Menggunakan Spektrofotometer yang Pengantar Dalam latihan ini, Anda akan belajar prinsip-prinsip dasar spektrofotometri dan pengenceran serial dan aplikasi praktis. Anda perlu keterampilan ini untuk menyelesaikan latihan lainnya di seluruh semester. spektrofotometer adalah alat yang sangat ampuh digunakan baik dalam biologi dan kimia ilmu belum beroperasi dengan hanya bersinar seberkas cahaya, disaring dengan panjang gelombang tertentu (atau sangat sempit kisaran panjang gelombang), melalui sampel dan ke sebuah pengukur cahaya. Beberapa sifat dasar sampel dapat ditentukan oleh panjang gelombang dan jumlah cahaya yang diserap oleh sampel. Instrumen yang akan kita gunakan di kelas adalah Spektrofotometri 401. Tujuan Pembelajaran (tanpa urutan tertentu) Konseptual Anda harus memahami: • mekanisme dasar spektrofotometer • prinsip-prinsip dasar spektrofotometri termasuk transmisi dan absorbansi. • maks A untuk suatu senyawa dan bagaimana ditentukan. • penerapan hukum Beer untuk menentukan konsentrasi dan koefisien kepunahan. • penggunaan spektrofotometri untuk mengidentifikasi senyawa • penggunaan kurva standar dalam menganalisis data Praktis • operasi dasar dari Spektrofotometri 401. • membuat pengenceran serial. Underlying Sains Prinsip-prinsip dasar spektrofotometri Suatu spektrofotometer absorbansi adalah instrumen yang mengukur fraksi kejadian cahaya yang ditransmisikan melalui solusi. Dengan kata lain, digunakan untuk mengukur jumlah cahaya yang melewati bahan sampel dan, dengan perbandingan intensitas cahaya awal mencapai sampel, mereka secara tidak langsung mengukur jumlah cahaya yang diserap oleh sampel tersebut. Spektrofotometer dirancang untuk mentransmisikan cahaya rentang panjang gelombang yang sempit (lihat Gambar 1 yang elektromagnetik spektrum). Suatu senyawa yang diberikan tidak akan menyerap semua panjang gelombang sama-itu mengapa hal-hal warna berbeda (beberapa senyawa menyerap panjang gelombang hanya luar terlihat spektrum cahaya, dan itulah mengapa ada solusi tidak berwarna seperti air). Karena berbeda senyawa menyerap cahaya pada panjang gelombang yang berbeda, spektrofotometer dapat digunakan untuk membedakan senyawa dengan menganalisis pola panjang gelombang diserap oleh sampel diberikan. Selain itu, jumlah cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi menyerap senyawa dalam sampel itu, jadi spektrofotometer juga dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi

senyawa dalam larutan. Akhirnya, karena partikel dalam suspensi akan menghamburkan cahaya (sehingga mencegah dari mencapai detektor cahaya), spektrofotometer dapat juga digunakan untuk memperkirakan jumlah sel dalam suspensi. Kami akan menggunakan spektrofotometer beberapa kali semester ini untuk mengukur konsentrasi bahan kimia yang terkandung dalam larutan. Gambar 1. Spektrum elektromagnetik. Cahaya tampak (400-700 nm) merupakan hanya sebagian kecil dari spektrum yang berkisar dari sinar gamma (kurang dari 1:00 lama) ke gelombang radio yang ribuan meter panjang Ketika mempelajari suatu senyawa dalam larutan oleh spektrofotometri, Anda memasukkannya ke dalam dudukan sampel disebut mangkok yg dihiasi dgn ukiran dan menempatkannya di spektrofotometer. Cahaya panjang gelombang tertentu lewat melalui solusi di dalam mangkok yg dihiasi dgn ukiran dan jumlah cahaya yang ditransmisikan (melewati solusi-transmisi) atau diserap (Absorbance) oleh larutan diukur dengan meter cahaya. Sementara spektrofotometer dapat menampilkan pengukuran sebagai transmitansi atau absorbansi, di aplikasi biologis kita biasanya tertarik pada absorbansi sampel diberikan. Karena senyawa lain dalam suatu larutan (atau pelarut sendiri) dapat menyerap panjang gelombang yang sama sebagai senyawa yang dianalisis, kita membandingkan absorbansi larutan uji kami untuk referensi kosong. Idealnya, referensi kosong harus berisi segala sesuatu ditemukan dalam larutan sampel kecuali substansi Anda mencoba untuk menganalisis atau mengukur. Sebagai contoh, di lab hari ini latihan Anda akan mengukur absorbansi dye, biru bromphenol yang dilarutkan dalam air. Referensi kosong dalam hal ini akan air saja. Jumlah cahaya yang ditransmisikan melalui solusi ini disebut sebagai transmisi (T). The transmisi didefinisikan sebagai rasio dari energi cahaya yang ditransmisikan melalui sampel (I) ke energi ditularkan melalui acuan kosong (I0). Sejak senyawa yang diuji tidak hadir dalam referensi kosong, transmitansi dari referensi kosong didefinisikan sebagai 100% T. T = I/I0 Angka ini dikalikan dengan 100 untuk menentukan transmitansi persen (T%), persentase cahaya yang ditransmisikan oleh substansi relatif terhadap referensi kosong. % T = I/I0 * 100 Sebagian tertentu dari cahaya akan diserap oleh senyawa dalam mangkuk yg dihiasi dgn ukiran tes, maka nya T% akan lebih rendah daripada kosong (dengan definisi, 100%). Gamma Sinar X-ray Ultraviolet Visible Infrared Microwave Radio Violet Merah Oranye Biru Hijau Kuning 400 500 600 700 nm 10-5 1013 nm nm

Untuk aplikasi biologis yang paling Namun, kita mengukur absorbansi (Al, juga disebut sebagai Optical Density atau ODL, di mana l adalah panjang gelombang digunakan untuk pengukuran), jumlah cahaya diserap oleh solusi. Absorbansi berhubungan dengan transmisi thusly logaritmis. A T =-log Sekali lagi, referensi kosong digunakan. Dalam hal ini, untuk 'nol' setiap cahaya yang diserap oleh apa pun di selain senyawa bunga solusi. Menurut definisi, absorbansi referensi kosong ditetapkan sebesar nol (Al = 0) Cahaya tampak (lihat Gambar 2) terdiri dari panjang gelombang 400-700 nm (nanometer). Ketika cahaya melewati sebuah solusi berwarna, beberapa panjang gelombang ditransmisikan dan yang lain diserap. Anda melihat warna panjang gelombang yang ditransmisikan. Misalnya, hasil warna merah ketika solusi menyerap panjang gelombang pendek (hijau dan biru) dan mentransmisikan panjang gelombang yang lebih lama (Merah). Sebuah spektrum absorbansi (a plot absorbansi sebagai fungsi panjang gelombang) ditentukan untuk memilih panjang gelombang optimal untuk menganalisis suatu senyawa yang diberikan. Panjang gelombang yang optimal (Amax) untuk mengukur absorbansi adalah bahwa panjang gelombang yang paling diserap oleh senyawa tersebut. Ini memberikan sensitivitas maksimum untuk pengukuran Anda. Sebuah spektrum absorbansi hipotetis ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar 2. Penyerapan spektrum. Grafik absorbansi vs panjang gelombang untuk sebuah senyawa hipotetis. The Amax untuk senyawa ini adalah sekitar 500 nm. Cahaya dari sumber cahaya spektrofotometer itu (dalam kasus hasil pengukuran dalam terlihat kisaran, lampu pijar sederhana) tidak terdiri dari panjang gelombang tunggal, melainkan terus menerus bagian dari spektrum elektromagnetik. Cahaya ini dipisahkan menjadi bagian khusus dari spektrum melalui penggunaan prisma atau kisi difraksi. Sebagian kecil dari terpisah spektrum kemudian melewati celah sempit. Ketika Anda menyesuaikan panjang gelombang pada spektrofotometer, Anda sedang mengubah posisi prisma atau difraksi kisi sehingga panjang gelombang cahaya yang berbeda diarahkan pada celah. Semakin kecil celah lebar, semakin baik kemampuan instrumen untuk menyelesaikan berbagai senyawa. Lebar celah di 401 Spektrofotometri sinar adalah < 8 nm. Sangat spektrofotometer berkualitas tinggi memiliki lebar celah <2 nm. Band ini cahaya kecil kemudian melewati mangkuk yg dihiasi dgn ukiran yang mengandung sampel. Cahaya yang melewati sampel adalah terdeteksi oleh fotosel dan diukur untuk menghasilkan nilai transmittance atau absorbansi (optik densitas) untuk sampel. Lihat Gambar 3 untuk skematik spektrofotometer.

