cle los tejidos enfermos puede realiza.se a partir de tres formas distintas de material anatrnopatológico procedente de: c) autopsias; bJ biolsias, y c') exte¡rsiones citológicas.

En los hospitales modernos, además de las autoisias, se remiten al Departamento de Anatornía Patrlógica todos los fragmentos que se resecan en el qurófano, todas las secreciones patológicas y granúmero de biopsias clínicas de prácticamente cuaquicr tejido u órgano. La introducción de la punciÓtaspiración y la necesidad de la comprobación histrlógica cle la mayoría de los diagnósticos clínicos t:acondicionaclo un aumento geométrico del núrnero dmuestras para rjiagnóstico citológico y/o anatotntpatológico.

Autopsia clÍnica y médicqlg1qse

Dependiendo de la finalidad con que se lleve a cal:la autopsia, existen dos modalidades distintas y clramente diferenciadas: autopsia médico-legal o forese y autopsia clínica.

Autopsia médico-legal^

Trata de investigar el origen de la muerte en l<casos en que existen irnplicaciones penales o civilttanto referentes a la propia causa del fallecimienlcomo en lo que respecta a Ias circunstancias dmismo. Desde el punto de vista técnico, la realizarnéclico forense por orden judicial. Las indicabionr

T4 Anatomía patológica general

osci lan según la legis lac ión c ie cada país; destacanentre otros motivos:

1) l .as muertes qLle ocLl r ren inmediatat t te l t te a lingreso de un paciet t te en e l hospi ta l , así conto en e lcaso c le rec ién nacidos ingresados en fase ternr inal .

2) I-os fallecidos con grancles lterid¿ts o por Irtuer'tes violentas.

3) ' l 'odos

los fallecimicntos cle causa desconociclao sospcchr-rsa.

4) Todos los suicidios.

Autopsia clínica

Al igual que la anterior, tatnbií:n prctr:rtclc conoccrla causa cle la tnuerte, aunquc cn este caso itrlportartmenos las c i rcunstar lc ias c l t t ¡ t t t r sobrevi r to. F,n losúl t imos años se han estanclar izar lo t rcs gran<les { r t r -pos clc uecrolrsias clí l l icas:

l . Necro¡rs ia per inata l , que estudia los cacl í lverescouprencliclos en el períoclo perinatal clef i lr iclt l ¡ lor laOMS ( fe tos o rec ién uac idos t l e l t es t ' r s t t l l c r i r ) r ü500 grarnos hasta los s ic te pr in teros c l ías r lc v idaextr¿iuterina),

2. Necropsia pet l iá t r ica, rc lat iva a l<ts cadi tv t : rcsde neonatos rle nrás dt: siete tlías clt: vjt la ], hasta los15 airos.

3. Necropsia de at lu l to , t :o t r i l t re t tc le e l r t rs to t ler:arlávcres.

La necr¡soidacl cle esta sistenlatizaciírn vierte deter-mirada prr r r var ios factores, entre los r ¡uc resal ta la

tl i fcreritte patok;{ía qtte se observa crl cacla uncl de losperíodos c lescr i tos. Así por e j t ' tnp l<1, las mal for¡na-

criones congí:nitas incom¡tati l-rlcs r:t in la virla extratrt t : r ina sot t e l e ic cet t t ra l c le l ¡ l r i t t rcr qrupo; los tutno-res l infoicles y lt:ttr:eltt ias, sínclrotttrt <le lnlri- 'rte súbitae in fecr : iones sol t la cat tsa ntas f rect tente de muerteen el seguttt lo, y las enfr,:rtnetlatles carcliovascttlaresy procesos c¿I l tcerosos y c le{er lerrat ivos los más

conruncs en el aclulto. Por otra lrartr:, de la necropsiaperinatal habitualmente form¿i ltarte funclahrental elconsejo genét ic t i f i t ta l , cos¿r qt r ( r t lo es tan t rascen-c lente para los restantes grL l l )os.

E,x is ten var ias técnicas t le aut t . rps i i r , pero todas

el las, s i se real iza l i a t lecuaclat .nt tnt t : , conducen a lc lsrnismos resrtltacios. 1,as variaciottt ls en la tí:cnica radi-can en e l or t lc ln y la forr r ra < le r l is t : t l r : iÓn. La exper ien-c ia c lcbe pcrut i t i r r : r l cat l¿t caso t t r ta¡ t tarse I )¿I ra con-scguir los fines tle forttta ít¡tt inut. [.¿rs t(:cnicas nlás fre-

cur)ntenrcnte ut i l izar las son:

1. ' l '(rcnir:a

der Virchow. Consiste' t:n la disección cleIt.rs (lrgattot; ¡tor sttparatlt), corl){.tt ' izaIt(lo por Ia cavi-dar l r : rat teal y s i r ¡Lr ien<lo l ror cr lc l l r l , cav ic lar l torác ic¿iy abr lontet t .

2 . Tí :cn ica i l r ' , ( l l ro l r . ( lonsis te t t ) Lrxf raer los órga-nos cn tres Lrlorltrcs, ctrello y tírrlx, abrlrlmen y rctro-

¡ r r : r i t o r r co , r ea l i zá r t r l osc l a t l i sec< ' i r i n se l l a rada < lecada bkrqt te.

l i . ' l 'écnica

rL ' Lc l r . r l le . Se t rat¿r t l t r la ext racc i í r r t enrun solo b loc lut : < le toc l¿rs las vís t :cras l l l r ra real izar larl iseccitin f r,rera r lcl catl iLr'(:r.

Antes de rcal izar l i t a t r to¡ ts ia, t : l pató logo c lebe( :ouoccr los datos c l í r l i t :os, t :o t t t r t r l t ls ¿rr l t te l l r , rs in tc-

Figura 2.1, lntagen nedionter tú crosc o ¡ t t o e s le reo scó pico t1e u nr:ili¡ttlro de bio¡tsirt rettal. Seatl u i erle n los flóc ulos gl o merulct-res ett fonno de un ouillo irregulart' roi izo tlt cupiktres.

Métodos en patologia l 5

Figura 2.2. Linfoma en el hilict deun bazo. La disección de todr,¡s lc¡scotnponentes del hilkt e.s ese¡¡t:¿t¡lplra un correcto estudic¡ dt' lnpte.zd.

r rogantes que se p lantearol l t i t t ra l l te c l c t t rso dc laenfermcdacl. Adenrás es preciso renlit ir ( loll la histo-r ia c l Ín ica un perrn iso escr i to y f i r tnaclo por la f a tn i l iaclirccta del paciente. Después cle realizar la tlutr rJlslrt,

quc puccle durar entre t tna y lnedia y c t tat r t i h t l r¿rs.se real iza un d iagnóst ico prov is ior la l t :on los hal laz-qos macros( :ópicos. La at t to¡ ls ia sc conl l l le ta, c les-pués del estudio microscópico t l c le ot ras técr t ic l iscomo micros<ro¡tía electrónica, ittmttnohistocluíntica,etc., con la remisiírn del protocolo, etl diagnÓstico def i-

n i t ivo y la corre lac ión anatomocl Ín ica de cada caso.Un ejemplo de tristoria y cliagnÓstico rlefir l i t ivo de ull;tautopsia aparece en las tablas 2.1 y'2.2.

El rnater ia l de autopsias rec ibe e l In isn lo t rata-miento que e l mater ia l de b iopsias, c lcpendiendo delas les iones macroscópicas encontradírs , la ex is ten-cia o Ito de diagnóstico previrl, ncr:esidarl cle correla-

c ión c l ín ica e in terés especí f ico por un t ipo c letermi-nado de les iones.

Patología quirúrgica

Una biopsia es una porc ión de te j ido obtenic la de

un individuo vivo ¡rara su estudio anatomopatológi-co. Según e l objet ivo perseguido a l real izar la tc lma,existen dos tipos fundamentales de bio¡isias: a) biop-sias de diagnóstico, y b) piezas quirúrgicas.

Las b iopsias de d iagnóst ico se real izat r con c l

ob¡et ivo fundamental dc concretar c l d iagnóst icohistopatológico (microscópico) cle ttna enfernleda(ly a l cual no se ha podido l legar por los nedios c l Ín i -cos habi tuales. En general , se caracter izan por ser

de pequeño tamaño, en ocasiones se t rata de c i l in-

dros o l i ten i r los ¡ lor prr t rc i í r t l de órgan' rs , que l lo

co rn ¡ r r cn i l en l a t o ta l i r l a t l de una l es i í r n . E je rn ¡ ; l cs

son l r ¡s c i l i l l r l ros r lc ¡ l t t t tc i í rn rcnal ( f ig . 2.1) y hel rát i -

ca . l as l t i o l t s i as c t l t á r l t ' as en de r l na tos i s , i as I l l ues -

t ras obl cn ic las l )or f i l r r : r l l ront :o.scopia, endosco¡ l ia

r l i ¡ lest i r ,a , et t ' .I-as piezas t¡uirúrrqir. l ir; son rle n)aYor tamañtl, pttes' '

to qr te suelcrn com¡rr t ' t t r ier órg; r t l t ls enteros e i l rc lu i r

la tota l i r lar l r le la lcs i i r t r a anal izar ( f iq 2.2) Hal l i t r . ra l -

ner)te, solt olttttt l i t l¿ts por erl <:iruj;rno ¡rara realizar el

t ratant ieuto de ut ra err f ermeclad, s i b ien c() l l lo cot l l -

p lemento in tpr tsc indi l : le debe real izarse e l estuc l io

anatonopato lógic t r cr rn la f ina l i< lad t le conf i rmat e l

d i¿tqnóst ic<1, esta l t l r :c t : l t rn pronóst ico y contr ibui r a

la planificaciírn clt: l trat¿rnietlto ulterior.l .as l t io¡ rs ias tanto t le : matcr ia l q t t i rúrg ic t l cot l l t l t le

or igen rnór l ic 'u tJe l tcr i r ¡ ln l i t i rse a l Departamento r le

Anatomía Pato ló{ ica i r tn lec l ia tatnente c lespuÓs r ie

Iraber sicio extraírlas. con el f in clt l que el anatomopa-

tó logo l . rueda valorat ; idecuaclamente las les iones

rnacroscópicas e indic¿rr las técnicas necesarias para

el cliagnóstico.

Examen macroscópico de bioPsias

El estuclio macroscóDii:o de biopsias y ¡riezas qui-

rúrgicas sc compone dt,r un coniunto de métodos per-

fet:tautente estructurarlos que definen una sisiemáti-

ca constat t tc i le t a t : t r . rac i í r l l para cada muestra. de

fr-rrma qut lcs result¿trl,. ls obtcniclos sean reproduci-

bles entrr: cl istintos pati logos.Los objetivos generrales quc se preterrden cunplir

con e l estudio nacroscóPico son:

16 Anatomía patológica general

aJ Describir exactamente el tifro de material renli-tido para estudio, incluyendo dimensiones clel nlismoy de las lesiones que contiene. además de especificarsu morfología, aspecto, coloración y, en el caso de laspiezas quirúrgicas, sus relaciones con estructurasvecinas. No debe olvidarse que en ciertos casos ladescripción macroscópica aporta tantos o nrás datosque la microscópica, tal y como ocurre en la patolo-gía vascular y cardíaca.

óJ Seleccionar detalladamente las áreas sobre lasque va a realizarse el estudio microscópico. Este pro-ceso, también conocido como muestreo o "tdllado"rjel material, es practicado de forma obligatoria porel pcrsonal facultativo.

Procesamiento de los tejidospara su observación microscópica

El microscoi t ic l es un inst rumento ó¡ l t ico r ¡ue,como su nombre indica (del qriego nloo, pequeño, vskopein, observar), permite ver objetos que por supequeño tamaño escapan a Ia perccpción del o johumano. Fue descubier to ¡ tor Anton von Leeurven-hock (16132-1723), que construyó var ios c ientos r le :microscopios a base tle clrientar lentes cle arrntcnto.El microscopio í rpt ico es e l inst rurnenlr ¡ de t ra l ta j r , tcaracterístico de los patólogos.

[x is ten dos t ipos de microsr :opios ópt icos o lo tó-n icos: microscopio s imple, estereosc<i¡ l ico o lu¡ ta yel microscopio compuesto o coniln, c¡ue pcrrrrite l;robservaciónjde secciones translúcidas y cr,rlorcadasde te j ido, y \por e l lo es e l inst rumento de t rabajocaracteristico de los patólogos.

Sin enrbargo, para que un tejido pueda ser obser-vado al microscopio se rec¡uieren dos condiciclnesprevias e lementales: aJ que e l te i ido conserve suestructura una vez separado del organismo de pro-cedencia, y b) que pueda ser seccionado en f i l lasláminas translúcidas, ya que por lo común los tejidosson opacos. En e l pr imer caso es necesar io l l revcrr i rde forma inmediata dos fenórnenos c legradat ivosmuy relacionados aunr¡ue conceptualmente diferen-tes, que llevan a la completa destrucción de los teji-rlos: autti l isis y putrefaccir.rn.

Autólisis es el proceso por el cual cles¡tués de lamuerte se produce la autodigestión enzimática celu-lar tras la salida del contenido l isosomial al citoplas-ma por rotura de la membrana delimitante de estr¡sorgánulos. Se denomina putrefacción al efecto queproduce la acción de determinacias toxinas y enzi-mas procedentes de microorganismos saprofitossobre los tejidos de forma que éstas complementat

el efecto lít ico de la autólisis hasta conseguir la totaldestrucción celular.

La fi lación tjsular consiste cn interrumpir los pro-cesos degradativos que aparecen tras la mucrte celu-lar, tratando de conservar la arrluitectLlra y compo-sición tisular lo más próxirna posible a la normalidad,de fornla que si se considera ai proceso vicla-nluer-te-degradación orgánica c() lno una secuencia c ine-matográfica, la fi jación en url nlomento determinadodel proceso proporcionarÍa rrna imagen estática delmismo que debemos procr l r¿rr comprenda los fotc l -gramas situados en mayor proximidad al instante dela muerte y, por tanto, al estaclo vital de los tejiclos.

De forma genérica, y se{irrl su lnecanismo de actua-c ión, los agentes f i jadores se r : las i f ican en dos { ran-des grupos: f i jadores pur rnótodos fÍsicos y fi jadorespor métodos c¡uínricos. En el ¡trimer caso ernplean elenfriamientrt por con(elar:ir in del tejiclo como méto-do para c letener la autó l is is v putrefacción t isu lar .l,ste tipo de proccdinrientos t:n l i i actualidad es esen-c ia l para preservar en c:orrd ic iones idóneas e l mate-r ia l c le estur l io para ¡ l rocedi rn ientos lnoler :u lares t lediagnírstico,

l ,os agentes f i jadores qrr í rn i r :os actúan insolu l ; i l i -zando l;rs proteÍnirs tisul;rres, lo cual bloquea la autó-l is is por inact ivaci í tn enzi r rht ica. De rnanera ac l ic io-nal , a lgunos de estos l íc¡u ic los f i jadores impic len e lcret:i l l iento bacteriano.

Aunque exis ten qrar) cafr t i ( lar l c le l íqu idos f i jado-res s imples, y r l i ferentes lu t :zc las de los mismos, e ln lás ut i l izar io r rsual lnente cs e l formalc lehído, gasincoloro, que se comerc i¿r l iza en soluc ión acuosasaturada al lJ7-40% (formalin;r concentracl,.r). En ana-totnía prato lógica se ut i l iza a l 10% en soluc ión denuever volúnlenes de agua clt un volumen de formali-na. Esta soluciírn del-¡e ser taniprinada a un pH de 7,que evita la formación del piqntcnto formolado, espe-c ia lmente en las prepar¿lc iones r londe hay muchasanqre. Otros fi jadorcs mcnos uti l izados son solucio-nes de ác ido acét ico, c le rncrcur io, c le a lcohol y deosrnio (fig 2.3).

El te j ido óseo despuós de f i jac lo se decalc i f ica ensohlciones decalcif icantes conlo írcido fórmico, ácidoclorhíc l r ico, ác ido nÍ t r ico, rc .s inas de in tercambioiónico o en una pila electrolít ica.

Una vez fi jadas las nluestras tisulares para estudiomicroscópico pueden ser preparadas de una granvariedad cle formas, aullque en su mayor parte requie-ren la inclusión en-Un nledio sóliclo. Este tipo de pro-ceder confiel-e a los tejiclos una dureza que impide lafragmentación de los misll.ros durante el corte, man-tiene las relaciones arquitecturales entre los distin-tos elementos y asegura Ia olttención de cortes muy

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Métodos en pati¡logÍa I 7

ffi *}i -,"* ; tÍ{ ;5;:-','';;ffig;!¡fiFigura 2.3. Linktma diluso rit; rttlulas qIandes: A) f ijartct con IJ,5; B) f iirtrto cr.'tt ltr¡nr¡\. Nótc'se que en Iu praparoción

fuñida con forrnol se. oprecian nt<:iar los dettilles celuk¡re's'

;ffi$,J.i$lbt:;i:*''i' ffiii ,, ,Sffi-ftffi"**ihi:;¡:' ." .-,t: " t;i;-r i;l i'*ü'- :,,iF*ffi $'t'-ffi

ffi$ ;1l'd*1;ffk, .,lru#ffi

f inos, regulares y ht t tuogr ineos. El pr inc ipal agente

empleado para la inc lus i í rn es la paraf ina, aprov$

chando la prcl¡riedad que Posee (le ellcolltrarse en

estac lo l íqu ic lo a temperaturas e l l t { ) rno a 55-60" C y

solidif icar a temperatLrra ambiellte.En los Deltartantentos cle Anatotnía Patológica este

tratamiento se realiza Inediarlte ¡lrocclsadores auto-

máticos que contienen múrlt iples vas(ls para realizar

los baños de deshiclrataciírrt y aclararniento y Ltn sis-

tema mecánico de transporte ¿r través cle ellos rer{tl-

lado por un progralrlador horario.Las b iopsias óseas para d iagnÓst ico de enf erme-

dades metabólicas suelen estudiarse sollre leiido l ic.r

clecalcif icado, incluido en sustancias l l lástici is dtrras,

del t ipo del metacrilato.La obtención de secciones t isu lares t ransl i rc idas

se real iza cor t un inst rumento de precis i í rn t lenonl i -

nado micrótomo ( f ig . 2.4) . Aunque exis ter t nunlero-

sos tipos de microtomos, el corte del material inclui-

do en paraf ina se real iza fundamentalmente con e l

rnicrotomo cle rotación o tipo Minot. La obtenr:lútl cle

cortes sobre teiido congelaclo se realiza ntediante el

denoninado cr i t ls tato, y la obtención de seccionespara microscopía electrónica, en el l lamado ultrami-

crotom0.Puesto que la mayoría de los colorantes uti l izaclos

no son solubles en paraf ina, los te j idos, t ras haber

sido cortaclos, deben ser desparafinados en xileno y

rehidratados previamente a la tinción.El criostato es un instrumento que permite la reali-

zación cle cortes de 4-5 nlicras de grosor ett biopsias

en lresco, previa congelación elt un tneclio adecuado'

Este microtomo real iza l r ls cor tes t ras e l lcastrar t . l

tejido en un medio hidrosoluble y aproximadamentc

a -20' C, El microtomo de congelación se uti l iza en la

preparación de cortes de biopsias en las que se van

a real izar tÓct t icas in lnunohistoquímicas o en las

biops ias ¡re roPer;tt orl as.

fo ¡ri,l¡rq-Ut!49&ttoria o intraoperatoria es Ia

qr-re envía el ciruiano clurante uua intervcnciíln c¡tri-

rúrgica con el f i l l <lc c¡ttr: se realice o conf irrne un diag-

n,:rit ico rlcl que tlcpcttcle Ia continuaciíln de la it l ter-

venciílt.l. ["]s nuv fi'ct:tltltlte en las intervenciones qui-

rúrq icas de i t t lo¡ l las ias para d iagnost icar la '

t 'nfcrnterlad, l lara tleterntinar la aft:ct¿iciírn de losr

extrcrnos rl¡: rest:ct:ií ln cluirúrgicos o I)ara ascgtlrar

la ariecuaciílt l <lt ' la Ittuestra totnada para cliagnítsti-

co posterittr. lrstas mu:stras soll collgeladas, a t:onti-

nuación se realizan varios cortes con ell criostato, qutl

se suelen tenir nal)itu¿Llnlente con hematoxil ina-eosi-

na v azul cle toluiclina. .Acttlahncnte se l ltrede, ell caso

neiesario, realizrrr casi cualr¡r-rier técnica histológica,

acor tar tc lo krs l i t ' t l r l l r ls de cacla rcacción a t ravés dr :

Figura 2.4. hli::rt¡t,ttno tle rotoción o de ti¡to Minot Í ie

oliser¿ u el tyon t't tlttttle tle rotat:ión puru inducir u¡.ta fue'r-

te it¡ercia il pctrtthlctqtle's e¡"t fonno de pinzo,qu.e inciLlü'a

sabre Iu cuc'hilla. ct¡kt<:atlct perpendicular al plano de 'la

irnaÉen.

18 A¡atomía patológica general

su real ización en un horno de microondas. l ln lamayoría de las biopsias peroperatorias se puede r€a-lizar un diagnóstico anatomopatológico en 4 o 5 minu-tos. La calidad de las muestras es metror clue con lastécnicas di fer idas, al mismo t iernpo ql le es l imitadala cantidad cle tejido que se estudia, por lo que eu unpequeño porcentaje de casos, inferior a[ 5l)á, el diag-nóst ico anatomopatológico real izado está sujeto aerrores. En estos casos el diagnóst ico def ini t ivo sedifiere 24-¡18 horas hasta estudiar las DreDaracionespernanentes.

