métodos de estudio en biología...
TRANSCRIPT
Métodos de Estudio
en
Biología Celular
Microscopía Óptica
Microscopía Electrónica
Técnicas Cito-histológicas
Cultivo in vitro de células y tejidos
Citoquímica-Histoquímica
Inmunohistoquímica
Autorradiografía
Fraccionamiento Celular
Ultracentrifugación
Citometría de Flujo
Cromatografía
Electroforesis
A. INFORMACIÓN MORFOLÓGICA
B. ORIENTACIÓN SOBRE LA COMPOSICIÓN QUÍMICA
C. SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES
D. INFORMACIÓN ANALÍTICA A NIVEL MOLECULAR
1. Técnicas Histoquímicas
Objetivos
• Permitir la identificación y localización de los diferentes compuestos
químicos dentro de la célula.
• Pero en muchos casos hace posible también la cuantificación de los
compuestos.
Aplicaciones
• Diagnóstico
• Investigación
son un instrumento invalorable en la detección y
pronóstico de innumerables alteraciones
histopatológicas.
ayudan a establecer el papel que desempeñan los
diferentes componentes celulares en los procesos
metabólicos de la célula.
Característica
• Es básicamente un método microscópico.
Condiciones
1. la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el
microscopio en su localización celular original.
2. la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea
específico para ella o para el grupo químico al que pertenece.
Identificación de la Sustancia
a) reacciones químicas similares a las usadas en química analítica,
pero adaptadas a los tejidos.
b) reacciones que sean específicas para ciertos grupos de sustancias.
c) medios físicos.
Técnicas histoquímicas
Detección de Lípidos
• Se utilizan generalmente colorantes del grupo del Sudán o aceite rojo.
• Generalmente se realizan cortes por congelación, para evitar la
solubilización de los lípidos que producen los solventes orgánicos.
• También puede utilizarse osmio como fijador-colorante, ya que
insolubiliza a los lípidos.
Técnicas histoquímicas
Detección de Hidratos de Carbono
• La técnica más empleada es la reacción de PAS (Peryodic acid Schiff).
• el reactivo de Schiff se une a grupos aldehído, que pueden tener diferentes
orígenes:
1. aldehídos libres, presentes en forma natural en los tejidos.
2. aldehídos producidos por hidrólisis selectiva (reacción de Feulgen-ADN).
3. aldehídos producidos por oxidación selectiva (reacción de PAS-glúcidos).
Técnicas histoquímicas
Tinción PAS-hematoxilina de vellosidades intestinales
Reacción de PAS
• La reacción de PAS (ácido peryódico-Schiff) fue ideada por McManus (1948).
• Está basada en la generación de grupos aldehído libres por oxidación de los
grupos glicólicos 1-2 de los polisacáridos por medio del ácido peryódico.
• Este método es positivo en células vegetales para el almidón, la celulosa, la
hemicelulosa y las pectinas.
• En los tejidos animales para el glucógeno, las mucinas, las mucoproteínas, el
ácido hialurónico y la quitina.
Técnicas histoquímicas
Reacción de PAS
Técnicas histoquímicas
Detección de Ácidos Nucleicos
• La técnica más empleada es la reacción de Feulgen, que depende de la presencia
de desoxirribosa.
• Los tejidos fijados se someten a una hidrólisis ácida débil con ácido clorhídrico
y luego se tratan con el reactivo de Schiff.
• La hidrólisis ácida extrae las purinas a nivel de la unión desoxirribosa-purina del
ADN y libera los grupos aldehído de la desoxirribosa.
• Los grupos aldehído libres reaccionan con el reactivo de Schiff.
Técnicas histoquímicas
2. Inmunohistoquímica
Objetivos
• Permitir la detección de sustancias tisulares específicas por medio de
anticuerpos.
• Identificar la presencia de distintos componentes celulares que no
pueden detectarse mediante otras técnicas.
Aplicaciones
• Análisis de la ultraestructura celular.
• Estudio de funciones de proteínas y ácidos nucleicos.