Panjang gelombang (nm) Absorbansi 450 500 550 600 650 700 1.2 1.0 0.6 0.2 Gambar 3. Komponen spektrofotometer. Ada hubungan antara konsentrasi dan absorbansi. Hubungan ini diungkapkan oleh hukum Lambert-Beer, yang lebih dikenal sebagai hukum Beer's. Hukum ini menyatakan bahwa absorbansi cahaya menyerap materi sebanding dengan konsentrasi dalam larutan. A = ELC e = koefisien kepunahan substansi, memiliki unit M-1 * cm-1 (unik untuk setiap substansi) l = panjang jalur sampel diukur dalam centemeters (yaitu lebar dari mangkuk yg dihiasi dgn ukiran-hampir selalu 1 cm) c = konsentrasi molar larutan (Anda harus mengekspresikan konsentrasi dalam hal molaritas) Hal ini karena hubungan ini bahwa ahli biologi mengukur penyerapan daripada transmisi. Hukum Lambert-Beer dapat digunakan untuk menghitung konsentrasi larutan jika kepunahan yang koefisien diketahui. Untuk menentukan koefisien kepunahan, Anda mengukur absorbansi dari diketahui konsentrasi larutan dan kemudian mengatur ulang persamaan untuk memecahkan e. e = A / lc Latihan: Kontrol dan Variabel Kontrol: Kontrol Positif: Bagian B: kurva standar dengan konsentrasi BPB tahu Kontrol Negatif: Bagian A & B: Air kosong, Variabel: variabel Independen: (variabel yang sengaja diubah) Parta: Panjang gelombang untuk mengukur Amax Bagian B: Konsentrasi bromphenol biru Variabel Dependen: (atau hasil atau hal yang Anda mengukur) Bagian A & B: Penyerapan Cahaya sumber Prisma Celah <8 nm lebar Mangkok yg dihiasi dgn ukiran fotosel Meter 0.586 Cahaya jalan

Controlled variabel: Semua parameter yang dipelihara konstan antara sampel bacaan (misalnya spektrofotometer yang sama untuk semua bacaan, panjang gelombang konstan untuk mengukur konsentrasi) Bagian A. Penentuan Amax dari bromphenol biru Dalam Bagian A dari latihan ini Anda akan menentukan Amax (panjang gelombang optimal untuk mengukur absorbansi) dari biru bromphenol. Bahan Beaker dari dH2O Tabung bromofenol biru (BPB) (18.6 pM) Cuvettes P-1000 Micropipettor dan tips biru Spektrofotometer Metode Perhatikan demonstrasi tentang cara menggunakan Spec 401 di kelas dan ikuti petunjuk di bawah ini. Gambar 4. Keyboard Spektrofotometri 401 spectrophotometer.1) Sampel kompartemen pintu 2) / unit layar 3) Mangkok yg dihiasi dgn ukiran pemegang 4) Detektor 5) uji tabung pintu akses. Penggunaan Spektrofotometri sinar spektrofotometer 401 • Pastikan tidak ada sampel pemegang mangkok yg dihiasi dgn ukiran dan bahwa wadah sampel dan pintu tabung reaksi akses ditutup (lihat Gambar 5). • Tekan pada tombol daya (terletak di bagian belakang instrumen) ke posisi ON. • "Spektrofotometri 401" akan muncul pada display unit diikuti dengan sesuatu seperti "E 546NM-0.123A " • Biarkan mesin pemanasan selama 10 menit sebelum Anda menggunakannya. • Masukkan panjang gelombang yang diinginkan (misalnya, 530) lalu tekan tombol [GO TO l] kunci. • Tampilan akan membaca, "AKAN 530 NM" dan kemudian akan membaca "E 530NM-0.123A" • Bersihkan dari mangkuk yg dihiasi dgn ukiran Anda yang berisi solusi kosong dengan KimWipe dan tempat dalam mangkok yg dihiasi dgn ukiran tunggal pemegang atau di posisi 1 dari pemegang beberapa mangkok yg dihiasi dgn ukiran di kompartemen sampel. Pastikan bahwa mangkuk yg dihiasi dgn ukiran sejajar dengan sumber cahaya. Pastikan untuk memiliki wajah yang jelas mangkok yg dihiasi dgn ukiran menghadap ke arah depan mesin! • Tutup pintu kompartemen sampel. • Tekan tombol AUTO ZERO pada keypad. Layar menampilkan "zeroing ..." dan kemudian akan menunjukkan "E 530NM 0.000A" • Lepaskan kosong. Lap dari mangkuk yg dihiasi dgn ukiran yang berisi sampel dengan Lap Kim, masukkan ke dalam kompartemen sampel dan tutup pintu kompartemen sampel. • Bacalah absorbansi ditampilkan (misalnya, untuk tampilan, "E 580NM 0.586A," absorbansi adalah 0,586) dan merekamnya dalam sebuah tabel. 1. Lihatlah pewarna biru bromphenol (BPB). Apa warna cahaya sedang dikirim? Apa