Citonatoloqía

[,a citopatología es la parte cle la anatornía patológica c¡ue mecl iante d iversos procecl inr ientos estudialas alteraciones morfológicas de las c(¡lulas despren-diclas l ibrenlente de los e¡ritelios cle revestirniento ocxtraídas de distintas zonas del cuel'po humano.

Aunque el estuclio citológico comr:l lzó a realizarst:en e l s ig lo XlX, e l verdat lero in ipulsor r le la c i to logíac l ín ica actual fue Papanicolau (1881f 1962), quepublicó en 1943 una nlonografía sobre Dir¡gnóstico delcancer uterinc¡ ¡tor el frotis uctqi¡ru!. A ¡rarl ir r le estafecha, los estuc l ios c i to lóqicos st : fueron arn l t l iar r t l r imecl iante e l cstuc i i r ¡ r le ot ras cí : lu las r l r :s i 'a lnat lascspontánearnent e cl recor.{i ( l¿rs ¡tor rl ivcrso:: ¡-r rot:ctl i-mientos conlo raspa( lo r l t sr r ¡ ter f ic ies, ce p i l lar lo ylavado en explorac iones endc¡scópicas y, en e l¡nonento actual , con la in t rQr lucc i ( rn, a grat r escala,t le la punción.qon aguja f ina y su enrpleo r l i r i { ido at ravés de Ia v is ión garnmagráf ica, ccoqráf ica ornediante tomograf ía ax ia l conrprr tar izar la r ¡uc l ran¡rosibil i taclo el acceso a órganos qurr no pire<ir:n tlc.s-caniar sus células a una superficie o cavirlacl.

Depenr l iendo del n later ia l de estudio y forrna c leobtención de las nruestras se distinguen clos tipos depreparaciones ci topatolír gicas'. c i to pato kt gfu exfo l ia-tiua y cibpatulogío prtr punciórt uspiraci(ut con ugujufina (PAAil.

La c i topato logía exfo l ia t iva t iene ¡ lor objeto in ter-pretar las célu l¿rs t le l cuerpo hurnano r les l t rendidasde la epidennis, Ios epi te l ios c lue rev is tcn estructu-ras orgánicas abiertas al cxterior y el ntesotelio queta¡liza las cavidades r:orporales cerraclas (pieura,peritoneo, articulaciones, espacio raquÍdeo, etc.). Deforma genérica, las células pueden obti:nerse:

1) Por exfoliación forzada mecliantc irotanriento oraspado con diversos instrumentos a nivel rle Ia e¡ti-dermis y epitelios en continuación con ella.

2) Aprovechando los fluidos que vehiculan de

Figura 2.1-r. Citc¡ ltqírt e rfr¡l irtl i t, rt qi ttttc olóqica ltt ñida co¡tcl ¡nt tr'¡tk¡ rlt Pu¡trtrticokut. .<¡t, rtl¡.seruatt células displosi-cos e¡tt lt: l ioles un ttt¡tables di[t:r,.tncías en el Iurnuño t'coloración nuclear junto tI Ltbuttdantt:s grnttulor:itos neu-lrófik¡s.

forna es¡rontánea a los c lenl i ¡ntos c lescantados(esputo, or ina, etc . ) .

3) f 'or mecl io c le inst rurn lntos r le ex¡rkrrac i í rn o

¡" l i tnr : ión quc extra€rr l e l corr r l ; , r rnente l íquic lo r :c . rnr :é lu las crr sr rs¡ tensi í ¡ r l l ro t ' r , r lcr r te c le zonas of r láni -cas j n t r : rnas ( t ra<: to rcs 1t ! ra t r r l i o , l r rLro gast ro- in tes,t i na l , r : av i c l ad t : s sc ros¿ rs , e l r ' . ' ) . i ) c cs ta n la l l e ra l osterr i t r l r ic . rs orr lán icos n l Í rs f r . t ,<:u t :n tenlente in ter¡ t rc-t ¡ l< los en r : i t t i ¡ rato logÍa t :x f o l i l t iva son: aparato qt tn i -ta l f r rnre: r r i no. ¿ i r l ro l rcs l - r i ra t or io , a l tarat o d igest ivc l ,v Ías r r r inar ias y ¡ t r í rs t t r t , t . ¡ t ie l y <:av ic lac l t :s orqánicascon )o i ) r n t t ) t r co , l t l e r r ra , ¡ r o ; r : a r r l i o , r a r l u i s y a r t i cu -l ac iones .

La c i lg_iqgia¡2lf1-p.Ll¡ l t i ir r I -. r s1 r i r ¡1c i rl n c o n a (uj a f i naíJ}AD t iene por objc to c l cs lur l io r le cólu las separa-<ias c le krs ( r rqatros cn ( ¡ tc se as ientan n let l ianteextraccrón por punción con r rqLl ia f ina de 0,6-0,8 mmcle c l ián let ro, segui t la c l r : as¡ t i r i r t : ión forzada con unale r i nga ha l t i t ua ln len te con t ' c t , r c l a a u l l s i s te rna c ievacío o p is to la c iue real iz ; r la sLrc r : ión. l is ta técnica sedesa r ro l l ó i n i c i a lmen te de l r i r l o a l a neces idad deresul tados c l iagn( is t icos rá l r idos con un mínimo det rau lna pa ra e l pac ien t , : ' , pa r t i cu la rmen te en s i t ua -c iones en las que no podía r l isponerse de una b iop-s ia arJecuada, y su mayor Ínr¡ tetu prov ino, por unaparte, dei hrst i tu to Karc¡ l insk; r c{e Suecia, y por ot ra,clel f i ' lemorial (]enter for Cancr:r and All ied Diseasesde Nue¡va Y<lrk.

En pr inc ip io, la PAA.F es apl icable a cualquierterr i tor io orgánico no coniunicaclo f uncionalmentecon la superf ic ie corporal , a l t l tque los terr i tor ios

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Iüétorios en patología l9

explorados más habi tualmente son mama, t i ro ides,hígado, pulmón, tumores de te j idos b landos ypróstata.

De forma general , la c i topato logía como proce-

d in i i en to d iagnós t i co pe rm i te l a de tecc iÓn detumores, les iones preneoplás icas y d iversos t iposde i n fecc iones , s i endo de g ra r t u t i l i dad pa ra l a

de tec r : i ón p recoz de l cánce r ( { i g 2 .5 ) . Po r e l l o , l aapl icac ión de esta técnica en estudios c i to lÓgicosde cerv ix uter ino de gran par te de la poblac ión hahecho descender la morta l idad por cáncer de cer-vix.

El material citológico se obtiene de forma rápida y

sencil la, y su proce.samiento debe realizarse inmedia-tamente para ev i tar e l deter ioro c le las célu las. Secoloca una pequeña cantidad de la muestra sobre unportaobjetos efectuando ur ta cxtensión muy f inasobre el mismo. En el caso de lícluiclos se uti l izarr cito-centr í fugas o nrétodos de i i l t rac ión r luc concentranlas células. Para evitar su desecación se introduce l¿rextensión en un l íquido f i jador -a lcohol , a lcohcl -éter...- durante aproxintadamentc 1/2 itora o bien sepulver iza la superf ic ie con un nebul izador. Con J los-terioridad puede pasarse a la colora<:ión (ví:ase másadelarrte).

Métodos de coloración en anatomíapatolÓgica

En lunción de su capacidad cle trnión electrostírticaa los tej idos se dist inguen cuatro grupos fundamen-tales de colorantes: colorantes básicos, ácidos, nett-tros e indiferentes.

Los colorantes básicos estírn fornlaclos por moló-culas que cont ienen grupos cat iónicos clue son losresponsables cle la carga global básica del coloran-te. l 'or este motivo se utilizan ¡tara colorear estruc-turas ácidas, pr incipalmente contenidas en cl int+r ior de los núcleos celulares ett forma de ácidosnucleicos. EI pr incipal ejemplo de este t ipo de colo-rante es la hematoxilina.

Los colorantes áciclos, a la inversa de los anterir>res, cont ienen grupos fuertemente aniónicos y engeneral tiñen estructuras proteicas básicas conteni-das en los citoplasmas celulares o las fibras del inters-t ic io y membranas basales. Los ejemplos más nota-blcs son eosina, naranja G y fucsina.

l-or; Cp]-üil¡lc!09-U-tros se producen por la unióncie carácter salino entre colorantes áciclos y básicos¡rara formar un precipitado insoluble en agua y nuyestable en disolución alcohól ica. El ejemplo máscaracterÍst ico es Ia t inción de Giemsa, mediante la

cual las estructuras adr lu ieren una tonal idad pol Í -

croma.Los s0-l-qra$es-!Ldi!üll!:s son aquellos que colo-

rean los te j idos por un ut t :canismo de impregnación

f ís ica.Aunque existen rnúltiples técnicas combinadas de

tirrción r¡ue colorean Sllt.,balmente los teiidos, descle

muy ant iguo los h is topat í r logos emplean de for¡na

rutinaria una sola de ellas: la cle henlatoxil ina-eosina( f ig . 2. t i ) . Esto es debi t lo a la ext raord inar ia r iqueza

cle mat ices rosados y r r l ios que provoca la colora-

c ión con eosina unic lo a la t :xcelente def in ic ión nu-

clear originarla por Ia ltelttatoxil ina. En citología exio-

l ia t iva, y especia lmente cn c i to logía g inecológica, e l

rnétoclo reconlenciabltl ¡ ' máts uti l izado es el de l 'alla-

n ico laou, r lue ut i l iza la ht lnatox i l ina como cc¡ lorante

nuck:ar y tl iversas ne;;clas de coloratrtes citopl/rsrni-

cos cronro el narania (i t ' l vcrde luz y l i i eosina. I iste

hct:lro lc ¡lrr,rporciona \lt l i i qrall cromaticidad y trans-

¡ - rarencia, ¡ t t - ' r t t l i t ienck, I , i t l i lerenciac ión de los f inos

r leta l les c i to lóqic t ls sobre los que sc funclamenta e l

d iagnírst i t :o .Pr i r c l <to l t t rar io , r ln r : i t r l loqía l lor put t i : i í ru-aspi ra-

c i í rn es pref er ib ie la <:o l r l rac ió l r c le May-( i r i in lva l r l -( i iemsa c¡ l¿t t inc iór t rá1t i r1; - t con Di f f -Quik, qt te permi te

la obsorvaci í rn casi i l ls la t tá t rea c le la mttest ra s in

necesidacl clc f i jaciírn.Aclenlás r ie los mét t l t los de hematoxi l ina-cosina v

Papanicolaol t co l l lo ¡ t rot :e, l i tn iento rut inar i< ls en e l

c l iaqní¡s t i<:o anatom<l1 l ; t t o lógico ex is ten nunlerosas

técnicas dc colorac i í t t t t ts l lecÍ f icas para las c l iversas

f ' ,,

r r(:;. .\

Figura 2.{i. 'l-i¡tción tle 'ttt'tt:,l..tc¡.tili¡to er¡sitto de- un hígctdtt

dlun paciente con leskin tóxico de hepatocitos produt:ida

por tratamiento con fúrrqacos aue-rsiuos del olcohol.

i ;r:'^q':*9d I

o n Anatomía patológica general

Figura 2.7. Amiloidosis de uesícukts seminoles teñitlo conrojo Congo [,os depósitos tle. aniloüle se sitúon l¡ósknnen-te bojo la ¡nembrano bosal de los repliegues e¡titeliales.

estructuras y componentes celu lares y t isu lares(véase aclicionalmente la tabla 1.3).

Microscopía de luz polarizada

Ciertos com¡tuestos orgánicos tit¡nen rrn singr:larefecto al ser incididos por un rayo cle luz. I istas sus-tarrc ias t ienen los átomos d ispuestos c le ta l lnaneraque a su t ravés los rayos de luz únic¿i rnente pasanen ciertos planos tle vibración. Deterrnin¿lrkrs clisp<>sitivos, cornobl prisma inventaclo ¡tur el f rancés Nicolen el pasaddisiglo, permiten el paso de luz en un soloplano. De este modo, cuando la luz polarizada atra-viesa un cristal de cuarzo, gira el plano cle polariza-c ión, lo quc se ut i l iza en anatomía pato lógica paraidentif icar ciertas sustancias que dan un color carac-ter Ís t ico o b ien t ienen un ángulo caracter ís t ico deextinción de la luz polarizada.

El microscopio de luz polar izada consiste en unmicroscopio normal de luz, en el que se interpone unacuña de cuarzo y un cr is ta l de Nicol entre la fuentede luz y el ojo del observador.

Algunas sustancias identif icables con el microsco-pio de luz polarizada son la colágena, queratina, sus-tancia arniloide, síl ice, asbesto, cristales de uratos yotras muchas sustancias especialmente cle origenexógeno (figs 2.7 y 2.8).

Histoquímica

Figura 2.8. Ciis¡a1es de r.¡xuluto en un riñón terrninal uis-tos c()n microsutpío da. lttz ¡tolonzoda.

logía y bioquíntica y se uti l iza para identif icar susran-cias quimicas y determinar su significación en los teji-do.s y en las céirrlas. Hal¡itu¡rlmente, el ar{ente rnáscolnún a ident i f icar es una errz ima, ut i l izando paraello cliversas sustaltcias (r:romírgenos) que bajo taacción enzi¡nática se transfor¡nan ell strstancias inso-lubles opacas o coloreadas v is i l t les a l microscopio.Der este modo pueclen oltjetivarse oxidorreductasas,transferasas, rl iversas hirlrolasas, l iasas, isclnerasasy sintetasas.

Descle la introdrrcción cle anticrrerpos para la iden-t i l icac ión c le moléculas en la práct ica de rut ina enanatornÍa patológica, los métrtdos histoenzimáticoshan ido perdiendo terre l to en re lac ión con los c lebase inmunol í rg ica, ya que hoy c l Ía es más seuci l lodeterminar la ¡rresencia rle una enzima atendiendo asu estructura ant igénica que 0 su act iv idad b io lógi -ca. Sin embargo, las apl icacrones secundar ias de lahis toenzimología para c ientostrar la ex is tencia c leuna reacción inntune previa ut i l izando ant icuerposrnarcaclos especÍficamente con enzimas constituyela base c le la inmunohistor¡uímica, técnica hoy díaesencia l en anatonr Ía pato l í rq ica, b io logía celu lar einmunología (véase posteriormente).

Pese a todo lo expuesto, la deterrn inación de laactiviclad enzirnática cle un tt¡i ido todavía conservavigencia eu:

1. La biopsia cle ntúsculo esquelético.2. l,a iclentlf icar:i irn de r:élrrlas del sistema hemato-

poyético (i ig. 2.9).3. Realización de estudios neurohistológicos com-

plejos.

I

La histoquÍmica es una ciencia que combina histo-

Figura 2.9. Alfa-naftil-ocetatoesterasa en monocilc¡s y sus pre-cursores o niuel de una extensiónde médula ósea. La actíuidadenzimática se p¿lso de. ntunifiesk'¡ fr*imediante una sal de diazonio(Fast Red) que por acción de lae.nzino .sobrr: .su substrab setransformo en un coloran[e azobc.o d<z coktr rojo brillante.

Métodos de microscopía electrónica

Los objetos muy pequeños no pt re i len ser v is toscon e l ln icroscopio ópt ico por ser tnct r torr ls r lue lalongi tud de la onda de Ia luz. [ .as or tdas l t tminosasmás cor tas, como la u l t rav io leta, l ienen e l inconve-niente que no se pt reden enf t tcar ac l t :cuaclamel t te yrepresentarr una meiora muy l in t i t i tc la a l tn icrosccl -p io ópt ico. En 192i1el f rancés l ,ouis t le Brogl ie (1 | i75-1960) sospechó que las partículas sttbatírmicas debí-an ex is t i r también en forma t le onclas. Nt teve aüosdespués, el alemán Ernst Ruska (1907-1988) constru-yó e l pr imer microscopio e lect r t in ico, que perrn i t íaenfocar ondas-electrón. El perfeccionanlientc¡ cle laf uente de electrones y de las lelttes y la obtenci(rn cleuna cámara cle vacío muy estable por donde ¡-rasanlos electrones permite alcanzar aumentos de variasclccenas de miles de veces. Actualmente. adernás delnr icroscopio e lect rónico de t ransnr is i í r r r , los nt icr t ls-copios de barr ido y e l microscopio e lect rónico deexplorac ión por túnel permi ten a lcauzar l ími tesmolcculares.

Existen dos tipos de microsr:opios electrónic.os úti-les en morf r ¡pato logía: l ) de t ransnis ión, muy út i lpara la observación de las estructuras subcelulares,y 2) de barr ido o de "scanning", que inforn la de larr ror fo logia externa y composic ión molecular de Iast rs t nr<: l uras anal izadas.

La ttt icrutscopía electrónica de transnisi(¡n perrtt itea i r r l r : ¡ r tar var ias decenas de mi les de veces. l ,a pre-

¡laraciírn rk: las muestras precisa una óptinta fi jaciónrlcl nraterial y cortes extremadamente finos, para per-rnit ir el ¡laso del lraz cle electrones que pro¡rectará la

:i¡:\',.;,;

inla(en. I ' ,1 f i jador cle ekrt '<:iírn es el glut;rraldehído entanpórt fosfat t l ¿L t tont ' t : t t t rac iones e¡r t re e l2- ' , \ 'X ' y

coll lo segurl(lo fi jaclor, el tetr(lxido de tlstnio.I)ad¿r la cscasa ca¡rat rclatl r le ¡lenetraci(ln de e:stos

f i i¿it lorcs. las tnuttstr¿tl, ¿t esttlt i i¿rr se cortan en blo-

r lucs de I n l rn" . Post t : r iorn lcntc, e l tc j i t io inc lu ido en

una rcsina plírstica, soltrc torkr el Et't l t l 812, a base clc

arakl i ta o las e¡ tox i r res inas. A cc lnt inuación se real i -zan cor tes de 1 nrm dt : t :s l tesor con e l u l t ramicro lo-rno, que sc se t i i tc : ¡ t cr . , t t azt t l de to lu id ina o ct ta lquierr l t ra t ( rcn ica para contr t t l c le la zona c l i lc se v¿iya a

estudrar.Posteriorneltte a la rcaliz¿rción cle los corte:s cle

control r:on el ultrarlt icrotomo se recorta el bloque

con una cuchi l la para r le jar únicamente la zona de-

seada, en getteral uo sulterior al tatnañcl de un glomír

ru lo, y sc real izan cor tos u l t raf inos de 50-90 nrm de

espesor qu€l se contrastan con acetato de urani lo y

c i t rato r le 'p lomo y se l l lo t l tan en re j i l las metál icaspara su observaci r i l t e t t e l microscopio e lect rónicode transmisiírn.

El rnicrosco¡tio electrónico uti l iza como fuente de

luz un haz de electrones tle longitud de onda 100.000

veces inferior a la luz empleada habitualmente y obte-nido a partir de un fi lantento metálico de tungsteno,mediante apl icac ión dc una corr iente e léct r ica de

200.000-600.000 voltios. I 'ara que el haz de electrones

discurra por el tubo es necesaria la realizacitin del

var.:ít¡ e n su interior, doltcle es controlado por un sis-

tenla de lentes de c<1n.,'ergencia y enfoclue goberna-

das por ordenador.La panta l la de observaciÓn está formada por una

sustancia fluoresr:ente: rronectada a una cámara foto-

.,* "ffw#k

22 AnatomÍa patológica general

gráfica en los sistemas más antiguos y por una cálta-ra de TV en los modernos r r r i t ' roscopios.

Los tejidos muestran una distribución irregular clela materia, que se contrasta con Ia it lprepnación pre-v ia con osmio y p lomo, c le iorma c lue e l haz c ie e lec-trones al atravesar el objeto quedará retenido por laszonas dcrnde existe mayor densiclacl y, por el c{)ntra-rio, pasará l ibremente por las áreas rest¿mtes, hastainc id i r sobre la panta l la y or ig inar f luorescencia ¿reste n ive l . Todo e l lo determina c lue a l obsr : rvar e lobjeto aparezca un juego de sonlbras y fluoresccnciaverde br i l lante que compone la in iaqeu ¡ r royectac lael forma de sombra geométr ica del te j ic lo . [ ]orno lai rnagen así obtenida puecle ser l igeramente r le fec-tuosa, el dia(nóstico o análisis clefinit ivo de la ¡rrepa-ración se hace a partir de las foto(rafías en blauco yrregro ( f ig .2.10) .

La microsco¡r ía e lect rónica es un método lento,caro y l imi tar lo c lc d iaqnírst ico anatontopato l ( rd ico.Las a¡rl icaciones rníls inr¡tortarrtes en anatclntÍa ¡tato-lógica son el cstuclio cle alqultas enfenletlarJcs croui-cas c le depósi to, la local izac ión de r lep(rs i tos in¡nu-nes en las g lomerulone{r i t is y la c leterrn inación de lahis togénesis de a lguuos turnores. l .c is incol tvcnierr -tes nlás im¡tortantcs clel microscoltio elcctrírnico sonel r:xccsivo tienpo que rcquiere la 1-rreparacirin de lasmuestr¿rs, las d i f icr ¡ l tar les t ( t< 'n icas l tara reai izar l t r rc-nos cor tes y t inc iorrcs y la escasez r l t n tater ia l c¡ r r r . tprrec le estuc l iarse c le r :at la r :ast t . l lc r : icntcmcl l le s t :esthn apl icando técnicas inurrutot : i toqrr ín l icas ntar-

Figura 2.10. Ilicroscr.tpía eleclrrtnic'tt de urt iu¡¡tor tie vr,/ctr-thin de lo glándula sctliuar. ̂5'e oóst¡r.¿'rr el reL;r¿sti¡nietnto tle,céLulas oncocíticas con el citoplasnto rt:plt:lo tle nitocr.¡n-drias y cálulas l infoides ett el cstrott tu (x I I .JStt ) .