Característica
• Se utilizan anticuerpos específicos contra una determinada sustancia
que luego se marcan para su identificación microscópica.
Milstein, Jerne y Köhler (1975)
Premio Nobel de Medicina en 1984
César Milstein (1927-2002)
Inmunohistoquímica
Anticuerpos Monoclonales
Técnica Inmunohistoquímica
• Luego se lava el preparado para eliminar las moléculas del
anticuerpo no unidas.
• Sobre un corte histológico se hace actuar una solución con el
anticuerpo ( ) capaz de unirse específicamente a un
componente ( ).
• Se aplican sistemas de detección enzimáticos o fluorescentes
( ) para detectar los anticuerpos unidos al antígeno, ya que no
son visibles por sí mismos.
Inmunohistoquímica
Método Directo: consiste en la unión de un anticuerpo primario
(2) a una enzima, fluorocromo o metal pesado (3), con la
consiguiente formación de un Ac primario conjugado que se une
luego a un Antígeno (1).
Método indirecto de dos pasos: se usa un anticuerpo primario (2)
contra la proteína o sustancia que se desea detectar (1) y luego un
anticuerpo secundario (3) contra el anticuerpo primario, marcado
enzimáticamente (4).
Sistemas de Detección de Anticuerpos
Método indirecto de tres pasos: consiste en un anticuerpo
terciario (5) conjugado con una enzima (6), que reacciona con un
anticuerpo secundario (3) conjugado con otra enzima (4),
previamente unido al anticuerpo primario (2).
Inmunohistoquímica
3. Fraccionamiento Celular
Objetivos
• Permitir la separación y aislamiento de organelos o estructuras
celulares.
• Obtener componentes celulares aislados para su posterior análisis
molecular.
Aplicaciones
• Análisis de las diferentes funciones celulares (síntesis de proteínas de
membrana, transporte de solutos, desarrollo de gradientes iónicos,
fosforilación oxidativa, etc).
• Estudio de funciones de proteínas y ácidos nucleicos.
Característica
• Se emplea la centrifugación diferencial, para lograr separar los
diferentes organelos o componentes celulares.
Fraccionamiento Celular
Centrifugación
“Es el método por el cual se pueden separar sólidos de líquidos con
diferente densidad mediante una centrífuga, la cual imprime una fuerza
mayor que la gravedad provocando la sedimentación del sólido o las
partículas de mayor densidad”
• El tubo se llena con una mezcla uniforme.
• Tras la sedimentación se obtienen dos fracciones:
• Pellet: que contiene el material sedimentado
• Sobrenadante, que tiene el material no sedimentado
A. Diferencial
• La muestra se ubica como una capa en la parte superior
del tubo.
• Tras la sedimentación se obtienen varias fracciones en
forma de bandas diferentes
B. Gradiente de Densidad
Fraccionamiento Celular
Centrifugación Diferencial
los tubos no se dejan oscilar
libremente, sino que se mantienen en
un ángulo oblicuo específico
Fraccionamiento Celular
Tipos de Centrífugas
permite que los tubos oscilen externamente
para que las partículas se muevan en
dirección paralela a las paredes del tubo.
Rotor Basculante Rotor Angulo Fijo
Fraccionamiento Celular
Fraccionamiento Celular
Fraccionamiento Celular
Centrifugación en Gradiente de Densidad
La centrifugación a través de un gradiente de densidad distribuye el contenido
de la fracción en varias capas, según la densidad de los componentes
4. Ultracentrifugación
Objetivos
• Separación de moléculas y componentes subcelulares.
• Permitir la obtención de componentes y moléculas aisladas para su
posterior análisis molecular.
Aplicaciones
• Estudio de las características de sedimentación de estructuras
subcelulares y moléculas.
• Análisis de las funciones de proteínas y ácidos nucleicos.
Característica
• Se utilizan ultracentrífugas capaces de alcanzar las 100.000 rpm.
• Todas las determinaciones se llevan a cabo luego de retirar el tubo de la centrífuga.
