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Metodi di laboratorio nel controllo microbiologico degli alimenti: classici ed innovativi

IZSTO

Istituto Zooprofilattico

Sperimentale del Piemonte,

Liguria e Valle d’Aosta

Torino, 10-11 Giugno 2013

S.S. Laboratorio Controllo Alimenti [email protected]

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• Aspetti normativi• Metodi normati

• Metodi alternativi

Cosa tratteremo…

• Aspetti pratici• Per il laboratorio

• Per l’utenza

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REGOLAMENTO (CE) N. 882/2004 DEL

PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO

del 29 aprile 2004

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relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla

normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla

salute e sul benessere degli animali

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I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficialisono conformi alle pertinenti norme comunitarie

oppure...

ART. 11Metodi di campionamento e di analisi

se tali norme non esistono, a norme o protocolli riconosciutiinternazionalmente , ad esempio quelli accettati dal Comitato europeo dinormalizzazione (CEN) o quelli accettati dalla legislazione nazionale ;

oppure...

in assenza, ad altri metodi utili al raggiungimento degli obiettivi o sviluppaticonformemente a protocolli scientifici .

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REGOLAMENTO (CE) n. 2073/2005 DELLA COMMISSIONEdel 15 novembre 2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti

alimentari

Reg. CE 882/04 – art. 11I metodi di campionamento e di analisi utilizzati nel contesto dei controlli ufficialisono conformi alle pertinenti norme comunitarie

Articolo 5 - Norme specifiche per le analisi e il campionamento

• I metodi di analisi, i piani e metodi di campionamento di cui all’allegato I sono applicati come metodi di riferimento.

• ...

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Metodiche classiche

• Metodi qualitativi

• Metodi quantitativi: conteggio ufc/g o ufc/mL

• Metodi semiquantitativi: MPN

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Metodi qualitativi tradizionali (ISO)...• Pesata del campione

• Prearricchimento

• Arricchimento

• Isolamento

• Conferma: biochimica e sierologica

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...Metodi qualitativi tradizionali (ISO)...• Pesta del campione


• Arricchimento

• Isolamento


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• Arricchimento

• Isolamento


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• Arricchimento

• Isolamento


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Salmonella spp.ISO 6579

Se negativo: esito in 72 ore

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Metodi quantitativi:

Conteggio ufc/g o mL

• Pesata

• Diluizione in base 10

• Semina diretta in piastra (per inclusione o spatolamento)

• Conteggio colonie

• Prove di conferma, se richieste

Batteri patogeni ed indicatori igiene conteggiati: Listeria monocytogenes, carica batterica totale, enterobatteri, E. coli ß glucuronidasi +, stafilococchi coagulasi positivi

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∑CN =

V x (n1 + 0.1n2) x d

10 g o 10 ml di campionein 90 ml di brodo BPW

Preparazione diluizione decimalisuccessive in acqua peptonata

Semina su terreno BP-RPF

Incubazione in aerobiosi a 37°CValutazione dopo 24-48 ore

Conteggio colonie tipiche

Assenza di colonie sospetteEsito come

< 10 ufc/g o <100 ufc/g

Emissione RdP

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Numerazione Stafilococchicoagulasi positiviConteggio colonie

ISO 6888-2

Emissione RdP

∑C = sommatoria colonie di due diluizione successiveV = volume di inoculo in ogni piastre (mL)n1 = numero di piastre della prima diluizionen2 =numero di piastre della seconda diluzioned = fattore di diluzione della prima diluizione considrerata

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10 g o 10 ml di campionein 90 ml di brodo BPW

Preparazione diluizione decimalisuccessive in acqua peptonata

Semina su terreno MYP

Incubazione in aerobiosi a 30°CValutazione dopo 48 ore

Conteggio colonie tipiche

Assenza di colonie sospetteEsito come

< 10 ufc/g o <100 ufc/g

Emissione RdP

Presenza di colonie sospetteProve di conferma

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Numerazione Bacillus cereusConteggio colonie

IS O 7932

ba = x C

A

a = numero di microrganismi identificatib = n. colonie confermateC =n. di colonie conteggiateA = n. colonie usate per la conferma

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Metodi semi-quantitativi:

Most probable number (MPN)

• Pesata

• Diluizione in base 10

• Semina diretta in brodo

• Se tubi +, semina in piastra

• Prove di conferma

Batteri patogeni ed indicatori igiene conteggiati: Listeria monocytogenes, E.

coli ß glucuronidasi +,

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L’impiego di metodi d’analisi alternativi è accettabile quando tali metodi sono validati in base al metodo di riferimento di cui all’allegato I e se è utilizzato un metodo proprietario certificato da una terza parte in base al protocollo definito nella norma EN/ISO 16140 o ad altri protocolli analoghi accettati a livello internazionale.

ART. 5Norme specifiche per le analisi e il campionamento

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I metodi alternativi• Metodiche immunoenzimatiche

• ELFA (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E.coli O157, …) (AFNOR …)

• Automatizzati o semiautomatici

• MPN in card - sistema TEMPO (AFNOR …)

• Metodiche biomolecolari

• Real Time (Salmonella spp , Listeria monocytogenes, VTEC, …) (ISO,

AFNOR …)

• End-point (Salmonella, stafilococchi enterotossigeni, …) (Centro di

Referimento Nazionale, EU-RL, …)

• PFGE (Salmonella, Listeria, S. aureus) (Centro di Referimento Nazionale,

EU-RL, …)

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Metodiche ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay )

Immunoenzimatici

• Rilevamento della presenza del target

attraverso la detection di antigeni specifici.