Figura 2.11, Irnogt,n ,tltrnt,slruclurul tle. un he.patociktdonde se ha trlentific:udr¡ t¡tt'dionle inmunocitoquí¡nrco cr¡nrtrr¡ coLr.¡idal el ctntíqt:tto t ore tlel uirus de Ia he¡tatitis B.Puedc upreciarso que l¡t tt¡rt.yor ocunuloción t;irttl ocurreen t.¡<:cinrlotl al nuclet,lt¡ ¡elulur y se de,tnue,slro p<tr Iu pnt-st'rtt:tct rle ¡torlícLtlc¡s elet. lnttlens(rs que correspontlen c orocr¡ It ¡ i Ll tt I rle yt s i f o d o l), ) r f i j o c ión r le l a n l i cuer¡to.sr:c¿r¡i¿1c,rú¡ nrurt'url¡; sr¡ttrc t,l prttrtrtrict si¡t nrurcor que re.t:onoce o!(¡nlíUrtú ).

ca l r r lo los ant i<: r rer¡ ros con oro colo ic la l o proteína Apara conr l r inar la espi '< : i f ic ic lad c le l procecl in t ientoirunune r;on cl alrírl isi l i rrltr; icstrt¡tural de las lesir-,rres( f i q . 2 .1 l ) .

l.a rrt ic rr tsr op íu t ' I t, r, trt itt ica de barrido prácticarnen-te n{r sc l ra ut i l izar lo p i r r .a r : l r l iagní is t ico. Aunque pue-dcn obst:rvarse írr,.r¿.1:; r¡lucll<¡ mayores sobre el con-to rno ex te r i o r < l r ' l os r , b j e tos , c ¡ue pe rm i ten v i sua l i -z;rr la ccrnrposicri ixl dc la.srrlrerficie celular (f ig.'2"1'2),sr i lamentr : s i rve l t r t r ; r r i l l t r :ner in fornración sobre laestnrctura r le l objc to ;u la l izado. Esta ú l t in ta i l l forma-c ión const i tuye e l f r rnt larnentc l c le los estudios demicroanál is is l )ar¿t cor) ( ) ( - ter la composic ión i í ln ica delas c i is t in tas estnrcturas subcelu lares.

Métodos inmunohis toquímicos

Los nétor los inrnunohistoquímicos comprendentodas acluellas técnic¿,s clue sirven para cletectar antigenos r:elrrlares o tisulales, basándose en reacclonesantígeno-ant ir : rrerpo. [ 'ara visual izar el lugar dondeocurre l¿r reacción antígeno-ant icuerpo se requiereemplear un trazador o marcador. El marcaje puede

IO

\tétoclos en patología 23

Figura 2.12. Imogen tridimensionoL ntetliunte microsut'pía electrónica de barrido de una célula tumoral de enfer-medad de l{<tdgkin en cultiuo ct¡ntt¡tttt¡.

real izarse con f luorocromos ( técni ( ras de inmuno-

f luorescencia) , enzi rnas ( técnicas inmnoenzimát i -cas) , iones metál icos en fornta colo idal ( té t rn ica de

innuno-oro) o isótopos radiact ivos. F, l a l t t ígenopuede detectarse tanto ¡lor marcaje tl irecto del anti-

cuerpo (técnicas directas) o uti l izanclo ult nlétodo de

narcaie secundar io, de los cuales ex is ten innumera-

bles procedimientos.

Fluorescencia

La f luorescencia es una forma de luni in isccnciaque se produce a par t i r c le una fuente de energía no

térmica.La f luorescencia pr imar ia o autof luorcscencia es

la que presentan determinadas sustancias cle forma

espóntanea, s in necesidad de ser modi f icac las; por

e jemplo, la lámina e lást ica de las ar ter ias ( f ig ' 2 .13) ,

colágena, lípidos, I ipctfuscina y tetraciclinas' La iden-

tif icación de dichas sustancias, por tanto, es relativa-

mente senci l la . más aún s isc t iene en cuenta que cada

una de e l las t iene una colorac ión especia l . l ,a auto-

fluorescencia puede observarse en cortes de conge-

lación posfi jados en etanol al 95%, sin teñir.En aquellos tejidos que no son autofluorescentes

se puede inducir f luorescencia -fluorescencia secun-

dalb- mediante tinción histoquÍmica con moléculasfluorescentes denominadas lluorocromos o uniendo

fluorocromos a attt icuerpos dirigidos frente a antíge-

nos tisulares; en este últ imo itroceclimicnto se funcla-mentan las técnicas de inmunol luorescencia ' L ,os

f luorocromos producen u i ra colorac ión verdosa'

amaril lenta o roja sobre la estructura donde se fi jan

(Fig. 2.14). Entre los colorantes fiuorocromos nrás uti-

l izados están el narania de acridina, el ioduro de p'¡6-

pidio y el bromuro de etidio para DNA, auramina para

bacilos ácido alcohol resistentes, f luoresceína y ficoe-

ritr ina para inmunofluorescencia y tioflavina'1' para

sustancia amiloide,El estuclio de la fluorescencia de una preparación

histo lógica se real iza por medio de un microscopio

equipado con una lánipara de luz ultravioleta'

Cúanclo un fenónleno sitnilar al descrito ocurre al

i luminar una sustancia con Ittz visible y la l iberaciÓtt

de energía se procluce de forma gradual, prolongán-

dose la emis ión de luz después de cesar la i lumtna-

ción del objeto, el fenómeno recibe el nombre ' le fos:

forescertcia,Las técnicas de inmunofltrorescenci4 fuero¡L intro-

cluciclas por Coonts y colaboradores en i94l y desde

entoncei se han ut i l izado arnpl iamente tanto l la t 'a e l

c l iag i róst ico c l ín ico conlo en invest igación t rás ica '

I lás icanrer t tc consistet t e l l poner de mani i iesto ¿rnt Í -qenos en los te j ic los por l l t t : t i io de ant icuerpos lnar-

caclos con fluc¡rtsceítla o fit loeritrina.La inn'utnoflttr¡resce nciu direda es la más sencil la y

h¡rl l i tLtal: consiste eln i ltclt l lar t lurante un cortcr pr:río-

do el telir lo con el artt icr-rrlr l)o correspondienl-e lnar-

c¿rc lo con ia f luoresceí t la o f i t oer i t r ina; los te j idos que

contierlen el antígeno soti fttt lrtemente fluoresr:elltes'

La ittt rutnr¡flttc¡rtt st:enr:ia inrlirec tu es m(lnos utlilizada,

aun( lLre t iene nt í r l t i l . l les l los ib i l idades: consiste en

estuciiar la prescncia de trn anticuerpo o ull antÍt¡eno

t isu lar por mccl io de su conjugación in ic ia l coo un

anticttcrpo no lnarcaclo v l lr lsteriormente con r' ln anti '

Figura 2.lll. Autr:¡fluorcsct:¡tciu omarillrt de las fibras el(ts-

tiias reduplicadns tle nanertt patolólica en el cursr' de la

hiperplasia miointimol que se asocia a hiperten:tión arte-

rrul.

24 Anatomía patológica general

Figura 2.14, Inmunofluctrescencia positiua que demues-tra depósitos copilores en ngregodos de IgG en uno glonrc-rulo ne fri t i s m e m br o n o p ro I i f e rul i u a.

cuerpo marcado con fluoresceína. La inmurlofluores-cencia se realiza en cortes de congelación de teiiclo

no fi jado. Estas técnicas son habituales para el esttt-

c l io de inmunocom¡r le ios y de ant icuerpos e l ) l ) iop-

sias renales cou glomerulonefrit is (f iq. 2.14) y en lriolr-

s ias de p ie l con enfermeclades s is térn icas de or iqeninmunológico. Más rec ientetnente const i t t lye l r la

base del estudio del contenidt¡ de l)NA irltrantrcleary de los antÍgenos'de la superficie cle lt ls lettt:ocitosmediante citometría cle flujo.

Los inconybnientes más importantels cie la innlu-nofluorescedcia son la necesidad cle ttn microsco¡lioequipado con una lámpara especial, la dif icultad dt:

observar la localización precisa del marcaje, ya quepor concepto la técnica inmunofluorescente es t¡nprocedimiento que impide visualizar adecuadamen-te el fondo histológico sobre el cual se ha producido

el fenómeno luminoso, y el hecho de que únicamentepueden estudiarse muestras de tejido fresco nofi jado.

Inmunohistoquímica

Desde principios de los años 70 se han ido introdu-ciendo nuevas técnicas de objetivación de la presen-cia de antígenos en los teiidos, basadas en la posibili-dad de unir químicamente un anticuerpo a un enzi-ma que actúa como trazador del rnarcaje.

Por este motivo, el lugar de la reacción antígeno-anticuerpo se visualiza añadiendo al final de la reac-ción el sustrato de la enzima más una sustancia,

denominada cromógeno. Como trazadores pueden em-plearse distintos tipos de enzimas, aunque la más uti-lizacla es la peroxida:;a, seguida de la fosfatasa alcali-na ( f igs. 2^15 y 2.16).

Los anticuerpos primarios indispensables para laaplicación de estas técnicas reconocen al antígenoproblema sobre los tejidos y pueden ser de dos tiposdiferentes: anticuerpos policlonales y anticuerposmonoclonales.

A través de la respuesta policlonal, que es la únicaposible bajo circunstartcias fisiológicas en los seresvivos, un animal es capaz de elaborar millones demoléculas diferentes de anticuerpos que reaccionancon la mayoría de los antígenos presentes en la natu-raleza. Cuando un antígeno macromolecular se introduce en un animal protluce la respuesta y prolifera-ción de varias clonas de linfocitos B que reconocende forma específ ica cai la uno de sus determinantesantigénicos. El resultarlo es la producción de una granvariedad de ant icuerpos que di f ieren en tanlaño,carga y afinidad. A este tipo de respuesta se le deno-nrina policlonal.

Desde un ¡runto de vi-sta prá.,t.o, la obtención de

¿ntLeUelpf6-pafi-sl9t1g-lc¡ se realiza inmunizando ilnanimal huésped con urta rnolécula específ ica puri [ i -cada (inmunógeno) elt l l tlttt: se encuerttra el antíge-no frcnte al cual se prr:tt'nde obteuer anticuerpos. !)laninal desarrollará ttna res¡tuesta humoral frente alirr rnuníl geno, ¡rrttcltrc ien cl o anticuerpos que se pL¡ e-den recolectar retal izart t lo sangrías y obteniendo eisuercl. El animal produt:e numerosas clonas cle célu-las plasmáticas, cacia tura cle las cuales es capaz deproducir un att t ict ierpo con t lna especif ic idad di ie-rer)te para t:acla ttno dt: los epÍtopos presentes etr elinrnunógeno.

[ ,os ant icuerpos pol ic lonales presentan una seriede inconvenientes en srr entpleo diagnóst ico o tera-péutico:

1) Falta de repro<lrrctibilidacl de resultados, ya quela respuesta inmune varía de unos individuos a otrosde la misma especie, e incluso también para unmismo indivicluo dependiendo clel momento en quese realice la extracción clel suero.

2) Obtención de r:alticiades limitadas que depen-den de los lotes de anintales inmunizados.

3) Purificación l¿rboriosa. La purificación de unantisuero se realiza nediante absorción con molécu-las o célrrlas afines a las empleadas para inmunizar alanimal.'fiene como objetivo eliminar a los anticuer-pos que reaccionan de forma cruzada no específica.

4) Incapacidad ¡rara discriminar determinantesantigénicos diferentes dentro de una misma molécu-la o célula. Por ello, los anticuerpos policlonales no

L2

Nfétodos en patología 25

se pueden diferenciar entre los antígenos que seexpresan en la membrana de una rnisma célula"

La técnica de obtención de anticuerpos monoclona-les fue desarrollada iror Kóhler y Milstein F,l objetivode su trabajo en un principio era estucliar ei mecatiis-rno de regulación de los genes que cociifican las inmu-noglobulinas. Para ello realizaron fusiones celularesentre mielomas murinos. LIn rnieloma es un t ipo detumor constituido por células plasmáticas; algunosde ellos son capaces de producir inmunoglobulinas-mielomas secretante.s-. Cuando el mieloma es secre-tante produce un único t ipo de inmunoglobul ina, lacausa de ello es que las células del tumor son de origen clonal, es decir, ¡rrovienen de una rinica célulamadre que sufrió la transformación rnali¡Jna.

En 1975, Kóhler y Mi lstein real izaron una fusiónentre las células de un nl ieloma murino y los esple-nocitos (linfocitos procedentes del bazci) de un ralírllinrnunizado con l tenr¿rt íes cle carnert . ' . l , t ¡s ct t i t ivoscelulares resultantes de esta fusión st ' denonrinat lhibridomas y son capaces de producir irtrnttttoglobu-linas que reconocen a los antígenos ttnt¡tleaclos en la

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ratón; las in inunoglobul inas que produce son del

¡nismo típo y con Ia misma especificidad que las codi-

l icadas por e l l in foc i io B.

El híbr ido resui tante c lc la fus ión da or igen, t les-

pués de v;iri¿rs divisionos. a l ln clcrn en el que todos

los híbridos que k-r constitrt-ven secretan ei ntistt ltr

t ipo de inrnunoglobulina. Se puede definir, pues' un

anticuerpo mr-¡noclonal co¡no el producto Oa unu scrla

clona de cé[Lrlas secretoras de inmunogl<;bulinas'

Las pr i r tc ipales venta ias del uso de ant icuerpos

monoclonales frente a los ¡lr l l iclonales son:

1. El anticuerpo mttnoclonal es ltomogéneo, y nr-l

varía, a diferencia de los policlonales, con cada il lmu-

niz;rción o sangría realizatla al animal.2. No sr: requicrt: tt l uso cle antígenos purif icados

para las irlrnunizaciones; a l)r)sar de ello se obtiencn

anticuer¡ros cle gran Pureza.ll. Los cultivos perrnancrrtes pueden proporciottar

el arrtir:uerpo tle forma il inlitarla.

F'igura 2"I6. Irununafinciótt dt: Ios rnelanocitos neo¡tlásíc,x ¡,¡t ,.¿n ¡nelaru>ma entpl,:ondo el anticuerpo específicaH S M 1 :; .v- e i nté t o il o d e e s t r e p to u i d i n a'b i o t i na-f o s fata s oulcalina rt:uclr-rLltt ¡:c¡n la suL dL: tliazonio Fast Red que defi-ne una colorocíón roitt brilLanft: en los lugares de fijación

del antiu rcrpo prir nario.

i¡rmunizacion.[,] hibricloma tiene dos propiedades fundanien- Conro es biert <:onot:ir lt l , los antígenos reaccionan

tales: con los anticuerilt-rs, clLlc a stl vez tienen determi-

nantes ant igó 'n icos q l te l t ls ¡ lernt i ten ¡ loder act t rar

L Capacidacl de crecimiento i l imitaiJo, ¡rro¡l ia de conto arttígerl()s para reat:ciottar corl t l tros anticuer-

las cétuias tumorales y que proce(k¡ clel (enorna de pos; asÍ sc prteden fc¡rtttar t 'atlr:nas casi i l imitadas; de

la célula ctel mieloma murirro. antÍgenos y anticuerpos. lr l marcaie del últ imo anti-

2. Capaciclael f le síntesis y secreciórr cle inmuno- cuerpo cort un t:nzit l ia cr;nto losf atasa alcalina tl pero-

globulinas, ya que posee material gené.tico dcl l info- xidasa, que tenga la proll icrlad de inducir una reac-

cito B sensibil izado frente al antír{eno inoculado al ci(rn colrireada en un sllstrato dettlrrninado como la

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frlgura 2,15. Inmunoti¡tción paro cromagrantru¡ t:n ¡¡r:I ¡ I t t t t: d e La n ge rh a n s p a n c re á t i c o r c u I i'-. rt t"lrt ¡¡;e d i it tt l,' c It ¡ t ( | t x I o tlt: e s lre p t au id i na-b i <t t i na' p e rtt x i d a s a ), re u e ! q rl rt(an diantinobencidino que de-fine una coiarución prtrdo'il(Hruz(a e.n los luqares de fiiación del antiurerpt:t prt'nnrüt .

26 Anatomía patológica general

Ávroi

diaminobencid ina, permi te la Íc lent i f icac ión de losantígenos contenidos en las células y los tejidos.

Como ya se ha mencionado, Ia enzima peroxidasa,obtenida del rábano picante, es el trazador enzilnáti-co más ut i l izado. Puede emplearse mediante técni -cas con anticuer¡ros marcados (técnica directa o inrl i-recta cuyo fundamento es s imi lar a l de la inmrrno-f luorescencia d i recta e inc l i recta) o mucho rnáscomúnmente ut i l izanr lo anl i t : r rerpos s in marcar

[p eroxidasa-antiperoxi clas a).Este procedimiento desarrollarlo ltor Sternber{er

y cols. en 1970 uti l iza como trazaclor innunoconrpk>jos formadoB por Ia enzima peroxiciasa y altt ictuerposespecíficos frente a ella ell luqar de anticrrerpcls rnar.cados. Al porrer en r :ontacto " in v i t ro" los ant ic :uer-pos con la peroxidasa se fornlan corn¡rleios antíqeno-ant icuerpci (comple j o peroxidasa-ant i peroxidasa oconple jo PAP) a t ravés c le una reac<: i í r r r de pr t ,c ip i -tac ión, Estos conrple jos están formados p() r t resmclléculas de peroxidasa y dos cle anticuerpo antipe-roxidasa.

Para este procedimiento de innunotinción se uti l i-zan secuencialmente tres reactivos inmunes diferen-t e s ( f i g . 2 l 7 ) :

1, Anticuerpo prinrario mono (de ratón) o policlonal (de conejo) frente al antígeno problema.

2. Ant icuerpo puente o secundar io, quer uni rá e lanticuerpo primario al complejo PAP (p. ej., inmuno-globul ina de cerdo f rente a conejo o de conejo ant i -rratón). El anticuerpo puente se aplica en exceso, detal forma que uno de los dos lugares posibles de uniónse asocie al anticuerpo primario y el otro quede librepara fi jarse posteriormente alcomplejo PAP

BIOTINA

Figura 2.17. Esquerna de Io reoc-, ión de inmunohistoquímica porel ntétodo de La peroxidasa-ant!pe-ro x i rl u s a y au id i na-b i ot i na.

3, Cornple jo PAP, c lue cont iene la enzima queactuará cclmo trazador de la reacción inmune.

Este procecl in iento de inmunolocal izac ión es de100 a l. i)00 veces más efectivo que los métodos indi-roct { )s q i ie emplean ant icuerpos marcados con f luo-r( )crt)lTlos o I)erox](l¿rs¿t.

Cuando la t r ip le re¿rr . 'c ión inmune se ha completa-do, se ¡rrocecle al revt,laclo de la peroxidasa mediantedianinobenr:idina o cLralquiera otro de los cromóge-nos atlecuados para esta enzima, ya que al añadir elsustrato natural de la penrxiclasa, en este caso ei aguaoxigenada o per(rxidr.r de hidrógeno, más el cromóge-no c l iaminobencid ina. er l oxÍqeno naciente l iberadopor la enzima a par t i r del substrato ox ida a l cromó-geno para or ig inar r rn produclo insoluble y de colorpardo ( { ig .2.15) .

Cuando los te j i r los son muy r icos en peroxic iasaendógena (caso de la rnédula ósea) o se pretendeobtener una colorac i i in más br i l lante que la proDor-cionada por el marcaje con peroxidasa es posible r-it i-I izar como trazador la losfatasa alcalina. Esta ri l t imaes una enzima capaz de hidrolizar los ésteres de fos-fato en un medio alcaliLro. La actividad o revelado cleesta enzima se realiza em¡rleando naftol-ASJosfatocomo substrato y sales de diazonio tipo fast red TR ofast blue BB conlo agente de copulación para produ-cir, como resultaclo de la reacción, un colorante azo!co rojo o azul (f ig. 2.1(;). El método más habitualnlen-te empleado es el anárlogo al PAP, denominado de laf os f atasa alca lina-ant i f os f atasa alcalina (FAAFA).

