Í n d i c e / I n d e x

Comentarios del directorIntroductory remarks

PersonalPersonnel

SeminariosSeminaries

Servicios de apoyo a la InvestigaciónResearch and Support Facilities

Lecciones conmemorativas 1999-2000

Biología celularCell Biology

Biología del desarrolloDevelopmental Biology

Inmunología y virologíaImmunology and virology

NeurobiologíaNeurobiology

Regulación de la expresión génicaRegulation of gene expresion

CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA

2oooMemoria Científica

Scientific Report1999

4

La biología molecular se encuentra

hoy en un momento apasionante. El

acelerado ritmo de adquisición de

conocimientos en las últimas décadas,

junto con la descripción del genoma

humano y de otros organismos, está

abriendo nuevas perspectivas en la

investigación de fenómenos biológicos

complejos, con una gran repercusión

potencial en los campos de la

biomedicina y biotecnología, de amplio

impacto social. El Centro de Biología

Molecular "Severo Ochoa" (CBMSO)

cumple ahora 25 años de andadura, en

los que ha desempeñado una función

pionera en el desarrollo y consolidación

de la biología molecular en nuestro país

y en la formación de nuevas

generaciones de investigadores. Esta

trayectoria, posible gracias al esfuerzo

de su personal científico y técnico y

basada en una entonces novedosa forma

de colaboración entre la Universidad

Autónoma y el CSIC, permite, y también

exige, plantearse unos objetivos

ambiciosos para poder situarnos en la

primera línea de la investigación científica

en los próximos años.

Esta memoria, correspondiente al

bienio 1999-2000, estrena un nuevo

formato y pretende dar a conocer los

principales parámetros de nuestra

actividad científica y las perspectivas de

futuro de nuestro Centro.

Las distintas áreas de investigación

del CBMSO abarcan aspectos básicos

y fundamentales de la biología, en

disciplinas como Biología del Desarrollo,

Virología, Inmunología, Microbiología

Molecular, Biología Celular, Regulación

de la Expresión Génica, Señalización

Celular o Neurobiología. Muchas de

estas investigaciones tienen una clara

orientación biomédica, relacionada con

enfermedades neurodegenerativas,

patogénesis viral y bacteriana, desarrollo

de vacunas, enfermedades metabólicas,

mecanismos de acción de fármacos,

oncogénesis, alteraciones del sistema

cardiovacular, respuesta inmune y

mecanismos patogénicos.

En el bienio 1999-2000, la actividad

de las distintas líneas de investigación

que se detallan en la Memoria ha dado

lugar a más de 350 artículos en revistas

internacionales, con un índice de impacto

medio de 5,9 en el año 2000. En este

mismo año, el número de proyectos de

investigación financiados en nuestro

Centro ha sido de más de 190, de los

que 140 corresponden a entidades

públicas nacionales o regionales, 27 a

proyectos de la Unión Europea y 26 a

convenios y contratos con empresas

farmacéuticas y fundaciones privadas.

Todo ello refleja una notable capacidad

de generación de recursos por parte de

nuestros investigadores. También se

detallan en la Memoria los premios y

distinciones recibidos por distintos

miembros del Centro, que son siempre

motivo de estímulo.

En el CBMSO trabajan en la

actualidad 100 científicos de plantilla del

Consejo Superior de Investigaciones

Científicas o de la Universidad Autónoma

de Madrid, y aproximadamente 125

científicos postdoctorales y 165

predoctorales. Esto da idea de la

capacidad de atracción y de formación

de nuestro Centro (donde se leen más

de 30 tesis doctorales por año), así como

de la necesidad de dispositivos

apropiados para que excelentes jóvenes

investigadores puedan continuar y

afianzar sus trayectorias científicas.

Comentarios del director

5

Es importante recordar la imprescindible y

cada vez más fundamental labor del

Personal de Apoyo a la Investigación (más

de 200 personas). Persiste la necesidad

de mejorar la promoción y aumentar el

número de este colectivo, acorde con las

nuevas exigencias estructurales y

tecnológicas.

Otro objetivo fundamental es la

disponibilidad de servicios científicos e

instalaciones comunes que permitan

abordar los nuevos retos de la investigación

biológica. Durante este periodo se ha

consolidado y reforzado el equipamiento

de los Servicios de Proteómica y de

Microscopía Óptica y Confocal, se ha

creado y dotado una Unidad de

Bioinformática y se ha abordado la reforma

de los laboratorios de cultivos celulares

nivel P-2. Se ha procedido también a la

adquisición de otros equipos comunes,

realizado inversiones relacionadas con

seguridad laboral, así como programado

la reforma del Servicio de Experimentación

Animal. A pesar de las reestructuraciones

realizadas para racionalizar al máximo su

uso, persiste el problema de la falta de

espacio en nuestro Centro, esencial para

la potenciación y el reclutamiento de grupos

de investigación y para la mejora de

nuestros servicios científicos.

Quiero destacar también la importancia

de los seminarios científicos (más de 70

anuales) en la vida y la proyección exterior

del CBMSO. Durante este periodo se han

seguido desarrollando los Programas de

Seminarios "Severo Ochoa" sobre Avances

en Biología Molecular, bajo el patrocinio de

diversas empresas y de la Fundación

Ramón Areces, con la participación de

prestigiosos científicos nacionales y

extranjeros. Se han celebrado también la

6ª y 7ª Lección Conmemorativa en honor

a Severo Ochoa, y se ha instituido la

Lección Conmemorativa "Eladio Viñuela",

en recuerdo de la excepcional personalidad

y trayectoria científica del co-fundador del

CBMSO y pionero de la biología molecular

española, fallecido prematuramente en

Marzo de 1999.

Los seminarios constituyen una parte

integrante de la vocación docente del

CBMSO, desarrollada a través de la

participación de sus profesores

universitarios y de miembros del CSIC en

los primeros ciclos de diversas licenciaturas,

y en el Programa de Doctorado del

Departamento de Biología Molecular, así

como en el Master de Biotecnología. En el

CBMSO también tiene lugar la formación

de personal técnico altamente capacitado

en la Escuela Taller de técnicos de

laboratorio, en colaboración con el INEM

a través de la Fundación Severo Ochoa,

así como un programa de visitas para

alumnos de enseñanza secundaria.

Con vistas al futuro, el CBMSO debe

plantearse objetivos ambiciosos, que le

permitan estar en la vanguardia de la

investigación en biología molecular,

biomedicina y biotecnología en el ámbito

nacional e internacional. Para ello, se está

impulsando la construcción de una nueva

sede del CBMSO en el campus de

Cantoblanco, y en el contexto del Parque

Científico de Madrid, que esperamos pueda

iniciarse en breve, con el apoyo de la UAM

y el CSIC. Esta nueva sede, y su nuevo

diseño organizativo, permitirá la

potenciación e incorporación de grupos de

investigación de calidad y facilitará el

desarrollo de programas multidisciplinares

que sumen capacidades metodológicas y

conceptuales, así como la renovación y

creación de servicios científicos, en

coordinación con otros existentes en el

campus y los que se planifiquen en el

Parque Científico. También es deseable

potenciar las interfases con empresas

farmacéuticas y biotecnológicas, sin

renunciar a la vocación fundamental de

investigación básica, que es esencial para

el progreso científico a largo plazo. Para

este proyecto estamos seguros de contar

con el concurso de las autoridades de la

UAM, del CSIC, del Parque Científico, de

la Comunidad de Madrid y del Ministerio

de Ciencia y Tecnología.

Quiero agradecer también

especialmente, una vez más, el esencial

apoyo de la Fundación Ramón Areces a

través de la ayuda institucional a nuestro

Centro, ejemplo de su compromiso con el

apoyo a la ciencia en nuestro país. A todas

las instituciones y empresas que nos han

apoyado, también nuestro reconocimiento.

En los próximos años se van a producir

avances extraordinarios en los campos de

la genómica y la proteómica funcional, en

el conocimiento de la función y la interacción

de genes, de los circuitos de control de la

expresión génica, de los mecanismos

patogénicos, todo ello con enorme

repercusión previsible para nuevas

estrategias diagnósticas y terapéuticas.

Estoy persuadido de que, con su bagaje

histórico y su realidad actual y, sobre todo,

con el esfuerzo y la calidad de sus

científicos, el CBMSO podrá contribuir a

estos avances del conocimiento en

beneficio de la sociedad.

Federico Mayor Menéndez

Director

6

The field of molecular biology

is at a very exciting moment. The

rapid pace of knowledge acquisition

in the last decades, together with

the sequencing of the human

genome and that of other

organisms is opening new

perspectives in the research of

complex biological phenomena.

This has major potential

repercussions for the fields of

biomedicine and biotechnology,

with widespread social impact. The

Centro de Biología Molecular

“Severo Ochoa” (CBMSO) is now

in its 25th year of operation, during

which time it has played a

pioneering role in the development

and consolidation of molecular

biology in this country and in

educating new generations of

researchers. This course of

development, possible thanks to

the efforts of its scientific and

technical staff and based on what

was then an innovative

collaboration between the

Universidad Autónoma de Madrid

(UAM) and the Council for Scientific

Research (CSIC) permits us to,

and demands that, we set

ambitious goals in order to position

ourselves at the leading edge of

scientific research in the coming

years.

This report, which corresponds

to the two-year period 1999-2000,

presents a new format and seeks

to summarize the principle

parameters of our scientific activity

and the future prospects of our

Center.

The different areas of research

of the CBMSO cover the basic and

fundamental aspects of biology in

fields such as developmental

biology, virology, immunology,

molecular microbiology, cellular

biology, regulation of gene

expression, cell signaling and

neurobiology. Much of this research

has a clear biomedical focus,

related to neurodegenerative

diseases, viral and bacterial

pathogenesis, vaccine

development, metabolic diseases,

drug action mechanisms,

oncogenesis, cardiovascular

system disorders, immune

response, or pathogenic

mechanisms.

In the period 1999-2000,

activity in the different lines of

research detailed in this Report

has generated more than 350

articles in international journals,

with an average impact factor of

5.9 for 2000. In the same year,

more than 190 research projects

were funded in our Center, 140 of

these corresponding to national or

regional public entities, 27 to

European Union projects and 26

to agreements and contracts with

pharmaceutical companies and

private foundations. This Report

also details the awards and

distinctions received by the

members of our Center, which are

always a source of encouragement.

One hundred scientists who

are staff members either of the

CSIC or of the Universidad

Autónoma currently work at the

CBMSO, as well as approximately

125 postdoctoral and 165

predoctoral scientists. This gives

an idea of the Center's ability to

attract and to educate young

researchers (more than 30 doctoral

theses are defended each year),

and also stresses the need for

proper mechanisms and resources

to enable excellent young scientists

to continue and strengthen their

careers. It is important to remind

the essential and increasingly

fundamental work of the technical

staff (more than 200 people). The

need persists to further promote

and increase this personnel

according to the new structural and

technological demands.

Another of our primary goals

is the availability of scientific

services and shared facilities that

allows us take on the new

challenges of biological research.

During this period, the equipment

of the Proteomics and Optical and

Confocal Microscopy Services has

been consolidated and enhanced,

a Bioinformatics Unit has been

created, and renovation of the level

P-2 cell culture laboratories has

been performed. In addition, we

have acquired other shared

equipment, made investments

related to occupational safety and

have planned the reform of the

Animal Experimentation Service.

However, lack of space continues

to be a problem at the Center

despite the reorganization done to

maximize its use; space availability

is key to promoting and recruiting

research groups and to improving

our scientific services.

I would also like to point out

the importance of the scientific

seminars (more than 70 each year)

in the life and external perception

Introductory Remarks

7

of the CBMSO. During this period, “Severo

Ochoa” Seminar Programs on Advances in

Molecular Biology have been developed

under the sponsorship of various companies

and the Ramón Areces Foundation, with the

participation of prestigious national and

foreign scientists. The 6th and 7th Annual

Commemorative Lectures have also been

held in honor of Severo Ochoa, and the

“Eladio Viñuela” Commemorative Lecture

has also been instituted in memory of the

exceptional personality and scientific career

of this CBMSO co-founder and pioneer of

molecular biology in Spain, whose untimely

death occurred in March of 1999.

The seminars are also an integral part

of the CBMSO's educational vocation,

developed through the participation of its

university professors and CSIC members in

numerous pregraduate courses, in the

Molecular Biology Department's PhD

program and in the Masters in Biotechnology.

Highly skilled technical staff is also trained

at the CBMSO in the Laboratory Technicians

Training Workshop, in collaboration with the

INEM (National Employment Institute)

through the Severo Ochoa Foundation.

Finally, we have a visitation program for

secondary school students.

With an eye to the future, the CBMSO

must set ambitious goals to be at the forefront

of research in molecular biology, biomedicine

and biotechnology both at the national and

international levels. In this regard, the

construction of a new building for our Center

is being promoted in the context of Madrid's

Scientific Park, which we hope will start

shortly with the support of the UAM and the

CSIC. The new building and its new

organizational design will allow us to

strengthen and incorporate quality research

groups, and will facilitate the development

of multidisciplinary programs that add up

methodological and conceptual capacities,

as well as the renovation and creation of

scientific services in conjunction with others

existing on campus and those planned in

the Scientific Park. Strengthening interactions

with pharmaceutical and biotechnology

companies is also desirable, though always

bearing in mind our basic research

commitment, essential to long-term scientific

progress. For this project, we trust we will

have the support of authorities from the

UAM, CSIC, the Scientific Park, the Madrid

Regional Government and the Ministry of

Science and Technology.

I want to give special thanks once again

to the Ramón Areces Foundation for its key

support, by way of the institutional grant to

our Center, an example of its commitment

to supporting science in this country. I would

also like to recognize all of the other

institutions and companies that have

assisted us.

In the coming years, extraordinary

advances will be made in the fields of

functional genomics and proteomics, in

knowledge of gene function and interaction,

networks of regulation of gene expression

and of pathogenic mechanisms, all of which

have enormous foreseeable repercussions

on new diagnostic and therapeutic strategies.

I am convinced that, with its background

and current reality, and with the efforts and

quality of its scientists, the CBMSO will

contribute to these advances in knowledge

in the benefit of society.

Federico Mayor Jr.

Director

8

PersonalPersonnel

B) Personal Cientifico/ Scientific Staff

CONSEJO SUPERIOR DEINVESTIGACIONES CIENTÍFICAS (CSIC)PROFESORES DE INVESTIGACIÓN /RESEARCH PROFESSORS

Alonso Bedate, CarlosAvila de Grado, JesúsDomingo Soláns, EstebanGarcía Ballesta, Juan PedroGarcía-Bellido y Gª de Diego, AntonioJimenez Martínez, AntonioLópez de Castro, José AntonioModolell Mainou, JuanMorata Pérez, GinésMoscat Guillén, JorgePalacián Gil, EnriqueRamírez Ortiz, GaloRipoll Quintas, Pedro M.Salas Falgueras, MargaritaVicente-Sandoval Rodríguez, IgnacioViñuela Diaz, Eladio

INVESTIGADORES CIENTIFICOS /RESEARCH SCIENTISTS

Alarcón Sánchez, BalbinoAlonso Lebrero, Miguel AngelBlanco Dávila, LuisGuerrero Vega, IsabelGutiérrez Armenta, CrisantoHaro Castella, César Jesús deJiménez González-Anleo, FernandoNieto López, AntonioPedro Montalbán, Miguel Angel deSalas Falgueras, JoséSalas Falgueras, María LuisaSánchez-Herrero Arbide, ErnestoSobrino Castello, FranciscoToribio García, Maria Luisa

CIENTIFICOS TITULARES / TENUREDSCIENTISTS

Ayala Serrano, Juan AlfonsoBusturia Jimeno, Ana MaríaCampuzano Corrales, SonsolesCastrillo Díez, José LuisCelis Ibeas, José Felix deDíaz-Meco Conde, Mª TeresaEscarmís Homs, CristinaJiménez Díaz-Benjumea, FernandoLópez Carrascosa, Angel L.Lucas Lozano, José JavierMartínez Salas, EncarnaciónMenéndez Arias, LuisPulido Vega, DiegoRedondo Moya, Juan MiguelRodríguez Marcos, Miguel A.Ruiz Gómez, MarTalavera Díaz, AntonioVasa Pinedo, Jasús A.Vázquez Cobos, JesúsVillasante Atienza, AlfredoWandosell Jurado, Francisco

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID(UAM)CATEDRÁTICOS / PROFESSORS

Amils Pibernat Ricardo

CENTRO DE BIOLOGIA MOLECULAR"SEVERO OCHOA"·

A) Direccion /Management Board

Director / Director

Federico Mayor Menéndez

Vicedirector / Vicedirector

César de Haro Castella

Director del Instituto de BiologíaMolecular del CSIC / Director of theInstituto de Biología Molecular CSIC

Jorge Moscat Guillén

Director del Instituto de BiologíaMolecular de la UAM / Director of theInstituto de Biología Molecular UAM

Cecilio Giménez Martín

Gerente / Administrative Director

Salvador Fortes Alba

Oficina de Dirección / Secretary to theDirector

Rosario Martín Rodríguez

9

Carrasco Llamas LuisCuezva Marcos José ManuelFresno Escudero ManuelGiménez Martín, CecilioHermoso Nuñez, José MiguelMayor Menéndez, FedericoMayor Zaragoza, FedericoMoreno Muñoz, FranciscoSatrústegui Gil-Delgado, JorginaUgarte Pérez, MagdalenaValdivieso Amate, Fernando

PROFESORES TITULARES /ASSOCIATED PROFESSORS

Abad Lorenzo, José PascualAlmendral del Río, José MªAragón Rueda, CarmenArmas Portela, RosarioBerenguer Carlos, JoséBogónez Pelaez, ElenaCarrascosa Baeza, Jose MªCatalán Tobar, EdgardoCorreas Hornero, IsabelDíaz Nido, JavierDíez-Guerra, Fco. JavierFernández Lobato, MaríaFernández Santarén, JuanGarcía Mateu, MauricioGarcía Ruiz, PredestinaciónHernández Sánchez, FranciscoIzquierdo Rojo, MartaJiménez Martínez, Juan SalvadorLópez Corcuera, BeatrizManso Martinez, RafaelMarín Palma, IrmaMartínez Serrano, AlbertoMontejo de Garcini Guedas, EstebanRemacha Moreno, MiguelRequena Rolania, José MªSantamaría Pérez, FranciscoSanz Martín, José LuisSierra Pérez, José ManuelZafra Gómez, Francisco

PERSONAL CIENTIFICOCONTRATADO

PROFESORES ASOCIADOS UAM

Bonay Miarons, PedroFeduchi Canosa, ElenaGarcía del Portillo, FranciscoHernández Pérez, FélixLiras Martín, AntonioLópez Guerrero, José AntonioRodríguez Pombo, PilarRuiz Gómez, Ana

PROFESORES AYUDANTES UAM

Abad Martínez, María JoséBenítez Moreno, María JoséIzquierdo Juárez, José MaríaPérez González, BelénRuiz Desviat, Lourdes

PERSONAL CONTRATADO CONGRADO DE DOCTOR

Aireksinen, AnteroAlvarez Domínguez, Mª del CarmenAragay Combas, AnaAroca Tejedor, PilarAzpiazu Torres, NataliaBenítez Moreno, María JoséBravo García, AliciaBullido Gómez de las Heras, Mª JesúsCamacho Pedrero, Ana

Carrasco Marín, EugenioDomínguez López, OrlandoDopazo González, AnaGarcía Alonso, LuisGarcía del Portillo, FranciscoGarcía Muñoz, Mª JoséGironés Pujol, NuriaGómez del Arco, PabloGómez Skarmeta, José LuisGonzález Crespo, SergioGuinea López, RosarioHernández Pérez, FélixIñiguez Peña, Miguel AngelLafuente Monasterio, Mª JoséLalioti, VassilikiMagali, SuzanneMarín Alberdi, DoloresMacias Noves, Ana MaríaMartín Blanco, EnriqueMendieta Gómez, JesúsMerinero Cortés, BegoñaMoreno Flores, Mª TeresaPérez Cerdá, CeliaPérez Martín, José ManuelRamón Cueto, AlmudenaRivas Nuñez, CatalinaRodríguez Márquez, AntonioRodríguez Martínez, Javier MªRojo Gozalo, SusanaRomaní Paez, SusanaRubio Rodríguez, Mari PazRuiz Sala, PedroSaiz Zalabardo, MargaritaSánchez García, MarinaSantos Tejedor, CruzSanz Alonso, LauraSchamel, WolfgangSoto Alvarez, ManuelVila del Castillo, VictoriaZamarro Molina, María Teresa

BECARIOS POSTDOCTORALES /POSTDOCTORAL FELLOWS

Abril Gallego, Ana MaríaAgudo Barriuso, MartaAguilera Bazán, AngelesAldudo Soto, JesúsAlejo Herberg, AliAndrés Hernández, GermánAngulo Barturén, IñigoArco Martínez, Araceli delArmesilla Arpa, AngelArtiga González, Mª JesúsAvalos Redón, IvonneAvila Flores, JuanaBaonza Cuenca, AntonioBaranowski, EricBarco Guerrero, AngelBerlanga Chiquero, Juan JoséBezombes, ChristineBoniotti, Mª BeatriceBonnin Bioslada, AnaBorroto Revuelta, Aldo JorgeBoskovic, JasminkaBuckwold, Victor E.Cano López, EvaCárcer Díez, Guillermo deCarmena de la Cruz, AnaCarrillo Rosales, GracielaCasares Fernández, FernandoCavodeassi Madarro, FlorenciaCebrián Baux, AnaCortés Peña, Mª LuisaCrucitti, PaolaCulí Espigol, JoaquinDi Liegro, Carlo M.Dufour, EmmanuelDurán Cascales, ConsueloEisenbrandt, Ralf

Espinosa Martín, Juan CarlosExtavour, CassandraFernández Fúnez, PedroFernández Malavé, EdgarFründt, CorinneGalindo Barreales, InmaculadaGarcía Escudero, RamónGarcía García, María JesúsGarcía García, Miguel AngelGarcía Palomero, Mª.EstherGarcía Peydró, MarinaGeerling, ArjanGiovinazzo, GiovannaGómez Gómez, FelipeGómez Lorenzo, María GraciaGonzález Muñoz, Víctor ManuelGonzález San Martín, EstherGoñi Laguardia, OscarGorfinkiel Hain, NicoleGuarinos Viñols, EstherGuerra Garcia, SusanaGutierrez Rivas, MónicaHaro Castuera, AmparoHernández Ramirez, GrecoHernández, GabrielaHurtado Martínez, AliciaIbarrola Andrés, NievesIllana Calero, Mª BelénIrurzun Ipiéns, AliciaJiménez Mateo, OscarKirchhoff, TomasKives Ostronoff, LucianaKrebs, StefanLafuente Duarte, EstherLallena Jimeno, Mª JoséLamas López, José RamónLim, FilipLombardia Uria, ManuelLópez de Quinto, SoniaLuque González, Carlos ManuelLuque, AlejandroLlorca Blanco, Oscar AntonioMadrid Pérez, OlgaMaroto López, BeatrizMartí Ripoll, MercéMartín García, VerónicaMartín Gordillo, FernandoMartínez Arca, SoniaMartínez Martínez, SaraMartínez Moya, MarinaMartínez Romero, NataliaMás López, AntonioMata Vicente, María TeresaMeijer, WilfriedMilán Kalbfleisch, MarcoMillán Martínez, JaimeMissich, RicardoMolina Balsa, IsabelMorales Kucharski, GraciaMoratilla Martínez, MartaMorato López, EsperanzaMoreno Arribas, Mª VictoriaMoreno Lampaya, EduardoMullor Sanjosé, José LuisMuro Galindo, SilviaNuñez Garrote, José IgnacioNusspaumer, GretelObregón González, EvaOliveros Herrero, MarianoPanzera Crespo, YaninaParadela Elizalde, AlbertoPenela Márquez, PetronilaPérez Alvarez, Mª JoséPérez Martínez, Mª del MarPozo Benito, Juan Carlos delPrada Delgado, AmayaPucciarelli Morrone, Maria GracielaRamos Gómez, MilagrosRecuero Vicente, MaríaResino García, Salvador

Ricart Engel, JavierRieckhof, GabrielleRiffo Duarte, MartaRodríguez Gabriel, Miguel AngelRodríguez López, Clara IsabelRodríguez Ramiro, AlmudenaRodríguez Sánchez, PalomaRojo Carrascosa, Mª GemaRubio Olmos, Miguel AngelSabariegos Jareño, RosarioSánchez Gómez, PilarSánchez Orzaez, Mª EmmaSan José Martínez, EstherSaniger Bernal, LuisaSan José Martínez, EstherSantoyo López, JavierSanz Burgos, Andrés PelayoSanz Martínez, EloisaSaturno de la Villa, JavierSaugar Gómez, IreneSayas Casanova, Carmen LauraSotillos Martín, Mª del SolSpeicher, Stephan AndreasTejero Díez, PedroTrougakos, IoanisTruniger, VerónicaUgalde Bilbao, CristinaVega José, Miguel deVentoso Bande, Iván JoséVila del Castillo, VictoriaVilla Díaz, AnaYagüe Gallardo, JesúsYuste Herranz, Eloisa

