metodi alternativi per la ricerca dei microorganismi e per la valutazione della loro vitalita prof....
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METODI ALTERNATIVI PER LA METODI ALTERNATIVI PER LA
RICERCA DEI MICROORGANISMI RICERCA DEI MICROORGANISMI
E PER LA VALUTAZIONE DELLA E PER LA VALUTAZIONE DELLA
LORO VITALITA’ LORO VITALITA’
Prof. Antonello PaparellaProf. Antonello [email protected]@unite.it
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1° gennaio 20061° gennaio 2006
entra in vigore il entra in vigore il
Regolamento CE 2073/05 Regolamento CE 2073/05
sui criteri microbiologici sui criteri microbiologici
applicabili ai prodotti applicabili ai prodotti
alimentarialimentari
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I PRIMI EFFETTII PRIMI EFFETTI
Sensibilizzazione dei laboratoriSensibilizzazione dei laboratori
Osservanza delle procedure Osservanza delle procedure
analiticheanalitiche
Sensibilizzazione dei produttoriSensibilizzazione dei produttori
Osservanza dei criteri microbiologiciOsservanza dei criteri microbiologici
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VOLONTA’ DI CONFORMARSI AI VOLONTA’ DI CONFORMARSI AI
CRITERICRITERIPuò spingere il produttore ad adottare Può spingere il produttore ad adottare
pratiche di decontaminazione su m.p. pratiche di decontaminazione su m.p.
e p.f.e p.f.
Anomala estensione della Anomala estensione della shelf-lifeshelf-life
Danni subletali e falsi negativiDanni subletali e falsi negativi
Eventuali residui indesideratiEventuali residui indesiderati
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DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE
DEI PRODOTTI ALIMENTARI
Le soluzioni più frequenti:
Acidi organici
Etanolo
Iperclorazione
Radiazioni UV
Vapore pressurizzato
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UN CASO UN CASO
PARTICOLARE: PARTICOLARE:
DECONTAMINAZIONE DECONTAMINAZIONE
DEI PRODOTTI IN DEI PRODOTTI IN
INGRESSO NELLA INGRESSO NELLA
CAMERA BIANCACAMERA BIANCA
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UNA LINEA DI DECONTAMINAZIONE
SUPERFICIALE CON IPERCLORAZIONE
DA UNA LINEA
COME QUESTA,
IN CONTATTO
CONTINUO CON
IPOCLORITO, E’
STATO
ISOLATO…
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un ceppo di
Listeria
monocytogenes
con particolari
performance adesive
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Pratiche di decontaminazione
inefficaciCicli di congelam./scongelam.
ripetuti POTREBBERO GENERARE
FALSE NEGATIVITA’
nell’analisi microbiologica
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per transizione delle cellule
microbicheda uno stato coltivabile
AD UNO STATO VITALE
NON COLTIVABILE (VNC)
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CELLULE VNC (VIABLE NOT
CULTURABLE)
Escherichia coli O157:H7 (Zhao and Matthews, 2000)
Strategia di sopravvivenza in batteri non sporigeni. Dimostrata in Salmonella, Campylobacter, Escherichia, Vibrio, Streptococcus, Micrococcus ma anche in sporigeni come Bacillus subtilis.