warna cahaya yang diserap? DI notebook laboratorium anda, berspekulasi tentang apa yang menjadi panjang gelombang yang Amax. 2. Untuk menentukan Amax senyawa tersebut, masing-masing tim akan diberi kisaran 100 nm dalam kisaran terlihat spektrum (400nm sampai 700 nm). Baca absorbansi sampel setiap nm 10 dalam jangkauan tim Anda ditugaskan. Anda kemudian akan memberikan data Anda ke TA yang akan mengkompilasi dan grafik data untuk seluruh kelas untuk menentukan Amax untuk BPB. 3. Ikuti Spektrofotometri 401 petunjuk di atas untuk mengatur panjang gelombang spektrofotometer dengan panjang gelombang terendah dalam jangkauan Anda. 4. Letakkan mangkuk yg dihiasi dgn ukiran referensi kosong (biasanya disebut sebagai "kosong") ke spektrofotometer ("Spec") dan ikuti petunjuk di atas untuk nol absorbansi. 5. Hapus kosong Anda dan tempat mangkuk yg dihiasi dgn ukiran berisi biru bromphenol ke spec. Baca absorbansi pada panjang gelombang pertama dalam jangkauan Anda dan catat dalam tabel yang disediakan dalam hasil bagian. 6. Ulangi langkah 6 - 8 untuk membaca absorbansi dari nm biru bromphenol setiap 10 untuk sisa Anda jangkauan. 7. Anda harus "re-nol" spec pada panjang gelombang masing-masing menggunakan kosong. Jangan khawatir jika tampilan spec mulai berkedip "UNFL." ini akan hilang ketika anda menekan AUTO ZERO tombol. 8. Bilas dua Anda cuvettes dengan dH2O dan tempat terbalik di sebuah KimWipe untuk menguras, Anda akan menggunakannya lagi dalam Bagian B. Catat nomor di bagian dalam buku catatan hasil lab anda dan berbagi data Anda dengan TA. TA Grafik akan semua data untuk bagian Anda (KITA bisa menggunakan komputer untuk membuat grafik! ha ha) dan memberikan Anda dengan hasil cetak grafik. Dari grafik, menentukan Amax untuk bromphenol biru. Ini adalah panjang gelombang akan Anda gunakan dalam Bagian B. Bagian B. Pengaruh konsentrasi pada absorbansi Pada Bagian B dari latihan ini, Anda akan membuat dilusi seri biru bromphenol dan mengukur absorbansi mereka untuk melihat hubungan antara konsentrasi senyawa dan absorbansi. Anda kemudian akan menggunakan hukum Lambert-Beer untuk menentukan kepunahan koefisien untuk bromphenol biru dan menentukan konsentrasi BPB dalam larutan yang tidak diketahui. Bahan biru bromofenol (18.6 pM) Cuvettes P-1000 Micropipettor dan tips biru Spektrofotometer Uji tabung