BECARIOS PREDOCTORALES /GRADUATE STUDENTS

Aguilera, Alfonso AlexanderAlcaide Alonso, PilarAldaz Casanova, SilviaAlexander Aguilera, AlfonsoAlonso Arias, RebecaAlonso Martínez, MaríaAlvarado, MiltonAlvarez Losada, SusanaAlvarez Nieto, GemaAranda Gómez, Juan FranciscoArias Esteban, ArmandoArmando Arias, EstebanArrasate Iragui, MontserratBaena López, Luis AlbertoBassy Alvarez, OlgaBatista Barcón, AliciaBejarano León, FernandoBigeriego Lafarga, PalomaBlanco Fuentes, RaquelBobadilla Casado, María JesúsBoceta Rodríguez, CarolinaBriones Llorente, CarlosBueno López, CarlosBurgos Le León, OliviaBurgos Muñoz, Javier SantosCalandria Pérez, CarlosCalles Arenales, BelénCarmona Delgado, T.A.Carmona, PedroCaro Azoy, EddyCarreira Moreno, AuraCases González, Clara ElisaCastán García, PabloCastellano Moreno, Mª del MarCastro Reguera, MargaritaCavero Martínez, SantiagoCerrato Blázquez, FranciscoCosta, KatyssullaCuesta Martínez, AngelCulubret Worms, Elayne NataliaChattopadhyay, SharmilaChichón García, Francisco JavierChirinos Espín, Mayel

10

Delgado Cañaveras, Mª del PilarDi Couza, JoséDíaz Gallardo, Martha YadiraDíaz González, Keybell M.Díaz Portuondo, EmilianoDíez Camacho, BelénDíez del Corral Baubry, RuthDimitrijevic, AnaDon Garrá, Silvana SaraDuque Muñoz, JavierDurán Molina, Mª.AngelesDussán Garzón, JennyEcay Crespo, Mª. JesúsElorza Moreno, AnaEpifano García, CarolinaEscudero Cuadrado, Luis MaríaEstella Sagrado, CarlosEstévez Fernández, RodolfoFelipe Fernández, Pablo deFernández Miragal, OlgaFerreras Diale, JuliánFonseca González, DamiánFont Rodríguez, Luis MiguelForcada Atienza, IvánFornes Chaves, AmparoFrames Bonilla, NuriaFrutos de Diego, SoniaFuentes Sánchez, LauraGámez Abascal, AlejandraGarcía Arriaza, Juan FranciscoGarcía Briones, MercedesGarcía Copín, SergioGarcía de Yébenes Mena, VirginiaGarcía Escudero, VegaGarcía Lievana, JobGarcía Marcos, AlbertoGarcía Martín, AngelGarcía Martínez, FernandoGarcía Muñoz, FernandoGarcía Simón, Mª IsabelGargiulo, LauraGascón Escobar, IreneGil Pagés, DianaGincel, Andrew W.Gómez Abascal, AlejandraGómez Martín, SilviaGómez Ramos, AlbertoGómez Vicente, VioletaGonzález Alonso, BeatrizGonzález Billault, ChristianGonzález Guerrero, ManuelGonzález Huici, VictorGonzález Partida, ElenaGonzález Santamaría, PatriciaGonzález Toril, ElenaGrado Sanz, Myriam deGrau Simón, RaquelHernando Martín, TeresaHernando Monge, EvaHernando Sebastián, RaquelHerranz Muñoz, HectorHerrero de Vega, SaturninoHerreros González, EstherHorcajadas Almansa, José AntonioIborra Martín, SalvadorIzcue Castellvi, Ana MaríaJhonstone España, CarolinaJiménez de Lucas, IsabelJiménez Sainz, Mª Carmenla Hoya Mantecón, Miguel deLara Arnaud, BeatrizLara Cabrero, AnaLarreta López, RuthLatorre Muñoz, EduardoLetizia, AnnalisaLópez Archilla, Ana IsabelLópez Bueno, AlbertoLópez de Heredia Alonso, MiguelLorenzo Alvarez, ElisaLorio García, Gretchen

Lospitao, EvaLozano Castro, JoséLucca Osorio, Marisel deLuz Ureña, MónicaMachado Rodríguez, GloriaMaldonado, JanetMarcilla Goldaracena, MiguelMarco Recuenco, Mª Carmen deMariggio, StefaniaMarín Palma, EnriqueMartín Aparicio, Mª EsterMartín Belmonte, FernandoMartín Castro, FranciscoMartín Cofreces, NoaMartín Manso, GemaMartín Ruíz-Jarabo, CarmenMartínez Maza, RodrigoMateo Fernández, RobertoMinguet García, SusanaMittelberunn Herrero, MaríaMiranda González, MarioMolina Polo, Nicolás SegundoMonjas Serrano, AliciaMonje Moreno, José ManuelMonjo Sacristán, AnaMonsalve Pérez, MaríaMontserrat, VerónicaMorales Aragones, PatriciaMorena de la Fuente, DianaMoreno Albiger, RenataMoustafa, MalkiMuñoz Montaño, Juan RamónNavarro Galve, BeatrizNavarro Lobato, Mª de las NievesNavas Fernández, Luis Fernando deNavascués Melero, Joaquín deNegredo Madrigal, PilarObeso Domingo, DavidOlazabal Olarrega, IsabelOña Blanco, Ana MaríaPalacios Lidón, SilviaParada Valdecantos, Pilar A.Pariente Peñamaría, NoniaParody de la Fuente, NuriaParrales Mena, AuxiliadoraPastor Montero, JavierPastor Pareja, José CarlosPerales Viejo, CeliaPeregrín Pedrique, SandraPérez Fernández, CoraliaPérez Fernández, JorgePérez Ferreiro, Carmen MaríaPérez González, AliciaPey Rodríguez, Angel LuisPomar Ballestero, NataliaPonce Moreno, JuliaPoyatos Belio, IrenePozueta Larios, JulioPrados Pinto, BelénPuertollano Moro, RosaPunzón Galvez, CarmenQuesada Navidad, Antonio JesúsQui, DeyiQuijada Arteaga, LuisRamírez Moreno, CarlosRamírez Parra, ElenaRamos Alvarez Buylla, ManuelRamos Martín, Mª del CarmenRico Errazquin, Ana IsabelRichard Rodríguez, Eva MaríaRivera Gorrín, HenryRodríguez Carrasco, YolandaRodríguez Gómez, Mª. JosefaRodríguez González, NuriaRodríguez Torres, AngelinaRojas Ojeda, PatriciaRomero Prado, MarinaRubio Gallego, Francisco JavierRuiz Gallego, FranciscaRuiz Pérez, José

Salero Coca, Enrique LuisSan Antonio de Felipe, BelénSánchez González, HumbertoSánchez Martínez, BlancaSánchez Muñoz, SilviaSánchez Ramón, SilviaSánchez-Valdepeñas, Carmen MªSantamaría Nuñez, GemaSanz Muñoz, RosarioSarnago Cebada, SusanaSasla Dongarrá, SilvinaSerna Rico, AlejandroSerrano Carballal, ElenaSerrano de las Heras, GemmaSerrano, Miguel AngelSesma Aguirre, LauraSierra Aragón, SaletaSilles Mc Caney, EduardoSimón Sanz, DianaSobrado de Vicente-Tutor, AntonioSolorzano Blanco, KarlaTiemblo Olmo, MercedesTrigueros Fernández, CésarTrinidad, LoreleValdueza Beneitez, JulioValle Benitez, NoeliaVega Moreno, Francisco ManuelVenero Núñez, CésarVergara Jáuregui, SilviaVila del Sol, VirginiaVilla Cuesta, María EugeniaYus Nájera, EvaZafra Amorós, OlgaZúñiga Lucas, Sonia

C) Personal deapoyo a laInvestigación /Technical Assistance

EN PLANTILLA

Alcalde García, JoséAlonso Barba, CarmenArenas Martínez, SantiagoBarat Cascante, AnaBustos Sánchez, Mª JoséCalleja Requena, ManuelChamorro Bello, MargaritaChorro y de Villa-Ceballos, Mª de losAngeles deDávila Cerrato, Mª MercedesFernández Moyano, Mª CarmenFuertes Villadangos, Miguel A.García García, CarlosGarcía Mira, José LuisGonzález Herrera, Rosa MaríaHermoso Crispín, CarmenHernández Baeza, María del RosarioHernando Bellido, AlmudenaLázaro Bolos, José MªLópez Varea, AnaMartín Fernández, Mª PalomaMartín Redondo, Mª AsunciónMora-Gil Cobo, Mª VictoriaNogal Paris, María LuisaNuñez Balbuena, EnriqueRevilla Novella, YolandaRodríguez Enriquez, IsabelRosa López, Juliana deSánchez Moreno, AntonioSanz Fernández, Miguel AngelSastre Merlín, Isabel

Sesé Cobos, BárbaraVillar García, Laurentino

CONTRATADOS/BECASTÉCNICOS

Alva Rabanal,JuanAlvarez Pérez, IgnacioAvila Flores, SilviaBaars, SigridBermejo Jiménez, CarolinaCabornero Catalá, Ana IsabelCaminero Jiménez, EvaCampos Trujillo, RamónCampillos González, MónicaCantarero Mateo, AngélicaCerrato Gómez, AntoniaCuadros Catalán, RaquelCubelos Alvarez, BeatrizDe la Calle Mustienes, ElisaEstrada Martín, BeatrizFerrés Marco, Mª DoloresFuertes Yebra, EstherGangoiti Medina, Jon AnderGarcía García, EstherGarcía Peydró, MarinaGarriga Fuentes, CésarGómez Buendía, TeresaGómez López, GonzaloGómez Mariano, GemaGutiérrez Aranda, JuliaIbáñez Pérez, CarmenLópez Abengózar, PalomaMartín Bermejo, María JesúsMartínez Ariza, AntonioMartínez Villarraso, AngelesNavarrete López de Soria, Rosa MªOrtega Pérez, InmaculadaPablos Pérez, Beatriz deParrón Muñoz, AngelaRanera González, BeatrizReina Alba, IsabelResino de Castro, JaimeRodríguez Benito, María JoséSaiz Delgado, Eva MaríaSánchez de la Chica, AscensiónSanz Rebollo, PalomaTorroja Fungairiño, Carlos

D) DepartamentoTécnico/TechnicalDepartment

GERENTE /ADMINISTRATIVEDIRECTOR:

Fortes Alba, Salvador

ADMINISTRACION /ADMINISTRATIONJefe/Head:

García Martín-Delgado, Jaime

Barroso López, RocioBelda San Mateo, EloyBerciano Ledesma, JuanDel Castillo Tamayo, MilagrosEscribano Sánchez, GloriaGarcía Arias, RamónMartínez Resa, Mª TeresaPallarés Vargas, ReginaPorto Alonso, Aurora

11

Rueda Cubero, EstebanVillar Pérez, Belen

ANIMALARIO / ANIMAL FACILITYJefe/Head:

Palacín Urquijo, Javier

Bordallo Martín-Fontecha, Miguel A.Campos Ramos, EmiliaCarrión Herrero, Fco. JavierCobeña Chivato, Miguel A.Cristóbal Cuartero, CristinaDíaz Rodilla, DiegoDoria Fiol, DoloresGarcía Martínez, VerónicaGonzález Moreno, Mª del CarmenMoreno Calle, AngelMuñoz Fuentes, Jaime AlbertoPedraza Fernández, ConradoQuintana Fernández, Juan AntonioRosco Pulido, PilarSalgado Muñoz, HugoSerrano Sánchez, Javier

BIBLIOTECA / LIBRARYJefe/Head:Gutiérrez García, Rosario

Sanz Frías, Angeles

COMPRAS Y ALMACEN /PURCHASE DEPARTMENTJefe/Head:Blanco Martín, José Luis

Celestén Martín, José MiguelCorral Díaz, MargaritaFernández Martín, Mª JoséHernández Sánchez, LorenzoMadrid del Alamo, RemediosPedraza Caro, TeodoroPedraza Fernández, Teodoro

CULTIVOS CELULARES / CELLCULTURE

Alonso Hernández, PilarBustos Sánchez, JuanaGutierrez García, AlfonsoRebelles Vicente, Juan Antonio

DISEÑO / DESIGN

Aganzo Mateo, PedroGalán González, José MaríaZazo Chapinal, Antonio

FERMENTACIÓN /FERMENTATION

Ureña Rodríguez, Dionisio

FOTOGRAFÍA / PHOTOGRAPHYJEFE/HEAD:Bautista Torres, Mariano

Belio López, Jose IgnacioPérez Gracia, José Antonio

INSTRUMENTACION /INSTRUMENTS AND EQUIPMENTJefe/Head:Seguido de la Fuente, Lorenzo

Calvo Romero, Manuel

González Galán, JesúsGonzález García, JulioGutiérrez de la Cruz, FranciscoMejías Pozuelo, José LuisMontesinos Salmerón, JoséMuñoz Maqueda, FernandoPozuelo Torrijos, Jesús

LAVADO Y ESTERILIZACION /WASHING AND STERILIZATION

Blanco Ferreras, Mª AngelesBlanco Ferreras, ValentinaCarrascal Blanco, IsabelCobeña Chivato, ConcepciónEscribano Molina, JosefinaGil Pinto, AfricaMartín Bermejo, María Nieves

MANTENIMIENTO /MAINTENANCEJEFE/HEAD:Muñoz Díez, José Antonio

Cordón Polanco, Pedro PabloFernández Arias, AlfonsoFernández Sanz, FranciscoGarcía Alarcón, Juan LuisGonzález Díaz, MiguelHernández González, JavierMartín Izquierdo, TomásMartos Valladares, CésarMontero Mínguez, EmilioRomero Celada, Juan MiguelZúñiga Parra, Ceferino

MICROSCOPIA ELECTRONICA/ELECTRON MICROSCOPYJefe/Head:Rejas Marco, Mª Teresa

Guerra Rodríguez, MilagrosOcaña Romero, Francisca

MICROSCOPIA OPTICA YCONFOCAL / OPTICAL ANDCONFOCAL MICROSCOPYJefe/Head:Díez Guerra, Javier

Sánchez Martín, Carlos

INFORMATICA / INFORMATICSJefe/Head:Pemau Alonso, Pedro

Bodas Gómez, OscarSantos Martín, Tomás

QUIMICA DE PROTEINAS /PROTEIN CHEMISTRYJefe/Head:Vázquez Cobos, Jesús

Barahona Nieto, FernandoGonzález-Nicolás Garrido, JosefaMarina Ramírez, Ana IsabelOgueta Villarreal, SamuelRogado Manzanares, Rosana

RECEPCION / RECEPTION

Cabrerizo Las Heras, LuisGil Marinas, Mª JesúsRamiro Sánchez, Juan

SECRETARIAS / SECRETARIES

Dirección / Management BoardMorales Pájaro, Adelaida

Gerencia / Administrative DirectorCondes Cano, AntoniaLlaguno Pérez, Reyes

General / PoolHorrillo Muñoz, LucíaNavarro Martínez, Carmen

SECUENCIACION DE DNA / DNASEQUENCINGJefe/Head:Modolell Mainou, Juan

Gutiérrez Luque, RuthMadueño Amor, Encarna

SEGURIDAD BIOLOGICA /BIOLOGICAL SAFETYJefe/Head:Sánchez Sánchez, Angeles

Arribas Arcones, MarisolAsperilla Cabrera, Ana MªCaparrós de la Jara, GemaNúñez Herrero, PilarRodríguez Fernández, ElenaValleros Muñoz, Sara

VIGILANCIA / SECURITY

Barajas Marín, ManuelDelgado Rodríguez, Juan AntonioGarcía García, FranciscoHidalgo Checa, FranciscoMirasol Burgos, Francisco de BorjaTirado Morón, Antonio

E) ProgramaCSIC/INEM1999Benito López, Mª. RosaCristóbal Cuartero, CristinaDíaz Rodríguez, BelénEscribano Sánchez, GloriaFernández Piñas, José VenturaFuentes González, MarioGarcía Pérez, RaquelGiménez Llorente, PabloGonzález Colilla, ConcepciónHerranz Carcedo, SoniaHerrero Herrera, Francisco JavierJadraque Jiménez, MaríaLeón Fernández, GabrielaLópez de la Fuente, SusanaLlorente Benedicto, Mª del CarmenMartín Maroto, FernandoNevado Carretero, IreneRedondo Bastante, Pilar

2000Aguilar Palma, ElviaAlonso Orcajo, Begoña

Calamonte Sánchez, AraceliCobeña Chivato, ConcepciónFernández González, RaúlGodoy Luján, RaulGómez Carames, RaquelGómez González, NuriaHevia Hernández, ElenaJiménez Suarez, NoeliaManso Gavilán, IsabelMartín Montero, RobertoMurillo Polle, SusanaParrondo Vélez, CarlosPlaza Diago, LoretoRubio Candelas, IsabelSánchez Ramos, MontserratSánchez Santos, Miguel AngelSanz González, MaríaSoto-Largo Dimitrieff, Santiago

F) SegundaEscuela Taller"Severo Ochoa" deTécnicos deLaboratorio /Second Workshop"Severo Ochoa" forLaboratoryTechnicians

Profesores / Teachers

Zapata Navarro, AuxiliadoraValle Sanz, Mercedes delGutiérrez Erlandsson, SylviaRamos Ruiz, Ricardo

Secretaria / Secretary

Herrador Morales, Mercedes

Alumnos / Students

Alvaro Sánchez, SandraAyuso Moreno, Mª. LuisaCalle Carnicero, AlbertoCano Cabezas, EmilioCasla García, MartaCazorla Plaza, MaríaDiego Encinas, RaulGarcía Muñoz, FernandoGómez Medina, SergioGómez Navajo, VanesaLópez Martínez, VanesaMillán Cuerva, JavierMillares Romero, SergioMonteagudo López, AlbertoMorales Sierra, Juan FranciscoMuñoz Alcalá, Mª AngelesRodríguez Vadillo, José ManuelSánchez Marujo, VanesaSanz Ballesteros, PedroVillalba Villacorta, Teresa

A

Biología del DesarrolloDevelopmentalBiology A.1 Análisis Genético de

mecanismos morfogenéticosen Drosophila

A.2 Mecanismos de señalizaciónen el desarrollo

A.3 Biología molecular deldesarrollo de Drosophila

A.4 Control genético de lamorfogénesis

A.5 Comunicación intercelular enel desarrollo de drosophila

A.6 Control genético de la divisióncelular en drosophila

A.1 Genetic Analysis ofmorphogeneticmechanisms in Drosophila .

A.2 Signalling mechanismsin development

A.3 Molecular biology ofdevelopment in Drosophila

A.4 Genetic control ofmorphogenesis

A.5 Cell-cell signaling indrosophila development

A.6 Genetic control of celldivision in drosophila

Resumen de Investigación

Señalización entre células de

proliferación

Hemos continuado el estudio de la funcion

de Notch en el disco imaginal de ala.

Encontramos que Notch estimula la

proliferación cellular y que colabora con

extramacrochaetae (codifica una proteína

HLH – no básica) durante la diferenciación

de venas. Hemos estudiado diferentes

aspectos de la formación del patrón de

venación, incluyendo la caracterización

functional del gen spalt y el análisis de las

rutas de señalización que afectan a la

diferenciación de venas.

En colaboración con otros laboratorios

hemos seleccionado y catalogado una serie

de mutaciones letales asociada a elementos

P. Con ello se han visto las correlaciones

entre morfología de discos imaginales

mutantes y los efectos clonales de células

mutantes en mosaicos genéticos. De este

análisis de cambios en comportamiento

cellular cabe destacar los efectos de varios

alelos del gen fat (que codifica para

E-cadherinas) en tamaño cellular, ritmo de

proliferación y morfología clonal.

La fusión de los discos imaginales

contralaterales en la metamorfosis es un

sistema modelo de alineación de epitelios,

aquí conectando niveles posicionales

homólogos. Hemos estudiado el proceso

normal y el efecto de mutaciones en genes

de la ruta Jun kinasa y de decapentaplegic

sobre la morfología (citoesqueleto y

filapodios) y migración celulares y

reconocimento del sustrato cellular larvario

(sobre el que migran las células imaginales

del borde del disco).

Hemos continuado utilizando el banco de

datos de proteínas de disco imaginal de la

como referencia para detectar cambios

debidos a mutaciones, concretamente los

asociados a mutaciones en genes

supresores de tumores (fat y l(2)gd). Se ha

iniciado igualmente la identificación

sistemática de polipéptidos del banco de

datos mediante electroforesis bidimensional

preparative seguida de técnicas de MALDI

Jefe de Línea/Group Leader:

Antonio García-Bellido

Personal Científico /Scientific Staff:

Juan Fenández Santarén,

José Félix de Celis,

Enrique Martín-Blanco

Técnicos de Investigación/

Technical Assistance:

Almudena Hernando Bellido,

Mª Paloma Martín Fernández,

Ana López Varea,

Rosario Hernández Baeza,

Carmen Alonso Barba.

Becarios Postdoctorales/

Postdoctoral Fellows:

Antonio Baonza Cuenca,

Pedro Fernández Fúnez,

Cassandra Extavour.

Becarios Predoctorales/

Graduate Students:

Jaime Resino de Castro

Luis Alberto Baena López,

José Carlos Pastor Pareja.

Estudiantes/Students:

Mª Eugenia Villa Cuesta, Bruno

Contreras Moreira,

Patricia Salama Cohén,

David Juanas Melero,

Mª Dolores Morales García,

Marta Moral Jimémez,

Beatriz García Fernández.

El proceso de expansión y fusión de discos imaginales en Drosophila es dirigido por

filopodios ricos en actina (rojo) que se originan en las células del borde del epitelio que

expresan Puckered, una JNK fosfatasa (verde). Los nucleos están teñidos en azul.

Martín-Blanco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14, 7888-7893 (2000).

Análisis Genético de mecanismosmorfogenéticos en Drosophila

A.1

14

Biología del DesarrolloDevelopmental Biology

García-Bellido, A. (1999). Los Genes del Cámbrico.Discurso Inaugural del Año Académico 1999-2000. 27de Octubre de 1999. Real Academia de Ciencas Exactas,Físicas y Naturales.

De Celis, J.F., Barrio, R. and Kafatos, F.C. (1999).Regulation of the splat/spalt-related gene complex andits function during sensory organ development in theDrosophila thorax. Development 126: 2653-2662.

De Celis J.F. (1999) The function of vestigial in Drosophilawing development: How are tissue-specific responsesto signalling pathways specified? BioEssays 21: 542-545

Barrio, R., De Celis, J.F., Boshakov, S. and Kafatos, F.C.(1999) Identification of regulatory regions driving theexpression of the Drosophila spalt complex at differentdevelopmental stages. Dev. Biol. 215: 33-47.

Martín-Blanco, E., Roch, F., Noll, E., Baonza, A., Duffy,J.B. and Perrimon, N. (1999). A temporal switch in DERsignaling controls the specification and differentiation ofveins and interveins in the Drosophila wing. Development126, 5739-5747.

Baonza, A. and García-Bellido, A. (2000). Notch signalingdirectly controls cell proliferation in the Drosophila wingdisc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 2609-2614.

Baonza, A, De Celis J.F. and García-Bellido, A. (2000).Relationships between extramacrochaetae and Notchsignalling in Drosophila wing Development. Development,127:2383-2395 .

Garoia, F., Guerra, D. Pezzoli, M.C., López-Varea, A.,Cavicchi, S. and García-Bellido, A. (2000). Cell Behaviourof Drosophila ft cadherin Mutations in wings Developemnt.Mechanism of Development. (In press).

Martín-Blanco, E., Pastor-Pareja J.C. and García-Bellido,A. (2000). JNK and decapentaplegic signaling controladhesiveness and cytoskeleton dynamics during thoraxclosure in Drosophila. PNAS, 97 no.14: 7667-8192.

De Celis, J.F. and Barrio, R. (2000) Function of thespalt/spalt-related gene complex in positioning the veinsin the Drosophila wing. Mech. Dev. 91: 31-41.

De Celis, F.J. and Bray, S. (2000) The Abruptex domainof Notch regulates negative interactions between Notch,its ligands and Fringe. Development 127: 1291-1302

De Celis, J.F. and Dominguez, M. (2000). Mecanismosgenéticos de la polaridad ocular en la mosca del vinagreDrosophila melanogaster. Investigación y Ciencia enprensa.

