methodenvergleich pcr- ssp/sso testsysteme ssp:bag,dynal,olerup sso:elpha,dynal reli
TRANSCRIPT
Methodenvergleich PCR-SSP/SSO
Testsysteme
SSP:BAG,Dynal,Olerup
SSO:Elpha,Dynal Reli
Vergleich SSP-SSO
SSP: Sequenz spezifische Primer
SSO: Sequenz spezifische Oligonukleotide
Elpha: Enzyme linked probe hybridization essay
Reli: reverse line dot blot essay
Vergleich SSP-SSO
Überprüft auf :– Eindeutigkeit des Ergebnisses– Notwendigkeit von Wiederholungen– Auflösungsvermögen und detektierte Allele– methodische Probleme– Auswertung– Kosten und Materialverbrauch– Zeitaufwand
Vergleich SSP - SSO
SSP Ergebnis nach
Amplifikation Zeitgewinn
SSO Cyclerbedarf
geringer Probendurchsatz
größer DNA-Bedarf geringer oft bereits im low-
resolution-Set hohe Auflösung
Prinzip der PCR-SSP
Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.
Prinzip der PCR-SSP
5´
3´
3´
5´
Primerannealing bei 37 - 72°C
Antisenseprimer
Senseprimer
Prinzip der PCR-SSP
5´
3´
3´
5´
Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C
Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon-gation, bis PCR-Cyclen beendet.
Prinzip des Dynal RELI
SSO-Molekülewerden auf Membran
immobilisiert
Ziel-DNA wird mitbiotinmarkierten Primern
amplifiziert und dena-turiert auf die Membran
gegeben
Strepavidin-konjugiertes
Reportermolekülmacht Bindung
sichtbar(enzymatisch..)
Erscheinung des Reli-Test
Prinzip des Elpha
Capture Oligo-nukleotid istan Wand des
Reaktions-gefäßesfixiert
PCR-amplifizierte biotinylierte DNAbindet an fixiertes SSO
Streptavidin-reportermolekül
ist mit Enzym gekoppelt,das Substratum-wandlung ver-
mittelt
Im letzten Schritt wird das Substrat, z.B. O-phenylene-
diamin, als Farbreaktionumgesetzt
Erscheinung Elpha-Test
Vergleich SSP - SSO
SSP
Elpha
Reli
Vergleich SSP-SSO
27 Proben DRB und 26 Proben DQB in Vergleich
je 4 Homozygote in DRB und DQB pro Probe DRB:BAG,Elpha,Reli
DQB:Dynal/Olerup,Elpha, Reli
1 x DQB-SSP allein, 2 x DQB SSP-Reli
Vergleich SSP-SSO
SSP Elpha Reli Cycler 47 Min 33,5 Min 48,75 Min
(reine Ampl.)
Detektion 18 Min 110 Min 100 Min(ohne Auswertung)
DNA 12/30 µl 4/2 µl 4 µl(100 ng/ml)
DNA 1:1 1:19/1:22 1:72Verdünnung DQB DRB
Schritte 2 12 21ohne Amplifikation
Vergleich SSP-SSOKosten pro Test
SSP Elpha Reli Kitpreis pro Bestimmung
DRB 37,- 65,- 45,-DQB 15/12 65,- 42,-
ReagenziendNTP-Puffer 10,5
Taq Polymerase 0,86/0,36 0,36 inklusive
RestkostenMaterial, Fotographie, Zeit... 1,50 6/12Pf 6 Pf
Vergleich SSP-SSOHomozygotenerkennung
SSP Elpha Reli
DRB 1/4 1/4 1/4erkannt 4,-nicht erkannt 3,-;15,-;13,-
DQB 3/4 2/4 4/4erkannt 6,-;2,- 6,-;2,- 6,-;2,-nicht erkannt 6,- 6,-;2,-
DRB-Allele der Sets
Allele DRB1 WHO 1998, Elpha, BAG, RELI
221
148
194178
194213
WHO 1998 Serologie Elpha BAG 1 BAG 2 Reli
DQB-Allele der Sets
Allele DQB1 WHO 1998, Elpha, Dynal SSP, Olerup, Reli
39
30
3437 38 38
WHO 1998 Serologie Elpha Dynal SSP Olerup Reli
Reli-Auswerteprogramm
Elpha-Auswerteprogramm
Vergleich SSP-SSOElpha-Frequenzentscheidung
0%
20%
40%
60%
80%
100%
01xx 03xx 04xx 08xx 11xx 12xx 13xx 14xx 15xx 16xx
Allelfrequenzen im HLA-DRB1
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 15 17 19
Vergleich SSP-SSOAllelfrequenzen DQB (KM)
0
5
10
15
20
25
30
35
DQ201
DQ202
DQ301
DQ302
DQ303
DQ304
DQ402
DQ501
DQ502
DQ503
DQ504
DQ601
DQ602
DQ603
DQ604
Vergleich SSP-SSOeindeutige Ergebnisse
SSP Elpha Relih/v a/v DR2
DR2
DRB 63% 85% 19% 52% 41% 70%
SSP Elpha Relialle Primerausfall
DQB 93% 77% 75% 100%
Vergleich SSP-SSOAuflösung
DRBSSP 15,5%Elpha h/v 82%
a/v 19,6%Reli 48,3%
DQBSSP 30%Elpha h/v 77%
a/v 74%Reli 71%