• Están diseñadas simplemente para generar grandes fuerzas centrífugas durante un
periodo establecido.
• La centrifugación ocurre en un ambiente casi al vacío para reducir al mínimo la
resistencia friccional.
• Este tipo de centrífuga se usa para purificar componentes que después serán sometidos
a estudios adicionales (preparativas).
Ultracentrifugación
Ultracentrífugas
2. Preparativas
1. Analíticas
• contiene dispositivos e instrumentos que permiten seguir el avance de las sustancias
en los tubos (celdas) durante la centrifugación.
• Se puede estimar varias veces la velocidad de sedimentación durante el proceso de
centrifugación y determinar valores de peso molecular, pureza, etcétera.
La ultracentrifugación permite separar moléculas
de ADN según la longitud de sus nucleótidos
Ultracentrifugación
Separación de Ácidos Nucleicos
Técnicas de Centrifugación
Sedimentación de Precipitados Centrífuga Preparativa Velocidad Fija
Separación de células y organelos
• Centrifugación diferencial Centrífuga Rotor Angular
• Centrifugación en gradientes Centrífuga Rotor Basculante
Separación de macromoléculas
• Purificación de ADN o proteínas Ultracentrífuga Preparativa
• Sedimentación en gradiente Centrífuga Rotor Basculante
Determinación de S
• Sedimentación en gradiente Ultracentrífuga Analítica
Determinación de M
• Sedimentación en gradiente Ultracentrífuga Analítica
5. Cromatografía
Objetivos
• Permitir la separación o fraccionamiento de moléculas a
partir de una mezcla de componentes disueltos.
• Purificar un determinado tipo de compuesto a partir de una
mezcla.
Aplicaciones
• Aislamiento de distintos compuestos químicos en estudio.
• Identificación y determinación de cantidades de
componentes
Característica
• Consiste en fraccionar una mezcla de componentes disueltos a
medida que se desplazan a través de algún tipo de matriz porosa.
Cromatografía
Características
• es un método físico de separación de
moléculas basado en el principio de
retención selectiva.
• las técnicas cromatográficas son variadas,
pero en todas hay una fase móvil (gas o
líquido) que arrastra a la muestra a través de
una fase inmóvil (sólido o líquido fijado a
sólido).
• los materiales de la fase inmóvil tienen sitios
a los cuales se pueden unir las moléculas
disueltas.
• conforme las moléculas interactúan con la matriz, su avance a través de la columna
se retrasa.
• cuanto mayor sea la afinidad de una molécula por el material de la matriz, más lento
será su paso a través de la columna.
• diferentes componentes de la mezcla poseen distinta afinidad por la matriz, serán
retardados diferencialmente
• a medida que el solvente pasa por la columna y se desliza hacia el fondo se puede
recolectar como fracciones en una serie de tubos.
Cromatografía
Cromatografía por Intercambio de Iones
• se emplea la carga iónica como base de
purificación o fraccionamiento analítico.
• es utilizado para la separación de proteínas, ya que
es improbable que diferentes proteínas de una
preparación tengan la misma carga total.
• se produce la asociación iónica entre proteínas y grupos con carga unidos a un material inerte de
sostén, corno la celulosa.
• las dos resinas más empleadas son dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y carboximetil (CM)-celulosa.
• la primera posee carga positiva y se une a moléculas con carga negativa (intercambiador aniónico),
la CM-celulosa posee carga negativa y actúa corno intercambiador catiónico.
Cromatografía
Cromatografía por Filtración en Gel
• permite separar proteínas o ácidos
nucleicos por su peso molecular.
• el material de separación consta de
minúsculas esferitas ubicadas en una
columna a través de la cual pasan las
moléculas en solución.
• las esferitas con polisacáridos con enlaces
transversos (dextranos o agarosas) de
porosidad diferente.
• para purificar la proteína buscada se pasa
la mezcla a través de una columna con
esferillas.
• éstas solo permiten el paso a su interior de
moléculas con un determinado peso
molecular.