Más recientenente se han introducido otros méto-dos de detección ¡rara inmunohistoquímica denomi-nados supersensit ivos, ya que producen una gran

L4

I1ótrrdos en patoiogía '¿7

i ln lp l i f icac ión c le la senal inrnune, lo cual es há.s i r :o s ise considera que los procedint icntos má: ; l rabi tual ¡ :sse ¡ r ract ican sobre te j ic los ¡ r rev i ; r rnerr te inc iu ic l r ¡ r ; l , : tl )araf ina y doncie los ant ígenos a denlostrar i l¿ru s i r j r rcn qrar l par te c lesnatr l ra l izados durar i t t : c l l i ) r ( )cesa-nr iento h is to l í rg ico. Este t ipo de rnélor ios r le e lev¿rr lascnsib i l idad se basan en la gran af in ic lac l rpret err t re s íl ) oseen l a b io t i na y l a av id ina q { tne f ando un f uu r tecnlar :e no inmul lc .

l .a ar t id ina es una { l icoprotcína de a l to ¡ reso nro l t ,c t r lar que está present t : e l l la c lara t le huevr¡ y la bar : ,t lr ia . l lrr:ptont,vcr:s ctr; idir¡i i : eli este últ inlo caso. i¡rr r ro l í :<:u la rec ' i l te la denonl inaci i rn r le est reptav i t l in¿ v¡r r t 'scrr ta a l i . f l i l l¿rs v( 'n ta j i rs sobr t , : ia o l t t t l r r i i l¿r t j t , lI i r r t ' vo , ( ' ( ) n to s ( )n su t a r t : r t c i a c l t , r cs i r l r l os o l i ( os¿ l r ' ; - rr r l r r s v I ) o s ( ' ( ' r u 1 l ¡ ) u n t o i s o t ' l ó r ' t r i t ' o r t r , r ¡ t r o . l : l l; un l r r i s ( ' asos . i a l l r o l é< 'u l¿ t es l i r f o rn ta r l ¡ r l l o r t r r ; t l r r rs r r i r n i t i t l a r l es , t ¡ r i e i o r r r t an L l J l¿ l es t n t ( : l r r r ; l i t , r t . i a r i ; rr r ¡ n r l l ¿ l t r o r t ' q i o r res l r i r l r r ¡ l r i l t i r :¿ i s r l r , u r r i r l l l ¡ , r r r l a l r i o -| i l t ; I .

l , ; r l t i r r t j ¡ t ¿ i ( , s u n i ¡ r , ' j l a n r i n ; t r 1 r ' l l l r j o 1 l t , s o n t o l t : r ' L r l a r

¡ r t , t t t , r r t . < t e r r t t ' ; r l < ' o r r r ¡ r l e i o 1 , , ( r ' i l l r r u i r r ; r l i ) r l r r c s tl n c u e r r t r a t ' n l a v e ¡ r r ; r r l t , l r t ¡ e v o t s t , t o t t ¡ , t q l t f i i l i l -i l l F l l t o ( ' o I t i l n t l ( ' U ( ' r l ) ( ) s v ( ' i l z t l n i l s t r ; i z a l l o r ; r s l t o tI tq ; r rs t ' t l t , f r ¡ rn la t ' r i va len t t , ¿ l c¿r ( i t , r r ¡ rs la t r ' r ; r l t s :u i r l loo t r r r l t o t u l < t r l t ' r t , s i c l u o s a t n n t r x i c i r l o s r i l r z t - i r ' ; l l - t ' s t i i ,¡ r ro l t , i ru rs v r { l i co l l ro l t : Í i r¿ rs . t , .n t ' s t t , sc l t t i r lo s r ' ( ( ) l l : , r .r i t r a r l u r : l ) r . l ( i ( l e l t u n i r s e l l a s t a 1 i r { ) i i ¡ o l r r r ' u l a s r l i ' l r i o -t i n a ¿ r r u r a s o l a r n o l t i c t ¡ l a t l t ' a r r t r c t r t , r ¡ l o .

l )o r o t r¿ l D¿r r t t , , la ¿¡v i t l i t ra l l t re r l t , r .o r r r l l i l t i l r s ( , ( . ( ) \ . i i -I t ' t r teur t :n t t a l lua ( r ; l r var icc la< l r l r ¡ l ro te inas . { l t r .o -l ) r r ¡ t r : Í r r a s y p o i i s a c á r i d o s ! a l r l r o c o l o i < l ; r l . A u u r ¡ u e{ ' o n l ( ) s e l l a c l i c h o , t a n t o l a a v i c l i r r ¿ t t : o l n o l ¿ r l r i o t i l t ; r

l ) u ( t ( l e n u n i r s e a a n t i c u e r p o s o l r r o l é r . u l a . s c r r z i r r r i r t i .( ' i l s , es la l l i o t i l l a la c ¡ue normalmr l l t t ¡ se con ju r la ( .onIos l l r i rn i t ros de l l i r lo a su per ¡uer io ta rnaño.

t.n t<tdr.rs los mittorl¡¡s inr-l lrrnot:nzinátir:os que uti-l iza l t r : l l ) rucedint i r tn to r le av i . l i l la y b iot ina para¡ron er rir: nrai¡ i l ies t o uila rcacciíin an tígeno-ant icuer-po r:s ¡ro.sibkr realjz¿r el nrarcaje r:on bic¡tina del anti-r i rer l )o ¡ r r i rn l l i r ; f t í - :c l ica c l i rccta) ( -1, lo que es muchonrás l l ; rb i t r r¿ i l , r le l ¿r l l t i t l ler l )o sccut" tdar io ( técnicaÍr r r l i recta ) L i r i ; rsr , l io i rur tunol t i r ¡ ica norrnal r i le¡ r t r 'i r n ¡ t l i t ' a ap l i c r r r ¡ r l r t r r i t r i r i r : j o < l c av i r l i n¿ r v t r azac lo rt l lz ln l¿ i l i ( o t 1 t t , l ' r r r i r i i rs , i r ' fos ia l ¡s¿r a l t a l i t r ¡ r ) ( lu( . ( r )nI t ' t t qa l t t q i r r r . s ( l ' . l r r i í r ¡ r l i l t r r ' . s r , r r l ¿ l av i t l i l r a [ ) i l . r r r ] u (s f ' l ) r o ( l l l z ( ; r l i r l t j ; l t i i r r r so l l n ' r ' l an t i cue r l x ) r , r ' t l l r r l . rr i l r l l i u t i n j l r i r j i , { r r t r ' t o ( l o r i e l r : on r ¡ t l t ' j o av id in ; r l ) ¡ r i t r l t . r, \ fJ( ) r ¡ t ,s t r t , l t ta i ' r r l i r ra- i r io l ina-S.AI i i l i , ¡ . 2 .17) lk , est r , .n r r i ( l o , u l { i . u l r r l n t ( , r ( ) r l l r no l i r c r r l as t l e l t i o t r r t a p r , i er l t r r r r ¡ l r r s r ' . r i r n i r r r l r ( r i r , r [ ) ( ) i r ¡ ¡ i t o . r l e t a l f r t n t r a r l r r e l ar ¡ t z i r t l I r ¡ z ; r t l r ) t ' r l I t 1 t ( r l ( , t l ) ( ) ¡ S ¡ J t t \ i r , l t , V a C i a . f , S t r I l t ¿ t i t ,r l L r c i ; r s t . r t s r l l l i r r l l r r l r l t , i ' s t c t i ¡ l r t r l c r n c t o t l r ¡ s s r ' ¿ 1 r l t u v; r l t r r v 1 ¡ 1 ' r ¡ ¡ ¡ , l t r ¡ r r r . t , l i r r r t i r : r r r , r ¡ l o ¡ t r i r r t a r i o 1 t r - i t ' < 1 ac t t t ¡ l l t ' a r s t , r ¡ i L r r , t l l l u i t l r i .

Citomet ría I' c itofluoronletría

: \ t rn r l r r t , i ; t s i n r ¡ iqer r t ' s r r ro r f o l r i r l i c i i i ; s r l r r o l l j e t i vas .l l i n t e r ¡ ; r t ' l ; r t i í r r r r ¡ r r t . r l t ' t , l l ¿ r s s t , l t ; r i ' r , ' e s s L r l t . i c l i v a y ,

¡ r o r r . i r n t o . s o r n e t i r i , r ; r r r r r i l t i p l t s ( ' r r o r e s . I r t l r t ' l J t ¡ , l a1 t ' i r r l t ' i l c i i r r l c i ¿ t ¿ ¡ n l r l o r r r í ; r ¡ l t r f o l i r q r t : a a r : l u a l e s l ) r o -i ) ( r l ( i { ) n i l t - l A u t a l o r r ' ¡ r I t i r l a r l r l t ' r l ' i t 0 r ; o b j e t i v o s t l u e t( { ) n ( l u r c i r l t ; i i l l r t i l a q n t j s t i t o t ' r r r L l o A ¡ l a r t i r r i e l O s; r í l i i s , \1 ) . \ ' a u n ( l i l r , l cn ta lner t te . s r . ] t¿ ru i r lo incor ¡ l r i ra t t -r l o ¡ r r o c c r l i r n i r ' r r t o s r l i { i t a l e s r l c l t r e d i c i r i n q L l e l / al r ; l ( r ' i t l ) ( ) . s i l ) l r ' l ; r c u a l r l i f i r ' ¿ r t ' i i l l ¡ r r r l o l n ¡ i l i r ' a t l c n r r n r e -r { )sos J )Ar¿ i l l r r , , t r : ¡s I r ' l L t l ; t r t ' s .

| )c lo rn l i l q r ,n I r :L i . [ r ldOs C: ; los ¡ l t .0 r :ec l in t i cn tOs sCl ; ¡ r s a n e r r l ; r L ¡ i i l i z ¿ r < i r i r r r i t , , u t ; r l j z l r r l o r e s r l e i r r r á g e n e s( f i r l . 2 . I8 ) r ¡ r ie l ran sus t i tL r ic lo los c r i t t : r ios n lo r fo l t iq i -

SISTEMA DE ANALISIS DE IMAGEN VISLIALIZACION ENTIEMPO REAL

::- 7*-*-.'*:-r_*DIGI íT,L¡ZACIOAI

Y Pfloc:E:-;LMi[-NTOl' ' lgrrrrr 2.tl i . I ir¡tri¡tctrnie.nto b,isi-t u tlt' tttt trrrttlizrttlor dilitol dr.z int(r¡ { r / l r ' \

, . { l : - '

AI t¡IACENAMII--NTOL._

28 Anatomía patológica general

cos subjetivos por parámetros morfométricos másobjetivos, lo cual, y en conjunción con el continuoprogreso de las ciencias biomédicas, físicas y de inge-niería, han transformado la citología en una nuevadisciplina conocida como citometría.

La citometrÍa puede ser separada en: citometríaestática o microscopio digita!, que tiene como carac-teristica principal el análisis de las imágenes, y lamicrofluorimetría de flujo (citometría de flujo), clondela imagen obtenida es secundaria y cuyo procesa-miento se caracteriza por su rapidez.

De forma general, en citometría estática es posibleplantear el análisis de las diferentes estructuras encuatro planos diferentes:

L Morfometría. Consiste en la descripción cuanti-tativa de las características geométricas de lasestructuras existentes.

2. Planimetría. Es la medida de las característicasgeonrétricas de estructuras en dos dimensiones (2-D).

3. EstereologÍa. Hace referencia al conjunto demétodos matemáticos que calculan los parámetrostridimensionales de un cuerpo a partir de la extrapo-lación de las medidas obtenidas en una o dos dimen-siones.

4. Densitometría. Analiza la cantidad de materiaexistente en una estructura a partir de la informaciónproporcionada por la mayor o menor concentraciónde un colorante que de forma estequiontétr ica secleposita sobre la misma.

El contenido inforrnativo de una imagen puede seranalizado cuantitativamente mediante la mediciónde la señal procetlente de una cámara de vídeo. Estarnedida se efectúa qeneralmente diqitalizando laseñal de vídeo.

l,a operaciírn de rnuestreo y digitalización de laseñal de vídeo equivale a la subdivisión de la imagenen un tablero de áreas elementales llamadas píxeles.A cada píxel está asr ¡ciaclo un nú¡nero o nivel de gris,qu€ corre$pclnde a la luminosidad del punto querepresenta y es indiviclualizado por las coordenadasespaciales que le curresponrlen.

l .a pr inera i l r tervenr: ión que puede real izarsesclbre una image'n a través de un sistema de análisisautomático es la aplicación de determinadcls opera-dores matemáti t :<¡s r lenominados "f i l t ros" que con-tribuyen a mejorar r¡ nlodificar algunos aspectos dela imagen inicial. c()rno por ejemplo mejorar la lumi-nosidad, resaltar algr-rnas tonalidades de gris provGcando su realce y contraste o eliminar determinadoscontaminantes no deseados.

[,] concepto de segmentación de una inragen hacereferencia a la selección del componente de la mismaque va a ser objeto de anál is is. En la práct ica, esteprocedimiento consiste en aplicar a la imagen unumbral (threshold) de discriminación por el cualtodos los píxeles situados dentro de dicho umbralson considerados como parte del objeto y el restoson tratados como ruido. En el fondo, todo se reducea colocar los pixeles seleciionados en blanco y losrechazados en negro, ¡ror lo cual el resultado final esuna imagen binaria en dos tonos (figs. 2.19 y 2.20).

Aunque esta fase del procesamiento parece la mássimple, y en realidad lo es, la mayor parte de los problernas aún no resueltos en análisis de imagen radi-can en el proceso de segrnentación. Ello es debido ala limitación que experimentan la mayor parte de los

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m-Figura 2.19. [mogen rligitalizuda en blonut y neero dt' k¡snúcleos de Qn glomérulo renul IerTidt¡s crtn hernatoxilinade Mayer.

Figura 2.20. Imagen umbralizada (segrnentoda), obteni-da de Ia. anterior y a partir de Ia cual e,s posible realizarrecuento automótico de las partículus seleccic¡nades, sumorfometrío y el cálculo de lo densidad óptica del DNAque contrcnen.

Mótodos en patología 29

FOTOT\4ULTIPLIOADOR

t; lgura 2.21. Esquema del canrtlrlt, iltr1o ¡tor drtnde circulQtt lost tslukts en un citómt:trr¡ de fluic¡.

$isf ernas para realizar la seqtnt:l l tat' iót¡ r-le la i l t¡aqetlp()/ pr()cedilTrientns puralnente automál icos.

Por el motivo expuesto y de f<irrna qelleral. l i l seq-

mentaci í )n de ut la inagen puede r t :a l izarse r le t r t rs

l<rrmas tl istíntas: interat:t iua, semiaul()nt(¡t[r '6 1' ¡1¡¡[¡u

mál i<:Lt La opción in teract iva pura t r l lp l i { 'a la in ler '

venciÓn cr¡ntinua del observadrlr sobre la imagr:n err

pmtalla para seleccitlnar los obietos a s{rqulentar i,a

rtgmentación automática de la imaqen str fttt l t lamen-

t l en la selecc ión de los n ive les de qr is qt te r r :a l tza

al r is tet la . [ .a segmentat : ión l ror pro<' t ld inr ie t t t t ls

lcmlautonrát icos i rnpl ica la posib i l idad de dejar

tt¡lerta la intervenciÓn del observadr¡n ¡rara poder

c l lml l iar t t i l rc lu i r a lqunr¡s t lb iet r ls t lo s t ' le< ' t t t r t lar los

lutomáticamente.

-4":1o' - {

ú \ Separación de Ia muffiseq¿Ín sus caractelísttü

nivel t l t ' r t 'so l t lnr i t r (vo i r rnr i ' t r i i :a) más e lcvadr l res

¡rt:c to al rlr: la l l l icrt¡$t'o¡ria óptic a clásica' F,sto es post-

b le grac iar i a l tnecanismt l d t ' f r l rnaci (x l de la in tagen

en rr¡l mit 'rr¡$t'rpitt <:ottfri<"al l¿istrr cle "scanning''.

[:,[ Lraratl iEllta a< lr-¡¿rl etl l t; r¡tte se refiere a la aplit:a-

ciírn de !ir:; prrx t 'dinrittntos rlt l clasif icaciÓn y análisis

aulonr;i l l t 'r¡ t le i l l tágeltes al rl iar{nírstico en patología

lo cousti luyttrt los sistenta s ;rrltotnáticos cle.screertln¿

Jrar a extenrli< l os t 'ítr vice'v'a! I tt;t l trs en citoloqía. Flstos

sislr:rnas sr: hatt rlt lsarroll;tr l l , r:otl la f inalidad dtl reclu'

r : i r e l núnlerr l de fa iso ne,{a l iv( )s y r l is r t t i l tu i r e l vo l r ¡ -

m+.'n cle tratrajo del <:itotér'nit '<1.

Aspectos basicos sob¡:e citometria de flujo

[.a citornetría de f lujo consisttl en el análisis rápicltr

cle células y, por extensiótr, rle partículas biológicas

inrl ividualizadas en susptlttsiírn, dentro i le ttn siste-

ma de flujo laminar s<¡brt: el rlrte incide un haz de ittz

que proporr:ittna inform¿rciirn acerca de sus caracte-

rísticas físic+químicas. F,l instrumento que relaliza cl

análisis, clenominado cit(inlctro de flujo, se compone

de tres sistentas i¡rstrumt¡lt¿rles integraclos: un siste-

ma de inyección y manttio cle la muestra; un detec-

tor f Ís ico y ópt ico de los parámetros c i to lógicos a

rnedir , y urr s is tcma digí ta l izat lo para e l proceso de

los dalos.E! s is tema c le inyecci í rn y manejo de la muestr¿l

recil¡r,: cl nornt¡re de cátn¡rra de flujo y consiste en lln

nlcca.rl isi ir r¡ ir idrírrrl ico p' rt:sr tri zado donde se ittcor'

¡.rt. ir i l l ;r stis¡rt, ' ttsiírn rle cí:lul; ls a analizar qlle es ve-

h i t :u l izada har : : ia un condt t t : to capi lar sobre e l que

i¡r.cicle un estrecho haz dr: ltrz obtenida a partir de un

láser de argtin (i ig. 2.21).

' Flnalnrente, a partir cle la imagen segmetltacla, y

¡ {Onde se t ra seleccionado la porc ión de ia n l ts t l ta aji ' tnrl l¡ar, es posible obtener datos nunéricos obieti-

que nos informan sobre su morfología, derlsidad

f,0mplelidacl interna, de manera que es Pt¡sible cla-

Ctr las célu las por e l tamaño, forma, re lac i t i l li toplasma y fases celulares, ctlya aplicaciíin

[nntecliata es el diagnóstico de clisplasias, carci-' ltr situ" y carcinomas invasivos; cuantif icaciÓttlóglca dt: los cultivos de células neoplásicas, y

lco de enfermedades metabólicas del huesrlno inflamatorias de la piel

En lt¡ rtrrc se refiere al uso de los procedimiento¡; det:cncia en patología cuantitativa, y con (:xcep-

dc la citornetría de flujo que se expone a t:onli

l lü¡clÓrr, tt l tttétorlo más innovador que en la ¡rctttali-

í l dlt l corrrt, 'nza a ser introducido en rl itesiro ¡rais t:s la

&,'Rlle m;t:<¡plu ó¡rtica láser confocal. Esta última os ulla$;,láCnktn (iuo cn ia invcstigaciÓn biornédica se a¡rlica al

S.Htut l to t lc l¿t l l ; r r lo r lc estructuras celulartrs con l t { l

ffi#0..'?¡,

30 Anatomía patológica general

6

¡.-

o6

+OO

N

El sistema de deteccirirr consla (le:

aJ un contador volumétrico dt' t i¡ro Coulter parael recuento de las unidade$ (:elulares quer flrrverr ¡rorel capilar;

b) sistema óptico, forrnado por diversae lentes rleanálisis:

c) los fotodetectores capa('es de recoger y trafisformar la luz refle¡ada en u¡ra rléb,i i cr¡rri,ert ' le elér'.tr ica.

l i l sistema electrírnir:o digital v cle análisis de datosconsta cle diversos amplif i ira<lores de señal, un trans-formador arialógico-digital para corlr¡ertir Ios pulsrise lect róniccr .s en i ¡ r formacir in d ig i la l v r ¡n r l r r l t 'nar lorque a lmacena y anal iza los r la tos. ¡ r ropci rc ior iarrc loesfudios estadíst icos y repres0nta i jon qráfr t a rJ t , l lsnt.t.rR{)¡i

Conxl método de tirrciri l l sr r¡l i l ir¿n fluoirx'rornosde do* t ipos fundamental { 's r r r lor la¡ laces de t ¡nrr -se a o t ras sus tanc ias pa ra l r ac r r l a " r f l u r ¡ re rcen te . s ;

¡xr ejemplo, anticuerp<-ls a tr¿!'ér rk" rura r.¡nr(rn r:or,¿i-lente que no altera su capacrclarl para lrgarse al antigen() y b) los que poseen capacidad para uni rs t :drrectanlente a componentes ct¡lulares. F,ntre los pri-meros, el más frecuentemente uti l izad<l es el isrtt io-cianato de fluoresceína (F-ITC), que puede combinar-se con otros como la ficoeritrina (PE) o los conjuga-dos covalentes de f icoer i t r ina y c ianinas, como lacianoficoeritrina 3 (CyPEl)) y la cianoficoeritrina 5(CyPE5).

Entre los fluorocromos que se unen clirectamentea estructuras celulares deben distinguirse:

c) Fluorocromos para ácidos nucleicos, que seunen estequiométricamente a los ácidos nucleicos.

Figura 2.22. Representación gró-fica dei ciclo celular medtante c.itr¡-me.tría de fhtjo. R/ - fa.se GAG I , R2= fase de slnfesis; R3 = fase G2-mrlos¡s.

[ .os r .nás anrpl iar r r ' ' r te usados sc in e l bronuro de et i -rl io v el vorhlrri t le' pro¡l idio, qlle se unen a los ácidosntrc lu lcos t 'A{) \ v \ l {N) , y e l naranja de,rcr id ina, quenuetle uti l izarg(tr i) ir l ' i i el estudio cliferencral entre ADNv ARN

b..) Flu<;rocrorr(,s l)ara meclir el potencial de mem-brana. <:tnul l¿r rr r|anlina.

r' l l- lutnocr,rrl l( ' i sensibles al calcio, colno el f lúo-lJ,va l ía¡ l $u oÍ lx ' ( ' r r r 1 lg ¿ l ¡91¡¡<: ión conforme se incre-rnenta el ( a rr 'rtr r ai ehrlar, ¡tor lo cual son mLlv uti l iza-dos en la invr':rf rrl¿¡r ir in intracelrrlar.

l ,as a¡ l l icar : r r . r r r t 's r r rás in t ¡xr r tat r tes c le la c i tometr íade f lu lo en pal o l lq ia son

i Arrá l is is i t , r r . l i l r ico r ie có]r r las sanr l r r Íneas ¡ rarala dt , ' t t r rnr i l r¿rr ' j r ' r r r l r , r l or iqen inmunolr ig i , :o y fenot ip<rc le las leuceuna.s r l in fot r ras.

2. ldent i f jc¿rc i r i r r r le ar l t ígenos int rat :etu lares, entrelr-rs clrre se en('u('nlrar) ar)tígenos virales marcad()restumorales. . .

lJ. Cuanti{icacir.rn de DNA y deterninación del ciclocelular, sobre torLr a¡rl icada al diagnóstico y pronós-tico de displasias y tumores. Fln este settt ido, una delas caracterÍsticas nrorfológicas de la transformaciónneoplásica es el aumento de la densidad y del tama-ño de los núcleos de un tejido por aumento de su con-tenido en DNA, un hecho que es suscept ib le de sercuantif icado nrerliante citometría de fluio.