Rodríguez, J., Agudo, M., Van Damme, J.,Vandekerckhove, J. and Santarén, J.F. (2000).Polipeptides differentially expressed in imaginable discsdefine the peroxiredoxin family of genes in Drosophila.Eur. J. Biochem. 267: 487-497.

Martín-Blanco, E. (2000). P38 MAPKs in Development:ancient roles and new functions. Bioessays 22, 637-645.

Baonza, A., Roch, F. and Martín-Blanco, E. (2000). DERsignalling restricts the boundaries of the wing field duringDrosophila development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,7331-7335.

García-Bellido, A. y Martín-Blanco, E. (2000). DesarrolloEmbrionario y Morfogénesis. en “ La Ciencia en tusmanos” Ed: P. García Barreno. Espasa-Calpe.

Genetic Analysis of morphogeneticmechanisms in Drosophila

Publicaciones /Publications:

The process of imaginal disc spreading in Drosophila is directed by long actin-rich filopodia (red) emitted

by leading edge cells expressing Puckered, a JNK phosphatase (green). Nuclei are stained blue.

Martín-Blanco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 14, 7888-7893 (2000).

Research summary

Signalling during cell proliferation

We have continued the study of Notch

function in the wing imaginal disc. We

find that Notch stimulates cell proliferation

and collaborates with extramacrochaetae

(encoding a non-basic HLH protein)

during the differentiation of the veins.

We have been studying several aspects

of vein pattern formation, including the

functional characterisation of the spalt

gene and the analysis of signalling

pathways affecting vein differentiation.

In collaboration with other laboratories

we have selected and study a number

of lethal mutations associated to P

elements. This has allowed to stablish

a correlation between mutant imaginal

disc morphology and the clonal effects

of mutant cells in genetic mosaics. From

this analysis of changes in cellular

behaviour, the effects of several alleles

of the gene fat (encoding an E-cadherin)

in cell size, proliferation rate and clonal

morphology were studied in detail.

The fusion of contralateral imaginal discs

during metamorphosis is a model system

of epithelial alignment, apposing

homologous positional levels. We have

studied the normal process as well as

the effects of several mutations in genes

belonging to the Jun and

decapentaplegic signalling pathways on

morphology (cytoskeleton and filepodia)

and cell migration and recognition of the

cellular larval substrate (used by the

edge imaginal disc cells to migrate upon).

We have used the wing imaginal disc

protein database as a reference to detect

changes due to mutations, particularly

those specifically associated to mutations

in tumor suppressor genes (fat and l(2)gd).

We have also initiated the systematic

identification of polypeptides in the

database by using preparative two-

dimensional electrophoresis followed by

MALDI techniques.

15

Otras actividades y reconocimientos cientificos relevantesAntonio García-Bellido: Presidente electo de la European Developmental

Biology Organization

(EDBO), 1999.

Tesis Doctorales/ Doctoral ThesesCassandra Extavour. Selección en la línea germinal de Drosophila

melanogaster. Universidad

Autónoma de Madrid, 2000.

Resumen de Investigación

Durante el desarrollo de los organismos

multicelulares, las células embrionarias

eligen un programa de diferenciación.

La información para este programa es

suministrada mediante moléculas

señalizadoras extracelulares que se originan

en grupos de células especializadas

denominadas organizadores. Una de estas

moléculas señalizadoras es Hedgehog

(HH). Esta proteína y los componentes de

su vía de señalización, inicialmente

identificados en Drosophila, estan

conservados evolutivamente. Alteraciones

en la vía de HH son la causa de varios

síndromes y malformaciones humanas tales

como la holoprosencefalia (HPC) y la

polidactilia. También la activación

inadecuada de la vía de HH esta relacionada

con el desarrollo de carcinomas de células

básales (BCC) y de meduloblastomas.

Nuestros estudios pueden ayudar a

entender el funcionamiento de la

señalización por HH.

Función del gradiente de HH en la

formación del patrón del ala.

Las estructuras adultas de Drosophila están

subdivididas en compartimentos y la

interacción entre estos induce la activación

de señales organizadoras. Así, en el borde

del compartimento anterio-posterior, la señal

de HH induce a su vez nuevas señales

morfogenéticas, como son los factores de

secreción Wingless (WG), homologo al

oncogen int-1, y Decapentablegic (DPP),

perteneciente a la familia de las proteínas

TGF-β. Esta cascada de inducción de

señales es fundamental para el desarrollo

de los apéndices. Sin embargo, habíamos

descrito que HH tiene además una función

morfogenética “per se”. Recientemente,

hemos podido diseccionar las respuestas

diferenciales a distintas concentraciones

del gradiente de HH mediante la

identificación y estudio de un nuevo alelo

de patched ptc (el receptor de HH) (Mullor

y Guerrero, 2000).

Función de las señales morfogenéticas

Hedgehog, Wingless y Decapentaplegic

en el desarrollo de la terminalia de

Drososphila.

El disco genital que da lugar a la genitalia

y a la analia de la mosca es por ahora el

menos estudiado. Sin embargo, desde el

punto de vista morfogenético, es el mas

interesante ya que para su desarrollo es

necesario por una parte la información dada

por los genes de formación de patrón y por

otra la suministrada por los genes de

determinación sexual. Hemos visto que las

respuestas a las vías de señalización de

HH, WG Y DPP están controladas

diferencialmente en el macho y en la hembra

por los genes de determinación sexual.

Este control diferencial de las respuesta a

señales es clave para desarrollo de las

estructuras sexuales del macho y de la

hembra (Sánchez, Gorfinkiel y Guerrero,

2001).

La terminalia de la mosca se considera

apéndice ventral y como tal, hemos visto

que expresa y requiere el gen Distal-less

(Dll). Dll actúa de mediador de las señal de

HH en el desarrollo de la analia impidiendo

el desarrollo de intestino, que no requiere

dicha señalización (Gorfinkiel, Sánchez y

Guerrero, 1999).

Jefe de Línea/Group Leader:

Isabel Guerrero

Becarios Predoctorales/

Graduate Students :

José Luis Mullor

Carlos Torroja

Becarios Postdoctoral/

Postdoctoral Fellows :

Nicole Gorfinkiel

Graciela Carrillo

Veronica Martin

Técnico de Investigación/

Technical Assistance :

Carmen Ibañez

María Sanz

Activación de los genes diana de la vía de Hedgehog en el límite de compartimento(anterio/posterior) del disco imaginal de ala de drosophila melanogaster: patched (rojo), cubitus(verde), decapentaplegic (azul).

Mecanismos de señalización en el desarrolloA.2

16

Biología del DesarrolloDevelopmental Biology

Signalling mechanisms in development

Publicaciones /Publications:

Research summary

During the development of multicellular

organisms, embryonic cells choose the

appropriate differentiation program

based on positional information.

Extracellular signalling molecules from

specialised groups of cells, termed

organisers, supply the information for

these programs. Thus, the signalling

molecule Hedgehog (HH) and the

components of its signal transduction

pathway play an important role in the

development and morphogenesis of

adult structures both in vertebrates and

invertebrates. These genes, which have

been previously identified in Drosophila,

are affected in different congenital

malformations such as the

prosencephaly and polydactily in

humans. Ectopic activation of the HH

pathway is also associated to basal cell

carcinomas (BCC) and

medullablastomas. Our studies should

contribute to the understanding of how

HH signalling operates.

The role of the Hedgehog gradient in

wing patterning.

Drosophila adult structures are

subdivided into compartments and it is

the interaction between these

compartments at their boundaries, which

may induce the organising activity of the

signal molecules. Thus, at the

anterior/posterior compartment

boundary, the HH signal induces new

morphogenetic signals such as Wingless

(WG), homologous to the oncogene

int-1, and Decapentablegic (DPP), a

member of the TGF-b family. This signal

induction cascade has a key role in the

development of the appendages. In

addition, we had demonstrated that HH

has a DPP-independent morphogenetic

effect. Lately, we have dissected the

different responses to the HH gradient

by using a gain of function allele of

patched ptc (the HH receptor) (Mullor

and Guerrero, 2001)

Role of the morphogenetic signals

Hedgehog, Wingless and

Decapentaplegic in the development

of the Drosophila terminalia.

The development of the genital disc,

which gives rise to the genitalia and

analia of adult flies, requires the activity

of both patterning and sex determination

genes. We have found that the sex

determination genes control the

development of the genital discs

modulating the responses to HH, WG,

and DPP signals. This signalling

modulation is key for the determination

of either male or female structures

(Sánchez, Gorfinkiel and Guerrero,

2001).

As in other ventral appendages, the

morphogenetic signals HH, WG and

DPP control the development of the

terminalia by inducing target genes such

as Distal-less (Dll). The anal primordium

of the genital disc is subdivided into two

territories, analia and hindgut. We have

found that Dll is specifically required for

analia formation versus hindgut

(Gorfinkiel et al., 1999).

17

Gorfinkiel, N., Sánchez, L. and Guerrero, I. (1999).

Drosophila terminalia as an appendage-like structure.

Mechanisms of Development 85: 1-11.

Mullor, J.L. and Guerrero, I. (2000). A gain-of-function

mutant of patched dissects different responses to the

Hedgehog gradient., Dev. Biol. 228, 211-224.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

José Luis Mullor. «Estudio del papel de la vía de

Señalización de Hedgehog en la determinación del

patrón morfogenético del ala de Drosophila». Universidad

Autónoma de Madrid. Calificaciòn Apto cum Laude.

Febrero de 1999.

Colaboraciones con la Industria /

Collaborations with the Industry.

Proyecto de colaboracion con PHARMAMAR.

Activation of the HH target genes at the anterior and posterior compartment boundary of thewing imaginal disc. It is shown the expression of Cubitus interruptus (green),Decapentaplegic(blue) and Patched (red).

Resumen de Investigación

Nuestra línea de investigación estudia la

traducción de la información genética en

patrones morfológicos. Una buena parte

de nuestro esfuerzo se ha dedicado a

esclarecer la función de los genes iroquois

(iro) de Drosophila y de sus homólogos

Xiro en Xenopus, aislados previamente en

nuestro laboratorio, como reguladores de

los genes proneurales en ambos

organismos.

Función de los genes iro en el desarrollo.

Hemos demostrado que, además de su

función como reguladores de los genes

proneurales, los genes iro tienen una función

más temprana consistente en especificar

grandes territorios del cuerpo de Drosophila

(mesotórax dorsal y mitad dorsal de la

cabeza y ojo) y del embrión de Xenopus

(placa neural). Su falta de función en

Drosophila transforma el mesotórax dorsal

en axila alar y las estructuras dorsales de

la cabeza en estructuras ventrales. iro

aparece como un gen selector para la región

dorsal de la cabeza de este insecto. En

Xenopus, Xiro1 y Xiro2 se inducen en el

ectodermo dorsal por la señalización de la

vía de Wnt. Las homeoproteínas Xiro actúan

como represores y antagonizan la expresión

de Bmp4, lo cual permite la neuralización

del ectodermo dorsal y la formación de la

placa neural.

Control de los genes proneurales en

Drosophila . Se ha caracterizado el

enhancer DC del complejo achaete-scute,

responsable de la activación de estos genes

en el grupo proneural dorsocentral. pannier

es un activador directo y ayuda a definir la

localización y extensión de este grupo,

mientras que wingless solamente tiene un

caracter permisivo.

La señalización por la via del EGFR es

esencial para generar las macroquetas

del notum de Drosophila . La señalización

ocurre entre las células de los grupos

proneurales y favorece la singularización

de la célula madre del órgano sensorial

estimulando el bucle de autoactivación de

los genes proneurales. Esta "estimulación

lateral" antagoniza la "inhibición lateral"

mediada por el receptor Notch y puede

favorecer la aparición de las macroquetas

en posiciones muy precisas.

Función del gen DRacGAP. DRacGAP

regula negativamente a la GTPasa DRac

la cual colabora con la señal de EGFR/Ras

en la activación de la MAPK en el disco

imaginal de ala de Drosophila. A su vez, la

vía de EGFR/Ras reprime la expresión de

DRacGAP, estableciéndose un bucle de

autoestimulación de esta vía.

Búsqueda de genes de prepatrón.

Mediante abordajes genéticos y moleculares

hemos continuado la búsqueda de genes

de prepatrón en Drosophila y de genes

activados o reprimidos por Xiro en Xenopus.

Se están estudiando diversos candidatos.

Regulación de la miogénesis en

Drosophila . La formación de los músculos

se produce por fusión de dos poblaciones

de mioblastos: los fundadores y los

competentes. Estamos estudiando la

regulación del proceso de fusión y por tanto

de la formación del patrón muscular

mediante el aislamiento y caracterización

molecular y funcional de genes específicos

de subpoblaciones de mioblastos.

Jefe de Línea/Group Leader

Juan Modolell

Personal Científico/Scientific Staff

Sonsoles Campuzano,

Mar Ruiz Gómez,

Isabel Rodríguez,

José Luís Gómez Skarmeta

Becarios Postdoctorales/

Postdoctoral Fellows

Joaquím Culí,

Sol Sotillos,

Florencia Cavodeassi,

María Jesús García García

Becarios Predoctorales/

Graduate Students

Luis María Escudero,

Joaquín de Navascués,

María Eugenia Villa

Técnicos de Investigación/

Technical Assistance

Elisa de la Calle,

Eva Caminero,

Ruth Gutiérrez,

Andrew Ginzel

Científico Visitante/Visiting Scientist

Juan Riesgo (Univ. Nac. Autónoma de

México, Querétaro)

Imagen de un grupo de precursores de órganos sensoriales del presuntivo radio alar de Drosophila compuestapor doce secciones ópticas confocales. Los precursores se identifican por la expresión del marcador neutralized-lacZ y están codificados en distintos colores de acuerdo con su posición en el eje z.

Biología molecular del desarrollo de DrosophilaA.3

18

Biología del DesarrolloDevelopmental Biology

Cavodeassi, F., Diez del Corral, R., Campuzano, S. and

Domínguez, M. (1999). Compartments and organising

boundaries in the Drosophila eye: the role of the

homeodomain Iroquois proteins. Development 126,

4933-4942.

Diez del Corral, R., Aroca, P., Gómez-Skarmeta, J. L.,

Cavodeassi, F. and Modolell, J. (1999). The Iroquois

homeodomain proteins are required to specify body wall

identity in Drosophila. Genes Dev. 13, 1754-1761.

García-García, M. J., Ramain, P., Simpson, P. and

Modolell, J. (1999). Different contributions of pannier

and wingless to the patterning of the dorsal mesothorax

of Drosophila. Development 126, 3523-3532.

Gómez-Skarmeta, J. L., de la Calle-Mustienes, E.,

Modolell, J. and Mayor, R. (1999). Xenopus brain factor-

2 controls mesoderm, forebrain and neural crest

development. Mech. Dev. 80, 15-27.

Cavodeassi, F., Modolell, J. and Campuzano, S. (2000).

The Iroquois homeobox genes function as dorsal

selectors in the Drosophila head. Development 127,

1921-1929.

Sotillos, S. and Campuzano, S. (2000). DRacGAP, a

novel Drosophila gene, inhibits EGFR/Ras signalling in

the developing imaginal wing disc. Development 127,

5427-5438.

Participación en la secuenciación del

genoma de Drosophila:

Benos, P.V. et al.(2000) From sequence to chromosome:

the tip of the X

chromosome of D. melanogaster. Science 287, 2220-

2222.

Adams, M.D. et al.(2000) The genome sequence of

Drosophila melanogaster.

Science 287, 2185-2195.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

García García, M.J.: "Especificación del patrón

morfogenético en la región

dorsocentral del tórax de Drosophila". Universidad

Autónoma de Madrid. 1999.

Cavodeassi, F.: "Función de los genes iroquois en el

desarrollo de la cabeza

de Drosophila". Universidad Autónoma de Madrid. 2000.

Distinciones/ DistinctionsJ. Modolell:

Premio DuPont para el fomento de la investigación. Año

2000.

DuPont Prize for the promotion of research. Year 2000.

Molecular biology of development in Drosophila

Publicaciones /Publications:

Research Summary

Our work aims at clarifying the translation

of genetic information into morphological

patterns. A large part of our efforts have

been dedicated to clarify the function of

the iroquois (iro) genes of Drosophila

and of their homologs Xiro of Xenopus,

previously isolated by our group as

regulators of the proneural genes.

Function of the iro genes in

development. We have shown that, in

addition to their role as regulators of

proneural genes, the iro genes have an

earlier function in the specification of

large territories of the body of Drosophila

(dorsal mesothorax and dorsal half of

the head and eye) and of the Xenopus

embryo (neural plate). Their loss of

function in Drosophila transforms the

dorsal mesothorax into wing hinge and

the dorsal head structures into ventral

head structures. iro behaves as a

selector gene for the dorsal head of this

insect. In Xenopus, Xiro1 and Xiro2 are

induced by Wnt signaling. The Xiro

homeoproteins act as repressors and

antagonize Bmp4 expression, which

allows the neuralization of the dorsal

ectoderm and the formation of the neural

plate.

Control of proneural genes in

Drosophila . The DC enhancer of the

achaete-scute complex, responsible for

the activation of these genes in the DC

proneural cluster, has been

characterized. pannier is a direct activator

and helps to define the position and

extension of this cluster, while wingless

has only a permissive character.

EGFR signaling is essential for

development of the notum

macrochaetae of Drosophila . Signaling

occurs within the cells of proneural

clusters and promotes the singling out

of the sensory mother cell by stimulating

the self-activating loop of the proneural

genes. This "lateral stimulation"

antagonizes the "lateral inhibition"

mediated by the Notch receptor and may

enhance the precise positioning of

macrochaetae.

Function of DRacGAP. DRacGAP

negatively regulates the DRac GTPase,

which collaborates with EGFR/Ras

signaling in the activation of the MAPK

in the wing imaginal disc of Drosophila.

In turn, the EGFR/Ras pathway

represses the expression of DRacGAP.

A loop of self-stimulation of this pathway

is established.

Search for prepattern genes. By means

of genetic and molecular approaches,

we have continued with the search for

new components of the Drosophila

prepattern and of genes activated or

repressed by Xiro in Xenopus. Several

candidates are being studied.

Regulation of myogenesis in

Drosophila . Muscle formation requires

the fusion of two cell populations:

founders and fusion-competent

myoblasts. We are studying the

regulation of fusion and, therefore, the

patterning of the muscles, by means of

the identification and molecular and

functional characterization of genes

specific for myoblast subpopulations.

19

Composite image of twelve confocal sections encompasing the group of sense organ precursors atthe dorsal wing radius of the wing disc of Drosophila. Precursors are identified by the expression ofthe neutralized-lacZ marker and are coded with different colors according to their z axis position.

Resumen de investigación

Durante el bienio 1999-2000 hemos

desarrollado fundamentalmente tres lineas

de trabajo; a) búsqueda de nuevos genes

de expresion restringida en las estructuras

adultas de Drosophila mediante el método

“yellow” b) estudio de la función del complejo

Hox (bajo la dirección de E. Sánchez-

Herrero) y c) estudio de los genes

extradenticle y homothorax, dos cofactores

generales de la funcion Hox en el Reino

Animal.

El análisis de los genes de expresion

restringida ha permitido encontrar un nuevo

mechanismo de generar subdivisiones

genéticas que no se basa en establecer

restricciones de linaje celular sino en

interacciones antagonistas entre genes de

tipo selector. Los genes pannier e iroquois

son los que hemos utilizado para describir

este fenómeno. Cremos que la mayor parte

de la diversidad morfológica en Drosophila

se origina por este mecanismo. El método

yellow nos ha permitido además encontrar

un nuevo receptor del producto de gen

wingless y también identificar a caudal como

el gen Hox responsible del desarrollo de la

analia. Dada la gran efectividad del método

estamos realizando una búsqueda de todos

los genes de expresion adulta en

Drosophila, que esperamos terminar en 2-

3 años. Hemos preparado el método para

clonar y secuenciar fragmentos de todos

estos genes y buscarlos en los genomas

de Drosophila y humanos. Esto nos

permitirá seleccionar para su estudio genes

altamente conservados en ambas especies.

Por lo que respecta a la función Hox, nos

hemos centrado en el estudio del gen

Abdominal-B (Abd-B), necesario para formar

la parte posterior del cuerpo de la mosca,

tratando de averiguar cómo genera

estructuras tan diferentes como el abdomen

posterior o la genitalia. Hemos observado

que en moscas que carecen de Abd-B la

genitalia se transforma en pata o antena.

Esta transformación viene acompañada de

cambios en la expresión de genes

requeridos para la formación de estos

apéndices, tales como Distal-less o

homothorax. Nuestro trabajo permite

concluir que Abd-B modifica una información

posicional común a patas, antenas y

genitalia proporcionada por genes como

decapentaplegic y wingless. La respuesta

a esta información posicional común,

modificada por Abd-B, hace que, en la

genitalia, se transcriban genes específicos

de la genitalia y se reprima la expresión de

genes requeridos en las patas o antenas.

Abd-B, sin embargo, codifica para dos

proteínas diferentes (aunque con una

extensa secuencia de aminoácidos

comunes), y con una distribución espacial

distinta. Nuestro trabajo se enfoca a elucidar

el papel de cada una de ellas en la

especificación de la genitalia y el abdomen

posterior. Para analizar la especificación

segmental conferida por genes Hox, nos

proponemos estudiar genes que se

expresan exclusivamente en determinados

segmentos durante el desarrollo. Con este

fin estamos analizando una serie de líneas

con elementos transponibles insertados al

azar en el genoma, y que dirigen la

expresión del gen lacZ bacteriano en

segmentos específicos. Estas líneas son

candidatas a estar insertadas cerca de

genes controlados de forma especifica por

genes Hox.

En cuanto a la función de los cofactores

hth y exd, hemos estudiado sus

interacciones con las vias de los morfógenos

Dpp y Wg en los discos de ala y pata.

Hemos demostrado que existe un

antagonismo entre hth/exd y las vias Dpp

y Wg que es el instrumento genético que

permite distinguir el desarrollo de los

apéndices y el tronco. La comparación con

los genes homólogos indica que el mismo

mecanismo opera en vertebrados. Asimismo

hemos identificado el gen teashirt como el

activador de hth en las regiones torácicas.

El papel de este último gen está siendo

estudiado en detalle.

Jefes de Linea/Group Leaders :

Ginés Morata,

Ernesto Sánchez-Herrero*

Personal Científico/Scientific

Personnel :

Natalia Azpiazu, Manuel Calleja,

Becarios Postdoctorales/

Postdoctoral fellows :

Eduardo Moreno,

Magali Suzanne

Becarios Predoctorales/

Graduate Students :

Silvia Aldaz, Carlos Estella,

Beatriz Estrada, Héctor Herranz,

Francisco Martin, Luis de Navas,

Ainhoa Perez

Técnicos de Investigación/

Technical Assistance :

Angelica Cantarero,

Rosa González,

Cristina González

* Jefe de Linea asociado /

Associate Group Leader

Abdomen de Drosophila que muestra en su parte posterior un clon mutante para elgen Abdominal-B que transforma la genitalia en pata.

Control genético de la morfogénesisA.4

20

Drosophile abdomen showing a Abd-B mutant clone that transforms genitaliainto leg.

Biología del DesarrolloDevelopmental Biology

Morata, G. and Sanchez-Herrero, E. (1999) “Patterning

mechanisms in the body and the appendages of

Drosophila” Development 126, 2823-2828

Morata, G. (1999) “Biologia Molecular, Desarrollo y

Evolución de Reino Animal” Fundación Botin pp 257-

285

Morata, G. and Basler, K. (1999) “Cells in search of a

signal” Nature Cell Biology 1, 61-62

Estrada, B. y Sánchez-Herrero, E. (1999) “El gen caudal

y la región posterior de los organismos” Investigación

y Ciencia 285, 34

Moreno, E. and Morata, G. (1999) “caudal is the Hox

gene that specifies the most posterior Drosophila

segment” Nature 400, 873-877

Morata, G. (1999) “Drosophila polyclones” en

Encyclopedia of Molecular Biology (ed. Thomas

Creighton) John Wiley & Sons Inc. 1893-1894

Mercader, N., Leonardo, E., Azpiazu, N., Serrano, A.,

Morata, G., Martínez-A., C., and Torres, M. (1999)

“Conserved role of Meis1/Hth in specification of the

proximodistal limb axis” Nature 402, 425-429

Peiffer, S. Alexandre, C. Calleja, M and Vincent, J-P.