• Utilizza un sistema automatizzato (VIDAS)

• Kit pronto all’uso

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Salmonella spp.ELFA

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Sistema TEMPO

Il campione è inoculato in card e l’analisi viene letta in maniera automatica dopo incubazione.È un sistema chiuso che rende il risultato in ufc/g o mL

Automatizzati o semiautomatici

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Metodiche Real-Time PCR

• PCR: amplificazione della sequenzatarget di DNA grazie a primer specifici

• Nella PCR tradizionale l’amplificazioneviene visualizzata dopo corsaelettroforetica e colorazione del gel dicorsa

• Nella RealTime PCR il DNA amplificatoviene rilevato in tempo reale dallostrumento e non è quindi previstanessuna manipolazione post-amplificazione

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Il protocollo R-Ti PCR

• Pesata del campione (25 g),

arricchimento e prima incubazione

(18-24 ore)

• Estrazione , amplificazione

• Risultato (PRESENZA/ASSENZA DI

DNA)

• DNA ≠ da batterio vivo e vitale

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Salmonella spp.R-Ti PCR

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Perchè un metodo alternativo?

• Più rapido

• Ridotto impiego di personale

• Ridotto uso di reagenti

• Migliore performance

• Multitarget

• Patogeni emergenti

• Intervento in emergenze sanitarie

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Come si procede ?

• Individuare il metodo più adatto

• Applicarlo in laboratorio

• Validare il metodo

• Accreditare la prova

• Renderlo applicabile sui campioni ufficiali

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-Aggiornamento bibliografico relativamente alle

principali tecniche rapide d’indagine, biochimiche

e biomolecolari, in grado di individuare il target

prescelto.

Individuare il metodo più adatto:

-Valuazione della possibilità di utilizzare kit pronti

presenti in commercio o metodi in-house

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1. Stesura Procedura Operativa

2. Allestimento e ottimizzazione in laboratorio dei

metodi individuati.

3. Vincere la iniziale diffidenza del personale

Applicarlo in laboratorio

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I risultati concreti in laboratorio

POS

10CA073

e

10CA074

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1. Se il metodo ha una validazione commerciale,

effettuare la verifica delle performance in

laboratorio

2. Le metodiche alternative e rapide verranno

validate secondo quanto previsto dalla norma ISO

16140 contro il metodo gold standard (es. ISO) o

procedure equivalenti (PGS condivisa tra II.ZZ.SS.)

Validare il metodo

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Accuratezza Sensibilità Specificità

AFNOR BRD (07/10-04/05)L. monocytogenes

98,30% 97,50% 98,90%

Un esempio…

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• L'autorità competente designa i laboratori che possono

eseguire l'analisi dei campioni prelevati durante i controlli

ufficiali.

Accreditare la prova - Reg CE 882/04 (art. 12)

• Le autorità competenti, tuttavia, possono designare

soltanto i laboratori che operano, sono valutati e

accreditati conformemente alle seguenti norme europee:

• EN ISO/IEC 17025

• EN 45002

• EN 45003

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I risultati concreti con ACCREDIA …due esempi

POS 10CA073 e 10CA074 accreditate dal dicembre 2007

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Applicazioni pratiche

• Oggi tutti i campioni di alimenti prelevati per la

determinazione di di Listeria monocytogenes e

Salmonella sp vengono processati con metodo Real-

Time PCR

– Reg CE 2073/2005 e s.m.i.

– PRISA

– PIF

– UVAC

– MTA

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Punti di forza metodi in Real Time PCR

• Tempi di risposta migliorati (campioni negativi in 30 h)

• Buona parte della procedura è automatizzata (minor errore

umano)

• Lettura automatica (minor errore umano)

• Kit pronti all’uso (migliore gestione reagenti a magazzino)

• Sistema miniaturizzato riduce i rifiuti speciali in laboratorio

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Criticità dei metodi in Real Time PCR• I positivi devono essere confermati con metodi

tradizionali

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Criticità dei metodi in Real Time PCR• Iniziale difficoltà interpretativa del RdP

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Un cenno sulla PFGE …• Metodo per la separazione di frammenti di DNA e

successivo confronto profili ottenuti

• Separazione di grossi frammenti di DNA prodotti

tramite enzimi di restrizione

• Si ricorre ad una lisi in situ (in un piccolo cubetto di

agarosio)

• � il DNA immobilizzato nell’agarosio preserva la sua

integrità

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Tappe principali della PFGE

• Incorporazione dei batteri in agarosio

• Lisi in situ delle cellule batteriche

• Rimozione dei detriti cellulari

• Restrizione del DNA mediante endonucleasi

• Separazione dei frammenti (gel 1%)

• Visualizzazione con transilluminatore

• Stoccaggio immagine del profilo di bande

• Analisi e interpretazione dei profili

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I risultati

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Interpretazione• In alcuni casi è possibile distinguere ad occhio la

presenza di profili identici o differenti per una o

più bande. Per profili con più di 10 bande:

– Nessuna banda di differenza = indistinguibili

– 2-3 bande di differenza = strettamente correlati

– 7 o più bande di differenza = non correlati

• Nel caso di molti campioni in esame è necessario

ricorrere all’utilizzo di software per l’analisi dei dati

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Elaborazione dei dati

L’elaborazione dei

dati mediante

l’utilizzo di

programmi

informatici specifici

consente di

calcolare i

coefficienti di

similitudine

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Applicazione della PFGE

• Confronto di isolati epidemiologicamente

correlati

• Studio di episodi MTA

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Applicazione di PFGE nel Laboratorio Controllo

Alimenti IZS PLV

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Grazie per l’attenzione!

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