metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... ·...
TRANSCRIPT
![Page 1: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/1.jpg)
Metode proučevanja molekularnih osnov in
identifikacije biokemijskih označevalcev
endometrioze
izbirni predmet
Endometrioza: klinični in biokemijski vidiki
22. april, 2014
T. Lanišnik Rižner
![Page 2: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/2.jpg)
T. Lanišnik Rižner. M. Ribič-Pucelj, Med. Razgl. 2010, 49: 263-274; slika prirejena po Guidice L.C. in Kao L.C. Lancet 2004, 364: 1789-1799.
Različne oblike endometrioze
![Page 3: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/3.jpg)
Teorije o nastanku
Burney R. in Giuidice L., Fertil. Steril. 2012, 58, 511-519
![Page 4: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/4.jpg)
Retrogradna menstruacija
Anger D.L. in Foster W.G. 2008, Frontiers in Bioscience 13, 1578-1593.
moteni procesi
![Page 5: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/5.jpg)
spremembe v eutopičnem endometriju
moten imunski sistem
pospešena sinteza estrogenov pospešena adhezija
pospešena angiogeneza
motena apoptoza
pospešena proliferacija
povečana invazivnost
razrast ektopičnega endometrija
zmanjšan zaščitni učinek progesterona
kronični vnetni odziv
![Page 6: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/6.jpg)
Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena
Podrobno razumevanje patofiziologije: vpletenost in
pomen posameznih procesov in posameznih
molekul v teh procesih.
Razlike v patogenezi in patofiziologiji med
različnimi oblikami endometrioze.
![Page 7: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/7.jpg)
RAZUMEVANJE PATOFIZIOLOŠKIH PROCESOV
NA MOLEKULSKI RAVNI
NOVE TARČE ZA RAZVOJ
ZDRAVILNIH UČINKOVIN
NOVI DIAGNOSTIČNI
OZNAČEVALCI
RAZVOJ DIAGNOSTIČNIH METOD ZA ZGODNJE ODKRIVANJE
ENDOMETRIOZE
IN ZDRAVILNIH UČINKOVIN ZA USPEŠNO ZDRAVLJENJE
![Page 8: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/8.jpg)
modelni sistemi
modelne živali
celične linije
vzorci tkiva
metode genomika
transkript-omika
proteomika metabolomika
primeri
etična vprašanja
![Page 9: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/9.jpg)
Modelne živali
Endometrioza se razvije samo pri človeku in primatih.
Modelne živali: primati, miši, podgane .
(transplantacija koščkov endometrija, homologni, heterologni modeli)
modelni sistemi
Tirado-Gonzalez I. in sodelavci, J. Reprod. Immunol. 2010, 86, 141-147.
primeri peritonealne endometrioze
Zakon o zaščiti živali, registracija in dovoljenje!
![Page 10: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/10.jpg)
Primarne kulture ektopičnega endometrija
„Eksplant“ 3D kulture:
koščki tkiva v hranilnem mediju.
Epitelijske ali stromalne celice.
modelni sistemi
Fasciani A. in sodelavci Fertil. Steril. 2003, 80, 1137-1143.
http://humrep.oxfordjournals.org/conte
nt/16/5/836/F1.expansion.html
primarna kultura
Zeitvogel A. in sodelavci
Am. J. Pathol. 2011, 159,
1839-1852.
![Page 11: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/11.jpg)
Celične linije endometrioze
Celične linije: epitelijske in stromalne.
Modela peritonealne in globoko-infiltrativne endometrioze.
ATCC: stromalna celična linija ovarijske
endometrioze CRL-7566.
modelni sistemi
epitelijske 11Z stromalne 22B
Ektopični endometrij peritonealne endometrioze,
transfekcija s SV40 T antigen.
Zeitvogel A. in sodelavci Am. J. Pathol. 2011, 159, 1839-1852. Boccelino M. in sodelavci J. Cell.
Biochem. 2012, 113, 1292-1301.
epitelij
ske
str
om
aln
e
Ekto
pič
ni endom
etr
ij
glo
bo
ko
-in
filtra
tivn
e e
nd
om
etr
ioze
transfe
kcija
s h
TE
RT.