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Sivasankaranm R., Calleja, M., Morata, G. and Basler,

K. (2000) “Wingless target gene Dfz3 encodes a new

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Azpiazu, N. and Morata, G. (2000) “Function and

regulation of homothorax in the wing imaginal disc of

Drosophila”. Development 127, 2685-2693

Calleja, M., Herranz, H., Estella, C. Casal, J., Lawrence,

P., Simpson, P. and Morata, G. (2000) “Generation of

medial and lateral dorsal body domains by the pannier

gene of Drosophila. Development 127, 3971-3980

Mann, R. and Morata, G. (2000) “The developmental

and molecular biology of genes that subdivide the body

of Drosophila” Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 16, 243-271

Premios y DistincionesPrizes and Distinctions

Ginés Morata. Pan-American Molecular Biology Lecture

Award, Mendoza (Argentina), Noviembre 1999

Ginés Morata. Miembro de Jurado del Programa

“Dintinció de la Generalitat de Catalunya per la Promoció

de la Recerca Universitaria”, desde 2000

Genetic control of morphogenesis

Publicaciones /Publications:

Research Summary

During the years 1999-2000 we have been

involved in three research lines:

a) the usage of the “yellow” method to seek

new genes defining restricted expression

domains in the adult cuticle, b) the study of

Hox function (under the supervision of E.

Sánchez-Herrero) and c) The study of the

developmental function of homothorax and

extradenticle two general co-factors of the

Hox genes.

The analysis of genes showing restricted

adult expression with the yellow method has

led to the discovery of a new mechanism to

generate genetic subdivisions during

development. It is not based on lineage

segregations but on antagonistic interactions

between selector-like genes. The model is

based on the results obtained with the genes

pannier and iroquois. We believe that much

of the morphological diversity in Drosophila

is originated by this mechanism. We have

also found a new Wingless receptor and have

identified caudal as the Hox gene responsible

for analia development. Given the efficiency

of the method, we are initiating a new screen

aimed at identifying all the Drosophila genes

expressed in imaginal cells, which we expect

to complete in 2-3 years. We plan to clone

and sequence fragments of all these genes

and subsequently identify those similar

sequences in the human genome. The genes

showing a high degree of conservation will

be selected for further study.

Regarding the Hox function, our work aims

at understanding the mechanisms whereby

the Hox genes specify different segments in

Drosophila.

We have

focussed on

Abdominal-B

(Abd-B), the

Hox gene

required to

determine the posterior part of the fly body,

analysing how Abd-B specifies structures so

different as the posterior abdomen and the

genitalia. We have observed that, in the

absence of Abd-B, the genitalia are

transformed into leg or antenna. This

transformation implies changes in the

expression of genes required to form these

appendages, such as Distal-less or

homothorax. Our studies led us to conclude

that Abd-B modifies a positional information

common to legs, antennae and genitalia

provided by genes like wingless and

decapentaplegic. The interpretation of this

positional information, modified by Abd-B,

results, in the genitalia, in the expression of

genitalia-specific genes and in the repression

of genes required to make legs or antennae.

The gene Abd-B, however, encodes two

different proteins (although they share an

long aminoacid sequence), and with different

spatial distribution. Our work aims at identifying

the specific role of each protein in the

determination of genitalia or posterior

abdomen. In order to unravel how Hox genes

confer segmental specification, we decided

to study genes that are expressed exclusively

in specific segments during development.

To this end, we are analysing several lines

with transposable elements, inserted at

random in the genome, which drive lacZ

expression in different parts of the body.

These lines are likely to be inserted in genes

controlled by Hox genes.

Finally, we have studied the interactions

between hth/exd and the Dpp and Wg

pathways during the development of the wing

and leg discs. We have found that there is

an antagonism between hth/exd and Dpp/Wg

which is the key element to distinguish the

development of the appendages and the body

trunk. A similar mechanism appears to operate

in the vertebrate limb. We have identified the

gene teashirt as the activator of the hth/exd

function in the thoracic regions.

21

Drosophila adulta mostrando en azul (mediante tinción X-gal) laexpresión del gen pannier en un dominio dorsal de los segmentostorácicos y abdominales

Adult Drosophile fly, showing in blue (x-gal staining) the expressiondomain of the pannier gene. It defines a dorsal region in all thoracicand abdominal segments.

Resumen de Investigación

La comunicación entre células media

muchos procesos en desarrollo. La

identificación y caracterización de rutas de

señalización es uno de los objetivos de la

biología del desarrollo. La mayoría de las

rutas de señalización que se han identificado

se usan de forma reiterada durante el

desarrollo en diferentes tiempos y tejidos.

En el estudio de la señalización entre células

uno de los principales aspectos es cómo

la activación de la ruta resulta en una

respuesta específica en células diana. En

este campo estamos enfocando nuestro

trabajo en dos aspectos del desarrollo de

los discos imaginales de Drosophila.

1. Especificación de las bracteas en la

epidermis de Drosophila.

Las bracteas son estructuras epidérmicas

de un sola célula que aparecen asociadas

con órganos mecanosensoriales en la

epidermis de Drosophila. Nuestros

resultados indican que la especificación de

las bracteas es un mecanismo inductivo

que está mediado por la ruta de RAS.

Hemos identificado a los genes spitz,

homólogo de TGFα, y torpedo, homólogo

de EGFr, como el ligando y el receptor de

esta señal inductiva. Nuestro objetivo es

caracterizar los componentes del fondo

genético que especifica la bractea como

resultado de la activación de esta ruta.

2. Morfogénesis de la articulación del ala

de Drosophila.

El gen wingless (wg), un miembro de la

familia WNT de glicoproteinas, se expresa

en un patrón complejo y dinámico en el

desarrollo del ala de Drosophila. Los

distintos componentes del patrón de

expresión de wg están bajo el control de

diferentes "enhancers". En la articulación

del ala wg se expresa en dos anillos que

rodean el ala. Nuestros resultados sugieren

que la activación de wg en el anillo mas

interno está mediada por la interacción

entre dos diferentes poblaciones de células

en el límite de expresión del gen vestigial,

el gen selector de ala. Nuestro objetivo en

este proyecto es identificar los componentes

de la ruta de señalización que media la

interacción entre estas dos poblaciones

celulares.

Jefes de Linea/Group Leaders :

Fernando Jiménez Díaz-Benjumea

Estudiantes

Undergraduate Student:

David del Alamo Rodríguez

Quetas mecanoreceptoras con su bractea asociada en la pata de Drosophila.La diferencia en pigmentación indica la pertenencia a diferentes linajes.

Comunicación intercelular en el desarrollode Drosophila

A.5

22

Biología del DesarrolloDevelopmental Biology

Cell-cell signaling in Drosophila development

Research Summary

Cell-cell communication mediates many

processes in development. The

identification and the characterization of

signaling pathways are main subjects in

developmental biology. The majority of

the identified signaling pathways are used

repeatedly in development at different

times and tissues, so in the field of cell

signaling one of the main subject is how

the activation of signaling pathways results

in specific responses by the target cells.

In this field we are focusing our works in

two aspect of the Drosophila imaginal

disc development:

1. The specification of the bract cells in

the Drosophila epidermis.

Bracts are single cells epidermal

structures, which appear associated with

mechanosensory organs in the Drosophila

epidermis. Our results indicate the

specification of bract cells is an inductive

mechanism mediated by the RAS

pathway. We have identified the gene

spitz, TGFα homologue, and torpedo,

EGFr homologue, as the ligand and the

receptor of this inductive signal. Now our

main goal is to characterize the

components of the genetic background

that specifies the bract cells as a result

of the activation of this signaling pathway.

2. The morphogenesis of the Drosophila

wing hinge.

The wingless (wg) gene, a member of

the WNT family of secreted glycoproteins,

is expressed in a complex and dynamic

pattern in the development of the

Drosophila wing. The different

components of the wg expression pattern

are under the control of different

enhancers. In the wing hinge wg is

expressed in two rings surrounding the

wing blade. Our results suggests the

activation of the inner ring enhancer is

mediated by the interaction between two

different populations of cells in the

boundary of the cells that express the

vestigial gene, the selector gene that

confers wing fate. Our goal in this project

is to identify the components of the

signaling pathway that mediates this cell-

cell interaction.

23

Mechanosensory organs with their bracts in the Drosophile leg. Different pigmentetionindicates different lineage.

Resumen de Investigación

Utilizando un anticuerpo contra Bub1, una

proteína específica del cinetocoro activo,

hemos podido mostrar que durante la

prometafase mitótica de Drosophila

melanogaster hay varias regiones

pericéntricas, todas ricas en algún miembro

de la familia del DNA satélite 1.688, que se

tiñen con el anticuerpo. Durante la metafase

sólo una región en cada cromosoma, su

centrómero, permanece activada. En el

cromosoma Y, totalmente heterocromático,

tanto la región centromérica como al menos

algunas de las regiones que muestran

activación transitoria contienen satélites

derivados de las secuencias teloméricas

Het-A y TART. Hemos visto también que en

el cromosoma Sdi-d hay una translocación

a la región pericentromérica del cromosoma

2 de una pequeña región heterocromática

rica en sequencias derivadas de HeT-A que

a veces substtituyen en su función al

centrómero: en algunos cromosomas

metafásicos la immunolocalización de anti-

Bub1 demuestra que la transposición realiza

la función centromérica. Por último, hemos

descrito que el cromosoma C(1)A es un

dicéntrico que se transmite normalmente

en mitosis y meiosis porque en general uno

de los centrómeros no es activo o, si los

dos son activos, la unión de uno de ellos a

los microtúbulos polares, aunque suficiente

para formar puentes anafásicos, se resuelve

sin roturas cromosómicas. Todas estas

observaciones apuntan la existencia de un

mecanismo de activación-desactivación de

centrómeros que, como todo proceso

biológico, se puede diseccionar

genéticamente si se dispone de las

herramientas genéticas adecuadas. La

existencia de un cromosoma dicéntrico nos

ha permitido diseñar un esquema genético

que permite identificar mutaciones en genes

involucrados en el proceso de activación-

inactivación centromérica. Nuestro objetivo

fundamental para el futuro es la inducción

de nuevas mutaciones y la caracterización

genética y molecular de estos genes tan

cruciales para la segregación cromosómica.

Jefe de Línea/Group Leader:

Pedro Ripoll

Personal Científico /

Scientific Personnel:

Isabel Molina

Becarios Posdoctorales/

Postdoctoral Fellows:

Giovanna Giovinazzo,

Yanina Panzera

Becarios Predoctorales/

Predoctoral Fellows:

Annalisa Letizia

Técnico de Investigación /

Techical Assistance:

Antonio Sánchez

Anti-Bub 1 staining (red) of the dicentric chromosome C(1)A

Control genético de la división celular enDrosophila

A.6

24

Biología del DesarrolloDevelopmental Biology

Genetic control of cell division in Drosophila

Publicaciones /Publications:

Research Summary

Using an antibody against Bub1, a protein

specific of active kinetocores, we have

been able to show that during the mitotic

prometaphase in Drosophila

melanogaster there are several

pericentromeric regions rich in members

of the 1.688 satellite DNA family that stain

with the antibody. By metaphase only one

region per chromosome, its centromere,

remains active. In the fully

heterochromatic Y chromosome both the

centromeric region and at least some of

the regions showing transient centromeric

activation are rich in Het-A- and TART-

related satellite sequences. We have also

found that in the chromosome Sdi-d a

heterochromatic region carrying Het-A

related sequences translocated to the

pericentric region of chromosome 2 can

substitute in its function the real

centromere: at metaphase, in a fraction

of the chromosomes the anti-Bub1

staining shows that it is the transposed

region the one acting as the functional

kinetocore. Finally, we have found that

the chromosome C(1)A is a dicentric

chromosome that is transmitted through

mitosis and meiosis because in most

cases one of the centromeres is inactive.

In those cases in which C(1)A behaves

as a dicentric the attachment of one of

the centromeres to the spindle

microtubules is strong enough to permit

the formation of a bridge during anaphase

but still weak enough to dettach without

chromosome breackage. All these

observations reveal the existence of a

mechanism of centromere activation-

desactivation that, as all other process,

can be genetically dissected if the right

genetic tools are available. Taking

advantage of the existence of a dicentric

chromosome we have designed a genetic

screen that permits the identification of

mutations in genes involved in the process

of centromere activation-desactivation.

Our main objectives for the future are the

identification and the genetic and

molecular characterization of these genes.

25

Agudo, M., . Losada, A., Abad, J.P., S. Pimpinelli, P.

Ripoll and A. Villasante. (1999). "Centromeres from

telomeres? The centromeric region oy the Y chromosome

of Drosophila melanogaster contains a tandem array of

telomeric HeT-A and TART sequences". Nucl. Acid Res.,

27, 3318-3324.

Agudo, M., Abad, J.P., Molina, I., Losada, A., Ripoll, P.

and Villasante, A. (2000) "A dicentric chromosome of

Drosophila melanogaster showing alternate centromere

inactivation". Chromosoma 109, 190-196.

Abad, J.P., Agudo, M., Molina, I., Losada, A., Ripoll, P.

& Villasante, A. (2000). "Pericentromeric regions

containing 1.688 satellite DNA sequences show anti-

kinetochore staining in prometaphase chromosomes of

Drosophila melanogaster" Mol. Gen. Genet. 264, 371-

377.

BB.1 Biogénesis mitocondrial enmamíferos

B.2 Desarrollo neuronal yneurodegeneración

B.3 Transducción de Señales porPKC atípicas

B.4.Citoesqueleto ynucleoesqueleto

B.5 Terapia génica de tumorescerebrales malignos.

B.6 Terapia génica experimental

B.7 Química de proteínas yProteómica

B.1 Mammalian mitochondrialbiogenesis

B.2 Neuronal development andneurodegeneration

B.3 Signal Transduction throughthe atypical PKC pathways

B.4 Cytoskeleton andnucleoskeleton

B. 5 Gene therapy in malignantbrain tumors

B.6 Experimental gene therapy

B.7 Protein Chemistry andProteomics

BiologíaCelularCell Biology

Resumen de Investigación

El objetivo fundamental que se persigue

con el desarrollo de esta línea de

investigación es conocer los mecanismos

celulares y moleculares que controlan la

biogénesis mitocondrial en células de

mamíferos. Se entiende por biogénesis de

la mitocondria el conjunto de procesos que

resultan en un aumento del número y/o de

la actividad mitocondrial en la célula. La

biogénesis mitocondrial es un programa

celular complejo que necesita de la

expresión coordinada de dos sistemas

genéticos que se encuentran físicamente

separados en la célula. Poco se conoce

sobre los mecanismos que regulan la

expresión coordinada de estos dos

sistemas genéticos en células de

organismos superiores. Menos aún, de su

operatividad durante el desarrollo y la

diferenciación de los distintos tipos

celulares. Por la implicación evidente que

la mitocondria tiene en múltiples

manifestaciones de la patología humana

(envejecimiento, enfermedades

neurodegenerativas, cáncer, diabetes, …..)

también se contempla el estudio de los

mecanismos que conducen a la expresión

de un fenotipo mitocondrial aberrante en

la célula.

Trabajos anteriores de nuestro laboratorio

han puesto de manifiesto que la localización

subcelular de los mRNAs que están

implicados en definir la función del orgánulo,

así como en el control de la estabilidad y

de la traducción de los mRNAs, juegan un

papel esencial en la regulación del

programa celular de biogénesis

denominado "diferenciación mitocondrial".

Un programa que tiene una importancia

fundamental durante el desarrollo de los

mamíferos y que está fuertemente reprimido

en algunas células cancerosas. Los

objetivos concretos de esta línea de

investigación se centran en la identificación

de los mecanismos que regulan la

localización subcelular y el control de la

estabilidad y traducción de estos mRNA,

en particular, del mRNA codificado por el

gen de la subunidad catalítica β de la H+-

ATP sintasa. Esto implica la identificación

y caracterización de los elementos

intrínsecos al mRNA, así como de las

proteínas celulares que interacionan con

dichos elementos, que son los responsables

de la regulación post-transcripcional de la

expresión de este gen.

Jefe de Línea / Group Leader:

José M. Cuezva.

Personal Científico / Scientific Staff:

José M. Izquierdo y

Carlo M. Di Liegro.

Técnicos de Investigación /

Technical Assistance:

Margarita Chamorro.

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Cristina Ugalde.

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Javier Ricart,

Miguel López de Heredia

(hasta enero 2000)

Gema Santamaría.

Las mitocondrias (verde, rojo y amarillo) en las

células de riñón.

Biogénesis mitocondrial en mamíferosB.1Biología Celular

Cell Biology

28

M. López de Heredia, J.M. Izquierdo and J.M. Cuezva(2000) “A conserved mechanism for controlling thetranslation of β -F1-ATPase mRNA between the fetalliver and cancer cells” J. Biol. Chem. 275, 7430-7437.

J.M. Izquierdo and J.M. Cuezva. (2000) “Internal-ribosome-entry-site functional activity of the 3’-untranslated region of the mRNA for the β subunit ofmitochondrial H+-ATP synthase”. Biochem. J. 346, 849-855.

C.M. Di Liegro, M. Bellafiore, J.M. Izquierdo, A. Rantanenand J.M. Cuezva. (2000) “3’-Untranslated regions ofoxidative phosphorylation mRNAs function in vivo asenhancers of translation”. Biochem. J. 352, 109-115.

Tesis doctorales/ Doctoral Theses

“Represión traduccional de la biogénesis mitocondrial

en hepatomas” Miguel López de Heredia Alonso

Universidad: Autónoma de Madrid Enero 2000

Sobresaliente “cum laude”.

“Identificación y caracterización molecular de la estructura

subcelular responsable del control citoplasmático de la

expresión del gen de la subunidad β de la H+-ATP sintasa

de hígado de rata”. Javier Ricart Engel Universidad

Autónoma de Madrid Enero 2000

Sobresaliente “cum laude”.

Mammalian mitochondrial biogenesis

Publicaciones /Publications:

Research summary

Our group is interested in investigating

the cellular and molecular mechanisms

that control the biogenesis of

mitochondria in mammalian cells.

Mitochondrial biogenesis is a complex

cellular response that results in an

increase in the number and/or activity

of mitochondria within the cell. The

biogenesis of mitochondria requires the

concerted expression of the nuclear and

mitochondrial genomes in which

molecular components of the organelle

are encoded. Little is known about the

mechanisms that regulate the

co-ordinated expression of these two

genetic systems in cells of higher

eukaryotic organisms. Even less is

known about their operation during

development and differentiation of

mammalian cell types. Because

mitochondria has been implicated in

many manifestations of human

pathology (ageing, neurodegenerative

diseases, cancer diabetes, …..) we are

also interested in the study of the

mechanisms that promote the

expression of an aberrant mitochondrial

phenotype in the cell.

Previous work from our laboratory has

documented that the subcellular

localisation, as well as the control of the

stability and translation of the mRNAs

that are involved in mitochondrial

function, play an essential role in the

regulation of the cell program of

“mitochondrial differentiation”. The

operation of this program is required

during mammalian development and is

repressed in certain cancers. The

specific aims of our group are the

identification and characterisation of the

mechanisms that regulate the subcellular

localisation, the stability and translation

of these mRNAs. In particular, we study

the mRNA encoding the β catalytic

subunit of the H+-ATP synthase. For this

purpose, we characterised the cis- and

trans-acting factors that are responsible

for the post-transcriptional regulation of

the expression of the gene.

29

Mitochondria (gren, red, yellow) in kidney cells.

Resumen de Investigación

La morfogénesis neuronal depende de la

organización de los diferentes componentes

del citoesqueleto, en donde los microtúbulos

desempeñan un papel central. Se ha podido

demostrar que el grado de fosforilación de

ciertas proteinas, por ejemplo, tau y

estathmina pueden controlar una serie de

procesos tales como el desarrollo neuronal,

algunos procesos neurodegenerativos e

incluso procesos oncogénicos.

Se tiene un gran interés en conocer como

afectan los cambios en la actividad de la

GSK 3 sobre distintos aspectos del

metabolismo en el sistema nervioso. Por

esta razón se han usado células de

neuroblastoma y cultivos primarios de

neuronas de regiones específicas del

cerebro, como modelos experimentales,

para examinar la expresión de ésta enzima

durante la diferenciación neuronal y las

posibles implicaciones en la patología

neuronal que se ha descrito en la

enfermedad de Alzheimer.

Nuestros resultados indican que la GSK 3

desempeña una función destacada en la

regulación de la dinámica de los

microtúbulos y que la existencia de una

mayor expresión del enzima puede ser

decisiva en la patología observada en

neuronas con esta enfermedad.

Estamos interesados también en analizar

la respuesta neuronal ante situaciones de

estress y/o lesiones del sistema nervioso

central. En este sentido , a partir de cerebros

lesionados hemos podido detecetar la

expressión de tirosinas quinasas de la

familia EPH, después de lesiones

excitotóxicas.

Hemos descrito la presencia y la sobre

expressión del componente proteoglicano

de la Proteína Precursora del Amiloide en

cerebros de pacientes de la enfermedad

de Alzheimer (AD); y hemos descrito,

además que poseen una capacidad

neuritogénica exacerbada.

Hemos descrito la presencia de la proteína

PS1(compnentes involucrados en la

patología AD) a lo largo del desarrollo

posnatal, así como su colocalización

regional y temporal con APP. Hemos podido

comprobar que la proteína quinasa

GSK3/Shaggy se activa tras la inducción

de la retracción de axones.

Esta activación aumenta la expresión de

fosfoepitopos de tau que son caracteristicos

de AD, como PHF-1. Además hemos

localizado el sisteam de activación en la

ruta de Rho

Jefe de Línea / Group Leader:

Francisco J. Moreno

Personal Científico / Scientif Staff:

Francisco Wandosell, Juan S. Jiménez,

María José Benitez, Concepción Pérez

Martín (desde Diciembre de 1999)

María Teresa Moreno

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Marta Agudo

Laura Sayas

(Predoc. 1999/ Postdoc. 2000)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Silvia Sanchez

Becarios Finnova

Beatriz García

Desarrollo neuronal y neurodegeneraciónB.2Biología Celular

Cell Biology

30

Neuronal development andneurodegeneration

Publicaciones /Publications:

Research summary

Neuronal morphogenesis depends on

the organization of cytoskeletal elements

among which microtubules play a very

important role. Regulation of tau and

stathmin phosphorylation might be one

of the key mechanism modulating

neuronal development,

neurodegenerative process and

oncogenic processes.

There are a great interest in elucidating

how different aspect of neuronal

metabolism are altered upon changes

in GSK 3 activity. Thus we have used

the human neuroblastoma cell and

primary cultures of rat cerebellar granule

neurons as model systems to study the

expression of GSK 3 during neuronal

differentiation and the possible

implications for neurite pathology in

Alzheimer"s disease. Our results are

consistent with an important role for GSK

3 in the regulation of cytoskeletal

dynamics during neurite growth and that

upregulation of GSK 3 may contribute

to cytoskeletal pathology within neurites

in AD.

We are interested too, in the analysis of

neuronal response after some stress

situations and after some insults. From

brain damaged, we have detected the

expression of tyrosine kinase of the EPH

family after excitotoxic insult.

We reported the presence of

proteoglycan Amyloide Precursor Protein

in Alzheimer’s disease brains and we

described its neuritogenic capacity. We

described the presence and the pattern

of expression of Presenilin 1 (PS1). The

localisation and the expression clear

correlated with the APP expression in

postnatal development.

In addition we have described the role

of GSK3/Shaggy, after the induction of

growth cone collapse and neurite

retraction. This activation enhanced the

phosphorylation of Tau epitopes

characteristics of AD brains, such as

PHF-1. And more significant , we

described that Rho pathway may be an

activation system of GSK3/Shaggy

31

Moreno FJ , Bagnat M , Lim F, and J Avila. (1999) Op

18/stathmin binds near the C-terminus of tubulin and

facilitates GTP binding. Eur J Biochem. 262, 557-562

Muñoz-Montaño JR , MorenoFJ , Avila J and Díaz-Nido

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Biochem. 191, 29-33

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modulates neurite outgrowth in cultured neurons: possible

implications for neurite pathology in Alzheimer's disease.

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of Eph receptor tyrosine kinase receptor after excitotoxic

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Gonzalez-Billault C., Demandt, E., Wandosell, F. Torres

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microtubule-associated protein 1B deficint mice expressing

alternative isoform of the protein at low levels. Molecular

Cell. Neuroscience 16, 408-421.

Tesis doctorales/ Doctoral Theses

“Análisis de los mecanismos moleuclares implicados

en la retracción de neuritas inducidas por ácido

lisofosfatídico ”, Laura Sayas Casanova, Univ.