Unknown larutan biru bromphenol Metode 1. Mendapatkan 4 tabung reaksi. Nomor mereka 1 sampai 4. 2. Gunakan P1000 untuk pipet 2000 ßl dari dH2O ke dalam tabung masing-masing. 3. Tambahkan 2000 ßl dari 18,6 bromphenol pM biru untuk tabung 1. Tabung ini merupakan 1 / 2 (atau 1:1) pengenceran. Konsentrasi biru bromphenol dalam tabung ini adalah 9,3 pM (18,6 pM * 1 / 2). 4. Untuk campuran isi tabung 1, gunakan mixer vortex. 5. Mengatur kecepatan pusaran pada tanggal 4. Pastikan saklar pusaran ada di TOUCH. 6. Tempatkan tabung Anda dalam cangkir karet hitam pusaran dan tekan ke bawah untuk mencampur sampel Anda. 7. Pipet 2000 ßl dari 1 isi Tube ke Tube 2. Campur menggunakan vortexer tersebut. Tube 2 adalah 1 / 4 (atau 1:3) dilusi. (Anda membuat pengenceran 1 / 2 dari pengenceran 1 / 2. 1 / 2 * 1 / 2 = 1 / 4) Apakah konsentrasi biru bromphenol dalam tabung ini? 8. Transfer 2000 ßl Tabung 2 ke Tube 3. Apa cairan ini? Kau membuat pengenceran 1 / 2 dari 01:04 dilusi. Berapa konsentrasi biru bromphenol dalam tabung ini? 9. Transfer 2000 ßl Tabung 3 ke Tube 4. 10. Atur spec. pada panjang gelombang Amax yang Anda ditentukan di Bagian A. 11. Zero spec menggunakan mangkok yg dihiasi dgn ukiran kosong Anda. 12. Baca absorbansi tabung 4. Merekamnya dalam bagian hasil Anda. 13. Tuangkan isi tabung 4 di wastafel dan membaca absorbansi tabung 3, 2 dan 1. Catat mereka di bagian hasil. 14. Remeasure absorbansi Anda BPB dicairkan. 15. Memiliki T.A. memeriksa data Anda. 16. Buatlah grafik absorbansi vs konsentrasi biru bromphenol (Anda dapat melakukan hal ini luar lab.) 17. Mendapatkan sampel biru bromphenol konsentrasi tidak diketahui. 18. Baca absorbansi pada Amax dan merekamnya di bagian hasil dari notebook Anda. 19. Berdasarkan data pada Tabel 2, menghitung kepunahan koefisien biru bromphenol dan menentukan konsentrasi biru bromphenol dalam sampel tidak diketahui Anda (juga di luar lab). 20. Kembali BPB tabung saham Anda ke iunstructors Anda 21. Ketika Anda selesai, tuangkan pewarna dilusi ke dalam bak cuci, bilas keluar cuvettes dan testubes dengan air keran diikuti dengan air suling dan menempatkan mereka terbalik sampai kering. Hasil Membuat dan melengkapi item berikut dalam latihan notebook Anda laboratorium: TABEL 1. Catat nilai absorbansi untuk panjang gelombang Anda ditugaskan untuk biru bromphenol. Panjang gelombang (nm) Absorbance Ketika membuat grafik, mengingat variabel independen (hal yang Anda berubah, panjang gelombang dalam kasus ini) berlangsung pada sumbu X dan variabel terikat (hal yang Anda mengukur, absorbansi pada

kasus ini) berlangsung pada sumbu-Y. Anda dapat melakukan grafik Anda dengan tangan pada grafik, tetapi pastikan untuk menggunakan seluruh halaman. grafik yang besar lebih akurat karena mereka lebih mudah untuk dibaca. Pastikan untuk label kapak Anda dan memberikan Anda sebuah judul grafik. TABEL 2. Penentuan efek pengenceran terhadap absorbansi biru bromphenol. Kumpulkan data Anda dengan mengisi nilai-nilai dalam tabel Tube jumlah Konsentrasi Pengenceran bromphenol biru Abs ______nm Dicairkan 0 18.6 pM 1 1 / 2 9,3 pM 2 1 / 4 3 4

Gambar Spektrofotometer

Sumber : http://www.bramweb.co.cc/download/gambarweb/spektro.gif