Cromatografía
Cromatografía por Afinidad
• utiliza las propiedades estructurales únicas
de una proteína para eliminar la molécula
específicamente de la solución, en tanto
que las otras permanecen disueltas.
• las proteínas interactúan con compuestos
específicos: enzimas con sustratos,
receptores con ligandos, anticuerpos con
antígenos, etc.
• cada proteína se puede eliminar de la
solución pasando la mezcla por una
columna donde la molécula interactuante
especifica (sustrato, ligando, antígeno,
etc.) se encuentra inmovilizada por unión
a un material inerte (la matriz).
• ej.: se pasa una mezcla de receptores de
insulina a través de esferillas de agarosa
unidas a insulina, el receptor se enlazará
específicamente a las esferillas.
6. Electroforesis
Objetivos
• Permitir la separación de moléculas a partir de una mezcla.
• Identificar diferentes moléculas en una mezcla.
Aplicaciones
• Caracterización química de proteínas y ácidos nucleicos.
• Aislamiento de distintos compuestos en estudio.
• Determinación del peso molecular relativo.
• Análisis de la expresión génica.
Característica
• Consiste en la separación de proteínas y ácidos nucleicos por medio
de un campo eléctrico
Electroforesis
Características
• es una técnica de separación de moléculas
por aplicación de un campo eléctrico.
• las moléculas disueltas se desplazan o
migran a una velocidad determinada por la
relación entre sus cargas.
• si dos moléculas tienen la misma masa, la de
mayor carga neta se moverá con mayor
velocidad hacia un electrodo.
• se deposita una gota de muestra sobre una tira de papel
de filtro u otra sustancia porosa embebida en una
solución conductora.
• se aplica un campo eléctrico sobre los extremos de la
tira y las moléculas disueltas en la solución conductora
se desplazan a lo largo de la tira, según de su carga
• la separación de proteínas se suele efectuar
en geles de poliacrilamida, que se extienden
entre dos láminas de vidrio.
• el tamaño del poro del gel se cambia
mediante ajustes en las concentraciones de
poliacrilamida y el reactivo.
• cuando se coloca una mezcla de proteínas y
se aplica corriente, las proteínas más
pequeñas migran por el gel con mayor
velocidad que las más grandes.
Electroforesis
Electroforesis en Gel
• la velocidad del movimiento depende del tamaño del
poro del gel y de la fuerza del campo eléctrico.
• un gel de poliacrilamida con abundantes enlaces
cruzados los poros son bastante pequeños.
• este tipo de gel puede separar proteínas y péptidos
pequeños, pero los más grandes no podrán desplazarse.
• es la técnica más importante para separar
mezclas de proteínas.
• éstas son expuestas al detergente iónico SDS
(dodecilsulfato de sodio) antes y durante la
electroforesis en gel .
• el SDS desnaturaliza las proteínas, por lo que
las multiméricas se disocian en sus
subunidades.
• todas las cadenas polipeptídicas son forzadas a
adoptar conformaciones extendidas, con
relaciones carga/masa similares.
• el SDS elimina las diferencias de formas y solo
la longitud de la cadena (masa) determina la
velocidad de migración.
Electroforesis
Electroforesis SDS-Poliacrilamida
• con esta técnica se pueden separar cadenas cuyos pesos moleculares difieren en menos
del 10%.
• además se puede estimar el peso molecular de una proteína por comparación de la
distancia que migró en un gel con las de proteínas de peso molecular conocido.
Electroforesis
Electroforesis Bidimensional en Gel
• las proteínas se separan en dos pasos:
primero por su carga y luego por su masa.
• en el primer paso se desnaturaliza el extracto
celular (urea en alta concentracion).
• luego se separa en un tubo de vidrio con
poliacrilamida saturado con una solución de
anfolitos (mezcla de moléculas polianiónicas
y policatiónicas).
• en un campo eléctrico los anfolitos se
separan y crean un gradiente en base a la
carga neta, lo cual establece un gradiente de
pH.
• las proteínas cargadas migran a través del gradiente hasta que alcanzan su punto
isoeléctrico (el pH en que la carga neta de la proteína es cero).