La citometría cle flujo permite valorar el contenidototal de DNA rle un;r población celular, y por tanto apart i r del misr lo conocer su p lo idÍa, Las célu lassomálicas de un organismo de esa misma especie tie-nen una cantidad doble de cromosomas (2n), por loque se denominan diploides. Este valor constante de

IB

I l i todo-s en I ) r to logi¿

cromosomas (euplo idía) está a l t t rado c l l i l i i lchostumores. siendo entonces cl nítl] lero d{: cr()mosonlasaneuploide, denorninándose hipoploirkl si cl t lúmerrrr je crom<lsornas es i t t f r : r ic . ¡ r a 2n o h i i te t r l r lo ide s i l ¡ lcantidacl es superior.

La ploiclía de una ltoblacitirt t:elrt lar ¡rLtt:t lr l l 'alorar-se a t ravés c le l ínc l ice de I )NA, t le f i l i ic lo c t t lno la prr l -porciórt cntre el contenido de l)NA cle tut;t l lol.rlaciórt[urncrral yel de r,ura ¡xrb]ai: ir in cerlular ltornt¡tl (t it:

'1. '22.).

4. Determinación c le la v iabi l idad -v r l r r l qntdt t i i t¿ir,:t ivar:iírn r. le células en cultivo.

5. Arrálisis cle reticulocitcts t: irctt laltte:i ett 1i¡t! lgr(1.6. Detecciót t de aut i ¡at t t ic l ler l )os cI ] s t ter( ) .7. Cuant i f icac ión c le l potcncia i de t t tcrn l r rana.I t . N ' ler l i r la del ( l ; r ' ' i r r t ract ' l t r lar .1 ) I ) r ' l e r rn i r t a< ' i í r l r r l c l ¡ i l l i r r t r a t ' r ' l t r l ; r r

P . i l . l i r ' , r r r f í ' - 'r r r r r i r \ , \ l u r r ( l

Autopsia

i l i l l R i l ¡ \ ; r r l r , r c , r n l i f I l r , ' \ , r t i ' l r \ \ \ l r , r 1 , , r i ) l . i ( ' 1 1 , f i l r i ( J

l ' l l l l t < l ' r i l i t r l l t t , r t \ ^ 1 , r - 1 r r \ ' 1 r r t ' i r , t r r \ l ; r s s l l l l { l

K r r r g l , S \ 4 r ' r ' l i a r l \ 1 t \ 1 J < l , r r , ' 1 r l r r \ i r 1 , ' 1 r s r \ t r , I l ' ; r l

I r , r l I 1 i 7 . ' l 7 , i . ; I 1 , 1 ' 1

L n n t t ' l t ' l r J ( 5 . ( l r r t ' r t \ 1 \ l \ l f r " r \ 1 r , , t . ' i r r l . l , , , r r r , L i t i t r

r t l t l t l a i r l t l ¡ l s v t l l a I r l r ' , t ' r s i I r , l l t ' s 1 , r r , 1 \ | ' , . ) : \ ] r ' í i

l 9 f i i { . , i 18 : I 2 , 11 } I l , r 1

P a r t l o l \ ' l i r r t l ¿ i r r l . l . l o l i r ' , { ¡ , 1 ¡ 1 1 i , ' ¡ ¡ f ' l 1 r

á t i t o l . ) s i i i t t a l . a t ' l ( { ) i t l r i i t i t r , t i t t l , t ¡ r '

l , l f ¡ r r l t l t ' l l r r l l l t ' t t ; t i t ' a l ¡ t r o l t ' s l r ( , r i r l { 1 i

( i a r s i , M ¿ r r i r i c l . l ' ) ' ! 1 . ¡ r p i : ) ; I ' . 1

F ü t c r ¡ t k S , l . N l ¿ r i i t r n l ) . l ) t l l r r t l l ¿ r r ( l . l i | .

l u t o l ) s y A r t s t ' f r r l t o o l r r r ; t l r t l o l t l r t ' J r '; 156:9- j

\ ! r l i l t , ¡ ¡ r l ( t l

l , : , r , ' . ¡ t r . 1

, r l r r ' , r l r t l r ¡

r L l r , , ' r \ l l r

i f t l l , , , ' , ¡ *

rlogiat . i l ) , S t t ' v t : n s. \ . l l r i ' o I - 1 ' a r l t l I r r : r t l r t t ' r i i I I i s l , r l r r

( l l l i r r c i l i l l l . i ' , ¡ r ) q : j l . o ! r { ' l . r I l r l r r r r { l rñ l l ( ' r ' h r r i c l r r t ' s

f , l l ) . ( ' o r i k I I ( M a r r L r a l 1 ¡ f I l i s [ 1 ¡ ] 1 r q i t i t l l t ' t l r r l i t i r r l s

t l t t ' l r l ) i t r g r r o s l i r : A ¡ r 1 t l i c a 1 i o n . ( t r r L n h i l i i . i r i r r { s t r r

New York . l1 )1 )4de l Mor¿r l v ( 'o l . La l )o ra t r t r io t l r ' \ r t ; t lo t t t í ¡ t l '¿ i lo l í r

l i l t t ,rrr r r rc 'r ic¡ na N' lcGr¿lw-l { i l l . N' laclr i t l . I 1) l l t .

J, I l t ' rrr t :r .1.1, Sicqler [ i l ' i , Accurat l ' of arl t l r , .r ; tsottsI r t ¡ t i ¡ r rs : A c r l r rC la t i yc , rc t r r i s I l t ' t : i i v t : : i tL tc l )

f r n t l r o l | 1 )S f i ; 19 : 1019 -102 IJ0{ . , l l r ¡ r l l r ' l r ¡ rk I t l } . ' l 'heory and Pract i<:e of I I is to-

l f l t 2rrr l cr l . l ) ,atel l t t Press, Nt 'w \/ork, l9l ' i ()

t l t ' r ' l rón ica

r l iagnos t i c r , ¡ leu t ro t i t t t i c rosr :o1 lv a l ld i lnnunoh is toch ' : -

r i l istrv. I{av¡ '¡ i [ ' r t .ss, Nrrl l ' \ i rr k. i988

F,r lanclsorr }LA. Diagnostic trartstt l ission clectron nl i( l ros-

co¡ rv o f lu tno t ' s . RAven I ' res r ; , Ner t ' \b rk , 1994

I r l¿ in i l so t t l i . , \ , i i osa i J . A re t ¡ l i s i i r a ] ) l ) roac t i to t ] te usc ' r ¡ f( r lec l ro r t l r r i c ro : ; t t t t l l v anr l o t l r l r i l l l c i l l a rv c l iagnos t r t :

1 t :c l t t r i c l t r t : s in surg ica l pa t l r r . r lo i ¡y . A ln J SLr rg [ 'a tb ' r l

1 1 l l l 5 ; 1 ( r : 2 1 l ) ' i i 0 .

Citopatologíar \ tk i r rs¿r i r l l l ' At l¿ ls o l l ) iaqrros l ic Cvto l la thol<){ \ ' i \ I

S ; i i i r l r l r ' r " ; i ' , I ' l l l l ; i r l r : l l r l r i ¿ r . I { ) 1 1 2 .K o s s I i , i , , ¡ . r , , r r 1 , , { \ f ' r l o r l l t t t l ( l i t s I I i s l < l ¡ t i r t l '

l ' i , t : l r l l l l , , r ¡ , , , . , , f 1 ' 1 ' l r i l ¡ r r l r : l ' l l i a , l 9 l l 2 .

\ i q l r r \ l , ' , ' , \ i , r , l l i . l . a l l o r a t t l r i o i , '

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\ , , r ' \ : ú . . . { ' r . r . r , ' s ( ' ¿ 1 ¡ 1 i ' ¡ ' ¡ 1 9 1 ) 5 . ' I ¡ t

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| ¡ ; . r . i \ 1 i r i , r i , r r r , l t r l ¡ r i r ; r l l r o l , r i l ) . ¡ \ p r i t c t l ( a l ; t ¡ r ; t t ' r ' r l l

r 1 r r l r l L , l , r . r : \ 5 l l ( l ' l ' r - r ' s : r . i ' l r i c a r l o . l l J f l ( ] .( , , 1 1 r 1 , r ' l r i \ \ i i , ; r v r r ' l l , , r l i , r r l r l o r i t ¡ r l t t i \ t l a l t l t t t Í ; l l ' i t l o r . r -

- t r l ; r n l { ' r , t r ¡ l r ' , i r ' i i r t ; t - \ l ( f , r ' ; t i t I l l l l . N ' I ¡ t l f i , l . l i ) { i l j .

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t ' , , ' : | : i r \ 1 , r 1 t ' t r t l ; t r ¡ i t t r t , , s ( ' l l t i t - r ' l t i i l l , i v i r l { s t o : l t r ,i r i r r , ' , r r l q l t l : l 1 1 l

r r ' i l ¡ i r , l r l { , u r ; r l r : ; i s i t l l i l i ¿ i l l r l t i t l ) i l t l l ( ) l ( ) { y : W l l ¿ t a r e t l l e

: s r r . r ' I l l r : l l ' ; r t l r r , l l 1 t \ 1 1 . l i ) . . . 1 t ) l ' i 2 0 4 .

l { , r r r r i l t ' ¡ l ' \ \ \ l l l r r ( N l r r r ¡ r l t l t t t c t r v i r t h i s t t l ¡ l a t t r o l o g v ' . . 1

l ' ; r l l , r , l | 1 1 1 ) i i i 4 1 : , t 7 l ' l l i l )

Koss L { i i i l ou t v l o r l l e t r i t ' t r r t r ; r sL l r ( l n t e l l t r ; t ¡ 1 l )N , , \ a r l i - l

o l i r t ' r - r ' r ' l l ( ( ) n r l ) ( ) n ( ' t t l s i r i l t L t l t t ¿ t t t t t l l ) l ( l r s : A c r Í t i l - a l

; r l l l l r ; r i s ¿ i i . i l t ¡ r n i ' a t h o l l 1 ) l 1 l : l f ) : 5 2 8 - 5 4 8 .

l , r ¡ r r { o l ; i r r t l i , \ . l : i o l r ' ( . y t o r r r l i t v l : i r s t l ' r i n r . : i p l es . W i l c v -

L i : s N t r r \ ( , r k . l i r l l l .

l ' L ' s r ' t ' ( . . I : i i o l o ( \ ' o f r l i seas t : : t i c f i r r i r t g and i n t c rp r c t r nq

t l i s l ¿ r s t : s t l r r o r l gh n to r ¡ r l t r t t t t t : t r y . l , ab I nves t l i ) l J7 l

5(i ;rt i8-57].Robinsorr J l ' . t fancl l , ¡ook r ¡ f I ¡ low ( lv tonlc t rv VIethods.

Wilt:r. l. iss. New \brk. I !11)ll.\\ ' ied (i{ , []artcls f ' lJ. l l ibbo l\1, l]vtch i lFi. hnage anal]sis

in i1Lrar i t i ta l iv t : r :y topat I I r r lo13y a l i r l h i : ; topatholcgy.i iunr l '¿ i t l to i l t lEq e0 i ¡49 i7 l

\ t 'oot t r ;n i i . Spr i r rgal l l ) , I 'o l ; ik . l \ { . lmagc analys is i l l lJ is-t ( , 1 { i r r \ ' . ( ( r l r ! . ¡ r - ¡ r i t i o t l ; i l a t t t l ( on f r ¡ t l a l M i i : l o sco l t y C i t n t -

l ; t v l i l r r l J r r i l r l . r i t \ ' I ' t t : s s . t ; r r l I l l r i t l ¡ 1 r1 . 1 f ) f ) 5 .l lA , I t t r l I r r r l , r ¡ ¡ \ ' o f I t t t t t l , t t t s ; t t t : r t ¡ r l l t s t t t s . i \ r i ¡ t I r r : ; o í

CAPITULO ilI

el desarro l lo t l t lar tér ' r l icas de ADN recoml i lnanteBásicanltnte. !rxla¡ l¿s e¡tfttrmedades corr fms¿' getre-

tit 'a r¡ r 'orr fa<'lort 's ¡in<ltt¡rrtttentes genéticos se f¡lr-den est i l rJ i¿r ¡ luvt l nr ' le f i ¡ ¡ur , donde las ¡ rers¡xr t t -

vas c l t ' avar t ( e l , i l i f l lormes. cotnr¡ det ia

recierrltr l¡efi l* el edtl i,r i l t ' l¡ rt:vista The Neu' f,ntkmd

ltttnol t,[ M+tdtttne. ( '()t l ol (:)l l l [] leo cle té<:tl i t:as tt lr.r lt-

t 'ulart 's ya tto ¡ruedett tra:¿ars'3 las líneas de lo qtre ¡lut-c lc ser <: iencia f icc ió l t ,

l.a anatornía ¡iatolírgit 'a, corno receptora de toclaslas nrrrestras turnr-¡rales v biopsias tle los hospitales,t i t 'n t ' r lue asunl i r t l i t 'hot t r t r t r ts y c l i r ig i r y capi ta l izarla lnayor parte dt' los esttlcl i,.rs rnoleculares, tarltc de

enferrledadeg n<¡tunltiralcs ('ottlo tulnorales, sabien-dtr a<lentí¡s t¡ue t ' l t 'ánt't 'r ts ltt enfertnedad Qe-nética¡y¡J5 lp¡¡¡qt¡111t en humtutt¡s

tstrur:lura genética

l ,a jn formación qenét i t : l . y ¡ - tor tanto e l contro l ú l -

t i rnr¡ de todos los I ) r ( )c( 's( )s celu lares, radica en dos

het¡ ras r ler pol inucleót idos ( lue const i tuyen e l ác ido

desoxi r ibc-¡nuclé ico o AI)N ( f lg . 3.1) . E l ADN constacle dos largas caclenas de nucléotidos, enrolladas en-

tre sí. r:on un código de sírlo 4 bases: las bases púri-

r :¿rs, adenina.y guanina. y las bases p i r imidín icas, c i -tos ina y t imina. Di r :has l tases están l igadas a t tna

l lentosa (desoxi r r ibosa) y a un grupo fosfato, que

sirve de eslabón con Ia otra pentosa adyacente for-

nlando un enlace 5'-3' t l iesler. Dicha unión confieregran estabi l idad estructura l a las cadenas de AI IN.Pero la base de la inform¡rción genética radica en el

codigo genético, que viene implícito en la diferentesecuencia de las 4 bases ¿r lo largo del ADN. Para

comprender cómo se t ransmite la in formaciÓn ge-

nét ica y ser conserva de gerneración en generación

dicha infornlaciírn, es básico el hecho de que las ba-

ses entre sÍ sean com¡llementarias y que durante la

síntes is del ADN de c loble cadena la base adeninasólo se acopie con t imina y Ia c i tos ina sólo con Ia

fr11' I

;tjji-

,?-,$.

'[i

J¡

Patología molecularSantiago Ramón y Cajal Agüeras, Xavier Matías Guiu y Enrique de Alava

Introducción

Estructura genética

Base de la tecnoloqía de.l ADN recombinante

Aislamiento y t¡htencirin del ADN de k,jtdos

NR o reucci(tn e.n cadena 'le lu yilimerLtso

FCR "rn sltu"

¡{R SSCP

Otros métodos paro de:tetkw mutarrcxwt

Técnicus de hibri&xiónSouthern blot y Northan tfntHibridación "in situ"F'ISH (técnica de hibridación "h ritu" con

fl.uoresr:encia;

7'é c n icas paro pro te í nas

Aplicaciones de Ia builogítt molecular <:n patologíe

Diagnóstico molecular en pobloqía tumoralAnálisis citogenéticoTócnicas moleculares específicas

Diagnóstico mole.cular en patokúía inferciosa

)tras aplicociones de Ia patología molecular

Bibliogrofta

Introducción

En los últimos 10 años r:l estudio de la mayorÍa delas enfermedades se ha impulsado enormemente con

D A. )'t Anatomía patológica general

F i g u r a i i . l , I i s l r u c t u r u t r 1 t ' 1 , l / r \ l ( , ' 1 1 , , , . ! t t l t ¡ , t ' . , 1 , \ / , \( : ' i ( t l t t onsl¡ lUt f lUS p0f UI tu st t t t ' \ t t t t ] . l t , t ¡ l t i t . , ¡ t t t , , : | ¡ , t t i , i , , '( t I I t t u / ) ( , t ¡ l ( ) sd . En l a s í n tes i . ' i ¿ i r , . r l 1 ¡ \ , ' r r r / l r / r r r / r \ , , . { . / r /r ( t r t \ , ( ) r ¡ l ¡ e l t z t t k t C td iC i r i n f l c l x t t t , . t t , t r ¡ t ) i t I t i r t o r t t i '

t , t , ' , , , , , " \ 1 , \

. r ' f á c o n l p l e m ( ' t r 1 , r f , ' , r ! ¡ ' r r r 1 , i l t ., , i , , . . l , r f i e d a d € ) S e l l l t e l r , r \ . i , , ' , . ' , ¡ f , , t , r r l r l t ' l

\ , \ ' r r r t o C U a n d O € S ' r . o ¡ , , ¡ 1 I I , l r l ' , 1 ( t 0 l l

r . , , 1 ¡ { o m o C U a n d O € S l | r r l , . , , ' . ' r ' . , r , , r , l i l f I ( l ( '\ x \ I i r l a s í n t e s i . s d e A D N t l t . r r , r . . , , \ r i ¡ , r f r r \ ( . ; l t ) -

" . r . r l r I & s d e l m i s m r ¡ y c ¿ r ( l i r l n . r { l l r , l l , l s s r r ' " , t , r l e

1 , . : r . l r i i t& que la nueva ca( lena t l c , , \ l )N se i t cor l l -, ) r ' l r l n t a r i a d e l a a n t e r i o r . l l s t a n i m p o r t a n t e r l u r :r x rs ta la n tayor " f ide l idad" pos i l ) le en la cop ia y s Ín -tes is de i ADN, que los mecan is rnos ceh l la res dc con-trol de la repl icacií ;n clel ul i .srno y de rel)aración derposibles errores cle síntesis son enormelnent(r colrn-p le jos y de gran t rascet leni : ia . Ci tn io luer¡ r ' l sr ver : / r .u l ) número i rnpor tante de enforntr . :d¿r [ ics rnr : ta l )a) j i -cas , t umora les , . . pue ( l en tene r s r r ( ) i i qen c t ) \ ¡ i L r i¿ l -c iones genét icas en la conr i t i t l rc i í l r l dc i¿s i :adcnasdel ADN que hacen qLte se t ransi l i ta L lna i r ) fonnl -c ión errónea. En e l n i rc leo las larqas n)o iécuias del

.¡t l) i\ están I)eqad¿rs v conrpactas, constituyendo loscronlosL)rnas. Cacla cronlosoIna consta de t l i fererr -tes.s( , rcuur l r : ias de Al )N y. por tanto, t ransmite d i fe-rentc. in f { ) r r r }ac ia ln { . lenót ica. I -a tota l idad de las se-Ct lenCi ; rs r le l . , \ l )N ] ' r . t romosomas Se ClenOlninaget loíTla.