Autonoma de Madrid, (2000) Apto cum laude

Colaboración con la Industria“Análisis de inhibidores de GSK3”

Acuerdo de colaboración UAM/CSIC y Neurofarma

Resumen de Investigación

La transducción de señales mediante la

fosforilación de proteínas implica una serie

de etapas que son esenciales en un gran

número de funciones celulares tales como

el crecimiento y la diferenciación celular o

la apoptosis. Estos procesos, cuando se

alteran, dan lugar a patologías como el

cáncer o los fenómenos inflamatorios. Un

aspecto clave en la comprensión de los

mecanismos que regulan la implicación de

quinasas en estos procesos es la

identificación de adaptadores y reguladores

específicos que confieren selectividad

funcional a estas enzimas. En este sentido,

las PKC atípicas (aPKC) son un excelente

paradigma de esta problemática ya que

han sido involucradas in diversas cascadas

de señalización que regulan dianas

moleculares completamente diferentes.

La identificación, en nuestro laboratorio, de

una secuencia relativamente corta de

aminoácidos, denominada AID (por Atypical

PKC Interacting Domain), que es necesaria

para que distintos adaptadores puedan

interaccionar con las aPKCs, explica cómo

una sola quinasa puede jugar distintas

funciones celulares. De esta manera, a

través de la proteína de andamiaje p62 las

aPKCs se ubican en la cascada de NF-κB

por debajo de RIP o TRAF6 y por encima

del complejo de IκB quinasa, que es

esencial para la supervivencia celular y la

transformación tumoral. Mediante su

interacción con la secuencia AID de MEK5,

las aPKCs pueden controlar el crecimiento

celular; mientras que por medio del AID de

Par-6 parecen estar implicadas en la

regulación de la polaridad celular. Además,

las aPKCs pueden ser inhibidas por la

proteína pro-apoptótica Par-4 cuyos niveles

se deplecionan durante la transformación

oncogénica, un evento clave para la

progresión tumoral.

Los objetivos actuales de nuestro laboratorio

se centran en tres cuestiones principales:

1) comprender en detalle las interacciones

que gobiernan la interacción de AID con

las aPKCs, lo que será importante para

el diseño de nuevos agentes terapéuticos

con propiedades anti-cancerosas y anti-

inflamatorias;

2) estudiar en ratones “knock out” el impacto

fisiológico que tiene la inactivación in

vivo de las aPKCs y sus moduladores;

3) investigar los mecanismos que utilizan

los oncogenes para promover la

depleción de Par-4.

En su conjunto, los resultados de todos

estos estudios nos suministrarán

información esencial para la comprensión

de los mecanismos que establecen la

especificidad funcional durante la

transducción de señales y permitirán

identificar nuevas dianas terapéuticas

potencialmente útiles para el diseño de

nuevas terapias.

Jefe de Línea / Group Leader:

Jorge Moscat

Personal Científico / Scientific Staff:

María Teresa Díaz-Meco Conde

Becarios Postdoctorales / Postdoctoral

Fellows:

Laura Sanz, María José Lafuente,

Teresa Zamarro, Christine Bezombes,

Antonia Avila,

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Pilar Sánchez, Sonia Frutos,

Angeles Durán

Técnicos de Investigación /

Technicians:

Esther García, Esther Fuertes,

Carolina Bermejo, Javier Millán,

Vanessa Sánchez

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

Marie W. Wooten

(Auburn University, Alabama, USA)

La estimulación con IL-1 promueve la formación de un complejo triple

IRAK-p62-TRAF6 in vivo.

Células Hep G2 se transfectaron con plásmidos Flag-TRAF6, HA-IRAK

y GFP-p62, tras lo cual fueron estimuladas (IL-1) o no (Control) con

IL-1 durante 10 min. Estas células fueron analizadas por microscopía

confocal de barrido con un anticuerpo de conejo policlonal anti-HA y

anticuerpo anti-conejo Alexa 594 (fluorescencia roja) para detectar

IRAK; asimismo, estas células se analizaron con un anticuerpo

monoclonal anti-Flag y anti ratón Cy5 (fluorescencia azul) para detectar

TRAF6. La fluorescencia verde indica la expresión de GFP-p62.

Transducción de Señales por PKC atípicasB.3

32

Biología CelularCell Biology

Lallena, M.J., Diaz-Meco, M.T., Bren, G., Payá, C.V.,

Moscat, J. (1999). Activation of IκB Kinase β by Protein

Kinase C Isoforms. Mol. Cell. Biol. 19, 2180-2188

Bandyopadhyay, G., Standaert, M.L.,Kikkawa, U., Ono,

Y., Moscat, J., Farese, R.V. (1999). Effects Of Transiently

Expressed Atypical (ζ,λ), Conventional (α,β) And Novel

(δ,ε) Protein Kinase C Isoforms on Insulin-stimulated

Translocation of Epitope-Tagged GLUT4 Glucose

Transporters In Rat Adipocytes: Specific Interchangeable

Effects of Protein Kinases C-ζ And C-λ. Biochem. J. 337,

461-470

Frutos, S., Moscat J., Diaz-Meco, M.T. (1999). Cleavage

of PKC but not of /PKC by Caspase-3 During UV-Induced

Apoptosis. J. Biol. Chem. 274, 10765-10770

Sanz, L., Sanchez, P., Lallena, M.J., Diaz-Meco, M.T.,

Moscat, J. (1999). The Interaction of p62 with RIP Links

the Atypical PKCs to NF-κB activation. EMBO J. 18,

3044-3053

Diaz-Meco, M.T., Lallena, M.J., Frutos, S., Monjas, A.,

Moscat, J. (1999). Inactivation of the IκB/NF-κB by Par-

4 Expression Potentiates TNFα-induced Apoptosis. J.

Biol. Chem. 274, 19606-19612

Barradas, M., Monjas, A., Diaz-Meco, M.T., Serrano, M.,

Moscat, J. (1999). The Down-regulation of the Pro-

apoptotic Protein Par-4 is Critical for Ras-Induced Survival

and Tumor Progression. EMBO J. 18, 6362-6369

Sanz, L., Diaz-Meco, M.T., Nakano, H., Moscat, J. (2000)

The atypical PKC- interacting protein p62 channels NF-

κB activation by the IL-1/TRAF6 pathway. EMBO J. 19,

1576-1586

Van der Houven, W., Diaz-Meco, M.T., Lozano, J., Krainer,

A.R., Moscat, J., Cáceres, J. (2000) The MKK3/6-p38

Signaling Cascade Alters the Subcellular Distribution of

hnRNPA1 and Modulates Alternative Splicing Regulation.

J. Cell Biol. 149, 307-316

Thomas, G., de Pablo, F., Schlessinger, J., Moscat, J.

(2000) The Ins and Outs of Protein Phosphorylation

(Meeting Review). EMBO Reports 1, 11-15

Rust, C., Karnitz, L.M., Paya, C.V., Moscat, J., Simari,

R.D., Gores, G.J. (2000) The Bile Acid Taurocheno-

deoxycholate Activates a Phosphatidylinositol 3-Kinase-

Dependent Survival Signaling Cascade. J. Biol. Chem.

275, 20210-20216

Moscat, J. and Diaz-Meco, M.T. (2000) The Atypical

Protein Kinase Cs: Functional Specificity Mediated by

Specific Protein Adapters (Review). EMBO Reports 1,

399-403

Signal Transduction through the atypical PKCpathways

Publicaciones /Publications:

Research Summary

Cell signaling through protein

phosphorylation constitutes a series of

events that are essential for a number

of important functions such as cell

growth, differentiation and apoptosis

which are subverted in human diseases

such as cancer and inflammation.

A key issue for understanding the

mechanisms that regulate the implication

of kinases in these processes is the

identification of selective adapters and

regulators that endow otherwise

promiscuous kinases with functional

specificity. In this regard, the atypical

PKC (aPKC) isoforms are an excellent

paradigm for this, as they have been

implicated in a number of distinct

signaling cascades that involve

completely different downstream targets.

The recent identification in our laboratory

of a relatively short amino acid sequence,

termed AID (for aPKC-interacting

domain), that is required for these PKCs

to interact with different protein adapters,

explains how a single kinase can fulfill

different functional roles. Thus, through

the interaction with the scaffold protein

p62, the aPKCs are located in the NF-

κB pathways downstream of effectors

such as RIP or TRAF6 and upstream

the critical IκB kinase complex, that is

essential for cell survival and tumor

transformation.

Through their interaction with the AID of

MEK5, the aPKCs impact cell growth,

and through the interaction with Par-6

they are actively involved in the control

of cellular polarity. In addition, the aPKCs

can be inhibited by the pro-apoptotic

protein Par-4 that is down-regulated

during transformation, a critical event for

tumor progression.

The present interest of our laboratory is

focused on three main issues:

1) To understand, at a detailed structural

level, the interactions that govern the

binding of AID with the aPKCs, which

will be important to design new

therapeutic agents that by blocking

those interactions could aid in the

treatment of cancer;

2) To study in knock-out mice the

physiological impact in vivo of the

inactivation of the aPKCs and their

regulators;

3) To investigate the mechanisms

whereby oncogenes promote the

down-regulation of Par-4.

Altogether, the results of these studies

will provide essential information to

understand how specificity is achieved

during signal transduction and will identify

new targets potentially useful to design

new therapeutic strategies.

33

IL-1 stimulation promotes the formation of a ternary complex containing IRAK-p62-TRAF6 in vivo.

HepG2 cells were transfected with Flag-TRAF6 and HA-IRAK along with a GFP-p62 construct, after which

cells were either untreated (Control) or stimulated with IL-1 (IL-1) for 10 min. Cells were then analyzed by triple

confocal laser scanning microscopy with a rabbit polyclonal anti-HA antibody and an anti-rabbit Alexa 594

antibody (red fluorescence) to detect IRAK, and a monoclonal anti-Flag antibody and an anti-mouse Cy5

antibody (blue fluorescence) to detect TRAF6. Green fluorescence indicated the expression of GFP-p62.

Resumen de investigación

La proteína 4.1 fue originalmente

identificada en el eritrocito humano como

un componente de 80 kDa cuya función es

el anclaje del citoesqueleto de actina a la

membrana plasmática. Estudios posteriores

pusieron de manifiesto que en células

nucleadas de mamífero la situación era

más compleja puesto que hay una gran

variabilidad de isoformas, originadas

mediante splicing alternativo del RNA

precursor, que se distribuyen en diferentes

compartimentos subcelulares y cuya función

está empezando a ser caracterizada. En

este sentido, nuestro laboratorio ha descrito

que 4.1 es un componente del

nucleoesqueleto al que se anclan factores

implicados en ‘splicing’.

Los objetivos principales que está

abordando nuestro grupo son: 1) la

caracterización de las señales responsables

de la distribución subcelular diferencial de

las isoformas de 4.1; 2) el estudio de las

funciones de 4.1 en los distintos

compartimentos subcelulares en los que

se localiza.

Los logros mas destacables del bienio 1999-

2000 han sido:

1) La identificación de un mecanismo

adicional generador de diversidad de

isoformas de 4.1 consistente en la utilización

de un tercer sitio de iniciación de la

traducción (ATG3) en el mRNA de 4.1. Este

sitio de iniciación sería el responsable de

la síntesis de un grupo de isoformas de

bajo peso molecular de 4.1 que se localizan

exclusivamente en el núcleo.

2) La delimitación de una secuencia

codificada por el exón 5 del gen de la 4.1

implicada en la localización citoplasmática

de la proteína 4.1. Una región rica en

leucinas con homología con las señales

denominadas NES (nuclear export signal)

es responsable de dicha localización. Estos

datos junto con resultados previos de

nuestro grupo muestran que si bien todas

las isoformas de 4.1 presentan una región

constitutiva que las dirige al núcleo, aquellas

que expresan el exón 5 alternativo (y por

tanto la NES) serían posteriormente

exportadas al citoplasma.

3) La identificación de una isoforma

específica de la proteína 4.1 que participa

en el mantenimiento de la organización de

los microtúbulos celulares.

Citoesqueleto y nucleoesqueletoB.4

34

Biología CelularCell Biology

Jefe de Línea / Group Leader:

Isabel Correas

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Carlos Manuel Luque González

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Carmen María Pérez-Ferreiro,

Alicia Pérez-González

Estudiantes de Licenciatura /

Undergraduate Students:

Elimelec Sendino Martos

Estudiante escuela técnica /

Technical Students:

Marta Casla García

Luque, C.M., Lallena, M.J., Pérez-Ferreiro, C.M., de

Isidro, Y., De Cárcer, G., Alonso, M.A. and Correas, I.

(1999). “The N-terminal 209-aa domain of high molecular-

weight 4.1R isoforms abrogates 4.1R targeting to the

nucleus”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:14925-14930.

Luque, C.M. and Correas, I. (2000). “A constitutive region

is responsible for nuclear targeting of 4.1R: Modulation

by alternative sequences results in differential intracellular

localization”. J.Cell Sci. 113:2485-2495.

Tesis doctorales/ Doctoral Theses

Carlos Manuel Luque González: "Caracterización de

isoformas de la proteína 4.1: Identificación de dominios

responsables de su localización subcelular". Universidad

Autónoma de Madrid. 1999. Apto cum laude.

Cytoskeleton and nucleoskeleton

Publicaciones /Publications:

Research Summary

Protein 4.1 was originally identified as an

80 kDa component of the membrane

skeleton of human red blood cells. In

these cells, 4.1 acts as an stabilizing

protein of the spectrin-actin network, linked

to the plasma membrane via interactions

with transmembrane proteins. Subsequent

studies showed that, in nucleated cells,

there are many isoforms of 4.1 that are

heterogeneous in size and intracellular

localization. Little is known about the

functional roles that proteins 4.1 are

playing in nonerythroid cells. Studies

carried out by our group have shown that

a specific 4.1 isoform is a component of

the nucleoskeleton to which proteins of

the splicing machinery attach.

The main current goals of our group are:

1) to characterize the sequence motifs

involved in differential targeting of proteins

4.1; 2) to investigate the roles that 4.1

plays in nucleated cells.

During the 1999-2000 period, our main

findigs are summarized as follows:

1) Identification of a third translation

initiation site (ATG3) in the 4.1 mRNA

which contributes to the generation of 4.1

isoform diversity. This site is responsible

for the synthesis of a group of low

molecular weight 4.1 isoforms specifically

targeted to the nucleus.

2) Delimitation of a sequence encoded

by exon 5 of the 4.1 gene responsible for

the cytoplasmic localization of a specific

subset of proteins 4.1. This sequence is

highly homologous to leucine-rich nuclear

export signals (NES). Our results showed

that all 4.1 proteins contain a conserved

region involved in nuclear targeting and

that 4.1 proteins expressing the alternative

exon 5 (therefore the NES) are

subsequently exported to the cytoplasm.

3) Characterization of a specific 4.1

isoform involved in the maintenance of

microtubule organization.

35

Resumen de Investigación

Los glioblastomas representan casi el 40%

de los tumores primarios cerebrales, poseen

una mortandad superior al 90 %

considerándose prácticamente incurables.

Los tratamientos empleados hasta el

momento (radioterapia, quimioterapia y

cirugía) no han sido capaces de mejorar

estos drásticos resultados. Los avances

recientes en ingeniería genética permiten

la utilización de nuevos procedimientos.

Estamos utilizando dos nuevas estrategias

alternativas a los sistemas asesino-suicidas

conocidos de terapia génica. La primera

basada en un gen vegetal (linamarasa) que

transforma el sustrato inocuo linamarina (2-

HO isobutyronitrile-β-D-glucopyranoside)

en glucosa y cianuro. Con este sistema

hemos logrado erradicar tumores de hasta

1000 mm3 de volumen en la rata Wistar. El

efecto colateral debido al cianuro puede

compensar los bajos porcentajes de

infección viral que se estiman en tumores

sólidos.

Se pretende caracterizar en profundidad

este sístema para su eventual utilización

en humanos. La segunda estrategia se

basa en la utilización de un promotor

regulable seguido de una potente toxina

para la célula eucariótica.

El promotor utilizado es el de la proteína

básica mielínica MBP (del inglés: myelin

basic protein) cuya expresión esta de forma

natural favorecida en oligodendrocitos y

células de la glia y se puede controlar los

niveles de actividad con la hormona tiroidea

T3. Hemos colocado detrás del promotor

inducible en unos casos la exotoxina A de

Pseudomonas y en otros la cadena A de

la ricina procedente originalmente de la

planta Ricinus communis.

Personal Científico / Scientif Staff:

Marta Izquierdo

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Marisa Cortés (hasta septiembre de

1999); Verónica Martín (hasta

noviembre de 1999);

Pablo de Felipe; Vega García-

Escudero; Pedro Carmona;

Daniel muñóz .

Técnico de laboratorio / Technical

Assistance:

Marta Vaz

Científico visitante / Visiting

Scientist:

Silvia Ciafré.

Universidad Tor Vergata de Roma.

Facultad de medicina. Septiembre-

Noviembre 2000.

Terapia génica de tumores cerebrales malignos.B.5

36

Biología CelularCell Biology

Gene therapy in malignant brain tumors

Research Summary

Glioblatomas represent almost 40% of

primary brain tumors, have over 90%

mortality and are considered virtually

incurable. The current cancer therapies

such as surgery, radiation and/or

chemotherapy, have had little success to

improve the median survival, of less than

a year, in patients with malignant gliomas.

The new advances in genetic engineering

allows the use of new strategies.

We are using two new destructive gene

therapy systems as alternatives to other

known killer-suicide methods in gene

therapy. The first strategy is based on the

plant gene (linamarase) that will hydrolyze

the innocuous substrate linamarin (2-HO

isobutyronitrile-β-D-glucopyranoside) into

cyanide and glucose.

We have successfully used this approach

to eradicate tumors up to a volume of

1000 mm3 in the Wistar rat. The bystander

effect due to cyanide can compensate

the low viral percentages of infection

estimated in solid tumors. Our intention

is to characterize in depth this system in

order to be able to use it in humans in

the future. The second strategy is base

in the combination of an inducible

promoter with a powerful toxin against

the eucariotic cell. The chosen promoter

is the MBP (myelin basic protein) that is

preferentially expressed in

oligodendrocites and glioma cells.

The presence or absence of the thyroid

hormone T3 controls the activity of this

promoter. Two different toxins were placed

immediately after the inducible promoter:

the Pseudomonas exotoxin A and the

Achain of ricin, originally from the plant

Ricinus communis.

37

Publicaciones /Publications:

de Felipe, P., Martín, V., Cortés, M.L., Ryan, M. &

Izquierdo, M. (1999) “Use of the 2A sequence from foot-

and-mouth disease virus in the generation of retroviral

vectors for gene therapy” Gene Therapy 6 198-208.

Marta Izquierdo (1999) “Terapia génica” Revisiones en

Cáncer 13 9-15.

Ismael Galve-Roperh; Cristina Sanchez; Maria Luisa

Cortés; Teresa Gomez del Pulgar; Marta Izquierdo and

Manuel Guzmán (2000). “Anti-tumoral action of

cannabinoids: involvement of sustained ceramide

accumulation and extracellular signal-regulated kinase

activation” Nature Medicine 6 313-319.

Verónica Martín, Maria Luisa Cortés, Pablo de Felipe,

Antonella Farsetti, Nora B.Calcaterra and Marta Izquierdo

(2000). “Cancer gene therapy by thyroid-hormone

mediated expression of toxin genes” Cancer Research

60, 218-3224.

Pablo de Felipe and Marta Izquierdo (2000). “Tricistronic

and tetracistronic retroviral vectors for gene therapy”

Human Gene Therapy 11 1921-1931.

Tesis doctorales/ Doctoral theses

"Utilización de vectores retrovirales portadores de genes

suicidas en el tratamiento de tumores cerebrales malignos”

Maria Luisa Cortés Peña, Universidad Autónoma de

Madrid, 1999. Sobresaliente Cum Laude.

"Diagnóstico molecular de tumores cerebrales”

Isabel E. Jimenez de Lucas, Universidad Autónoma de

Madrid 1999. Sobresaliente Cum Laude.

“Construcción y estudio de vectores retrovirales portadores

de toxinas para el tratamiento de tumores cerebrales por

terapia génica”. Verónica Martín García, Universidad

Autónoma de Madrid, 1999. Sobresaliente Cum Laude.

“Construcción y caracterización de nuevos vectores

retrovirales para la terapia génica del cáncer”. Pablo de

Felipe Fernandez, Universidad Autónoma de Madrid

2000. Sobresaliente Cum Laude

Resumen de Investigación

La capacidad de integración de los vectores

retrovirales es un inconveniente para

algunas de sus aplicaciones a la terapia

génica, tales como la sustitución génica,

ya que la interacción homóloga entre la

secuencia curativa y el gen defectivo puede

resultar ineficiente debido a la acción de la

integrasa.

Hemos construido partículas retrovirales

defectivas en integración que transducen

una secuencia parcial del gen de la timidina

kinasa del virus Herpes (gen htk). Estas

partículas se usaron para transducir células

portadoras de un gen htk con una mutación

de cambio de fase, obteniéndose una

curación de cada 5000 células transducidas,

frecuencia 1000 veces mayor que la

obtenida por otros grupos usando vectores

no optimizados y modelos celulares no

caracterizados completamente Hemos

detectado interacciones pseudocurativas

no basadas en homología, para cuya

caracterización y evaluación de su influencia

en futuras aplicaciones clínicas hemos

diseñado un nuevo modelo celular en el

que el gen htk defectivo ha sido fusionado

con el gen de la proteína fluorescente verde

(egfp). Ambas actividades serán restauradas

sólo si un genuino evento de recombinación

elimina la mutación del gen htk.

Con el fin de aumentar la capacidad de

interacción por homología, así como de

conferir a los vectores retrovirales ventajas

que ofrecen vectores episomales, hemos

aprovechado la capacidad del cDNA

retroviral para formar círculos cuando falla

su integración. Los vectores defectivos en

integración fueron dotados con elementos

episomal en cis (el origen de replicación de

SV40) y en trans: la región de unión la

matriz (MAR) del gen del interferón βhumano. Actualmente estamos estudiando:

a) El efecto de los elementos episomales

sobre el título viral obtenido; b) el estado

episomal o integrado de los genes

transducidos; c) el efecto de los elementos

episomales, en combinación con la

retrotranscripción inherente al sistema,

sobre la integridad de las secuencias de

DNA transducidas.

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Antonio Talavera Díaz.

Becarios Predoctorales /

Graduate Students

Humberto Sánchez González

Laura Fuentes Sánchez

Terapia génica experimentalB.6

38

Biología CelularCell Biology

Experimental gene therapy

Research Summary

The integrative nature of retroviral gene

therapy vectors is sometimes considered

disadvantageous, integration directly

affecting their application to substitutive

gene therapy, as the homology-based

interaction between the vector-carried

curative sequence and the defective gene

would be masked by the integrase-

mediated nonhomologous interaction,

making the sought-for process inefficient.

We have constructed integration-defective

retroviral particles transducing a partial

sequence of the Herpes thymidine kinase

(htk) gene. When these were used to

transduce mouse cells harbouring an htk

gene with a frameshift mutation, one in

5000 cells were cured, a frequency 1000-

fold higher than the ones reached by other

groups using non-optimised vectors and

less-characterised cell models. Besides

genuine homologous recombination, we

have detected pseudocurative vector-

genome interactions; to characterise these

and to evaluate their effect on future

clinical applications, we designed another

model containing the defective htk gene

fused to the green fluorescent protein

(egfp) gene. Both activities are restored

only if a genuine homologous interaction

eliminates the mutation in the htk moiety;

any type of pseudocurative interaction

will be distinguished from a genuine

correction by the absence of fluorescence.

In order to increase the chance of

homologous interaction and to confer

retroviral vectors the advantages that

episomal vectors offer, we have taken

advantage of the ability that retroviral

cDNA exhibits to form circles when

integration fails. Integration-defective

retroviral vectors have been endowed

with a cis episomal element (the SV40

replication origin) and a trans- acting one:

the matrix attachment region (MAR)

corresponding to the human β-interferon

gene. Vectors carrying these elements

are being studied to evaluate: a) the effect

of the episomal elements on the titres

reached; b) the episomal versus

integrated state of the genes transduced

by these vectors ; c) the effect that the

episomal elements, in combination with

the inherent retrotranscription process

can exert over the integrity of the

transduced DNA sequences

39

Publicaciones /Publications:

A. Talavera (1999) Comentario "La terapia génica

permite la recuperación de la inmunidad específica de

virus en un modelo murino de inmunodeficiencia severa

combinada" al artículo homónimo de KD Bunting y col.

Virología. 6: 58-60.

A.Talavera, A. Liras, L. Fuentes y H. Sánchez.(2000) "El

VIH y otros retroviruscomplejos en la terapia génica de

células en reposo" Virología 7, 2-15.

