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Metagenômica e sequenciamento de nova geração
Fabrício Campos
25 de junho de 2015
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Conceitos
• METAGENOMA
– É o genoma coletivo do microbioma total
encontrado em um determinado habitat
• METAGENÔMICA
– É a análise genômica das comunidades de
microrganismos de um determinado ambiente por
técnicas independentes de cultivo
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Viroma
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Ferramenta poderosa
• Informação genética sobre novos
microrganismos e seus produtos (genes,
proteínas, enzimas, etc)
• Conexões genômicas entre função e filogenia
de organismos “não cultiváveis”
• Perfis evolutivos de função e estrutura de
comunidades
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Sample preparation
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Sample preparation
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Genome fragmentation
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Genome fragmentation
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What is genome assembly?
• Hierarchical structure
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Scaffolds
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Digamos que você sequenciou o genoma abaixo (depois da fragmentação):
“era o melhor dos tempos, era o pior dos tempos, a era da sabedoria, a era da bobagem...” Charles Dickens
era o melhor dos
dos tempos, era o pior
a era da sabedoria,
melhor dos tempos, era
a era da bobagem,
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reads
contigs
scaffolds
era o melhor dos
era o melhor dos tempos
o melhor dos tempos, era
melhor dos tempos, era
dos tempos, era o
dos tempos, era o melhor dos tempos, era o pior
“era o melhor dos tempos, era o pior dos tempos ...”
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O que é montagem de genomas?
• Processo de reconstrução da sequencia de DNA original de um organismo a partir dos “reads”
• Mundo ideal
– “Reads” não ambíguos e livres de erros
– Simples problema de dedução
• Mundo real
– “Reads” ambíguos (muito curtos ) e com erros
– Problema de inferência complicado de resolver
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O que fazer após o sequenciamento
• Editar, montar e anotar todos os contigs
– Software Geneious
• Fazer a predição dos genes daquelas regiões não anotadas
– FGenesB
• Fazer o Blastp > identificar a proteína
• Volta para o Geneious e edita as anotações
• Depositar Contigs no Genbank
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SoftBerry - Gene identification
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Annotation in Geneious
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Problemas na montagem
• Kit Illumina de 2 x 75 pb (melhor 2 x 300 pb)
• Falta de processador e memoria computacional para processamento de dados
– Processador 4 núcleos e 8 Gb de memoria RAM não é suficiente
– Ferramenta Geneious “Combined mapping and de novo assembly” não roda ou demora muito
– Pelo menos um servidor com 16 núcleos e 64 Gb de memoria RAM
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Problemas na montagem
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The limitations of draft assemblies for understanding prokaryotic adaptation and evolution
Fonte: N. Ricker et al. / Genomics 100 (2012) 167–175
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6 fagos inseridos no genoma
E. faecalis P8
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Demora na montagem
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Demora na montagem
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Genomas montados no lab
• Metagenômica de fezes de suínos
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Genomas montados no lab
• Porcine parvovirus tipo 2
– Montagem do genoma de PPV-2 a partir dos “contigs” gerados pelo software Geneious
– Os 5425 pb foram cobertos pelos contigs (região azul) em até 31.767 vezes
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PPV-2
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PPV-2: Ref-Seq no GenBank
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Herpesvirus bovino 1
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Genoma de herpesvirus humano x herpesvirus bovino 1
BoHV-1 (~135kb)
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Diferenças entre Cooper GenBank e a “nossa”
• Cooper GenBank (JX898220): 134.896 pb e 72,4% de GC
• Cooper “nossa”: 134.004 pb e 72,5% de GC
• Nível de identidade: 98,5%
• Diferença: 892 pb
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Região US1.67/US2 excisada durante replicação
Cooper GenBank
Nossa Cooper
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Região US1.67/US2 excisada durante replicação
Cooper GenBank
Nossa Cooper
/
Nossa Cooper
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O que acham disso?
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Aplicações em medicina
• Identificar genes funcionais e/ou novas vias metabólicas
• Estimar a diversidade microbiana; permitindo o estudo dos genomas em uma comunidade como um todo
• Compreender a dinâmica da população de uma comunidade inteira
• Identificação novos patógenos
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Aplicações em medicina
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Aplicações em medicina
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Aplicações em medicina
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Referencias
• J. Miller, S. Koren, G. Sutton (2010) Assembly algorithms for
next-generation sequencing data Genomics 95 315-327.
• M. Pop (2009) Genome assembly reborn: recent computational
challenges Briefings in Bioinformatics 10:4 354-366.
• Web
– http://bioinformatics.net.au/
– http://vicbioinformatics.com/