I . a un i r l a r l f r r r r c i o r ra l r i c l ADN es e l CEN, que es l aI )¿rr tc ( l ( . ' , \ l )N r ¡ r rc r , ; r ¡ r c lar or igen a una proteína. Enci ¡ l roceso r le ion l l¿rcrr l r r r le las proteÍnas hay una sr : -r i ( , ( l e l ) ¡ sos t l r i r v i n r l ) ( ) r t i i n tes que es necesa r i o sa -l r t ' r ¡ r a ra ( ' n l en ( l ( ' r no s í r l o có rno func ionan l os q ( ) -r r ) s . s i l o t ; r r l i t i ( r r r t l r i n< le p i l eden co lne te rse"( ' r r ( ) l ' ( 's ' v . i )or corrs i r ¡ r r i t :n te, cnfermer lades y pxFc ( , sos l l a to la )q i c ' os I | ¡ r r i r ne r I l ¿ i so es l a t r ansc r i ¡ r -t i ón o s ín tes i s d t . . \ l l \ ( ¡ l e es l a rno lé r :u la que va al l e ' r ' a r l ¡ i r r f r r r n l¿ l c j i r i i 1 , ' r r é t i t a r l c l núc leo a l c i t op las -t r r ; l r l r r ¡ r r l t ' s r ' \ l n t l t , ' , r i r l a s y t r u i e í n a s , F l n l a s í r r t e s i sr f t ' l \ R \ s t ' f r i r r r , r I r r , , t r l t ' t t ; l d e n L r t l e ó t i t l o s c o r r ) -g t i r " t : r ' t r l , t r ! . r i ; { r ' r r r , l r t i t t l 1 ¡ . ( ' o l t ( 1 O S f l t f t ' f t ' n | t a S

r r l i r r , t r r . i i r . , i . ¡ r ; . , r i I r ) l í ' ( i l 1 ¿ l ( o t l s t a r l , t l ; r l t a S e' i f . t , r , , t I I . r ¡ l . r t , r t , , , . r r ( l t , l i l z l i ( i t f f i l l o S ¿ i t ' n V e z

r l , , " r . r , r f , f , r , r r | - t t r ' t t t ( , f ) A S O ( t S l ¿ t l f ¿ r t l ¡ r ' t ' l í l t t, , \ r r 1 r r r 1 r . i r ; , 1 I , ¡ i r I u l t : l t l t : l o S f i l t o s o i l t i l l ;

| 1 . 1 . ' \ , j , r r \ ¡ . . ' ' r ' r , \ l { N - n t c t t s a j c r o . s t ' . r c o -

; . i . i , , ' . ' l , i \ . i , \ L f ¡ r ! ( , S r ) t l ( , S t ' l t , t r ' i ó l t ( i É ' A ¡ t i -

' , , . . J , 1 \ \ , r , t ' t J t i ; . 1 S 1 l r ¡ l r ' Í t u i s t - , S t l t ', , r , , 1 r , t r ; , r | , , \ r , I L l i i l , ( l a l ) l ( ) ( l U ¡ i l l t ( t l , l l t , r r -

V r , t t r , r , I ' , i r t ' i . t r , . J t , t t r , f f t t i t < ' l i l l t t . l t , n i l f t t ; t\ r r r r l ¡ ¡ , | . r , r , , { ! . r \ \ i l ¡ l i ) l + ' t l o n r i r ' r a t i a ; r t l l ;

l r r i ¿ l i r l l i ) r ' s l , r , r l r i r U 1 r , 1 r r ; f t r t ' s l ) i l s i , s r l r , \ t l ' \( l l t r ' \ r l l ; t ¡ n . l ( ' r ( l { , t r r ' l r r ¡ , r l o n r l t ' l , \ R \ r l n s l , l r ' 1 r .

l f r ' s l r , i s ( ' : \ l ) 1 , r f , l ' ' r ( i i r r t . l t r ¡ r r r f l t , l l a s t , ( l t l r r I

r l i l r , r l l l l s I \ \ r r ( ' f r ' , : ' r r r ' l l t t ¡ l l t ' t r , . l ) t i ( , ( l r , t t ¡ l r , r r i t t -r i r s l l t ; r c l , r 1 1 ¡ r o s r : r " r r l r ' s t l r f t . r e n t e s . ( ' r t n r ¡ s t l l ' r

, i i r ; l v { } r í a r i t t , l l 0 s l ) U ( , ( l t l li t s { , ( l i l - 1 1 ( ' ; } l t } i i s ( l { ' , r r , r , r ( l r i i l . L o 5 ¡ ¡ ¡ 1 1 ¡ n 1 ¡ " 1 1 ( l ( } s ( l L l e

est¿in ( 'n t ' l t ' i lo¡ t l tsr l , r s( )n i r ( 'o l ) la(1os v quiac ios h;u; -t¿r los r ibosornas I )or t t l l la¡ r rar lo ARN <le t ransfererr -c ia o AI{N-t . ( iuÉ: t ie}nc i t } la secuen(: ia r le nucleí r t i r l r rscornplcrnentar ia (ant i - r . 'odón) a Ia de los codones delAI{N nrunsaj t ' ro , ( le t i r l f onna que I )ueden a( : r )p larseen t re s í e l co r l í r ¡ t y r ' l an t i codó r r y pc r rn i t i r que l osan l i no i t c i ( l os se va \ / i l n i l i s ¡ ron ie r rdo en t re s í , con f i -quran(10 la proteÍna.

I '.n la lerr:tLrra clcl ci ir l igo qenético, como en todo lerr-guajer , hav una ser ic r lc r t : r i las] contro les fundarnerr-ta lcs c¡ue re( lu ieren r rn orr ' len cxqLl is i to para ev i tar"!.rr1'or',rs". tJn0 rle rl ir 'h{')s controles es reqular "cuárL-t lo" . " r r i l l lo" .V "cuí t t t t r r " se cxpresa un deter ln inadrJqel ) et t l : rs r : i : l t t las, Lt , : ; c t rote 's ( tn la oxpresión de ung,cn f is l l | lo de IOS l r r r :c¡ in ismos más f recuentes en iafornraci(rn y progrr.sl(ir l ( le tumores malignos y otrasDatoio! í ¡s . F i l ¡ r r inrer r r ive l r ie contro l es la requlac ién

2L

i"'ir. .i 1l

"1:'',!.

IJ

Patología molecular 35

l ' igutra 3,2, Trsnscri7(I( i t l ' ' t ()

durt ión. En el Proceso (1+ tt t ; t t \

, rr¡.t,:tórt se forma ARN ttu'n.trt¡,'''

i¡ttt' ¡t)sttlrktrmente en ¿l ( tt(){)ttt\.nü s( 'r ' t t i rui de molde por(r i{ t l r t l

rt¡(tt tr )n tle l<ts polipé¡llukt'

de la trairscripción de los genes (fiu l l .2) l lav dos se-(:uencias en el ADN que ccntrolan el inicio de la trans-

r:ripción y que tienen gran important'ta. Son los pro-

mo l ( ) res y l r l s l a t t l i l ado res o e l l l l ; i t l ( ' ( ' r s " l . , os

¡rromotores son se<:uencias del AD\ qut' están adva-( tentes a l gen que se va a t ranccr i t r i r y ' r :s donde se

u,rien los enzimas resgtn.sab{e* de la Eíntes¡is del ,ARN

la ARN polimerasa y otros t tínt' lotes I rrr f¡ctlrtrclt>

rgs $on secuencia$ del ADN rituada¡ a <lirtancr¡ del

f,0{l a transcribir y que [)or tnet &nlÉn](]l{ rlo blrrt cr>

f,l$cidos en la actualidad tarnblétt puedert rc8uiür lá

ngpresión de diclro gen, l)e hec:ho se l)Jenra (¡ur l,{r$

üit 'oraciones en la secttencia del AL)N rle l<¡l f acil l ta'.,$¡nr,es pueden ser responsables tle exprerrfin atre'

de genes después de la rotura de lof crom{)*(}y de t ranslocaciones

' f ior último, recordar que en la molécula de ADN, la Base de la tecnología delADN recornbinanter parte del mism<t no codifica para AR.N y no va

lugar a proteínas y se le llama hoy por hoy ADN

o no funcional. Por tanto, se distingue un ADN

nte v otro no codificante o silente. El primero

ncta de exones y el segundo de intrones y cle lar-gecuencias repetit ivas cuycl siglt if icado se desco-

Los intrones son secuencias de nucleótidos que

res. de f i t ta i l tgenier Ía b ioqr : Ín l ica ' son bástct )s püra

comprencler nluchtls cle los l lroyectos d'e terapia gé-

nica r¡ue hay trtt Inarcha, ,: lóll l() se puecle consegtrir l i t

expresión r ie t u i t gen hut t t¿tno en bacter ias v de toc la

ia tecnoloqia del ADN ret :ot t tb inante. Aunque los da-

t l rs rnole<'u l¿rres y b ioqt t l r t l i< ' r is que sabemos sobre la

e..i lru(tura rlei Al )N y el I otrltrrl de la expre.sión gerré-

t i ( a t ( ) r l car1¡ vez mán r . o t t l ¡ r le¡os, hay mucl tas lagu-

t'tü$ o p,unt()t "lre8f {)$" qlrt ' f rr ) ( f ) l locelnos elr la actua-

ll 'Jarj l)ettJe los lnet'anisrrios (lLle rigen la activación

lrrlul¡r a p¿rt:r cle señaL,'s í 'xl ( lrnas, hasta l lor qué se

rr:gularr ró.hr t letr, 'rninadrls qt' l l trs en el núcieo y quién

rr:gula a es<is regula.clor(:ri ( l( ' los qettcs. hay múltiples

cuesll()le$ para las qtl( ' I)o ( ()l lo(:elnos respuesta'

Irl cl iagnóstict¡ niolecular cle las enfermeclades, y la

posi bil id acl cle detr¡t-.tar al t t lrac iones genéticas pun-

tuales han revolucionacltl Ia investigación médica en

krs últ imos ailos. Dicho avallce se basa en la aplica-

c ión de la tecnología del ADN recombinante, en la

iclentif icacióli y en la obtettciÓn de genes o alteracir>

nes genéticas asociadas a las dir¡ersas enfermedades(fig 3.3).

i lon Ía tecnología del ADN recombinante se pueden

nranipular genes y obtenr:r grandes cantidades de

ADN. La base cle ciicha tecnología fue el descubri-

miento c lc t tnos e l lz imas bacter ianos, los l lamados

enzimas cle restricción, (lue rolnpen el ADN en sit ios

específicos prorlucieniio rt lt i ls fragmentos que se l la-

min f ragmentos de restr icc ión. Cada enzima $a se

conocen n¡ás de 200 enzirnas de restricción) recono-

va"n a estar representados en la proteÍna final re-tañte, l,a alternancia de exones e intrones es habi-

oCI lu mayor parte de los genes. Al transcribirseen AllN, la secuencia corresponcliente a los in'

S|l eB $eparada antes de salir del nÚrcleo por unplcltl ¡:roceso llamado "corte y empalrne".Iinal-

0l Al{N, que corresponde sólo a secuencias cietodtf lcuntc o crxÓnico, sale al citoplasma y tiene

lu traducclÓne0lnprer¡slÓlt t lc estos mecanisnlos molecula-

36 Anatomía patológica general

Amplif icación de la recombinación de ADN- rnediante clonación de bacterias

Figura 3.3. Esquema de Ia tecno-lctgía del ADN re.combinante. Seobsen¡a cómo tras cc¡rtar un fraq-mentc¡ de ADN con determinodasenzinrus de- restricción puede uco-pktrse a la estrut:tura del ADN deun plósmido. Lueqo, dicho plovni-do se incrtrporo ett boclerius tlucse crecen aislundo poslerürtrtrn.te gronde,s cantitlodes de plúsmi-dos con el fraEnento de. ADN itrtroducido.

ce una secuenc ia ú rn ica r ie nuc le r í l l i d t i s ! ' t ' ¡ r r la l¿ t ¿

dena del ADN de forma simétrica (en anlb¡ls t ¿t l+'n¿s

a la misma a l tu ra) o de fo r rna as i l t l¿ ' f r t ca i . . t l , ' r . t r , / r

mas se denominan con el norl lbre <le l¡ t¡¿t lerta r le l .r

que procec len , por e iemplo [ . ( ( lR I r r l c I r . h r ' l t , h ' ¡ r

cr-r1r), Snta I (de la Serr¡ l l t t t tr t t ln ?o\ | ¡ ' t t | ¡ l t i i rr l ¡

me l l ta l e l hecho r1e q l rc t ra l l¿ f {ú r l r ¡ , i t i¿ r h r l r ¡ r r ,

de l A I )N quec la un b t ¡ rde rue l to ( { } r l i f i l { ' r I le t } l ¡ r l ( r d ¡

otr<l l ' rorde del I)NA Cr-rrtarln ¡xrr lA rrrrsrtra t 'n¿lnla f . . ,(

ta t :om¡l lententarieclacl es la l tase r l t ' la ler lrrr loqia t lel

ADN reconbil lante, porque I)err l) i te l iq¡r Al )N err ¡ l lás'midos y cóstnidos, dontle, tras rt l tnlrt ' r el ,{ l )N cort los

ur ismos enz i tnas , se puede in teqrar la s r t r te t t r t . t { t 'n r r r r . ' n k r s m i s m o s . L o s ¡ l l á s n i r l r l s \ ¡ ¡ n t + - ( t ( ' f ( ' \ 1 1 t ' l

\ i r \ ' r , , r l a r e s c ¡ u e s e r n u l t i ¡ l l t , . r r ( , ¡ r ¡ i . r r l ¡ . 1 t t ' r l . t ! \r ' \ i ,? r ' \ r r r \ r l s ge l les en las ml \ f l r . r r l r ' r ' r l . r l r l r l l l . r \ l ,1r . , r r ' t¿ar f l r ( lOS Se les mete l l t t ¡ ¡ r t r r l r r r ' \ t \ t r f t ( lá a t l l )

1 i r r ' iÑr { ¡ ' r . Cuan( l0 CfeZCan l . i l f ü ( 1? ' r t . r l t ¡ñ¿r la l ¡ ¡ ( )Sf ' t 1 l l r l r ¡ ¡ ' ) l i c0 S í l lO CfeCefán ar I t . l l " r i , ¡ r re l k ' r ' r l l In te -

¡ r a . l . e l 1 r lás ln ido con e l gen d( ' t l v r l l r r r r . t,

" r ! e \ ta aprox imac ión b ioqu i r r i r r a ( lue per ln i tei r ¡r1,rr t f aqmentos de AI)N e introducir los en microor_

{.t f 1t:r i l ¡( ,s como bacterias, se puede estucl iar e[ efectorle la expresión de dicha .secuencia génica en las bac-

terias. Asimismo se puede introducir el ADN control

en un vector o como los plásmidos, (lue se transfec-tan luego a las bacterias, de tal rnodo que tras cultivarmasivamente las misnras pod¿irnos aislar los ¡:lásnti-dos y finalmente la secuencia génir:a rie ADN tlLie ha-bíamos insertado originalmente, ¡rcr'o iist¿ v('z ('n riran-des cantidades. Si el fragmr:nto de.,\DN qrie liabianl(rsmetido en los plásmidos era conocido, lo podenros uti-lizar ya como sonda específica en técnicas de hibricla-ción molerular. Si dicho fragmento cle AIJN no es cei-

i l r x ¡ r l , r r r . ¡ rü r r le r r '1 , ' r ' 1 r r { . r r ¡ r { ) r tned i t l de las " l i l l re -

rr.r l ' r1+.1 .\ l ) ! i {r ixr l , ;nr ¡ { le AI)N c'txl i f icante obtet l i t l t l

á rt .rr irr r tc R\A InÍ 'r \{ ! r r() ¡xrr tran.s< r i¡x ' i írn reversa).

I r ¡r i l l í ' t rxl¡rs r ' !r ' !r t , r i l ¡ i l t t . l t ¡ getle¡i y toda la tec-

l r r l t i1 ta r . r r { r * r } t , r ¡1 , r . \1 , \ fe t < lml l inan te Se ha¡ t S i tn -

f r l t l x .u lo ¡ n r r ¡ f ¡o r ' r , i l r ¡ ¡ l l r t t t { rg añ( ) . r i co t t e l es ¡ lec ta -

r u l ; r f { l¿ ' t ( ¡ r tx tn t r r , r , . ' l¿ lF ( n l ( 'A r l t ' l ) ( 'R o t i t '

arnl¡ lrh( *r rr-; l r"r ' r ¡ ¡r1' r ,r ¡ le l¿ f)() l lmerasa prlr ( i I i .

Mu l l l r e r ¡ l9 f ( . i r r ¡1 , d r r r ¡ ( ¡ , le f ' ( R l lo se fe t l t t ie ren

vec lo res t la ( tenar r ¡ , r r ¡ r lasn tx l ( )$ v se p t redr : a inp l i -

f l r ' ¿ r r t r r a l u r n e r t r ¿ r u t r . r , f ' ( l e 4 l ) N e r l L l r t l r l b t l t l e e n -

\ ¿ t v ( ) i ( ) l l t l l t a t ' x r l t ¡ | \ l l , r \ ( ' r ! s l f ) t l l r l a c l

Aislant ientr) v ofr i t ' r r t r )n del AI)N de tejk lo¡ _[ 'ara la o i r tenur í r l r t ] , ' \ l rN t le tnuestr ¡ rs t is t t lares hay

di ferentes rnéto( los .v l t ro tocolos ( l t le l ) i is icamenteconsisten en in t r (x l l r ( ' i r c l f ragmento de te j ido en untampón cle l isis, coll t ' l tzitnas proteolít icos (proteina-sa K) y luego en sel)af ar las proteÍnas clel AIIN de losextractos. l.,as diferclicias entre los cliversos protocGlos radican en la [)ayor o Il lenor canlidad de ADN qtte

se requiera obtener y trn la ¡iureza del mismo. F{ay dospuntos iunclanrent,,rlos (l lre ltay que tener en cuentaen la obtencion de A[)N tlt: los tejidos y que van a con-dic ionar l¿rs t l i fercnt t 's tócnic4s d iagnóst icas que sevírn a realizírr y p()r t¿rnto los resultados que se espe-rt:n obl,encr. [Jno t¡s el qratlo de degradación clel ADN.Si necesi tanus estur l iar f r :agmentos largos de ADN,( :orno con las técnicas t le Southern-b lot , es pr ior i ta-rio partir cJe tejidos f rescos rtc incluidos en parafina.[,os protocolos para l;r obtención de ADN a partir dete j ldos inc iu idos en l )araf ina son semejantes a losrlescritos a ¡rartir rle tcjido fresco,

'23

Patología molecular 37

TABLA 3,1. Técnicas moleculares

1. Análisis de ADNSouthern-blotPCR y variantesHibridación "in situ"/FISH

2. Análisis de ARNNorthern-blotRT-PCRIlibridación "in situ"

3. Anólisis de proteínasWestern-blotInmunohistoquímica

La técnica resumida es así:

1. Real izar var ias secciones c le paraf ina en e l l r l i -crotomo (puede bastar cor t l -2 secciones c le 5 mi-c r as) .

2. l)esparafinización en xilol (dicho paso es nece-sario cr¡and<l se quiere aislar ADN rle alto peso ttrole-cular ) .

l] l .avar las $ecctorles con al<'ollol de 95llt,, se se-can y luego se incubat l t 'on prot t : ina$a k en un ta ln-pón con un detergente.

4. Posteriormente $r sep{ra el AI)N IXtr exlrx"clÓ,n$fgánica con fenol y cloro{ormo, qur rtpsre ht lrrt>i'elnas del ADN y se prectpita el ADN en e,tanol (Xrrr

ff i,étodo más rápido es la uti lrzat' i ful <lt allar (t)r 'K"ell-

tfaciones de cloruro s()dict¡ o un rlpntr qwlmte ct>

$o el Chelex-Iffi, que atrapa lar pro{e{nm, rtl¡¡rln'

ftlss delADN que luego re precipile rfl c{¡rxil

Recientemente se han propuesto nllevos métodosmuy rápidos para la obtenciÓn del ADN, especial-mente para estudios con PCR, en que, tras la incuba-ción con el tarnpón de lisis el tejido se somete a so-nicación en baño caliente, se centrifugan lasmuestras y el sobrenadante se utiliza directamentepara elanálisis por PCR.

Las técnicas ntoleculares nrás utilizadas en la actua-liclad (ver tabla 3.1) se irasan tanto en el estudio de laestructura como de la expresiÓn génica. Las técnicasmás extendidas para estudiar Ia estructura génica sonla PCR, la hibridación "in situ" y elSouthern-blot. ['araestudiar la expresión génica, tanto a nivel de trans"cripción en ARN como de traducción en proteÍnas rtpueden utilizar l{r lticas ¡rara ARN, como el Norl h*rn'blot, RT{fR e hihri<la<'r,r'¡r "in situ" y técnicas ¡xra 1ln>teÍnas corno el Wr'¡lt'rrr lik rt y la inmunohistrx¡ttlntt<'a

PCR o reacción en cadena de la polimerasa

l lasta la i l ttroducciótt rle esta técnica, la síntesis de

ADN se har'Ía en el laboralclrio de una forma tediosa

v lalxrriosa. Era tret:esa rio añadir el enzima ADN poli-

nrera$á en rrn lrañlr a l i7"r ' 11,'a es la temperatura ó¡rti-

nla rle ¡l ichos en¿Ínra"c tlr la tnayor parte de los orga-

rr i l lRrx ( f rg, t 4) Pet<l ¡ r ; r t , t ( ¡ r ¡ese produzcalasíntes is

ele Al)N e$ nt(e$árlo (]it( ' ' ie separen primero las he-

l l ra t 11¡"1 n l r f n to. l<r t ¡ t t , ' r " ( r )ns ique cru l ca lor ca len-tan<J<¡ las rnue$tras a l i l i " ( : luego hav que añadir un

cel¡arkrr r¡ re¡'u€¡rcia g('rt i<'a conplementaria al ADNqür querernos sintetizar. hil lr idaciórt que se produce

a tem¡xratrrra específ it:a (,50-60"C), y, por útlt imo, ttn

Flgura 3.4. Técnica de t{:R. Estatécnicu se ¿tosc en añadir secuen'Clas de nucleótidos cornplementa-rlcs (¡rrimers o cebadores) a ktsOxlremls del ADN que se quiereQm¡tlificar. Hay uarias fases, quelncluyen la separación de lqs cq'donus tla ADN, el acoplamiento deI0$ ¡lrltners o cebadores y luego latfnt0.$l.s de ADN a partir de los pri-ln$rs, Dic,os po.sos .se pueden re-flllsar n u mero.$o.s reces obtenien'dn flnalmente ¡4,ran cantidad del¡ltgt r ut r t t t t s de I A D N

38 AratomÍa patológica general

Figura 3.5. PCR con trens(:rip(-ión int:erso. Lo dett'ct't,'tntle ciertos RNAs quiméricos es e.s¡recf iu; de cit'rftt.s *trt t¡mos (tumores malignos de diferenciut ' tr in rnesent¡utrrtr t l ;El esquema mue.stra el onúLtsis dt ' . l l ru¡tstnl,) \ t l ¡ tu¡)( tr

cos (EWS-WTI, EWS-FLLi, y I'AX;|J:Kl{lt ) (n t tir¡,,'. .i ,,):mopatológicos de sart:onrus ( lu¡¡ l t¡ ' t i t ' .st¡t t , l t l t tst , , ' t t t i iIas pequeñus v redondas, . \ot '( ( i r 'n(t t /r L,rabdotniosarcrtmu alt¡eolar). PurtL cudtt tu¡¡¡, , t ' , " ; , '

uno imagen I istológico ( izquit ' rdtt) i , /¡r r , ' i . , i , "(de.recha) Cornr¡ cr¡nfrt t l prtsi f iut t ' t t ( t \1r ' | ; , ' , , \ . 'pleó lo arnpl i f i (üctón de Qt [ tr t t¡ t t i i ¡ tr , t ' t tL :"tr ' t '1 'r " 'estú u(prcsudo e¡t t t l t lus,r{ ir , r /1r l¡r: , l t t tgs1,,, , t , ,

enz i f l ta . la ,A l )N J )o l l l l te rasó r . l { ¡ r . l r t r i i , r1 r } * , r { t Í t¿1 l r r ' r ,do nu t : le t i t i t l os ( le fo rn la cor ru r ie r r r t 'n lana . t i , rs l r r ' l r r ¡ rd e l A I ) N s e p ¿ I r a c l a s , c o l l i c n Z á n ( l o , r ( i , r r l n r r i i ! l ( ) n { l tl o s c e b a d o r e s . P u e s b : e n , e l r l t ' s t u b n r r r r n t o q t , r n . r i

t raza t lo por Mu l l i s y per fecc i ( )nar lo po ; ' Sark r lu t , t ' lu t l l r z ¿ r u n a h D N p o l i m e r a s a r e s r s t p n t e , r t o r l ; r s l a st t ' [ I r f t r 4 l u r a s , c o m o S o n a q u e l l á s r i u r ¡ \ r ' o i r t r t , r ¡ t . i i r l (f l | l { r r ¡ ¡ r t d f l i s m o s q u e f i o b r e \ ' t \ r ' t t . t r r i i t l ( ( r ' i l l r i t , l, f \ .rrr11r <tqUAtiCUS. COn Ia Utl lrr .ru( )tr r lr , \ l ) \ lx l l lnle-ra r . i , " r Ínoes tab le todo e l p r r r r r l r l r . a r r r ¡ r l r f r r ac i i rnr le l \ l r \ Duede rea l i zarse en e l rn rs ln ( ) lu lx r r le r . : r ¡sa-

\r, \ r i l lo se requiere un aparato () trrrnrx'rclarlor que\ r \ . r ¿Justando la temperatura del tubo r: ic l icamen-tc es decir, tiene que haber una fase de desnaturali-¿acrón delADN a 95"C, una fase de hibridación de loscebadores o primers y otra de sÍntesis de ADN. Unavez que se ha sintetizado el fragmento a detectar clicho ADN de doble cadena puede servir cie molde pa-ra un nuevo ciclo de amplificaci(ln, con las fases cledesnaturalización, hibridación y síntesis. Este pro(:e-dimiento puede realizarse numerosas veces (generai-mente 30-40), de tal forma que al final se obtienel nu-merosas copias del fragmento de ADN deseaclo,

La técnica de PCR se puede usar para detectar ii i-serciones génicas, delecciones, translocaciorles y rtu-taciones puntuales, Se puede realizar a partir de teji-

do fresco f i jado o incluido en paraf ina. La pr incipalventaja y desventaja de la I'CR es su extremada sensi-bilidacl. Puede detectar una secuencia de ADN que es-tá en una rnínina pro¡rorción ep el tejido (hasta unacéiula que está en un tolal c1e i0' o 10" células) y a par-t i r de hasta sólo 10-l00 copias delADN problema elrlas muestr¿s c'lÍnicas. Esta gran sensibilidad puede re-preserntar a veces su grar) lirnitación, y es por la posi-bilitlacl rle que se cle¡teclen falsos positivos por ionta-n) inaci( in at ' r ' ic lental dt ' las muestras biológicas, deahí la rnrJrorlancla (le sr: realización con controles pcFsitrvos v negatrv(is y t'rr r'r¡rtirna.s condiciones técnicas.