Jefe de Línea / Group Leader:

Jesús Vázquez

Técnicos de Investigación / Technical

Assistance:

Fernando Barahona, Josefa González-

Nicolás, Anabel Marina, Rosana Rogado

Becarios predoctorales / Predoctoral

fellows:

Mónica Campillos

Becarios postdoctorales/Postdoctoral

fellows: Samuel Ogueta,

José Ramón Lamas

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

Fernando Martín (ThermoFinnigan, CA,

USA)

Carmen Piñeiro (Instituto Investigaciones

Marinas Vigo)

Montse Carrascal (Instituto

Investigaciones Biomédicas Barcelona)

José Luis López (Universidad de

Santiago Compostela)

Juan Ramón Hernández (Universidad

de La Laguna)

Jesús Mateos (Instituto Investigaciones

Biomédicas Madrid)

Fernando Viedma (Hospital de La

Princesa, Madrid)

Fernanda Agius (Universidad de Málaga)

Iria Soto (Universidad Complutense de

Madrid)

Química de Proteínas y ProteómicaB.7

40

Biología CelularCell Biology

Resumen de Investigación

El avance tecnológico más importante de

nuestro laboratorio es la implementación

de un método jerárquico para la

identificación de proteínas a gran escala.

Las bandas de proteínas de SDS-PAGE o

electroforesis bidimensional se digieren “en

gel”, y se obtienen mapas de péptidos

mediante espectrometría de masas (EM)

tipo MALDI-TOF, que se usan como “huellas

peptídicas” específicas para identificar las

proteínas en las bases de datos. Los

péptidos se analizan mediante nanospray-

trampa iónica MS/MS, y los espectros de

fragmentación obtenidos se usan para

identificar la proteína con muy alta fiabilidad

cuando la huella peptídica resulta

insuficiente. Esta estrategia, por su rapidez

y sensibilidad, ha desplazado

completamente la secuenciación clásica de

Edman, que sólo se usa para determinar

la secuencia N-terminal. La implementación

de este método ha permitido el comienzo

de proyectos de identificación de proteínas

a gran escala (“Proteómica”) en nuestro

centro.

Se ha invertido un gran esfuerzo en el

desarrollo de métodos para la identificación

de modificaciones postraduccionales

mediante EM. Por ahora hemos

caracterizado, en colaboración con otros

grupos, 16 modificaciones, incluyendo, entre

otras, 9 sitios de fosforilación, y una

acetilación en un péptido presentado por

el MHC.

Nuestro grupo también ha desarrollado gran

experiencia en la secuenciación “de novo”

de péptidos no presentes en las bases de

datos, mediante interpretación manual de

espectros de fragmentación múltiple (MSn).

Hemos secuenciado “de novo” más de 200

péptidos. En colaboración con Fernando

Martín, hemos aprovechado esta

experiencia para el desarrollo de un

programa de inteligencia artificial que

permite la secuenciación automática “de

novo” de péptidos. Este programa es capaz

de obtener secuencias peptídicas completas

en casos donde un operador experto sólo

consigue obtener información parcial, e

incluso secuencias de péptidos conocidos

en situaciones en las que los motores de

búsqueda actuales no los identifican en la

base de datos. Nuestro programa podría

abrir el camino a la Proteómica de especies

cuyo genoma no está representado en las

bases de datos.

En el aspecto científico, estamos trabajando

en la identificación de factores implicados

en la regulación del promotor del gen APOE,

en relación con el riesgo de desarrollar la

enfermedad de Alzheimer (EA). Hemos

identificado un factor nuclear con una

afinidad preferente por una variante

polimórfica asociada a un aumento en el

riesgo de EA, y dos proteínas que modulan

el efecto de AP-2, un factor de transcripción

que regula el promotor en cerebro. También

hemos caracterizado los aminoácidos de

AP-2 implicados en la unión al promotor

mediante un método nuevo basado en

ensayos de protección de DNA a la digestión

tríptica y análisis de mapas de péptidos

mediante MALDI-TOF.

Protein Chemistry and Proteomics

Research Summary

The most important technical

development of our laboratory is the

implementation of a hierarchical mass

spectrometry-based (MS) method for

high-throughput protein identification.

Proteins bands or spots from SDS-PAGE

or bidimensional electrophoresis are “in

gel” digested, and peptide mass-maps

obtained by MALDI-TOF MS, which are

used as specific “fingerprints” to identify

the proteins in databases. The peptides

are analyzed by nanospray-ion trap (nESI-

IT) MS/MS, and the resulting fragment

spectra are used for highly-accurate

peptide identification when the protein

was not unambiguously identified from

the peptide fingerprint. The approach is

much faster and sensitive, and has

completely displaced classical Edman

sequencing, which are only used for

determining N-terminal sequence. The

successful implementation of the method

allowed our center to begin large-scale

protein identification projects

(“Proteomics”).

A great effort is being devoted to the

development of methods for identifying

posttranslational modifications by MS. By

now, we have characterized, in

collaboration with other groups, 16

modifications, including, among others,

9 phosphorylation sites, and an acetylation

in peptide presented by the MHC.

We have also developed a great skill in

“de novo” sequencing of peptides not

present in databases, by manual

interpretation of multiple subfragmentation

(MSn) spectra. We have sequenced “de

novo” more than 200 peptides. In

collaboration with Fernando Martín, we

have taken advantage of this experience

for the development of artificial-

intelligence-based software for automated

“de novo” peptide sequencing. The

software is able to obtain complete peptide

sequences in cases where an expert

operator only manages to obtain partial

information, and even sequences from

known peptides in situations where current

search engines fail to retrieve them from

databases. Our software may open up

the way to performing Proteomics from

species not present in databases.

In the scientific aspect, we are involved

in the identification of factors implicated

in the regulation of APOE gene promoter,

in relation with the risk of developing

Alzheimer’s disease (AD). We have

identified a factor which binds with higher

affinity a polymorphic variant which is

associated with increased AD risk, and

two proteins which modulate the effect of

AP-2, a transcription factor which

regulates the promoter in brain. Finally,

we have identified the exact amino acids

of AP-2 involved in binding to the promoter

using a novel method based in DNA-

protection from tryptic digestion and

MALDI-TOF peptide mapping.

41

Publicaciones /Publications:

Marina A., García M.A., Albar J.P., Yagüe J., López de Castro

J.A. and Vázquez J. (1999) “High Sensitivity Analysis And

Sequencing Of Peptides And Proteins By Quadrupole Ion Trap

Mass Spectrometry”

J. Mass Spectrom. 34, 17-27

Yagüe J., Ramos M., Vázquez J., Marina A., Albar J. P. and

López de Castro J.A. (1999) "The south amerindian allotype

HLA-B*3909 has the largest known similarity in peptide specificity

and common natural ligands with HLA-B27" Tissue Antigens

53, 227-236

García M.A., Campillos M., Marina A., Valdivieso F. and Vázquez

J. (1999) "Transcription factor AP-2 activity is modulated by

protein kinase A-mediated phosphorylation" FEBS Letters 444,

27-31

C. Sánchez, N. Domenech, J. Vázquez, F. Alonso, A. Ezquerra,

J. Domínguez (1999) "The porcine 2A10 antigen is homologous

to human CD163 and related to macrophage differentiation" J.

Immunology 162, 5230-5237

Reyero M. I., Cacho E., Martínez A., Vázquez J., Marina A.,

Fraga S. and Franco J.M. (1999) "Evidence of saxitoxin

derivatives as causative agents in the 1997 mass-mortality of

mediterranean monk seals in the Cape Blanc peninsula" Natural

Toxins 7, 311-315

Paradela A., Alvarez I.,García-Peydró M., Sesma L., Ramos

M.,Vázquez J. and López de Castro J.A. (2000)

"Limited diversity of peptides related to an alloreactive T-cell

epitope in the HLA-B27-bound peptide repertoire results from

restrictions at multiple steps along the processing-loading

pathway" J. Immunology 164, 329-337

E. Núñez, B. López-Corcuera, J. Vázquez, C. Giménez and C.

Aragón (2000) "Differential effects of the tricyclic antidepressant

amoxapine on glycine uptake mediated by the recombinant

GLYT1 and GLYT2 glycine transporters" British J. Pharmacology,

129, 200-206

S.Ogueta, R.Rogado, F.Moreno, J.M.Redondo and J.Vázquez

(2000) "Identification of phosphorylation sites in proteins by

nanospray-quadrupole ion trap mass spectrometry" J.Mass

Spectrom., 35, 556-565

Yagüe J., Alvarez I., Rognan D., Ramos M.,Vázquez J. and

López de Castro J.A. (2000) "An N-acetylated natural ligand

of HLA-B39: classical class I MHC proteins bind peptides with

blocked N-terminus in vivo” J.Exp.Med., 191, 2083-2092

García M. A., Campillos M., Ogueta A., Valdivieso F. and

Vázquez J. (2000) "Identification of amino acid residues of AP-

2 transcription factor critical for DNA binding" J.Mol.Biol., 301,

807-816

J. Yagüe, J.Vázquez and J.A. López de Castro (2000)

“A post-translational modification of nuclear proteins, NG,NG-

dimethyl-Arg, found in a natural HLA class I peptide”

Protein Science 9, 2210-2217

Yagüe J., Ramos M., Ogueta S.,Vázquez J. and López de

Castro J.A. (2000) “Peptide specificity of the amerindian B*3905

allotype: molecular insight into selection mechanisms driving

HLA class I evolution in indigenous populations of the Americas”

Tissue Antigens 56, 385-391

C

Inmunologíay VirologíaImmunologyand Virology

C.1 Transmisión de señales através del receptor para elantígeno de celulas T

C.2 Bases moleculares de lapatogenicidad y del potencialanti-tumoral de los parvovirus.

C.3 Biología de la infección decélulas por virus animales

C.4 Variabilidad genética devirus RNA

C.5 Activación del Sistema Inmune

C.6 Replicación del DNA yciclo celular

C.7 Expresión génica enprogramas de activaciónlinfocitaria y angiogénesis

C.8 Replicación y transcripcióndel DNA del bacteriófago ø29

C.9 Virus de la peste porcinaafricana

C.10 Desarrollo del sistema linfohematopoyético humano

C.11 Inmunología de los antígenos

de histocompatibilidad

C.1 Signal Transduction throughthe T cell antigen receptor

C.2 Molecular bases of parvoviruspathogenicity and anti-tumourpotential

C.3 Biology of animal virusinfection

C.4 Genetic variability of RNAviruses

C.5 Activation of the ImmuneSystem

C.6 DNA replication andcell cycle

C.7 Gene expression inlymphocyte activation andangiogenesis

C.8 Replication and transcriptionof bacteriophage ø29

C.9 African swinefever virus

C.10 Development of the humanlymphohematopoietic system

C.11 Immunology of histocompatibility antigens

Resumen de Investigación

El receptor para el antígeno de los linfocitos

T (TCR) está compuesto de 6 subunidades:

TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε y

CD3ζ. Mientras que las dos primeras son

responsables del reconocimiento del

antígeno, las demás están encargadas de

la transmisión de señales al interior celular.

El TCR no actúa como un simple interruptor

sino que es capaz de dar distintas

respuestas dependiendo de ligeras

modificaciones en el antígeno. En nuestro

laboratorio, estamos dedicados al estudio

de los mecanismos que regulan la

formación de este complejo multiproteíco

y de cómo se transmiten las señales de

activación al interior de la célula. En líneas

generales, los objetivos de nuestra línea

de investigación son los siguientes:

Dilucidar la estequiometría del TCR.

Tenemos evidencia de que cada complejo

TCR tiene dos heterodímeros TCRα/β y,

por lo tanto, el potencial de unir dos ligandos

simultáneamente. Esto nos ha llevado a un

modelo de TCR dimérico que tiene

relevancia para entender los mecanismos

de activación (modelos de activación

seriada y en paralelo) y la afinidad de su

interacción con el antígeno.

Estudiar los mecanismos de ensamblaje y

retención intracelular. Existe un mecanismo

de control de calidad que regula la expresión

de complejos completos en la superficie

celular. Los complejos incompletos y las

subunidades aisladas son retenidas

intracelularmente, en el retículo

endoplásmico y/o degradadas. Nuestro

interés se centra en la caracterización de

las señales de retención intracelular

existentes en las distintas subunidades y

en cómo son anuladas cuando se forma

un complejo TCR completo.

Redundancia/especialización funcional de

las subunidades del TCR. Estamos

estudiando hasta qué punto la existencia

de múltiples subunidades y motivos de

transmisión de señales obedece a una

necesidad de especialización funcional ó

a una mera necesidad de amplificación de

señales. Nuestros estudios se enfocan

principalmente a la dilucidación del papel

de las subunidades del TCR en los

procesos de maduración y selección tímica.

Jefe de Línea / Group Leader:

Balbino Alarcón

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Aldo Borroto (hasta Mayo 2000)

Ester San José

Edgar Fernández

Wolfgang Schamel (desde Abril 2000)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Diana Gil

Pilar Delgado

Alicia Monjas (desde Octubre 1999)

Técnicos de Investigación /

Laboratory Technicians:

Maite Gómez

Toñi Cerrato (desde Junio 1999)

Transmisión de señales a través del receptorpara el antígeno de celulas T

C.1Inmunología y Virología

Immunology and Virology

44

Fernández-Miguel, G., Alarcón, B., Iglesias, A.,

Bluethmann, H., Alvarez-Mon, M., Sanz, E., & de la Hera,

A. (1999). Multivalent structure of an αβ T cell receptor.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1547-1552.

Teixeiro, E., Sahuquillo, A.G., Alarcón, B., & Bragado,

R. (1999). Apoptosis-resistant T cells have a deficiency

in NF-κB-mediated induction of Fas-L transcription. Eur.

J. Immunol. 29: 745-754.

Borroto, A., Lama, J., Niedergang, F., Dautry-Varsat, A.,

Alarcón, B., & Alcover, A. (1999). The CD3ε subunit of

the TCR contains endocytosis signals. J. Immunol. 163:

25-31.

San José, E., & Alarcón, B. (1999). Receptor engagement

transiently diverts the T cell receptor heterodimer from

a constitutive degradation pathway. J. Biol. Chem. 274:

33740-33746.

Zapata, D.A., Pacheco-Castro, A., Torres, P.S., Ramiro,

A.R., San José, E., Alarcón, B., Alibaud, L., Rubin, B.,

Toribio, M.L., & Regueiro, J.R. (1999). Conformational

and biochemical differences in the TCR/CD3 complex

of CD8+ versus CD4+ mature lymphocytes revealed in

the absence of CD3γ. J. Biol. Chem. 274: 35119-35128.

San José, E., Borroto, A., Niedergang, F., Alcover, A., &

Alarcón, B. (2000). Triggering the TCR complex causes

the downregulation of non-engaged receptors by a signal

transduction-dependent mechanism. Immunity 12: 161-

170.

Delgado, P., Fernández, E., Dave, V., Kappes, D., &

Alarcón, B. (2000). CD3δ couples T cell receptor signalling

to activation of the ERK pathway and thymocyte positive

selection. Nature 406: 426-430.

Borroto, A., Gil, D., Delgado, P., Vicente-Manzanares,

M., Alcover, A., Sánchez-Madrid, F., & Alarcón, B. (2000).

Rho regulates T cell receptor ITAM-induced lymphocyte

spreading in an integrin-independent manner. Eur. J.

Immunol. 30: 3403-3410.

Alcover, A., & Alarcón, B. (2000). Internalization and

intracellular fate of TCR-CD3 complexes. Crit. Rev.

Immunol. 20: 325-346.

Gil, D, Gutiérrez, D., & Alarcón, B. (2000). Intracellular

redistribution of nucleolin upon interaction with the CD3ε

chain of the T cell receptor complex. J. Biol. Chem. (en

prensa).

Balbino Alarcón es miembro de EMBO desde Octubre

2000. Balbino Alarcón is EMBO member since October

2000.

Signal transduction through the T cellantigen receptor

Publicaciones /Publications:

Research summary

The T cell antigen receptor (TCR) is

composed of 6 subunits: TCRα, TCRβ,

CD3γ, CD3δ, CD3ε and CD3ζ. While

the first two subunits are responsibles

for antigen recognition, the others are

responsible for signal transduction. The

TCR does not act as a simple switch

but is able to produce different responses

depending on slight modifications of the

antigen. In our laboratory we are

dedicated to the study of the

mechanisms that regulate the formation

of this multiproteic complex as well as

the signal transduction mechanisms.

Our general research objectives are the

following:

To elucidate the stoichiometry of the

TCR. We have some evidence

suggesting that there are two TCRα/βheterodimers per TCR complex and

therefore, the TCR has two potential

antigen-binding sites. These results have

led us to propose a model of dimeric

TCR that is relevant to understand the

mechanisms of activation (serial and

parallel triggering) and the affinity of its

interaction with antigen.

To study the mechanisms of assembly

and intracellular retention. There is a

quality control mechanism that regulates

the expression of complete complexes

on the cell surface. Incomplete

complexes and isolated subunits are

either retained inside the cell (in the

endoplasmic reticulum) or degraded.

Our interest focuses on the

characterization of the intracellular

retention signals and how these signals

are hindered in a complete TCR.

Redundancy vs. functional specialization

of the TCR subunits. We are studying

whether the existence of multiple

subunits and signal transduction motifs

responds to a need for functional

specialization or just a requirement for

signal amplification. Our studies are

mainly oriented to elucidate the role of

the different TCR subunits in thymic

maturation and selection.

45

Otras actividades y reconocimientos/ Other merits and activities:

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

En el género parvovirus, la multiplicación

viral es dependiente de funciones

moduladas por la proliferación,

diferenciación y transformación de la célula

hospedadora. En nuestro laboratorio

empleamos la especie prototipo del género,

el virus diminuto del ratón (MVM), como

modelo para analizar a nivel de organismo

las bases moleculares de la patogénesis

de estos virus, y las posibilidades de su

uso racional como agentes anti-cáncer en

clínica. Estos objetivos generales son

abordados actualmente en cuatro temas

relacionados.

1. Patogénesis viral y estructura de la

cápsida. Hemos descrito dos enfermedades

nuevas en ratones SCID adultos infectados:

i) la cepa MVMi induce una severa

leucopenia acompañada de una

estimulación de los precursores eritroides

definitivos. El virus tambien infecta células

madre hematopoyéticas, lo que podría

permitir su uso como agente radiomimético

en transplantes de médula ósea. ii) la cepa

MVMp inoculada en SCID evoluciona hacia

variantes virulentos que poseen alterada la

interacción con el receptor primario. El

laboratorio ha contribuído a la resolución

de la estructura tridimensional de la cápsida

del MVMp, y se está analizando la topología

de los residuos responsables de la virulencia

de estos variantes.

2. Transporte nuclear. Se han identificado

en el laboratorio las señales de localización

nuclear (nls) de las proteínas estructurales

del virus. Mientras que VP1 posee nls

convencionales, en VP2 hemos descrito un

motivo de localización nuclear en

conformación de lámina beta, que funciona

transportando al núcleo complejos de

subunidades VP1/VP2 en células que

atraviesan la fase S tardía del ciclo. La

naturaleza de esos complejos y de los

residuos de la cápsida que participan en la

maduración del virus son objetivos

principales de esta investigación.

3. Fosforilación de la cápsida. Las

subunidades VP1 y VP2 que forman la

cápsida (T=1) del MVM están fosforiladas

en residuos de serina y treonina, pero los

sitios principales de fosforilación difieren

entre ambas proteínas (ver figura). El

dominio principal de fosforilación de la

cápsida está formado por las tres serinas

del péptido B situado en el extremo N-

terminal de VP2. Estas fosforilaciones

juegan un papel crítico en la salida del

núcleo de la partícula viral madura, y son

incorporadas por kinasas celulares cuya

identificación está en marcha.

4. Oncotropismo de MVM. Hemos descrito

importantes determinantes de tropismo

hacia células de glioblastoma humano en

la región del genoma del virus que codifica

por las proteínas no-estructurales. En

consecuencia, se han construído virus

mutantes MVM que demuestran una

capacidad anti-cáncer humano en modelos

animales. En el futuro se pretende identificar

los efectores celulares implicados en estas

interacciones, así como desarrollar nuevos

virus más oncotrópicos con efectos tóxicos

mínimos en células normales.

Jefe de Línea / Group Leader:

José M. Almendral

Personal Científico Contratado /

Scientific Personnel with a Contract:

Mari P. Rubio

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral fellow :

Beatriz Maroto

Becarios Predoctorales / Graduate

Students :

Eva Hernando, Susana Guerra,

Alberto Lopez, Noelia Valle.

Estudiantes /

Undergraduate Students :

Javier García

Técnicos de Investigación /

Technical Assistance :

Vanesa Sánchez

Mapas bidimensionales de fosfopéptidos de las proteínas de la cápsida del MVMp. Las proteínas VP1 y VP2

aisladas de cápsidas purificadas y marcadas con 32P fueron digeridas con tripsina y analizadas por cromatografía

bidimensional en capa fina. Los péptidos de VP-2 se han designado alfabéticamente de acuerdo a su migración

en 2-D, y esta nomenclatura se mantiene para los péptidos comunes con VP-1 (D a O). P a S son los péptidos

específicos de VP-1. 1D: primera dimension. 2D: segunda dimension. O: origen. La resolución se indica por la

barra a escala.

Bases moleculares de la patogenicidad y delpotencial anti-tumoral de los pa rvovirus.

C.2

46

Molecular bases of pa rvovirus pathogenesisand anti-tumour potential

Publicaciones /Publications:

Two-dimensional phosphopeptide maps of parvovirus MVMp capsid proteins. The VP-1 and VP-2 proteins

isolated from purified 32P-labeled capsid were digested with trypsin and subjected to two-dimensional thin-

layer chromatography analysis. VP-2 tryptic peptides are alphabetically designated according to their 2-D

migration, and this nomenclature is maintained for the peptides shared with VP-1 (D to O). P to S are VP-

1 specific peptides. 1D: first dimension. 2D: second dimension. O: origin. The resolution is indicated by the

scale bar.

Research summary

In the parvovirus genus the viral

multiplication relies on functions

modulated by proliferation, differentiation,

and transformation of the host cell. We

use in our laboratory the type species

of the genus, the minute virus of mice

(MVM), as a model to analyze at the

organism level the molecular bases of

parvovirus pathogenesis, and their

possible rational use as anti-cancer

agents in the clinic. These general

objectives are currently tackled in four

related topics.

1. Viral pathogenesis and capsid

structure. We have described two novel

diseases in infected adult SCID mice: i)

a severe leukopenia together with a

stimulation of the definitive erythroid

precursors induced by the MVMi strain.

The virus also infects hemopoietic stem

cells, what might allow its use as a

radiomimetic agent in bone marrow

transplants. ii) the MVMp strain

inoculated in SCID evolves towards

virulent variants showing an alteration

in the interaction with the primary

receptor. The laboratory has contributed

to the resolution of the three-dimensional

structure of MVMp capsid, and the

topology of the residues responsible for

the virulence of these variants is being

analyzed.

2. Nuclear transport. We have identified

the nuclear localization sequences (nls)

in the viral structural proteins. Whereas

VP1 shows conventional nls , VP2 we

have described in a nuclear localization

motif (nlm) in a beta-stranded

conformation, that functions transporting

into the nucleus VP1/VP2 complexed

subunits in cells traversing the late S

phase of the cell cycle. The nature of

these complexes as well as of the capsid

residues participating in virus maturation

are major aims of this research.

3. Capsid phosphorylation. The VP1

and VP2 subunits forming the MVM

capsid (T=1) are phosphorylated in serine

and threonine residues, but the main

phosphorylation sites differ between both

proteins (see Figure). The major

phosphorylated domain of the capsid is

formed by the three serines of peptide

B placed at VP2 N-terminus. These

phosphorylations play a key role in the

nuclear exit of the mature viral particle,

and are incorporated by cellular kinases

which identification is underway.

4. MVM oncotropism. We have

described important tropism determinants

toward human glioblastoma cells in the

region of the viral genome coding for the

non-structural proteins. Therefore, mutant

MVM viruses were constructed showing

an anti-human cancer activity in animal

models. In the future, we aim at

identifying the cellular factors involved

in these interactions, as well as to

develop new targeted oncotropic viruses

with minimal toxic effects in normal cells.

47

Segovia, J.C., Gallego, J.M., Bueren, J.A., and Almendral,

J.M. (1999). Severe leukopenia and dysregulated

erythropoiesis in SCID mice persistently infected with

the Parvovirus Minute Virus of Mice. J Virol., 73, 1774-

1784.