![Page 12: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/12.jpg)
Vzorci ektopičnega tkiva
Ektopični endometrij odvzet ob laparoskopiji:
za izolacijo DNA, RNA, proteinov, metabolitov ...
za pripravo parafinskih rezin.
modelni sistemi
http://www.microarraystation.com/tissue-
microarray/
http://php.med.unsw.edu.au/cellbiology/index
Tkivne mikromreže LCMD
lasersko zajemanje z mikrorezom
![Page 13: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/13.jpg)
Ustrezen načrt raziskave
Soglasje Komisije RS za medicinsko etiko
(http://www.kme-nmec.si/)
Raziskave v skladu s
1. Helsinško deklaracijo o biomedicinskih raziskavah,
2. Konvencijo Sveta Europe o varovanju človekovih
pravic in dostojanstva človeškega bitja v zvezi z
uporabo biologije in medicine (Oviedska konvencija).
3. Slovenskim kodeksom medicinske deontologije.
Pisno soglasje vseh udeleženih oseb.
etična vprašanja
![Page 14: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/14.jpg)
„Standard operating procedure“
Natančen načrt študije, protokol zbiranja vzorcev in podatkov.
Ustrezen, ponovljiv način zbiranja in shranjevanja vzorcev, ki
omogoča najboljšo kvaliteto vzorcev za nadaljnje analize.
Vprašalniki za ustrezno zbiranje vseh pomembnih podatkov o
preiskovani in kontrolni skupini.
metode
![Page 15: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/15.jpg)
Možni pristopi proučevanja metode
Epigenomika/Genomika ~ 25 000 genov
Transkriptomika ~ 100 000 mRNA
> 1 000 miRNA, ...
Proteomika > 300 000 proteinov*
Metabolomika ~ 40 000 metabolitov***
*Nishimura et al. 2005, J. Gastroenterol. 40, 7-13; **HMDB: The Human Metabolome Database 2013
![Page 16: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/16.jpg)
Epigenomika metode
http://www.nature.com/scitable/topicpage/epigenomics-the-new-tool-in-studying-complex-694/
Dedne spremembe v genomu:
metilacije DNA,
modifikacije histonov
(metilacije, acetilacije,
ubikvitinacije)
Vpliv okolja.
Metode:
bisulfitno sekvenciranje
primerjalna hibridizacija metiliranih področij
![Page 17: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/17.jpg)
Nekateri geni vpleteni v razvoj endometrioze so hipo/hiper metilirani
Guo S.W. Mol. Human Reprod. 2009, 15, 587-607.
Steroidogeni
faktor 1
primeri
![Page 18: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/18.jpg)
Genomika /
transkriptomika
metode
http://www.sabiosciences.com/howpcrarrayworks.php
Primer DNA mikromrež Možnosti:
proučevanje SNP,
mikrosatelitov,
izražanja genov,
študije miRNA, ...
http://www.fastol.com/~renkwitz/microarray_chips.htm
![Page 19: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/19.jpg)
Profil izražanja genov kot diagnostični označevalec?
primer
D- bolnice, N- zdrave osebe; rdeče P, rumeno ES, modro LS
DNA mikromreže
eutopični endometrij
21 bolnic III-IV faza
16 zdravih oseb
USA patent:7871778
PCA - analiza glavnih komponent Hierarhično grupiranje
Z B
Z
B
![Page 20: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/20.jpg)
Transkriptomika
metode
http://www.sabiosciences.com/howpcrarrayworks.php
Kvantitativni PCR (qPCR)
proučimo izražanje genov
(mRNA)
določimo količino miRNA
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
84 ali 370 genov
![Page 21: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/21.jpg)
Različni vpliv progestinov na vnetne procese
Beranič N. in Lanišnik Rižner T. neobjavljeni rezultati.