Asimrsnlo es ¡xrsr l r l t ' t studiar vims ARN o real izaranál isrs ( udnt i l ¡ rrvu, l t ' t .x l rresión génica mediante laté t 'n l ra r le l ' ( R , r l i , i r t i r r le ARN, que con la enz in latranscn[) l ¡s; .r ulverr r *r ' t , rnvierte en ADN (f i t . 13.5).i s l ¡ 1 r , , . t ! r ( , r r l { ' r ¡ r ' r r ! r l i , r R T - P ( ' R . n l L r y L l t i l i z a ( l a n ni ; l a i l r l . l l r i l ¿ r l l ; ( i t ¡

\ , I i ¡ . 1 ) ' r i r " ' r l l r r ' l t , r : t . " ' q n / , i t ( k l A f e a l i Z a f e s t u ( l i ( ) . S

, ; ¡ . r r ; 1 r . ¡ r , \ r , r , 1 t 1 , r i ' r l ' , ' ¡ r U e r ( 1 0 C ' r l n l a f l e n S i t l a f i Y

" i l t l , t l , r r ! t i , r t r¿ r r r j , 1 , : , r I f . l ( l e e l ec t r o fo res i s

i ' \ l t , , l ' r ' r ,

L , r r q , , r , , ! ' a r r . ¡ , . , . " . 1 l t ' s ¿ f f r ) l l a r l t i l a t é C n l t : a t l t :l ' { X . r , q r t ' ¡ r r , f u - r , , r r ( r r r r n t 'S t t s t t l a f es . Se t ¡ a f -I t , 1 l r r t . r . t i ' i r c s ' ' r , , r r r ¿ i r ¡ r t t , r l ¡ ¿ f a f i l l a y , t f a S l a

i ) r r ' I r i r f a r l ( ' t r l l s { 1 i . 4 ' r { ' 1 , , / r { 1 r i \ f l ) l ( x f ' ( ] t ' a r e a l i z a r

Figura 3.6. l'úR con tr(utscripción inuersa. En el tumortle.smaplásico de céluhts pequeñas y red<ndas se detectonlra¡tscritos quimérir:os I':W'S WTl que se pueden amplifi-tur enple.ando prinors ttdecuados. La figura rnuestralransrritos t¡uimericcts en los 5 turnores estudiados. Todos¿:llr¡s tiene¡t un tarnttño rle 2(iB pares de bases, saluo un ca-so ('t:olle, 1,), que tiene un tailruno onormol de 451 paresde bases. Su cionado y se:ruenciecion reue[ó una inserció¡tde l8.lJ pares de buses.

25

PatoiogÍarncrlecular ' 39

Desnaturalización del ADN

Hibr idación in s i tu

'ü

Sistema dedetección

Digestión con proteasaspara exponer e l ADN

\Sección tisularcon sospecha deinfeición viral

ldenlificación de la secuenciaviral por nrélodos colorim€lroso por auiorredrogrnfít

Figrrra 3.7. Esquema de La léc¡ti-ca rir,.SlS[]:f Como se obserua en eltlittLr.jo, es importante compürars¡entpre el gen de las muestras pa-ktlrigiltts con tejido normal. Se re-ali;tt i'CR y luego el proclttclo srcorrc en un gel de poliacrtlurtt<luque pernlite seporar las (utlt ttrttr le.t ' !,) l ' l nutudtts y que, l iet¡(t, ¡ lt l t 're . t tCiOS t r id intensi r . ¡nql ¡ r ¡ t , r r t , L , tt'n l)(so ¡¡x¡leculur.

.l

los pasos cle amplif icar:ií l l en carlena cle la polinrrrra-sa, añadienckr krs trrinre'rr o cebadores, los nuclerit i-dos y la Al )N ¡ ro l i rncrasa a los l )or t i ls . A lgrrnas casasc:onrerc ia les ya t jenon a l )ar¿t( )s dc I ) ( 'R qLr t , d is l lont 'nde nt íx lu los con at laptac i ( r r t para . ior tas, t ¡ r re t rar ts f i r ' -rer) Ios t l i ferentes < i r ' los dr . l r ,n l l ) ( . : i l tur i l ¿r l ( rs i l i ls r i l ( )s

l i s t a t écn i ca l i en t - . u r r g ran ¡n te re r ¡ x ) r ( j r r ( , p t ' r r n i l t 'estudiar e interpretar la$ aileraorxleli otx try{:nilar idetectar los nticrorlrgant$rl(¡ri ( l{.r}{rl rJel t r f l l t 'xto ce-hrlar y tisular de la lesxin

PCR SSCP

Como declam{)s. el e$tud¡o ¡rr l{'R lx.rnri{t" nntpl,i-ficar y detectar a'quellot ¡¡ene* tft" l<x qur ct)rxxrmri$su secuencia. Con dicha tócnlca anlp{tf i{árrx}Í r}t AJ)Ny tenemos un resul tado de por i l rvo o negatrv() . ( . lu t 'en muchas ocasioner i es suf ic ierr le . ln i r e iernpl { r . enel diagn(rstico de enfernledades rnfecr it¡sas, lranslo-caciones, etc . Perro hay tarnt r iér r , r rur :has st t l ¡a( lon( .bdonde la alteración genética es punlual. e$ declr. Íor)mutaciones que pueden ser múl't iples -v diferentes alo largo de la secuencia génica v qrlr, ( 'on P(lR se vana amplif icar en cualquier (:aso Prir eletnplo. dicha cir-cunstancia es la habitual en el {en sr¡presor I ' '", cluet iene múl t ip les mutaciones d i {erentes y que es la a l -tcrac ión oncogénica más f recuente ern tumr l res l lu-rl1anos. Para saber si hay mutación en trn cletermina-( lo gen, e l método d iagnóst ico cr inc luyente cs lasecuenciación de dicho Qen, comparándr¡io con otr<rnormal detectando qué codón y r1ué base es la muta,rla. Dicho procedimiento es largo y lallorioso, por lcr(lue se han desarrollado unos métodos de análisis dentu lac iones más rápidos y genér icos, como el PCR-

SS( l ' r I ' r i l r r r ' f , r \ r ' ( i r ,1 r r r l i oac t ion-S ing le -St t a r t r l . { r i r i -

I o r r t I a t i r l r j - I ' , r I r : t r o r 1 i I r I s t t I ) .f : , s t r : r r l c to r . l ¡ s t ' l rasa o t ) t l l . te Ias cac i 'e t ras se t t l l l l as

r l c A I ) N ( ' { r I r I l l t a ( i o r r e s ¡ l u n t u a l c s t t , - l n e n r l i f t : r e t t t e

r r ro ' , ' i l i< l i r r l t ' l ec t ro fo r r : t i r ' ; r cn t ¡e )es de ¡ ro l ia< ' r i lanr ic lar r r i ( l t ' sn ; r lu r ' ; r l r z¿ur t t ' s t f i r ¡ . i l 7 j . [ ) i cha c l i fe l rc r t le lnur , ' i -

l i t l a r l v t r r r l r ; i r la< la l ro r r l t r r ' ¿ r l ox is l i r una sc( 'L l ( - l c ia r : le

r r l ¿ l r ^ r ' r t r r ' l r ¡ s t l , 1 r , r t ' n l r ' " ' ' r r r r l l c c r r l r ¿ l r ' o n f j { u r ¿ l c i í l nt n ( J t r l t ( . r r $ r ( . ) r l ¡ l t ¡ r i t , r r ¡ , 1 ' r ' ¡ ¿ i n l o v i l i d a d e l e c t r < t f c l -r e l r r ¿ i s 1 { , n } ¿ j t ( x i r . , ( , i ¡ , \ , t t i i l i l t ¡ u e h a v c l i l e r t - ' l t c i a s

! \ l {1.\ i . i Aplh:a<' iones l l ínir:¿rsrnás fre<:uenlesdd Sfi(.P

I Mvh¡t"t¡¡vtt,s v¡nlolit'rts ¡,n cattcer

RASi r t '

I{f}

2 (iene.t de enlen¡tedurh'.s hereditariesNetrrofit¡rornatosis t i ¡ r, r IPoliposis col(rric¡ f arr r l i¿rr íAI)C)Síndrome de la nrLrjL,r \\ 'Síndrome N4arlan (gerr rle la fibri l ina)Parálisis prrri r idica lr i ¡ rr 'rkai(:micaI'umor de WilrnsFibrosis quíst icaHipertriglicerdenria' fay Sacl rs t ipo Il; 'enik:r¡tonuriaHenlofi l ia I lItaqr,rit isrno vitanrina [) clependienteRenir r i t is p igrnentosa (qeu de la rhodopsina)Peri¡rherin-RDS genL,nfe¡:medad Pelizaeus-Nlcrz:ba<:herPolimorfisrnos v alter;r(ionr:s alélicas familiares I

40 Anatomía patológica general

en el ADN, pero que no nos precisa a quir nivel, pue-de detectar alrededor del90% cle todas las mutacio-nes puntuales en fragmentos de menos de ll0fl nucle-ótidos y alrededor del B0% en fragmentos mayoresde 400 nucleótidos; es decir, cuanto rnayor es el fr¿rq-mento, menor es la sensibil idacl del FCil-SS(lP. l,a vi-sualización de las bandas puede realizarse r:on tér:ni-cas autorradioqráficas si algunos de lc¡s elementosde la PCR estaban marcados con azulre o fósforo ra-diactivo o se puede revelar con métoclos no radiacti-vos, como la técnica de nitrato rle plata.

Las desventaias del métockr I)CR-SSP(' son lr¡s l¡ l-sos negat ivos, que conlo hernos indicat lo puer lenocurrir l iasta en un 10% dt las tx asiones v que rlr) n()spermiten estar seguros de rlue lo haya ninquna rnL¡-tación en los casos negativt-rs.

Esta técnica puede ut i l iz i l rsr ) [ )ara € l r l ia{n i rs t l r ¿rde gran número de enfermeda( l t 's , , ' r ] r \ r la l r ¡ l jes r , ¡ ,máticas ltabla ll.2).

Ottolqelqgt p,qry _de!e$ar m u t ac i ( )nes

Prác t icamente todos los l l l é l rx lo r , r ( t r , l r .a lL r r r r r ,r lel ADN ampli f icado prevlAmert1{, 1r rr l ' l l {

A) Tócnlca lrcGE (ek"q'trefr¡rmte m ¡el ár ¡rr.diente dernaturalizante)

Es ut l nrétot lo muy sensi i i lc { ¡ r r r , r l t ' l t ' t t , r ¡ ¡ ¡¿5. 1 l r , ' l ! rN ' r1tle las rnrrtaciones. Se basa en ¿il iarl ir ¿r la st.r.r¡er¡¡' i ;r r lelos pnmen una cadena de nucleírti<krs (i( i y lucqo re;r-l izar una electroforesis en qradil l.nte rle telrrircratrrra.Co¡r *'qta técnica se pueclen separ¿lr rrlr¡lír 'ulas de AI)Nctr!¡ \rr uencia clif iere en una sol¿ tr¡rt t ' tr f unt.ir in clelar ¡ ' r '1*r^c ladeSdefUSióndel ¡ \ l ) \11r \ , ' l r r ¡ ' r ¡ l ; rs lnr) -I t r r { , t r , te ADN se funclen €r t S€r{ i rx , t r l ¡n l l , r r r ¡ ; r t los t l (>r IUi l r i ' r t le fus ión, Cuando a lcanz¡ l l Urr i r < le lerminaclat t ' r l r ¡ r ratura o concentrac ión c ies l tatura l izante. i .aternlx'ratura a la que funde un dominio constituye su'Irn

y depende fundamentalmente de la secuencia denucleótidos. Las Tm de fraEnentos de ADN varian ctrmo consecuencia de cambios mínimos, pudiéndose vi-sualizar cambios en [a movilidad electroforética de lasbandas. Se requiere un aparato especial y unas conrli-ciones técnicas de difíci l aplicacirln de fr¡rma rutinaria.

B) Electroforesis en gel de poliacridanrida paraheteroduplex

q ASO (Allele-Specif oligonucleotitle tr ybritl ira-tion)

En esta técnica el producto arnplif icado de ADN esanalizado con hibridación por Dot-blot. Las sondas a

estudiar suelen marcarse radiactivamente y se hibri-darán sólo con las secrrencias de las que son tota l -mente conplementarias. Se requiere que la mutaciónesté presente en ai menos un 5% de la población ce-lu lar . Este método se ut i l iza para detectar mutacio-nes en sit ios específicos, como las del oncogén RLSen tunrores humanos. (luLl suele localizarse en los co.d<rnes i 2 1. ] y 6 l [ .as sorr r las especí f icas para f rag-lnr :ntos de , \ l )N que enl l lo l )€rn d icha mutación recur l r ¡ r 'erán sr i lo e l \ l ) \ r r u tar lo y no e l normal . Esterr rét rx io r ro, rhstante t r r r r* ' ( l r )s inconvenientes: a) de-

l .x . r t r l rerr r ' lo r l r '1 , ¡s r r rut , r , l r )nes a estudiar se requer i -rán varr¿¡ sr,tr!( l{r\ 1r.rr a , 'r ' tr '<'tar las cliversas variactr¡nes tx ¡s tb les f ) ) l¿r ( | r r r ( i r ( ¡ , rnes de h ibr idación t ienen( l t l t , r ,s l , r r n t r ¡ r , npl r r l r r¿. i r las, ] )ür? cada son( la para po-t i e f ev l l a l t ¡ t t r ! r f r Í t r r i l r ' \ 1 , . " l l t ( ' a ( .

Re ( ¡ . f ; t r ' ! r l t t r l r ' \ r - r r r r l t ¡ l i z¿ l do e . s t a t écn i ca p ; t r a

r ' l t , i l r t ¿ r . . l l r r l r r , ( 1 , 1 , 1 , l l r , t r t ' s t ( l u ¿ t l e t t ¡ l r o c e s 0 l il r e r r r ¿ i i , l , r ( i r r r \ ( ¿ r ¡ ¡ r r , . , [ l r ) t ' 1 , v e ] i Q a . . , d a d O q i t e

{ r ' t } t l ¿Jn r . r ¡ t r ¡ t r i r r \ t r l r , r \ su t , l en c j e tec ta r se r t t u -

l " l { r o i l r ' \ \ f ^ r f r r r . t t l l ? ' s , r r s , l r ' l t t tm0 f p f im i t iV t l y C , l l t l

l r . ' i l r i l l r , i l i . t ¡ ¡ / , r f l , t \ , l : r , I i l l r f ' l t t t , t . l l t l tV t ' fSaS l nUeS-

i rd t l rH i lu , ¡ l l r . t \ r l re r r ' .

l . l \ l ¡ 1 1 ' r I r / f l r , " ! : l r '

| .r t v rleter:tar las rt 'cidi-

[ ¡ Prrllr*a'fhro dr lnrrgltud de fragmentos den"iffir"r ¡{t{¡

I t t t ' ¡ l t ; t t t ' l r x l r ' r . ' r ' t l i ' ' ( ¡ l e l a 5 I n U t a C i O l ) É ' S e S -

t t ' l t l o r , r i ¡ , ¿ , t r l . r s l l l '

t l e r e s l r i e t i i r n l J r ' , s ' , , | ¡ r , , s r t r ¿ V t t r r ¡ t a c i o t ¡ r , s . t : l

c n z i r t r a n o r e { ' o r ) ( ) ( r ' b l r l ) i r r t l ( ) d e c r l r t e r y s t , r l r i g i n a r t

cl i ferer t tes bant las en las i r ' l r r las r :<¡nt r< l l .

F) PCR-aleloespecifi <:a (MisMatch).Este n létorkr se basa cn Ia detección de mutacic-

nes conocicla.s mecliantt 'amplif icación por PCR. Fist;rtécnica es út i l para r lc tectar mutaciones a lé l icascuando la configuracióll normal del otrc¡ alelo está en"exceso". Se parte de oligonucleótidos alelo-específi.cos para la secuencia nrutada y tiene una gran sensi-bil idad, pr-rdiendo dt.tectar hasta una célula mr"rtadaentre un nril lón.

Técnicas de hibridación

Iiouthern blot y Northern-blotAnlbas tér :n icas se l l¿rsan en e l anál is is del ADN

(5orrtliern-biot o S-B) o cle ARN Qt{orthern-blot o N-B)rneciiante separacióir de los mismos por electrofore-s is y poster ior h ibr idaci t in con sondas especí f icas.En e l S-B eIADN genónr ico (e l ADN ¡61¿l ¡s l ¡ lar ) se

4 t" t f

PatologÍa molecular 4l

corta con enzimas de restricción en varios fragmen-tos y luego se separa en electroforesis en gel de aga-rosa. En el N-8, el RNA celular se aisla y se separa tarn-b ién según e l tamaño pr l r e lect rof i l res is en qel .Después de la electroforesis, l<¡s ácidos nucleicos sontransferidos desde el ¡¡el a un fi l trrr de pa¡xl de nai-lon o nitrocelulosa al que se qrxxl"rn ftiamente unidmcon la misma distribur:ión y rr:para<'iÓn qtn en el ¡gd(fig. 3.8). Posterionnente. el flliro rk ¡n¡rel m hlt¡rklncon las sondas etpecfficar ¡xrr el AIIN o ARN qur

Figura 3.9. Souf/rern-blot. I'ora reoltzur cl Southernblolcont)iene primero digerir el DNA con diuersos ent,imas derestritción y onalizsrlo eLeclrofc¡rélü:cunente en un getl deagoroso (pane,l izquierdo). El DNA cr¡ntenidr¡ en dicho geise transfiere entonces a una metnbra¡n de nilo¡t q le que seaplican sondas comple,mentarios radiactiuas (panele.s <:en.tral y derecho). El e.¡emplo tnuestre el estudio de un tumordesmopló.sico de celulas pequeños y redondos (TDCPR), lu-mor pediátrico en el que existe una fusión enlre los ortc('g€-nes EWS y W|. Algunas bandas de DNA pre,sentesen el Felde agarosa se hibridan tonto con EWS co¡no con Wl, po-niendo de manifiesto Ia fusión de dichos penes.

Figrrra 3,8. 7'écnica de Southern-Blottinq. Los diferentes pasos dee,sk¡ técnics estón repre.sentadosen t:l dibujo. Se requiere correr Issmu('strus de ADN, cortado preuio-menle, en geles de agarosu, [rzns-ferirlas a papel de nitrocelulosa yposf eriornente qñqdir las sondasde .t.[)N c'tnryle mentarias que que-renl.s estudi<tr. Se reuelo habúuul-mr:. ¡ ¡ tt, Dor métodos rodiacl i tu ¡s

queramos esturliar. Las sonclas pueclen ir marcadasradioactivarnente con I ' r l bien por sústancias (lue

¡rermi tan l r reqo srr v isual izac ión por medios color i -rnétricos o luminiscentes (fi¡¡. 3.9).