Frechilla, D., Insausti, R., Rubio, M.P., Almendral, J.M.

and del Río, J. (2000). Implanted BDNF-producing

fibroblasts prevent neurotoxin-induced serotonergic

denervation in the rat striatum. Mol. Brain Res. 76, 306-

314

Hernando, E., Llamas-Saiz, A.L., Foces-Foces, C.,

Mckenna, R., Portman, I., Agbandje-McKenna, M., and

Almendral, J.M. (2000). Biochemical and physical

characterization of Parvovirus Minute Virus of Mice virus-

like particles. Virology, 267, 299-309

Lombardo, E., Ramírez, J.C., Agbandje-McKenna, M.,

and Almendral J.M. (2000). A beta-stranded motif drives

capsid protein oligomers of the Parvovirus Minute Virus

of Mice into the nucleus for viral assembly. J. Virol. 74,

3804-3814

Maroto, B., Ramírez, J.C., and J.M. Almendral (2000).

The phosphorylation status of the parvovirus minute

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Sobresaliente cum laude.

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

La mayoría de los virus animales interfierencon procesos celulares. Dos estructuralescelulares son, principalmente el blanco deacción después de la infección viral: lasmembranas celulares y la maquinaria desíntesis de proteínas. El interés de nuestrogrupo se ha centrado en analizar estainterferencia a nivel molecular. Así, hemosencontrado que las membranas celularesse permeabilizan por ciertas proteínasvirales denominadas viroporinas. Estas sonproteínas de pequeño tamaño ehidrofóbicas, capaces de formar oligómeros.La interacción de estas proteínas conmembranas da lugar a la formación deporos hidrofílicos. La función de lasviroporinas durante el ciclo de infecciónviral consiste en facilitar la salida de nuevaspartículas virales. Por otro lado, lainterferencia de los virus animales con latraducción celular apunta al factor deiniciación eIF4G como el principal candidatoresponsable de este efecto. Algunos virusanimales tales como los picornavirus y losretrovirus codifican proteasas que hidrolizanel eIF4G, mientras que otros virus talescomo el virus de la influenza o los reovirus,contienen proteínas que interaccionan coneste factor de iniciación.

Proteínas virales que modifican lasmembranas celulares . En los últimos añoshemos analizado la función de proteínasvirales que aumentan la permeabilidad delas membranas celulares. Posiblemente, laproteína viral mejor caracterizada a esterespecto es la 2B de poliovirus y suprecursor, la proteína 2BC. Nuestro interésmás reciente se ha centrado en el estudiode la protéina 6K de togavirus y la Vpu delHIV1.Tanto el virus del bosque Semliki(SFV) como el virus Sindbis (SV) codificanuna proteína muy hidrofóbica de unos 60aminoácidos (conocida como 6K), queinteracciona con membranas. La funciónde esta proteína se ha examinado mediantesu expresión individual en células, así comomediante la construcción de una serie demutantes del SV defectivos en el gen 6K.

Nuestros resultados, así como los obtenidospor otros grupos indican que la 6K participaen tres procesos: provee las secuenciasseñal para el procesamiento de lasglicoproteínas, está implicada en el tráficode las glicoproteínas virales, y facilita lacorrecta gemación de las partículas virales.La proteína Vpu del HIV1 posee variascaracterísticas parecidas a la proteína 6K.Así, la expresión individual del gen vpuaumenta la permeabilidad de la membrana,tanto en células bacterianas como demamífero. Un mutante del SV defectivo en6K que expresa el gen vpu ha corregidovarios de sus defectos.

Regulación de la traducción en célulasinfectadas por virus . Las proteasas viralesestán apareciendo como los componentesprincipales implicados en lacitopatogenicidad viral. Así, las proteasasde poliovirus 2A y 3C son capaces de matarpor ellas mismas células humanas. Laproteasa 3C de poliovirus mata a estascélulas por apoptosis, mientras que la 2Ainduce necrosis en la gran mayoría de lascélulas que las sintetizan. Además, la 2Abisecciona el eIF4G, el factor de iniciaciónde la traducción que, a su vez interaccionacon otros factores, tales como el eIF4E, eleIF4A y el eIF3. La rotura del eIF4G por la2A separa a este factor en dos dominios,dando lugar a la inhibición de la traducciónde los mRNAs celulares. Hay que resaltarque los mRNAs celulares ya implicados enla traducción son menos dependientes deleIF4G que los mRNAs que se sintetizan denovo. Resultados recientes de nuestro grupoindican que también la proteasa del HIVhidroliza el eIF4G. De esta forma estaproteasa es capaz de separar los tresdominios que se han descrito en el eIF4G.Esta hidrólisis da lugar a la inhibición delos mRNAs que contienen la estructura cap,mientras que los mRNAs con una secuenciaIRES no son bloqueados. Por lo tanto, lasproteasas de algunos picornavirus yretrovirus comparten la propiedad dehidrolizar el eIF4G, aunque el mecanismomolecular exacto de cada una de ellasdifiere.

Jefe de Linea / Group Leader:

Luis Carrasco

Personal Científico / Scientific Staff:

Mª Eugenia González, Rosario Guinea

(hasta Septiembre 1999).

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Alicia Irurzun, Ivan Ventoso

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Ana Oña (hasta Febrero 2000),

Celia Perales, Carlos Calandria,

Raquel Blanco, Enrique Alvarez,

Susana Molina.

Técnicos de Investigación /

Technical Assistance:

Miguel Angel Sanz,

Carmen Hermoso

Biología de la infección de células por virus

animales

C.3

48

Biology of animal virus infection

Publicaciones /Publications:

Research summary

Animal viruses interfere with a numberof cellular processes. Two mainstructures are targeted by viruses uponinfection: cellular membranes and theprotein synthesizing apparatus. Effortsdedicated by our group have beenoriented to analyze this interference atthe molecular level. Thus, the plasmamembrane becomes permeabilized bya number of viral proteins collectivelyknown as viroporins. These representa group of small, hydrophobic proteinsable to form oligomers encoded byanimal viruses, that upon interaction withmembranes form hydrophilic pores. Thefunction of viroporins during the viruslife cycle is directed to facilitate the exitof the progeny virions from cells.Besides, virus interference with hosttranslation points to the initiation factoreIF4G as a major target for this effect.Some animal viruses, such aspicornaviruses and retroviruses, encodeproteases that cleave eIF4G, while otherviruses, as influenza virus or reoviruses,contain proteins that interact with eIF4G.

Viral proteins that modify cellmembranes . We have studied in thepast several proteins that enhancemembrane permeability. Perhaps oneof the best characterized protein in thisregard was poliovirus 2B and itsprecursor 2BC. Our recent interest hasfocussed on togavirus 6K and HIV1 Vpu.Both Semliki forest virus (SFV) andSindbis virus (SV) encode a hydrophobicprotein of about sixty aminoacids (knownas 6K) that interacts with membranes.The functioning of this protein has beenexamined by the individual expressionof the 6K gene in cells and by theconstruction of several SV variantsdefective in this gene. Our results,together with the information obtainedfrom other laboratories, indicate that 6Kparticipates in three processes: providesthe signal sequences for glycoproteinprocessing, is involved in glycoprotein

trafficking and facilitates the correctbudding of virus particles.The HIV Vpuprotein has a number of characteristicsthat resemble alphavirus 6K. Thus, theisolated expression of the vpu geneenhances membrane permeability inboth bacterial and mammalian cells.Moreover a SV variant defective in 6Kthat expresses HIV Vpu has correctedsome of its defects.

The regulation of translation in virus-infected cells . Viral proteases areemerging as major components involvedin virus-induced cytopathogenicity.Notably, the poliovirus proteases 2A and3C are able to kill human cells uponexpression. Poliovirus 3C kills cells byapoptosis, while 2A induces necrosis inmost cells. In addition, 2A bisects eIF4G,the initiation factor of translation involvedin the interaction with other factors, suchas eIF4E, eIF4A and eIF3.

Cleavage of eIF4G by 2A separateseIF4G in two domains, leading to theblockade of translation of cellularmRNAs. Curiously, cellular mRNAsalready engaged in translation are notdependent on the intactness of eIF4G,while newly made mRNAs necessitatethis factor to become translated. Recentfindings from our group indicate that theHIV protease also targets eIF4G. Thus,this protease is able to separate thethree main domains of this initiationfactor. The cleavage of eIF4G by theHIV protease leads to the inhibition ofcap-dependent translation, while proteinsynthesis on mRNAs bearing an IRESsequence is still permitted. Therefore,some picornavirus and retrovirusproteases share the property to cleaveeIF4G, although the exact mechanismfollowed by each protease differs.

49

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Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Ana Oña Blanco. "Cambios en el tráfico de

glicoproteínas y en la permeabilidad de la membrana

plasmática inducidos por la proteína del virus de la

polio". Calificación: Apto "cum laude". Universidad

Autónoma de Madrid. Febrero de 2000.

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Jefe de Línea / Group Leader:

Esteban Domingo

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Cristina Escarmís,

Luis Menéndez-Arias

Becarios Postdoctorales / Postdoctoral

Fellows:

Eric Baranowski, Antonio Mas,

Eloisa Yuste, Antero Airaksinen (desde

octubre 2000/since October 2000)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Armando Arias, Clara Cases,

Juan Francisco García Arriaza,

Mónica Gutiérrez-Rivas, Nonia Pariente,

Carmen M. Ruíz-Jarabo, Saleta Sierra

Técnicos de Investigación / Technical

Assistance:

Mercedes Dávila, Gema Gómez-Mariano,

Isabel Rubio Candelas (Jul.-Dic. 2000/Jul.-

Dec. 2000)

Científicos visitantes / Visiting

Scientists:

Scott Weaver (University of Texas Medical

Branch at Galveston, Texas, USA)

Variabilidad genética de virus RNAC.4

50

Resumen de Investigación

Los objetivos generales del grupo son entenderlas bases moleculares de pérdida y ganancia deeficacia biológica de virus RNA, desarrollar nuevasestrategias antivirales y entender las basesmoleculares de la fidelidad de copia de laretrotranscriptasa (RT) del virus de lainmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). En elbienio 1999-2000 los estudios principales fueron:

(1) Documentar múltiples vías molecularesalternativas tanto para la pérdida como para laganancia de eficacia biológica del virus de lafiebre aftosa (VFA) y VIH-1. La distribución demutaciones a lo largo del genoma del VIH-1, quese asocian a pérdida de eficacia biológica poractuación del trinquete de Muller, es distinta a lasobservadas durante la evolución natural del virus,subrayando la influencia de la dinámicapoblacional en las velocidades de evolución dedistintos genes del mismo virus. Mediante empleode análogos de base mutagénicos hemosestudiado la pérdida de infectividad del VFA porentrada del virus en catástrofe de error(mutegénesis letal).

(2) Se ha demostrado la existencia de memoriaen cuasiespecies del VFA, en forma decomponentes minoritarios del espectro demutantes. Esta memoria molecular es un reflejode genomas que fueron mayoritarios durante lahistoria evolutiva del virus.

(3) El VFA evoluciona en cultivos celulares demodo que un triplete Arg-Gly-Asp, esencial parael reconocimiento de integrinas que actúan comoreceptores del virus, puede ser dispensable. Dadoque el Arg-Gly-Asp se halla en un bucle antigénico,la dispensabilidad del Arg-Gly-Asp propició unacoevolución de antigenicidad y tropismo celular.Hemos obtenido evidencia de que el VFA puedeemplear tres vías alternativas para la entrada enel mismo tipo de célula. Esta flexibilidad en el usode receptores se asoció a sustituciones deaminoácidos en la superficie de la cápsida.

(4) En colaboración con los grupos de los Dres.N. Verdaguer e I. Fita (Instituto de BiologíaMolecular, CSIC, Barcelona) y de los Dres. D.Andreu y E. Giralt (Universidad de Barcelona) sehan realizado estudios de difracción de rayos Xy criomicroscopia electrónica que han establecidoque el bucle antigénico principal del VFA (quecontiene el triplete Arg-Gly-Asp) ocupa posicionesdistintas al formar un complejo con dos anticuerposdistintos. Estos estudios estrucuturales hanayudado a definir los mecanismos molecularesde coevolución de tropismo celular y antigenicidaddel VFA.

(5) Hemos demostrado que la Tyr-115 de la RTdel VIH-1 juega un papel muy importante en la

discriminación entre desoxyrribonucleótidos(dNTPs) y ribonucleótidos (rNTPs). Estacapacidad discriminatoria es independiente delcatión utilizado como cofactor (Mg2+ ó Mn2+), adiferencia de lo que sucede con la fidelidad decopia o discriminación entre dNTPs correctos eincorrectos, que se ve notablemente influida porel catión utilizado en los ensayos. Utilizando RTscon cambios de aminoácido en la posición 160hemos demostrado que la interacción entre laPhe-160 y la Tyr-115 es crítica para mantener laactividad polimerasa de la RT.

El cambio de Tyr-115 por Trp y otros cambios noconservativos en esta posición dan lugar a RTscon muy baja actividad polimerasa, y el virusresultante no es viable. En colaboración con elgrupo del Dr. Cecilio López-Galíndez (InstitutoCarlos III, Majadahonda) hemos demostrado queen el caso del mutante Y115W, el virus puederecuperar viabilidad a través del cambio Met-230 Ile, implicado en la interacción de la RT con eliniciador (o “primer”). La pérdida de afinidad porlos dNTPs experimentada por el mutante Y115Wera compensada por la acquisición del cambioM230I. En otro estudio más reciente, hemos analizadoel papel de una inserción de dos aminoácidos(frecuentemente, Ser-Ser) entre las posiciones69 y 70, que aparece en la RT de virus resistentesa AZT y otros fármacos antirretrovirales, y queen muchos casos contribuye a la pérdida deeficacia del tratamiento. Hemos demostrado quela inserción es crítica para la adquisición deresistencia a los inhibidores de la RT análogos anucleósido, y que el mecanismo molecular deresistencia al AZT se debe a que la RTmultirresistente tiene una actividad fosforolíticadependiente de ATP mucho mayor que la enzimasilvestre. Esta actividad le permite desbloqueary extender eficazmente iniciadores que tienen suextremo 3’ bloqueado con AZT.

Además de las indicadas en (4) y (5) nuestrogrupo mantiene colaboraciones con los gruposde los Dres. V. Soriano (Hospital Carlos III, Madrid),M.A. Martínez (irsi Caixa, Badalona), M. Leal yE. Lissen (Hospital Virgen del Rocío, Sevilla),Olga I. Lavrik (Novosibirsk Institute of BioorganicChemistry, Novosibirsk, Rusia), Alain Favre(Institute Jacques Monod, C.N.R.S.-Universidadde Paris-Jussieu, Francia), Eric J. Arts (Divisionof Infectious Diseases, Case Western ReserveUniversity, Cleveland, Ohio, EE.UU.), Miguel E.Quiñones-Mateu (Cleveland Clinic Foundation,Lerner Research Institute, Cleveland, Ohio,EE.UU.), así como con varios investigadores delCentro de Astrobiología (CSIC-INTA, Madrid).

Genetic variability of RNA viruses

Publicaciones /Publications:

Research Summary

Research SummaryThe main objectives of our research groupare to understand the molecular basis offitness loss and fitness gain of RNA viruses,to develop new antiviral strategies, and todefine the molecular basis of copying fidelityof reverse transcriptase (RT) of humanimmunodeficiency virus type 1 (HIV-1). In1999-2000 the main studies were:

(1) To document alternative molecularpathways for fitness loss and fitness gain offoot-and-mouth disease virus (FMDV) andHIV-1. The distribution of mutations alongthe HIV-1 genome, associated with fitnessloss through operation of Muller’s ratchet, isdifferent from the distribution observed duringthe natural evolution of this virus. Thisunderlines the influence of viral populationdynamics on the rate of evolution of differentgenes of the same virus. Using mutagenicbase analogs we have studied loss of FMDVinfectivity through virus entry into errorcatastrophe (lethal mutagenesis).

(2) The existence of memory in FMDVquasispecies, in the form of minoritycomponents of the mutant spectra, has beendocumented. Memory reflects thosegenomes which were dominant at an earlierstage of the evolutionary history of the virus.

(3) FMDV evolves in cell culture in a waythat the triplet Arg-Gly-Asp, which is essentialfor recognition of integrins which act asreceptors for this virus, can becomedispensable. Since the triplet Arg-Gly-Asp islocated on an antigenic loop, dispensabilityof Arg-Gly-Asp prompted a coevolution ofantigenicity and host cell tropism. We haveobtained evidence that FMDV may employthree alternative pathways to enter event hesame cell type. Such a flexibility in receptorusage has been associated with amino acidsubstitutions at the surface of the capsid.

(4) In collaboration with the groups of Drs.N. Verdaguer and I. Fita (Instituto de BiologíaMolecular, CSIC, Barcelona) and of Drs. D.Andreu and E. Giralt (University ofBarcelona). X-ray diffraction andcyroelectronmicroscopy studies haveestablished that the FMDV loop (whichincludes the Arg-Gly-Asp) occupies differentpositions when forming a complex withdifferent antibodies. These structural studieshave contributed to defining molecularmechanisms of coevolution of cellular tropismand antigenicity of FMDV.

(5) We have demonstrated that Tyr-115 ofRT of HIV-1 plays a pivotal role in

discriminating between deoxyribonucleotides(dNTPs) and ribonucleotides (rNTPs). Thisdiscriminatory capacity is independent of thecation used as cofactor (Mg2+ or Mn2+), unlikein the case of fidelity of DNA synthesis (ordiscrimination between correct or incorrectdNTPs) which is notably influenced by thecation used in the assays. Using RTs withamino acid substitutions at position 160 wedemonstrated that the interaction betweenTyr-115 and Phe-160 is critical for thepolymerase activity of the RT. The replacement of Tyr-115 by Trp and othernonconservative substitutions renderedenzymes with very low polymerase activityand nonviable virus. In collaboration with thegroup of Dr. Cecilio López-Galíndez (InstitutoCarlos III, Majadahonda) we showed that inthe case of mutant Y115W, it was possibleto recover virus viability through theacquisition of an additional mutation (M230I),at the primer grip of the RT. The diminishedactivity shown by mutant Y115W, whichresults from a loss of dNTP binding affinity,was compensated by the acquisition of themutation at position 230, that probably impliesthe repositioning of the primer relative to theincoming dNTP. In another study carried out recently, weanalyzed the role of an insertion of two aminoacids (frequently, Ser-Ser) at positions 69-70, that appears in the RT of viral isolatesresistant to AZT and other antiretroviral drugs,and contributes to the loss of therapeuticefficiency. The characterisation of severalmutants obtained by site-directedmutagenesis revealed that the AZT resistancemechanism involved an ATP-dependentphosphorolytic activity which is much higherin the resistant isolate than in the wild-typevirus. This activity allows the virus to unblockand extend efficiently those primers bearingan AZT-terminated 3’ end.

In addition to those indicated in (4) and (5),our group has collaborations with the groupsof Drs. V. Soriano (Hospital Carlos III,Madrid), M.A. Martínez (irsi Caixa, Badalona),M. Leal and E. Lissen (Hospital Virgen delRocío, Sevilla), Olga I. Lavrik (NovosibirskInstitute of Bioorganic Chemistry, Novosibirsk,Rusia), Alain Favre (Institute Jacques Monod,C.N.R.S.-Universidad de Paris-Jussieu,Francia), Eric J. Arts (Division of InfectiousDiseases, Case Western Reserve University,Cleveland, Ohio, EE.UU.), Miguel E.Quiñones-Mateu (Cleveland ClinicFoundation, Lerner Research Institute,Cleveland, Ohio, EE.UU.), as well as withseveral scientists from Centro deAstrobiología (CSCI-INTA, Madrid).

51

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S.L., Barcelona, pp.33-55 (versiones en español e inglés).

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1 reverse transcriptase in the mechanism of AZT resistance.

EMBO J., 19, 5752-5761.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Mónica Gutierrez Rivas: “Contribución de la Phe-160 y la

Met-230 a la fidelidad de copia de la retrotranscriptasa

del virus de la inmunodeficiencia humna tipo 1" (Tesis

dirigida por el Dr. Luis Menéndez-Arias y codirigida por

el Dr. Esteban Domingo). Universidad Autónoma de Madrid.

2000. Calificación: Sobresaliente Cum Laude por

unanimidad.

Premios y Distinciones/Prizes and Distinctions

Esteban Domingo, Miembro del Consejo Científico del

Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer

(IDIBAPS), Barcelona/Member of the Scientific Board of

Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer

(IDIBAPS), Barcelona.

Miembro del Consejo Asesor de la División de Virología

de la Unión Internacional de Sociedades de Microbiología

(IUMS)/Member of the Advisory Council of the Division of

Virology of the International Union of Microbiological

Societies (IUMS).

Miembro del Panel Editorial de AIDS Reviews/Member of

the Editorial Board of AIDS Reviews.

Placa de la Sociedad Española de Virología (SEV)

(1999)/Award from the Spanish Society for Virology (SEV)

(1999).

Doctor Honoris causa por la Universidad de Lieja (Bélgica)

(1999)/Doctor Honoris causa from Université de Liège

(Belgium) (1999).

C M Y CM MY CY CMY K

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Personal Científico / Scientific Staff:

Mauricio García Mateu

Becarios Predoctorales / Predoctoral

Students:

Roberto Mateo Fernández

Estudiantes / Undergraduate Students:

Ana Isabel Díaz Franco

Científicos visitantes / Visiting

Scientists:

Marc Martinell (Universidad de Barcelona)

Estabilidad e ingeniería de proteínas víricasStability and engineering of viral proteins

C.4

50b

Resumen de Investigación

M.G. Mateu ha iniciado durante este períodoun grupo de investigación independiente en unnuevo laboratorio. El grupo estudia losdeterminantes moleculares de la estabilidad decápsidas víricas mediante ingeniería deproteínas, y las posibles aplicaciones para eldiseño de nuevas vacunas y antivirales. Estánen marcha dos proyectos que utilizan comomodelos el virus de la fiebre aftosa y el parvovirusdiminuto de ratón, respectivamente. El análisisestructural ha revelado interaccionespotencialmente relevantes para elensamblaje/desensamblaje y la estabilidad decápsidas. Se están explorando los efectos demutaciones en estos y otros residuos interfásicossobre la estabilidad de viriones y cápsidasvacías. El segundo proyecto se realiza encolaboración con el grupo del Dr. J.M.Almendralde este Centro. Se han completado estudiossobre el supresor de tumores p53 iniciados porM.G.Mateu durante una estancia sabática (1996-98) en el grupo del Prof. A.Fersht (Centre forProtein Engineering, Cambridge, UK), y se haniniciado otras colaboraciones con el grupo delProf. E. Giralt (Universidad de Barcelona) y conel Dr. J.L.Neira (Centro de Biología Moleculary Celular).

Research Summary

M.G. Mateu has started a new research groupworking in a separate laboratory. His group hasfocused on the study of the moleculardeterminants of viral capsid stability, and on theexploration of possible applications for the designof new vaccines and antivirals. Two ongoingprojects respectively contemplate foot-and-mouthdisease virus and minute virus of mice as models.Structure-based analysis has led to theidentification of potentially relevant interactionsfor capsid assembly/disassembly and stability.The effects of mutations of some interfacialresidues on the stability of virions and viral-likeparticles are being explored. The latter projectis being carried out in collaboration with Dr.J.M.Almendral´s group from this Institution. Somestudies on tumour suppressor p53 initiated byM.G.Mateu during a sabbatical stay (1996-98)in Prof. A.Fersht´s group (Centre for ProteinEngineering, Cambridge, UK) have beencompleted. Other collaborations involve Prof.E.Giralt´s group (Universidad de Barcelona) andDr. J.L.Neira (Centro de Biología Molecular yCelular)

Mateu, M.G., Sánchez del Pino, M.M. and Fersht,A.R. (1999). Mechanism of folding and assembly ofa small tetrameric protein domain from tumoursuppressor p53. Nature Struct. Biol. 6, 191-198.

Mateu, M.G. and Fersht, A.R. (1999). Mutuallycompensatory mutations during evolution of thetetramerization domain of tumour suppressor p53lead to impaired hetero-oligomerization. Proc. Natl.Acad. Sci. USA. 96, 3595-3599.

Yiu, C.-P.B., Mateu, M.G. and Fersht. A.R. (2000).Protein folding transition states: elicitation of Hammondeffects by 2,2,2-trifluoroethanol. ChemBiochem. 1,47-53.

Publicaciones /Publications:

C M Y CM MY CY CMY K

Desarrollo de nuevas estrategias para el controly prevención de enfermedades virales: el virusde la fiebre aftosa como modelo

Publicaciones /Publications:

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Personal Científico / Scientific Staff:

Francisco Sobrino

Becarios Postdoctorales / Postdoctoral

Fellows:

Jose Ignacio Núñez,

Margarita Sáiz,

María Flora Rosas

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Esther Blanco (1999),

Mercedes García Briones,

Silvia Gómez

Técnicos de Investigación / Technical

Assistance:

Teresa Hernández (1999)

Científicos Visitantes / Visiting

Scientist:

Gilliane Ganges (CENSA, Cuba),

Eliandre de Oliveira (U. Barcelona),

Jordi Feliu (U.A.Barcelona)

C.4

51b

Resumen de Investigación

Se trabaja en el desarrollo de nuevas vacunasy de estrategias antivirales. Para ello se utilizael virus de la fiebre aftosa (VFA) como modelo,debido a su interés básico y a la importancia dela enfermedad que produce.