Riduzione volumetrica da forme coccobastoncellari a piccoli corpi sferici non dotati di involucri
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LA CONDIZIONE VNC NON E’ L’UNICA REAZIONE
POSSIBILE ALLO STRESS CELLULARE
“esposizione a condizioni nutrizionali
sfavorevoli, sostanze chimiche tossiche
o condizioni fisiche subottimali”
(Neidhart e VanBogelen, 2000)
STRESS NELLE CELLULE MICROBICHE
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STATO FISIOLOGICO DELLE CELLULE ESPOSTE A STRESS
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LE CELLULE MICROBICHE
tra la vita e la morte…
VITALI
assenza di stress crescita regolare e vitalità cellulare
STRESSATE
stress lieve crescita rallentata o bloccata ma cellule vitali
DANNEGGIATE
stress moderato crescita bloccata e diminuzione vitalità
MORTE
stress estremo inattivazione della maggior parte della popolazione
ADATTATE ALLO STRESS
stress superato risposte adattative con > tolleranza allo stress
SUICIDATE
stress lieve/moderato autolisi per > metabolismo futile
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STRESS, ADATTAMENTO E SOPRAVVIVENZA
AI PROCESSI DELL’INDUSTRIA ALIMENTARE
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DECONTAMINAZIONE E VNC DECONTAMINAZIONE E VNC
Maggiore probabilità in caso di:Maggiore probabilità in caso di:
Alimenti a Alimenti a shelf-lifeshelf-life estesa (ESL) estesa (ESL)Criteri microbiologici severi in Criteri microbiologici severi in
esportazioneesportazioneAlimenti con elevate cariche superficialiAlimenti con elevate cariche superficialiAlimenti con SL bloccata dalla Alimenti con SL bloccata dalla
distribuzionedistribuzione
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STRATEGIE ANALITICHE IN STRATEGIE ANALITICHE IN
SITUAZIONI A RISCHIO DI SITUAZIONI A RISCHIO DI
DECONTAMINAZIONE E VNCDECONTAMINAZIONE E VNC
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SE SI SOSPETTA UN FALSO NEGATIVO DA VNC SE SI SOSPETTA UN FALSO NEGATIVO DA VNC
Doppia procedura: arricchim. + Doppia procedura: arricchim. +
resuscitationresuscitation
Doppia semina: con/senza disattivanteDoppia semina: con/senza disattivanteRicerca modificazioni substrato (inibenti, Ricerca modificazioni substrato (inibenti,
pH)pH)Metodi specifici per VNCMetodi specifici per VNC
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METODI PER LA STIMA DEL METODI PER LA STIMA DEL
DANNO MICROBICO DANNO MICROBICO
SUBLETALESUBLETALE
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Alla ricerca delle VNC…
Metodi per stimare la vitalità
cellulare
DEFT (Jakobsen DEFT (Jakobsen et alet al 1984; Ruocco 1984; Ruocco et alet al 1991) 1991)
Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang et alet al 1999) 1999)
Colorazione CTC-DAPI (Cappelier Colorazione CTC-DAPI (Cappelier et alet al 1997) 1997)
Bioscreen/Turbidometria(Phillips Bioscreen/Turbidometria(Phillips et alet al 1998;Paparella 1998;Paparella et et
alal 2003) 2003)
COCO22 detection time in GC (Guerzoni detection time in GC (Guerzoni et alet al 1985) 1985)
Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)
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STIMA DEL DANNO STIMA DEL DANNO
MICROBICO SUBLETALEMICROBICO SUBLETALE
NELLA BIOCONSERVAZIONE NELLA BIOCONSERVAZIONE
DEGLI ALIMENTI CON OLI DEGLI ALIMENTI CON OLI
ESSENZIALIESSENZIALI
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RIDUZIONE DEL 2,3,5-RIDUZIONE DEL 2,3,5-
TRIFENILTETRAZOLIOTRIFENILTETRAZOLIO
STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE
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Studio del danno da olio essenziale in Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenesL.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et alet al
2004)2004)
AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO:AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO:
Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile) Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile)
formazano (rosso, insolubile)formazano (rosso, insolubile)
Valutazione quantitativa della vitalità cellulare Valutazione quantitativa della vitalità cellulare
(deidrogenasi)(deidrogenasi)
- usata in studi di fisiologia vegetale -- usata in studi di fisiologia vegetale -
Numerosi ceppi di Numerosi ceppi di L.monocytogenes L.monocytogenes sono stati esposti a sono stati esposti a
diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory
Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo
screening, con TTC.screening, con TTC.