I ln las reacciorres de hr l r r id ; lc ión hay una ser ie def actores tó<:n i t 'os r lue corrd ic ionan e l resul tado f ina ly sobre lodo la es¡re<'if i<:ir ' lrrrl i le la reacciírn. Son lasl lama¡ lur r 'o l r rJ ic ionrs <k ' + 's t r inqencia. y que corrs is-l *n l ¡á¡ i l< 'amente en adal , lar la temperatura de des-rrutr¡valira<'ión. n la ft¡erza i(rnica cle la reacciírn, la pro-

¡xrrt ' f{xr rlr las bases guarrina r:itosina en las sondas,la lrn$tud de la sonda y la proporción de formamida(a¡Ísnte qur: lavorecer la se¡rar,ici(rn de las hebras deAl)N) l,a.s meiores r:onrl iciones y, por tanto, las dem¡iyor esptrif icidad se'oirtendrán con las tempera-Ir¡ras más altas, con las nlayores concentraciones deformamida y r'<ln la nrenor f r-rerza i, inica.

tjna a¡rl icación típica ¡.,ueckr ser el estudio de pre-$encia < l la a lnpl i f icac i í r r de oncogén €rn un te j idolfie .| l t))

Hibridación "in situ

I-a hibridación "in situ' es una técnica histoquími-ca que permite visualizar al mr,croscopio fragmentosde ADtl o ARN. Tielle dos r] '¿rndes ventajas sobre lasotras técnicas de biologí;i molecular que detectan áci-dos nucleic<ls, cl Southern$lot y el Northern-blot:

1) L,a posi t iv idad se c letecta en secciones t isu la-res, con lo que puede correlacionarse con el t ipo ce-lular y el contexto patolót¡ico.

A '1 L AnatomÍa patológica general

Figura 3.10. Southern-blot paro deteL'tttr omplifica<'t.ll- *r.nica. La antplificacion del gen MYCN ( N-myc ) es un la(tolpronostico sduerso en el neurobktsk)n¡o, un tuntor perlratrico de origen neural. La intensidud de los bandos en el wlde Ia figura se correlaciona con el núntent de crtprus delgen MYCN. En el ejenrylo de Ia figura e! qen rle 1¡¡s c¿¡r/e nr¡rpesadas de Ia inmunoglobulüta (lUI.). que nun(u olxtrcrtarnplificado, se emplea camo co¡ttn¡\. l,os (uutft., lxtt ñ'rrle\q nq I i z ado s e n e I ge I t e n í a n n¡eld.sta.s i.s o I I n ( ) fi | ( n& ) tl+, I d w tgnóstico; Ios pacientes I y 2, con omplificacón dr lll t \ ruuieron un curso clínico mucho ntús errcstv) qrc lt 'r ¡xtcientes 3 y 1, que no tenínn ontplificcrcittn del lyn

2) l,a técnica se ¡ruede re¿ll¿.ar a ¡rnrtir de tttt t rr¡,nes de hasta c inc<- l n icras, penl ) i l tend() pnr tat ) to,analizar rnúltiples secciones t:on variaclas son<las enpequelias biopsias y/o lesiones. Por el contrario, pa-ra la realizaciQn del Southern y el Northern se requie-re aislar el AQÑ y el ARN del tó¡iclo, respectivanenre,y en general dólo se pueden realizar I o 2 Northern-blot a partir cle pequeñas biopsias,

La técnica se basa en la hibridación de secuenciascomplementarias de ADN o ARN. Las condiciones defijación y preservación del tejido son importantes,recomendándose la fijación en paraformaldehído al4%.Las sondas pueden ir marcadas radiactivamente,detectándolas por aLltorradiografÍa o bien con bioti-na o digoxigenina v visualizarse por una reacctórr cGlor imétr ica ( f ig. 3.1 i ) . i

[¡¡i marcarlores radiactivos más utilizados .son elP:i2 r,fíre foro). S35 lazuf re ) I'" ¡ioclo; v H3 ¡tináidina ti-tnada) tn c¡ro dr n<r utrli¿ar sondas radiactivas son¡lreferlbltr aqunll{s nlarcadas con digoxigenina, da-elo r¡ut en c&to df r : t r r¿arse sondas marcadas conbiotlna hay qu+ lfrrer , rr:rjado con los problemas defonrlo in*prl:l{k'u I r inu{'hos tejidos, especialmen-te hígarfti, hay b{r*i n,,r t r r irigena, por lo que si las son-t{an er{.fui rnlrrlrl*r ¡ q "rr trrotina, los anticuerpos quer¡{i,Jirs¡um p*rn drlr"r ' rr r.l producto de la hibrida-r rxr ¡xra*en rpá{ {'1, }rr.rl t¡inbién con biotina endóge-lm rt,*r¡Jt¡rndo en fatr¿ ,r,,.irtrvidad,

l^r .r a¡r l icor: l rNrer rJr. ; , r hrbr idación " in si tu ' se re-sunl.rn ert l¡ tal¡la .1 'l

llSH (tftnln dt hibridnclén uln situ'ocon fluorrrmch)

[ ,a técnica de l ' lS l i sr l r ¡sa en la ut i l izac ión de son-c las cspecÍ l icas l )ara r l t ' lc rn l inados cromosomas osecuencias de los ln isuros. Perrn i te estudiar ¡ r l tera-c iones genét icas conconr i tantemente con la v isual i -zación cle Ias células y eri el contexto tisular de la les ión. Esle métodr-r se puede ut i l izar tanto encromosomas en metafa.se como en interlase" Obvia-

Tffid----.Ihbffi"-*: ---ffiññ;- *=*Jairroaa¿ ¡.asasas¿' ¡¿zii;ciñ¿ S¿üróAó¿,,'i

-'--::,- ----Tl--:-:*-

pglEci¡ lam¡da ¿"6

[IEJiqÓTlJ¡ñóÉE

migraclón en gel)oliacri lamida 6% r. cadohas scnc¡llas

)08 caoenas

+ J3'iif..,o,.u,,0" J látl8'r"'u"=---Q rFF --A *arren:r.deos,I-c, ---Q.

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figración en gel miñr¡.,ón a^ ñar

Figurg 3.11. TECNICA DE HIBRI-DACION "lN SITU". Esta técnicaperm¡te uisualizqr el ADN en suco ntexto cito lógico e h i s to ló gico.Hay que realizar los mismos pososque en otras técnicos de hibrida-ción molecular. El producto de re"acción puede uisualizarse por mé-todo s c o lorimétrico s o radiact iu os.

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29

44 Anatomía patológica general

Flgura 3,12. Western-blot. En esta técnico las prcttt:Irtos,analizudas electroforéticamente, se pue.den tronsferir ouna membrana, donde se pueden unir selectiuumente oonticuerpos monoclonales, de manero anóloga ol Sout.hern-blot. En la figuro una membrana que rrntlene pnieínas extraídas de tres casos de. tuntor desmoplasict¡ de r:é,lulos pequeños y redondas se ha trakdo secuencialmentecon onticuerpos monoclonale,s para EWS y paro WT1 I-{lpresencia de bqndos que se morcen ct¡n kts dos anticuer.pos pone de- manifiesto que en este tumor no sólo huv- DNAquimérico EWS-WI y RNA quimérico (fiss..?.5 y Jl fi), sr.no tambien proteínas quiméricos EWS-IYTl

a estudiar. L,os pr incipales inconvenientes son queno se sabe dónde se expresa delrtro del tejiclo estu-diado y que metodológicamente es una tócnica la-boriosa y tediosa.

¡\i

Aplicaciones de la biología molecularen patología

I-as aplicaciones del diagnóstico molecular en lapráctica clínica son cada vez más extensas y básica-rrrente se pueden aplicar en 6 grandes grupos (ver ta-bla 3.5): patología tumoral, infecciosa, metabólica,así como en el estudio cle factores predisponentes adeterminadas enfermedades. Asi, mismo. con diver-sos marcadores muy polimórficos, es decir, con unagran variabilidad entre las diferentes personas, sepueden constituir patrones de ADN identificativos decada individuo como auténticas tarjetas de identifi-cación como elDNI.

Dichos patrones pueden ser muy útiles en patolo-gía forense para identificar criminales, violaciores, pa-ra distinguir muestras de biopsias ante confusiones,para reconocer casos de enfermedad injertr_r-contrahuésped, en la que los linfocitos del donante prolife-ran en el receptor, etc.

Las posibilidades del diagnóstico molecular depen-den no sólo de la disponibilidad/preparación técnicadel laboratorio y de la validación y desarrollo de son-das o primerc específir:os para las diversas enfermeda-des, sino también del tipo de muestra que se pretendeestudiar y analizar (tabla 3.5). Como se indicaba en ladescripción de los métodos de biología molecular quese emplean habit¡ralmente, hay una serie de limitacio-nes técnicas que üenen dadas por la "calidad" del ADNde la muestra y de su grado y modo de conservación.Lo ideal es partir de tejido "fresco", sin manipulacio.nes ni ¡xrsibles degradaciones. No obstante, dado queno slemprr s,e dis¡mt'{l(' tejido reciente, se han adaptado múrltiphs técnic¿¡s ;rl liiagnóstico molecular a par-tir de material irx'h¡kj''¡ r'rr ¡rarafina, rlue es la forrna ha-bitual de (\xl${:rvar kr:r tt.ridos en la actualidad.

Dlagnós t i co rnolec u I a r elp_ltglqgía !g!g¡1!_[ .os méto<krs t lescr i los anter iormente se están

empezanc lo a u t i l i za r r je fo rma s is temát ica en mu-chos prt-rcesos neolt l í rs icos, s iendo enormes lasperspect ivas f uturas. l , l cárncer no es más que unacúrmr¡ lo cle al teraciorrcs gen(: t icas que conf ieren"ventajas" t le crecimiento a las células y l ; rs hacenresistentes a los controlcs cle la prol i feración celu-lar tanto internos collro t:xternos. Como se estudia-rá en el capítulo r ie crtrc inogénesis, el descubri-miento de kls t¡ncír t lent:s y gencs supresores esbásico para entender el r lesarrol lo de los tumores.La detección de dicl-ras al teraciones oncogénicaspuerle permit i r un f{ran í lvance no sólo en el diaq-nóst ico, s ino tambiél l r :n el establecimiento de fac-tores pronósticos y l;r ¡rosibilidad de una aplicaciónterapéut ica más select iva.

Hay ya nás cle 50 onr'írgenes y de l0 genes si¡pre-sores ident i f icados en tumores hunlanos (ver capÍ-

TABLA 3.5. Aplicaciones dcl diagnóstico molecular

Reordenamiento genartlco en procesoslinfoprolif erativos

Estudio de alteraciones oncogénicas

Iclentif icación de agenters infecciosos

Estudio de alteraciones genéticas hereditarias

ldentif icación de "rnuest¡a"

6. Estudio de metabolopatíasL__

-- -

31

Patología molecular 45

tulo de carcinogénesis). El modo de estudiar dichasalteraciones oncogénicas estará en función del tipode gen y de la anomalia, es decir, si la activación espor mutación puntual, por translocación. . . l{ay múl-tiples mecanismos moleculares que pueden induciractivación "oncogénica": translocaciones e insercio-nes cromosómicas, delección de ADN, transversio-nes (mutaciones puntuales) o missense mutaciones,mutaciones non-sense o alteraciones de las proteí-nas, al teraciones delspl ic ing delARN... Adernás esbásico el considerar la posibilidad de que variaci<t-nes en las secuencias de estos génes "oncogénicos"no sean activantes y por tanto se asocien al polimor-fismo genético individual y no al desarrollo del tu-mor.

Análisis citogenético

Con la caracterización del cariotipo y las características morfológicas de los cromosotnas se puedendetectar anomalías de los mismos, como es la típicatranslocación 9-22 (cromosoma Philadelphia) en la

leucemia mieloide crrinica. Dicha técnica requierecultivo de células y la preparación de los cr<lmostt-mas en metafase (fig.3.13). Tiene ladesventaja de quese necesitan aislar las ci:lulas a estudiar, que entrenen mitosis y r¡r.re adenrás la alteración cromosómicasea muy evidente.

Por tanto, los grandr:s inconvenientes que tiene es-ta técnica en el estudi,r de tumores son: a) la dificul-taci de cultivar células 'le tumores sólidos. Puede apli-carse esta técnica con rnás facilidad a los procesoshematológicos, y b) s(rlo detecta las alteraciones ge.néticas que conlleven canibios morfológicos grose-ros de los cromosomais.

El estudio citogenético se ha impulsado enortne-nemente en los últirnos ailos con la técnica de FISH ode hibridación "in situ" <le los cromosomas. Con cstatécnica, qr-re utiliza sondas t:specí{icas para deternti-nados cromosomas, sc ¡rucde:

1) Detectar pequeñas alteraciones cromosónticasen estudios en metafal;e.

2) Detectar incluso en secciones de parafina aneu-ploidia ( tr isomías, delr :¡¡¡s¡pr. . .1.

l l i , I r ' f r i l

Figura 3.13. Anólisis citogenético y molecular tle célulos tumorales. En et ADN de las célulos rnlignos puede lnber ol-teracictnes groseros crc¡mosómicas que se detectan por estudkts citogenéticos, y alteracknr's genéticas que pue,den estu-diarse por Ia técnica de Southern-blctt y de PCR (amplificoción en cadena de kt po[imeras<t).

qo Anatomía patológica [eneral

TABLA 3.6, Aplicación de la PCR en patología infecciosa

Modif icado de Pan LX, Diss TC, Isaacson IrG.'J 'he polymerase chain reaction in histopalfroloql ' . I l istopathol 1995;26:20I-217

CoxsackieCitomegalovirusEnterovirusEpstein-BarrHepa t i t i sA ,ByCHerpes simpleHIVPapilomavirusHTLV Iy I ISarampiónRubéola

Técnicas moleculares específicas

1. Southern-blot. Muy ut i l izada hasta hace unr¡saños en estuclios de reordenamientos génicos en pro-cesos l infoicles. Se ut i l iza a part i r r le ADN de tej idosfrescos que se corta con determinados enzi lnas derestricción y luego se hibricla con las sondas a estLl-cliar. En el caso de los procesos linfo¡rroliferativos, sepuede determinar clonal ic lad a part i r del qen clc lascadenas pesadas cle inrnunoglobrr l inas en l iufonlas [ ]o de receptores r le krs antígenos en los l infom¡s ' I ' .

Detectará monoclonal ic lar l cuant lo cl i r :ha al teraciól lesté en más del l -5% dc células rkt la rnuestra. Conlose verá en el qqpítulo ile patología linfoicle, el cslurlicrde monoclon$lidad es muy importante para cliferen-ciar en ocasioiles procesos reactivos linfoicles cle pro-cesos tumores Iinfoproliferativos, La rnonoclonalicladse basará en la detección de un porcentaje determi-naclo de células con unos reorclenamientos sentr.jan-tes de caclenas pesadas de inrnunoglobulina o a nivelde los receptores T.

2. PCR. Ha revolucionado el estudio de los tumo-res malignos. Tienen mucha más sensibilidad que elSouthern-blot en determinar clonaliclacl, ya que la de-termina en menos del 0,1% de células e incluso a par-tir de ADN procedente de parafina.

3. Estudio de predisposición genét ica del cáncer.Al menos hay ya 13 alteraciones genéticas heredita-rias que se asocian al desarrollo de procesos malig-nos. Dicha predisposición radica en la transmisiónde oncógenes o en la delección de genes supresoresy puede detectarse en células procerientes cie ia líneagerminal (linfocitos o cualquier otra célulil. Asímis-mo si no es conocido todavía el gen, pero sí su locali-zación alélica, puede hacerse un abordaje con mar-cadores pol imórf icos de ADN, t ipo microsatél i tes,

Bordetella pertussisChlamydia irachomatisHelic<;bacter piloril,egionella pneurnophilaMycobacteriun lepraeMycobacterium tuberculosisRickettsiasSalmonellaVibrio cholerae

CandidasArnebasI l istoplasma capsulatumLeisirmaniasPneumocystis carinii' l 'r ichomonasvaginalis t

cercanos a cliclro gerr y hacer un árbol genealógico decl ichas al teracr iones genét icas y del inear la vÍa detransrnisión de la enierrnedad. Por ejemplo, con losn¡icrosatélites (ser:ut:ncias repetitivas del ADI\|), queson muy pol imórf icos y especÍf icos de cada individuo, puede estudiarse ia asociación de los misrnoscon cleterminados trunoi"ts. De esta fornra se pudodetectar r:n familiarer; alectos del sínclrome de Lyncho cáncer cle color.l fanlil iar no asociado a poliposis, elgerr asociarlo al cánt:er rlr colon cle comienzo precoz,MSH.2,

Diagnóstico rnolccLrlar en patologíainfecciosa

En el cliagnóstico tle agerttes infecciosos, las técni-cas moleculares t ierrc-:n tanbién unas trrerspect ivasenormes, conforme se vayan del ineando secuenciasespecíf icas para los respect ivos mic:roorganismos.Pueden ser especialnrente irnportantes en el diagnós-t ico de aquel los agentes infecciosos que crecen encuitivo muy lentamerrtr,: cc)nro Ias micobacterias, hon-gos o virus. Pero hay tlos puntos muy importantes enla valoración de las t(:cnicas cle biolosía molecular enpatología infecciosa:

l. La posibilidad de falsos ¡rositivos.2. Se detecta al ageri te infeccioso, pero no puede

concluirse quc esté carrsando la enferrnedad.

Por ejemplo, en l r ,s í l l t imos años se están empe-zando a detectar micobacterias en esputos y no siem-pre su presencia implica que dicho paciente esté srrfriendo una enfermedacl activa en relación con dichasmicobacterias. Por tanto, una conclusión muy impor-

Patologia molecular

tante en el diagnóstico de los agentes infecciostls por

métodos moleculares es que hay que <:<-¡rrelaciortar-los con la c l Ín ica del enfer lno.

En patología molecular, tanto en las bio¡lsias comrien las autopsias, se pueden uti l izar para detectar nti-

croorganismos las técnicas cie hibridaciÓn cle ácidosnucleicos y de Ia ampliación en caclena de la polime-

rasa (tabla 3.6).

A) TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN.'l 'anto a partir deADN (Southern-blot) como a partir cle ARN (Nort-

hern-b lot ) t ienen más sensib i l idad y especi f ic idadque los test inmunológicos (toltvencionales. Se pue-

de realizar hibriclación "in sittt" a nivel de l¿rs seccic¡nes t isu lares, que puede permi t i r a l pato lógo'detec-

tar al microorqanismo en un contexto adecuaclo, r 'erla relación con la res¡tuesta tisul¡rr y l loder cont:l ir irque d icho agente in fecc ioso es patógeno. Por h i l l r i -dación "in situ" pueden detectarse nlicrotlrganistnosy virus como el virus de Epstein IJarr, Citomegalovi-rus, herpes, v i rus del papi lonra humano. . .

B) PCR. Puede detectar cualquier microorgat l is-mo, incluiclo virus ARN cotl lo cl cle la hepatit is C. \ 'ase han dr:scrito primers específicos para más de 100microorganismos diferentes. Recicntementtl sc estítdesarrollando la técnica de I 'CR "in situ" para tletec-tar a n ive l t isu lar a los microt r rgat t is lnos e l l L l l l con-texto aclecuado y ¡toder t:t;rrcl¿rt-iollarlo c:ott la res-puesta h is topatr r lóg ica.

Otras aplica_ci_ongs de Ia pa!q!off''a rn_qlqlqq_

Es obvio cleducir que, conforne se vall estttdiandoy conociendo las alteraciones genÓticas (ltle subya-cen en diversas enfermeclades, las posibiliclades clediagnóst ico molecular se van cxtenct ienclo. P,reve-mente comentaremos la utilidad cie estas técnicas.elldiversos grupos cle enf ermeclades.

l. Enfermedacles neurodegenerativas. Nluchas e¡r-fermedades "neurodegenerativas" son hereclitarias yel diagrróstico molecular de las misrnas puecie sermuy importante en la detecciÓn precoz de ia enfer-meclad y de los portadores de dichas alteraciotres ge-néticas. Por ejemplo, ya se ha identificado la altera-ción genética en el síndrome clel cromosoma X frágil'en la esclerosis lateral amiotrÓfica fant i l i ; r r , el i c ier-tas formas de enfermedad de Alzheilner. Ia enferne-dad de Hunt ingtorr, la distrof ia niotÓnic¿r, la atrof iamuscular bulbar (enfermedad de Kenncdl') y de laataxia espinocerebelosa tipo I. Muchas de estas en-fermedades se asocian a expansión inestable o au-

mernto cle tripletes o secuellcias de trinucleÓtidos en

Ios respect ivos ge nes. Dicha ex¡ lansión se asor : ia a

inact ivación de la t ranscr ipc ión de los respect ivosqenes o a ull auntento dt:l nivt¡l de rneti lación de nu-

cleótidos err clicha regii in (.r 'trr cap. 5).2, ülg¡¡:edadcs cardill{.ase!.leleE. En este grupo

rle enfernedades, erspecialnli:nte en la arteriosclero-

sis, se est.á avatizanclo nlt lcho en el estudio de los ge-

nes que regulan los nivelt:s del a¡lo-l ipclproteina, l ipo-proteínas y Iípidos quc secundariamente originan la

ar ter ioescleros is . La detet lc ión de anomal ías en d i '

chos genes puede perniit ir la posibil idad cle diagnós-

tico precoz.:. Edcrrnc¿actes nlet

Clomo se verá en el capílrrlu 5 hay múltiples enfermtr-

clacles en las rltte se t 'a conot:ienclo su alteración mo-

lecular y por consigr.t ienttl l i i aplicación de las tí:cni-

cas c lescr i t¿rs va a pen' r t i t i r e l c l iagnóst ico precoz de

las nrisutas.

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