• esta técnica, denominada enfoque isoeléctrico (IEF), es capaz de separar proteínas que
sólo difieren en una unidad de carga.
Electroforesis
Electroforesis Bidimensional en Gel
• en el segundo paso se saca el gel IEF del tubo y se lo coloca sobre un segundo gel de
poliacrilamida saturado con SDS.
• al aplicar un campo eléctrico, las proteínas migran desde el gel IEF al gel de la capa
de SDS y se separan de acuerdo con la masa.
• mediante la separación secuencial de las proteínas por carga y masa se logra una
excelente separación de proteínas celulares .
• los geles bidimensionales permiten separar hasta 1.000 proteínas al mismo tiempo.
7. Cultivo de Tejidos
Objetivos
• Permitir obtener células en gran cantidad.
• Contar con mucha cantidad de células derivadas de una única célula.
• Tener muchos tipos diferentes de células vivas al mismo tiempo.
Aplicaciones
• Análisis de diferentes actividades celulares (endocitosis, movimiento
celular, división celular, transporte de sustancias y síntesis de
macromoléculas).
• Estudio del proceso de diferenciación y muerte celular.
• Análisis de la respuesta de las células a tratamientos con fármacos,
hormonas, factores de crecimiento y otras sustancias activas
Característica
• Se basa en recrear las condiciones fisiológicas de las células en su
tejido original.
Cultivo de Tejidos
Tipos de Cultivos
cultivo en masa
se coloca un gran número de células, que al
desarrollarse y dividirse forman una capa
uniforme de células que cubre el fondo del
recipiente.
Cultivos Primarios
cultivo clonal
se colocan pocas células en el cultivo, que
quedan separadas de sus vecinas, de manera
que la proliferación forma colonias derivados
de una única célula madre.
• son los que se obtienen directamente de los tejidos vegetales o animales.
• se cortan fragmentos pequeños de tejido y separan las células entre si por medio de
enzimas proteolíticas como la tripsina
• a continuación se lavan las células para liberarlas de la enzima y se las coloca en
medios de cultivo apropiados en recipientes de vidrio o plástico.
• normalmente se utilizan tejidos embrionarios o tumorales, debido a que su grado de
diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.
Cultivo de Tejidos
Tipos de Cultivos
• son aquellos que se obtienen por subcultivo o resiembra de un cultivo
primario.
• se separan las células y se las coloca en un medio de cultivo dentro de
recipientes.
• generalmente las líneas celulares no se pueden cultivar indefinidamente, sino
que luego de unas cuantas generaciones comienzan a morir.
Cultivos Secundarios
• son cultivos que continúan creciendo y multiplicándose en forma indefinida.
• las células se han adaptado al crecimiento prolongado in vitro por una
transformación de tipo tumoral.
• las células establecidas crecen en forma más apretada y necesitan menor
cantidad de nutrientes.
Cultivos de Líneas Establecidas
Líneas celulares estables
• Control del entorno celular
• Homogeneidad celular
• Conocimiento del tipo celular
• Economía
Ventajas Desventajas
Falta de diferenciación
Inestabilidad de la línea (mutaciones DNA)
Cultivo de Tejidos
Líneas celulares estables
BHK: Fibroblastos de riñón de hamster sirio dorado
CrFK: Fibroblastos de riñón de gato doméstico
MDCK: Epitelio de riñón canino (Cocker Spaniel)
CHO: Epitelio de ovario de hamster chino
VERO: Fibroblastos de riñón de mono verde africano
HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano
MDBK: Epitelio de riñón de bovino adulto
HUVEC: Endotelio de vena umbilical humana
FHBE: Endotelio de corazón fetal bovino
Etc., etc., etc.
Cultivo de Tejidos
Preparación cultivos
Cultivo de Tejidos
Cultivo de Tejidos
Cultivo de Tejidos
Las células vegetales crecen formando grupos de células indiferenciadas
llamados callos, en los cuales se puede inducir el desarrollo de retoños para
regenerar nuevas plantas