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Studio del danno da olio essenziale in Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenesL.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et alet al
2004)2004)
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Paparella Paparella et alet al 2004 2004
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CITOMETRIA DI FLUSSOCITOMETRIA DI FLUSSO
STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE
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Doppia colorazione
Secondo Ananta et al., 2004:Secondo Ananta et al., 2004:
Carbossifluoresceina diacetato Carbossifluoresceina diacetato
(cFDA) (cFDA)
Attività esterasicaAttività esterasica
Propidio ioduro (PI) Propidio ioduro (PI)
Danno di membranaDanno di membrana
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Determinazione in citometria di flusso
CoulterCoulter®EPICS®XL (BeckmanCoulter ®EPICS®XL (BeckmanCoulter
Inc.)Inc.)::
FLOW RATE: 400-600 events/secFLOW RATE: 400-600 events/sec
10 000 events/sample10 000 events/sample
FL1 CHANNEL (525 FL1 CHANNEL (525 ± 20 ± 20
nm):nm):
FUORESCENZA VERDE (cF)FUORESCENZA VERDE (cF)
FL2 CHANNEL (620 FL2 CHANNEL (620 ± 15 ± 15
nm):nm):
FLUORESCENZA ROSSA (PI)FLUORESCENZA ROSSA (PI)[email protected]
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GateFluorescenz
a delle cellule
Possibile spiegazione del meccanismo cellulare coinvolto
G1 cF- and PI+
Attività esterasica non rilevabile, membrana
compromessa
G2 cF+ and PI+ Esterasi attiva,membrana danneggiata
G3 cF- and PI- Attività esterasica non rilevabile, membrana intatta
G4 cF+ and PI- Esterasi attiva,membrana intatta
Gate delle cellule colorate con cF e PI (Ananta et al., 2004)
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Sottopopolazioni dopo doppia colorazione con cF
e PI
GATE 4
VITALI
GATE 2
DANNEGGIATE
GATE 1
INATTIVATE
GATE 3
BASSA FLUORESCENZA
FL1 CHANNEL: cF
FL2 C
HA
NN
EL: P
I
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TURBIDOMETRIA/BIOSCREENTURBIDOMETRIA/BIOSCREEN
STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE
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4% NaCl
O.D
. (6
00
nm
)
Time (Hrs)
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Effetto dell’aggiunta di NaCl durante
i trattamenti con differenti % OE
Origano
Time (Hrs)
O.D
. (6
00
nm
)ATCC 19114
0% NaCl
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VALUTAZIONE DELLA VALUTAZIONE DELLA
PERMISSIVITA’ DEL SUBSTRATOPERMISSIVITA’ DEL SUBSTRATO
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DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE
DEI PRODOTTI A BASE DI CARNEDEI PRODOTTI A BASE DI CARNE
MICROBIOLOGICAL CHALLENGE TESTMICROBIOLOGICAL CHALLENGE TEST
E MODELLAZIONE DEI RISULTATI E MODELLAZIONE DEI RISULTATI
((L.monocytogenesL.monocytogenes) )
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PRODOTTI STUDIATI:
Prodotti a base di carne: prosciutto
crudo, coppa, lardo
SCOPO:
Decontaminazione superficiale in camera
bianca (prima dell’affettatura)
OBIETTIVO MICROBICO:
Diminuzione dell’inoculo (L. monocytogenes
ATCC19114)
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CHALLENGE TEST:
Cocktail di 5 ceppi di L. monocytogenes:
ATTC19114 + 4 ceppi isolati da prodotti a base
di carne
(1 x 105 UFC/cm2)
DISEGNO SPERIMENTALE (E MODELLAZIONE):
Effetto interattivo di NaCl, acido lattico e % olio
essenziale sulla diminuzione logaritmica
dell’inoculo
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Effetto dell’aggiunta di NaCl durante il trattamento con
differenti % olio essenziale di origano, con (a) o senza
(b) emulsionante (lecitina)
Logarithmic decrease (LogMPN) = 7,07x[EO] -
1,353x[NaCl] - 0,785x[NaCl]2 - 11,43x[Lactic
Ac.]2 - 22,26x[EO]x[Lactic Ac.] +
13,87x[NaCl]x[Lactic Ac.]
Logarithmic decrease (LogMPN) =
5,58x[EO] - 3,29x[Lactic Ac.] -
2,33x[EO]2 -1,39x[EO]x[NaCl]
+3,03x[NaCl]x[Lactic Ac.]
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NUOVE NORME PIU’ FLESSIBILI
CONCLUSIONICONCLUSIONI
SEMPRE PIU’ FREQUENTE LA DECONTAMINAZIONE
RISCHIO DI FALSI NEGATIVI NELL’ANALISI MICROBIOLOGICA
STRATEGIE E METODI GIA’ DISPONIBILI