„PCR Array: Inflammatory Cytokines and Receptors“ (PAHS-011, Qiagen)
progestini
celice Z-12
izražanje genov
primeri
Visanne
Dabroston
![Page 22: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/22.jpg)
Proteomika metode
http://kenyaforensics.blogspot.com/2012/05/application-of-
elisa-in-forensic.html
Validacija: ELISA
Proteinske mreže
http://www.stat.purdue.edu/sbc/protein_array_analysis.html
![Page 23: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/23.jpg)
Iskanje biokemijskih označevalcev s proteinskimi mrežami
Antibody Array
725 specifičnih protiteles, ki prepoznajo proteine vključene
v ključne signalne poti in v uravnavanje izražanja genov.
http://www.arrayit.com/Products/Microarray_Slides/Epoxy_Slides/epoxy_slides.html
primer
bolnice kontrole
![Page 24: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/24.jpg)
„Multiplex“ ELISA metode
http://www.bio-rad.com/en-si/applications-technologies/bio-plex-multiplex-immunoassays
![Page 25: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/25.jpg)
Proteini vnetnih procesov kot biokemijski označevalci
Bio-Plex metoda (IL-6, IL-8, IL-15, IL-18, IP-10,
MCP, VEGF, GROa, ICAM, VCAM)
ELISA (glikodelin A, RANTES, ficolin-2,
CRP, leptin)
serum in peritonealna tekočina
58 bolnic z endometriozo
40 brez endometrioze
Kocbek V., Vouk K., Bersinger N., Hevir N.,Mueller M.D. Lanišnik Rižner T. poslano v objavo
primeri
Model Vzorec AUC Specifičnost
(%)
Občutljivost
(%)
leptin/ glikodelin-A + bolečibne + starost + leptin/ glikodelin-A: starost
serum 0,912 83,3 83,6
fikolin2/ glikodelin-A + bolečine + starost
serum 0,887 83,3 83,6
fikolin2/ glikodelin-A + IL8PF/mg proteinov + bolečine + starost
PF 0,936 97,0 80,0
![Page 26: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/26.jpg)
Metabolomika metode
http://www.nature.com/nprot/journal/v7/n5/fig_tab/nprot.2012.024_F1.html
Masna spektrometrija
![Page 27: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/27.jpg)
Lipidni metaboliti kot diagnostični označevalci?
Tarčna metabolomika ESI MS/MS
140 lipidnih metabolitov: glicerofosfolipidov,
sfingolipidov, acilkarnitinov
plazma
52 kontrol
40 bolnic z endometriozo jajčnika
primeri
90 % občutljivost, 84 % specifičnost
![Page 28: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/28.jpg)
Študije metaboloma razkrijejo nove tarče
ESI MS/MS
140 metabolitov
52 kontrol
40 bolnic
Vouk K., Hevir N., Ribič-Pucelj M., ...Osredkar J....Lanišnik Rižner T. Human Reprod. 2012, 27, 2955-2965.
primeri
E.C. 2.3.1.23
LPCAT4
lizofosfatildil
acil transferaza
E.C. 3.1.4.4
PLD
fosfolipaza D
![Page 29: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/29.jpg)
Študije metaboloma razkrijejo biokemijske označevalce
primeri
23 zdravih kontrol 22 bolnic z endometriozo
82 % občutljivost, 91 % specifičnost
![Page 30: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/30.jpg)
Modelni sistemi endometrioze:
živalski modeli,
„explant“ kulture,
primarne celične kulture,
celične linije,
vzorci tkiva.
Pristopi proučevanja molekularnih osnov:
epigenomika/genomika//transkriptomika,
proteomika,
metabolomika,...
Metodološki pristopi so splošno uporabni pri proučevanju
molekularnih osnov in identifikacije biokemijskih označevalcev
različnih bolezni.
![Page 31: Metode proučevanja molekularnih osnov in identifikacije ...ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/... · Patofiziologija endometrioze še vedno ni razjasnjena Podrobno razumevanje patofiziologije:](https://reader033.vdocuments.site/reader033/viewer/2022060704/607090cde9b5892ac41bd499/html5/thumbnails/31.jpg)
Trenutno razumevanje patofiziologije endometrioze