Vergleich SSP-SSOWiederholungen
SSP Elpha Relih/v a/v DR2 DR2
DRB- insgesamt 37% 15% 81% 41% 59% 30%- Ausfälle 19% 7% 11%- Ag Ausschl. 22% 7% 44% 26%- DR2 0% 4% 33% 30%
DQB- insgesamt 7% 62% 0%- Ag Ausschl. 7%- Ausfälle 0% 15%
Vergleich SSP-SSOSSP-Problemfälle
DRB: BAG-Set kann bei Vorliegen von DRB1*13 *1424 nicht sicher ausschließenbei Vorliegen von *13,- kann auch *1130 nicht ausgeschlossen werdenbei Vorliegen von *3,- kann auch *1420 nicht ausgeschlossen werden
Sets von Dynal oder Biotest zeigen dieses Problem nicht
Vergleich SSP-SSOSSP-Problemfälle
DQB in einem Fall einer DQB1*06 Homozygotie war ein *0304 nicht
auszuschließenin einem Fall einer DQB1*0301
Homozygotie war eine *03032 und *0306 nicht sicher auszuschließen
DQ 3 Splitaufteilung nur in DQ 7 möglich
Vergleich SSP-SSOElpha-Problemfälle
DRB bei Vorliegen von DRB1*03/04 und *11/12 ist im Bewertungsmodus
alle/vollständig auch *13 und *14 möglich
zusätzlich sind bei Vorliegen von *03,*07,*11,*12,*08
ebenfalls *13 oder *14 möglich
Vergleich SSP-SSOElpha-Problemfälle
DQB in Primermixen A oder B trotz positiver Kontrollbande kein
spezifisches Amplifikat in 31% der Amplifikationen; in diesen Fällen nur bei 75% korrelierendes Ergebnis
Wenn in jedem Mix spezifisches Amplifikat korrektes
Ergebnis in 78% d.F.
Vergleich SSP-SSOspezieller Fall Elpha
DNA Probe 990606SSP und Reli DQB1*02,-Elpha-Test:1) alle Kontrollen positiv DQB1* 0301,06012) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 020x,030x3) PM A kein spezif. Amplifikat DQB1* 02,-
Vergleich SSP-SSOReli-Problemfälle
DRB Bei Vorliegen von 3,- oder 13,-Homozygotie ist auch heterozygote13,3 möglichBei HLA-DRB1*11,12 kann *13 nichtausgeschlossen werdenIm Falle DRB1*03,11 wird homozy-got 3,- oder 11,- von der Auswerte-software als wahrscheinlich angegeben
Vergleich SSP-SSOReli Problemfälle
DQBes steht keine Auswertesoftware zur Verfügung
Vergleich SSP-SSOspezieller Fall Reli
DNA Probe 990291SSP-Ergebnis DRB1*03,11Reli Auswertesoftware:1) 0308,-2) 1109,-3) 03xx,03084) 03xx,11xxreproduzierbar
Bewertung Elpha-Test VorteileVorteile::
– stabile DRB Amplifikation
– automatisches Waschen
– Gesamtprozeß-automatisierung verfügbar
– Mit Update ist eine Auswertung auch früherer Daten hinsichtlich neuer Allele möglich
– für DR2-Auftrennung werden Primer mitgeliefert
Nachteile:Nachteile:– instabile DQB Amplifikation– je nach Softwareeinstellung
werden bestimmte Allele aus der Bewertung ausgeschlossen
– sehr abhängig von technischer Ausstattung, die bei Defekt die Testdurchführung unmöglich macht
– Pipettierarbeit zeit- und materialaufwendig
– Dokumentation der Reaktion nur als Photometermeßwerte im PC und auf Ausdruck
– viel Material nicht im Lieferumfang
Bewertung Reli-Test Vorteile:Vorteile:
– sehr stabile Amplifikationen
– Testdurchführung mit wenig Materialaufwand
– Streifen sind zur Dokumentation archivierbar
– HLA-A und -B bereits verfügbar
– kaum mechanische oder elektrische Geräte nötig
Nachteile:Nachteile:– für DQB keine Auswerte-
software– keine Automatisierung
der Waschschritte oder des gesamten Ablaufs verfügbar
– schlechte optische Aufbereitung des Befundausdrucks
Bewertung SSP Vorteile:Vorteile:
– stabile Amplifikationen– Fotos des Gelbildes
zur Dokumentation archivierbar
– teilweise Automatisierung verfügbar
Nachteile:Nachteile:– hoher Platzbedarf im
Thermocycler– ausgefallene
Amplifikationen machen Neuansatz des gesamten Sets nötig
– höhere Kosten für Polymerase
– mehr Ethidiumbromid-gele als Sonderabfall
– mehr Pipettieraufwand für einen Patienten