Se ha caracterizando la respuesta inmune celularinducida por el VFA y por vacunasconvencionales, peptídicas y basadas envectores virales, en dos importanteshospedadores (cerdo y vaca). Se ha trabajado,también, en el análisis funcional de elementosreguladores del RNA y de proteínas noestructurales del VFA y de otros virusrelacionados. Finalmente, se están desarrollandométodos aplicables a la epidemiolgía molecularde virus RNA.

Parte de este trabajo ha sido desarrollado en ellaboratorio del que se dispone en CISA-INIA.Se está colaborado con: V. Ley (INIA), E.Martínez-Salas (CBMSO), E. Domingo(CBMSO), E. Giralt y D. Andreu (U. Barcelona),K. McCullough (IVI, Suiza), L. Glass (RoslindInst., RU), P. Barnnet (IAH, RU), E.L Palma(INTA, Argentina), A, Villaverde (U.A. Barcelona),R. Moreno (H. de la Princesa) y M.T Frías(CENSA, Cuba).

Research Summary

Research work is focused on the developmentof new vaccines and antiviral strategies, usingfoot-and-mouth disease virus (FMDV) as amodel, due to its basic interest and the relevanceof the disease it produces.

We have analyzed the immune response elicitedby the virus, its conventional and peptidevaccines and by recombinant adenoviruses intwo important hosts (cattle and swine). We havealso analyzed the functional role of RNAregulatory elements and non-structural proteinsin FMDV and related viruses. Finally, we havedeveloped methods for molecularepidemiological analyses of RNA viruses.

Part of these activities has been carried out inthe Laboratory that F. Sobrino utilizes at CISA-INIA (Valdeolmos). During this period we havealso collaborated with the following groups: V.Ley (INIA), E. Martínez-Salas (CBMSO), E.Domingo (CBMSO), E. Giralt y D. Andreu (U.Barcelona), E.L Palma (INTA, Argentina), K.McCullough (IVI, Switzerland), L. Glass (RoslindInst, UK), P. Barnnet (IAH, UK), A. Villaverde(U.A. Barcelona), R. Moreno (H. de la Princesa)y M.T Frías (CENSA, Cuba).

Sobrino, F., Blanco, E., García-Briones, M. and Ley,V. (1999) Synthetic peptide vaccines: foot-and-mouthdisease virus as a model. Dev. Biol. Stand. 101, 39-43.

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Sanz- Parra, A., Jímenez-Clavero, M.A., García-Briones, M., Blanco, E. Sobrino, F. and Ley, V.(1999)Recombinant adenovirus expressing the foot-and-mouth disease virus P1 precursor polypeptide inducescellular but not humoral antiviral immunity and partialprotection in pigs.Virology 259, 129-134.

Ibarrola, N., Moreno-Monteagudo, J.A., Sáiz, M.,García-Monzón, C., Sobrino, F., García-Buey, L.,Moreno-Otero, R. and Martínez-Salas, E. (1999)Response to retreatment with interferon alpha plusribavirin in chronic hepatitis C is independent of theNS5A gene nucleotide sequence. Am. J.Gastroenterol. 94, 2487-2495.

Brun, A., Rodríguez, F., Parra, F., Sobrino, F., andEscribano, J.M. (1999) Design and construction ofafrican swine fever virus chimeras incorporatingforeign viral epitopes. Arch. Virol. 144, 1287-1298.

Díaz, H., Núñez, J.I., Ganges, L. Barreras, M., Frias,M.T. and Sobrino, F. (1999) Molecular epidemiologyof classical swine fever in Cuba. Virus. Res. 64, 61-67.

Bigeriego, P., Rosas, M.F., Zamora, E., Martínez-Salas, E. and Sobrino, F. (1999) Heterotypic inhibitionof foot-and-mouth disease virus infection bycombinations of RNA transcripts corresponding tothe 5' and 3' regions. Antiviral Res. 44, 133-141.

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García-Briones, M.M., Russell G., Carrillo, E. Palma,E., Taboga, O., Tami, C., Sobrino, F.and Glass, E.J.(2000) Association of bovine DRB3 alleles with theimmune response to foot-and-mouth disease viruspeptides and protection against viral challenge.Vaccine 19, 1167-1171.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Esther Blanco Lavilla: "Estudio de la respuesta inmunecelular frente a proteínas del virus de la fiebre aftosa:implicaciones para el diseño de vacunas sintéticas".Universidad Autónoma de Madrid. Marzo 1999.Calificación: Sobresaliente "Cum Laude".

Mercedes García Briones: "Implicaciones de lasproteínas no estructurales del virus de la fiebre aftosaen la respuesta inmune inducida por el virus y en lainteracción con la célula hospedadora". UniversidadAutónoma de Madrid. Noviembre de 2000.Calificación: Sobresaliente "Cum Laude".

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de investigación

TNF regula de modo autocrino LA

activación del linfocito T, mediante el

control de la activación del factor de

transcripción NF-κB, especialmente c-rel.

Este control tiene lugar mediante la

fosforilación de varias serinas entre la

posición 309-540 de c-rel. La infección de

linfocitos T por el virus HIV-1 requiere de

la secreción autocrina de TNF que a su

vez activa el LTR viral vía NF-κB. Esta

infección induce la expresión de la iNOS,

que secreta NO el cual activa la

replicación viral. Además, la proteína tat

de HIV afecta la activación del linfocito T,

uniéndose a los factores de transcripción,

c-rel y AP-1 impidiendo su asociación,

conduciendo a una inhibición de la

transcripción de IL-2.

La activación del linfocito T induce la

expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2),

implicada en la síntesis de

prostaglandinas, cuya expresión y función

en linfocitos T no habían sido descritas

anteriormente. La inducción de COX-2

tiene lugar mediante la activación del

factor de transcripción NFAT. Además,

COX-2 juega un papel importante en la

activación del linfocito T, ya que la

inhibición específica de esta enzima

conduce a la inhibición de NF-κB, NFAT y

AP-1 con la consiguiente inhibición de la

secreción de citoquinas (IL-2, TNF, IFN-γ).

Estos resultados añaden un nuevo

mecanismo para explicar el modo de de

los antiinflamatorios no esteroideos,

inhibidores de esta enzima.

El protozoo parásito Trypanosoma cruzi

causa de la enfermedad de Chagas que

cursa con una inmunosupresión en la fase

aguda y autoinmunidad en la fase crónica.

Hemos caracterizado una mucina, AgC10

de T. cruzi, que parece ser la responsable

de la inhibición de la producción de

citoquinas en la fase aguda. Además,

hemos descrito la existencia de 2

mecanismos de inmunosupresión en la

fase aguda, uno mediado por AgC10, y

otro por la inducción de células

inmunosupresoras mieloides inmaduras

Gr1+Mac1+ que secretan NO que inhibe la

activación T. Además, hemos demostrado

claramente que la autoinmunidad juega

un papel importante en la patología de la

fase crónica. Así, hemos identificado en

nuevo autoantígeno, Cha, que es

reconocido por la mayoría de los sueros

chagásicos y presenta reacción cruzada

con 2 proteínas de T. cruzi. Un epítopo es

reconocido por linfocitos T y otro por

linfocitos B. Además, la transferencia de

células T autoreactivas es capaz de

inducir patología similar a la causada por

la infección.

Jefe de Línea / Group Leader:

Manuel Fresno

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Pedro Bonay Miarons, Eugenio

Carrasco Marín, Miguel Angel Iñiguez

Peña

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Iñigo Angulo Barturen, Angel García

Martín, Núria Gironès Pujol, Esther

González San Martín, Oscar Goñi

Laguardia, Clara Isabel Rodríguez

López

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Pilar Alcaide Alonso, Javier Duque

Muñoz, Raquel Grau Simón, Carmen

Punzón Galvez, Belén San Antonio de

Felipe, Carmen Mª Sánchez-

Valdepeñas, Virginia Vila del Sol

Técnicos de Investigación /

Technical Assistance:

María Cazorla Plaza, Mª de los Angeles

de Chorro y de Villa-Ceballos, Consuelo

Muñoz Fernández

Activación del Sistema InmuneC.5

52

Laín de Lera, T., Folgueira, L., Martín, A.G., Dargemont, C.,Pedraza, M.-A., Bermejo, M., Bonay, P., Fresno, M. and Alcami,J. (1999). Expression of IκΒα in the nucleus of humanperipheral blood T lymphocytes. Oncogene 18, 1581-1588

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Bonay, P. and Fresno, M. (2000). Lectins from TropicalSponges. J. Biol. Chem. 275, 29283-29289

Giordanengo, L., Maldonado, C., Rivarola, H.W., Iosa, D.,Gironès, N., Fresno, M. and Gea, S. (2000). Induction ofantibodies reactive to cardiac myosin and development of heartalterations in cruzipain-immunized mice and their offspring. Eur.J. Immunol. 30, 3181-3189

Fresno, M. and Muñoz-Fernández, M.A. (2000). Monografía.Anticuerpos monoclonales como herramientas terapéuticas:Remicade infliximab

Matesanz, F., Delgado, C., Fresno, M. and Alcina, A.(2000).Allelic selection of human IL-2 gene. Eur. J. Immunol. 30, 3516-3521

Activation of the Immune System

Publicaciones /Publications:

Research Summary

TNF regulates T cell activation in an

autocrine fashion, through the control of

the activation of the NF-κB transcription

factor. This control takes place through

phosphorylation of several serines in the

309-540 region of c-rel. HIV-1 on

infection of T lymphocytes requires

autocrine TNF secretion that in turn

activates LTR via NF-κB. HIV-1 infection

induce iNOS expression which

synthesize NO and activates viral

replication. Besides, HIV-1 tat protein

alters T cell activation, being able to bind

to c-rel and AP-1 transcription factors,

preventing their association. Thus,

leading to IL-2 transcription inhibition.

T cell activation induces

cyclooxygenase-2 (COX-2) expression,

involved in protaglandin synthesis.

COX-2 expression and function had not

been previously described in T cells.

COX-2 induction taken place through

activation of NFAT transcription factor.

Besides, COX-2 plays a very important

role in T cell activation, since its specific

blockade leads to inhibition of NF-κB,

NFAT and AP-1 activation. Those results

add a new mechanism to explain the

mode of action of non-steroid

antiinflammatory drugs.

Trypanosoma cruzi, a parasite, causes

Chagas’ disease characterized by

immunosupression in the acute phase

and autoimmunity in the chronic phase.

We have characterized AgC10, a mucin,

responsible for the inhibition of cytokine

production in the acute phase. Besides,

we have identified 2 mechanism of

immunosuppression: one mediate by

AgC10 and another that involves the

induction of Gr1+Mac1+ immature

myeloid cells that secrete NO that in

turns inhibits T cell activation. Besides,

we have clearly demostrated the role of

autoimmunity in the pathology of the

chronic phase. Thus, we have identified

a new autoantigen, named Cha,

recognized by the vast majority of

chagasic sera, and has crossreactivity

with 2 T. cruzi proteins. One

crossreactive epitope is recognized by T

cells and the other by B cells. Besides,

adoptive transfer of T cells to naive

recipients causes a disease similar to

infected mice.

53

Tesis doctorales dirigidasDirected Doctoral Theses"Caracterización de un nuevo factor de transcripciónhumano del tipo bHLH como un autoantígenodominante en la enfermedad de Chagas" Clara IsabelRodríguez López Universidad Autónoma de Madrid1999 Apto "cum laude”

"Modulación del factor NF-kB por TNF en la activacióndel linfocito T. Bases moleculares de la activación de c-Rel" Angel García Martín Universidad Autónoma deMadrid 1999 Sobresaliente "cum laude”

"Efectos de la proteína tat de VIH en la activación delinfocitos T". Esther González San Martín UniversidadAutónoma de Madrid 2000 Sobresaliente "cum laude”

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

La duplicación del material genético y su

coordinación con el ciclo celular son

procesos cruciales para la proliferación

celular. La salida y entrada del ciclo celular

constituyen puntos de control con

implicaciones en diferenciación celular y

desarrollo. Aunque la estrategia de control

del ciclo celular y la replicación del DNA

parece estar mecanísticamente conservada

en eucariontes, existen diferencias

fundamentales en los elementos

reguladores presentes en levaduras,

animales y plantas.

Nuestro interés se centra en entender cómo

se regulan estos procesos en plantas,

organismos que poseen unas características

únicas de crecimiento y desarrollo

derivadas, fundamentalmente, de su

inmovilidad y de la estrecha coordinación

entre división celular y desarrollo. Para

ello, trabajamos en varias líneas

complementarias integrando el estudio de

la replicación del DNA de geminivirus, los

efectos de las proteínas virales en la célula

huésped, la regulación de la transición G1/S

y el control de la replicación el DNA celular.

Las proteínas Rep y RepA de geminivirus,

que forman oligómeros, son importantes

para el ciclo replicativo. Hemos identificado,

entre otros, un complejo de Rep, la proteína

iniciadora de la replicación, con el DNA del

origen y estamos estudiando las proteínas

celulares que interaccionan con Rep. RepA

secuestra la proteína relacionada con

retinoblastoma (RBR), homóloga del

supresor de tumores.

Esto posiblemente permite la activación

transcripcional de genes, dependientes de

E2F/DP, necesarios para la iniciación del

período S y la replicación del DNA viral y

celular. Estamos interesados en estudiar

la ruta de RBR/E2F/DP, los genes que

regulan y su función durante el ciclo celular,

la replicación del DNA y el desarrollo

mediante un abordaje de biología molecular

y de genómica funcional en Arabidopsis

thaliana.

Jefe de Línea / Group Leader:

Crisanto Gutiérrez

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

M. Beatrice Boniotti

Juan Carlos del Pozo (desde enero 2000)

Corinne Fründt

Alejandro Luque

Riccardo Missich (hasta mayo 1999)

Elena Ramirez-Parra (desde julio 2000)

Andrés P. Sanz-Burgos (hasta

diciembre 1999)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

M. Mar Castellano, Elena Ramírez-

Parra (hasta julio 2000)

Andrés P. Sanz-Burgos (hasta

diciembre 1998)

Visitantes / Visiting:

Javier Plasencia (UNAM, Mexico)

Damian Fonseca (IB, La habana)

Replicación del DNA y ciclo celularC.6

54

La ruta de retinoblastoma en plantas y su conexión con la replicación del DNA degeminivirus, la activación transcripcional de genes regulados por E2F y la proliferacióncelular.

DNA replication and cell cycle

Research Summary

Duplication of genetic material and its

coordination to cell cycle progression are

crucial for cell proliferation. The regulated

exit from and re-entry to the cell cycle

constitute key events during cellular

differentiation and development. The

basic strategy for cell cycle and DNA

replication control seems to be

mechanistically well-conserved in

eukaryotes. However, differences exist

in the regulatory elements evolved in

yeast, animals and plants.

Our research is aimed at understanding

how those processes are regulated in

plants, sessile organisms with a unique

body architecture, growth and

development in which cell division is tightly

coupled to development. To this end, we

follow complementary approaches to

study geminivirus DNA replication, the

cellular effects of viral proteins, the G1/S

transition and the cell cycle regulation of

DNA replication. Geminivirus Rep and

RepA proteins, which form oligomers, are

crucial for the replicative cycle.

We have identified, among others, a

complex of Rep, the initiator protein, with

origin DNA and we are studying cellular

proteins that interact with Rep. RepA

sequesters the retinoblastoma-related

(RBR) protein, a homologue of the human

tumor suppressor RB protein.

This, most likely, allows the transcriptional

activation of E2F/DP-responsive genes

required for S phase progression and viral

and cellular DNA replication. We are

interested in studying the RBR/E2F/DP

pathway, the E2F-responsive genes and

their role during plant cell cycle, cellular

DNA replication and development with a

combination of molecular biology and

functional genomics in Arabidopsis

thaliana.

55

Publicaciones /Publications:

Xie, Q., Sanz-Burgos, A. P., Guo, H., García, J. A., Gutierrez, C.

(1999). GRAB proteins, novel members of the NAC domain family,

isolated by their interaction with a geminivirus protein. Plant Mol.Biol. 39, 647-656.

Illana, B., Lázaro, J. M., Gutiérrez, C., Meijer, W. J. J., Blanco, L.,

Salas, M. (1999). Phage φ29 terminal protein residues Asn80 and

Tyr82 are recognition elements of the replication origins. J. BiolChem. 274, 15073-15079.

Inzé, D., Gutiérrez, C., Chua, N.-H. (1999). Trends in plant cell

cycle research. Plant Cell 11, 991-994.

Castellano, M. M., Sanz-Burgos, A. P., Gutierrez, C. (1999). Initiation

of DNA replication in an eukaryotic rolling-circle replicon: identification

of multiple DNA-protein complexes at the geminivirus origin. J. Mol.Biol. 290, 639-652.

Gutiérrez, C. (1999). Geminivirus DNA replication. Cell. Mol. LifeSci. 56, 313-329.

Peres, A., Ayaydin, F., Nikovics, K., Gutiérrez, C., Horváth, G. V.,

Dudits, D., Feher, A. (1999). Partial synchronization of cell division

in cultured maize (Zea mays L.)cells: differential cyclin, cdc2, histone

and retinoblastoma transcript accumulation during the cell cycle.

J. Exp. Bot. 50, 1373-1379.

Ramirez-Parra, E, Xie, Q., Boniotti, M. B., Gutiérrez, C. (1999).

The cloning of plant E2F, a retinoblastoma-binding protein, reveals

unique and conserved features with animal G1/S regulators.

Nucleic Acids Res. 27, 3527-3533.

Gascon, I, Gutierrez, C, Salas, M. (2000). Structural and functional

comparative study of the complexes formed by viral φ29, Nf and

GA-1 SSB proteins with DNA. J. Mol. Biol. 296, 989-999.

Missich, R., Ramirez-Parra, E., Gutierrez, C. (2000). Relationship

of oligomerization to DNA binding of wheat dwarf geminivirus RepA

and Rep proteins. Virology 273, 178-188.

Gutierrez, C. (2000). Geminiviruses and the plant cell cycle. PlantMol. Biol. 43, 763-772.

Ramirez-Parra, E., Gutierrez, C. (2000). Charcaterization of wheat

DP, a heterodimerization partner of the plant E2F transcription

factor which stimulates E2F-DNA binding. FEBS Lett. 486, 73-78.

Gutierrez, C. (2000). DNA replication and cell cycle in plants:

learning from geminiviruses. EMBO J. 19, 792-799.

Patentes/ Patents

Gutiérrez, C., Ramirez-Parra, E., Xie, Q. (1999) "Transgenic plants

(E2F)", CSIC-BTG, PCT / EP99 / 03158 (España-Europa-USA-

Canadá-Japón).

Gutiérrez, C., Castellano, M. M., Sanz-Burgos, A. P. (1999), "Nuevo

método de obtención de plantas transgenicas resistentes a

geminivirus", CSIC-BTG, (España).

Gutierrez, C., Ramirez-Parra, E. (1999, 2000) "Wheat DP proteins

and uses thereof", CSIC-BTG PCT / ES99 / 02474 (España, Europa,

USA, Canada, Japon)

Tesis doctorales/ Doctoral Theses

Elena Ramirez-Parra: "Identificación y análisis del factor de

transcripción E2F/DP de plantas". Universidad Autónoma de Madrid,

Julio, 2000. Calificación: Sobresaliente cum laude.

The retinoblastoma pathway in plants and its conenction with geminivirus DNAreplication, transcriptional activation of E2F-responsive genes and cellular proliferation.

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

Nuestro interés científico se centra en el

estudio de la regulación de la expresión

génica en la activación de linfocitos y células

endoteliales. En estos modelos celulares

estamos analizando los mecanismos que

integran la transducción de señales

extracelulares con la activación de factores

de transcripción, a su vez encargados de

regular programas específicos de inducción

génica.

En linfocitos gran parte de nuestros

objetivos están dirigidos al estudio de la

regulación de la familia de factores de

transcripción NFAT, cuyos miembros

controlan la expresión de gran número de

genes del sistema inmune,. Esta familia

está constituida por al menos 4 miembros

que residen en el citoplasma en células en

reposo y se translocan al núcleo en

respuesta a aumentos intracelulares de

calcio. Este proceso conlleva la

desfosforilación y translocación al núcleo

de NFAT mediada por calcineurina, y más

tarde, al cesar las señales de calcio, su

exportación al citoplasma por la acción de

quinasas nucleares poco caracterizadas.

Un objetivo del laboratorio es analizar la

regulación por MAPKs de la localización

nucleo-citoplasmática de NFAT. Hemos

demostrado que la activación de JNK y

p38 conduce respectivamente a la

exclusión de NF-AT en el núcleo y

modificación de sus propiedades

transactivadoras. Por ello, intentamos

identificar los residuos fosforilados por

MAPKs para determinar su funcionalidad

“in vivo”. Por otro lado, mediante

abordajes proteómicos usando

espectrometría de masas y transfectantes

estables de los distintos miembros de la

familia, estamos analizando la

composición de los complejos integrados

por las proteínas interaccionantes con

NFAT.

En células endoteliales estamos

analizando las rutas de señalización y el

papel de distintos factores de

transcripción en la respuesta a VEGF

(factor de crecimiento del endotelio

vascular), un factor mitogénico y

angiogénico muy potente. Recientemente,

hemos determinado que la respuesta

endotelial a VEGF conduce a la activación

de NFAT, lo que se requiere para la

expresión de Ciclooxigenasa-2. Dado el

papel de este gen en angiogénesis y

cáncer, estamos estudiando el efecto de

inhibidores de NFAT en modelos de

angiogénesis en ratón y en la formación

de estructuras capilares a partir de células

endoteliales primarias. Hemos

determinado que la inhibición de NFAT

por Ciclosporina A produce inhibición

selectiva de angiogénesis por VEGF y no

por FGF. Estos resultados nos han

conducido distintos inhibidores de NFAT,

pueden interferir en patologías que cursan

con neovascularización debida a VEGF,

como la retinopatía diabética o la

retinopatía inducida por hiperoxia en

ratones neonatos.

Jefe de Línea/Group Leader:

Juan Miguel Redondo

Personal Científico /Scientific Staff:

Eva Cano López1, Antonio Rodríguez

Márquez1

Becarios Postdoctorales

/Postdoctoral Fellows:

Pablo Gómez del Arco2, Gabriela

Hernández, Sara Martínez Martínez

Becarios Predoctorales /Graduate

Students:

Janet Lynn Maldonado2, Elisa

Lorenzo Alvarez, Inmaculada Ortega

Perez, Antonio J. Quesada Navidad1.

Técnicos de Investigación

/Technicians:

Vanesa Gómez Navajo1

Científicos Visitantes/Visiting

Scientists:

Abelardo López Rivas (IPB Lopez-

Neyra, CSIC, Granada)

1 Incorporación en al año 20002 Baja en el año 2000

Expresión génica en programas de activaciónlinfocitaria y angiogénesis

C.7

56

A model for the role of p38 in the shuttling of NFAT1. In resting lymphocytes, phosphorylated NFAT1 islocated in the cytoplasm as a complex that includes calcineurin (CnA and CnB) and p38 MAPK. Upon calcium

signaling, calmodulin (CaM) binds NFAT1 and calcineurin is activated resulting in the dephosphorylation ofNFAT1 and the unmasking of the nuclear localization sequences (NLS) and DNA-binding domain (DBD).

Dephosphorylated NFAT1, p38 and calcineurin translocate to the nucleus as a complex and calcineurinmaintains NFAT1 active for the duration of calcium signals. At some time point after cell activation, NFAT1 is

phosphorylated by p38 MAPK and exported to the cytoplasm upon cessation of calcium signals.

Un modelo del papel de p38 en la localización subcelular de NFAT. En linfocitos en reposo, NFAT resideen el citoplasma en estado fosforilado formando un complejo con calcineurina y la MAPK p38. Los incrementosen calcio intracelular conducen a la activación de la calcineurina que desfosforila NFAT1 y éste expone sus

secuencias de localización nuclear (NLS) y de unión al ADN (DBD). NFAT1 desfosforilado, p38 y calcineurinaforman un complejo y se translocan al núcleo donde calcineurina mantiene NFAT activo mientras duran las

señales de calcio. Cuando éstas cesan, NFAT1 es refosforilado por p38 y exportado al citosol.

Gene expression in lymphocyte activationand angiogenesis

Research Summary

Our research interest is focussed on the

study of the regulation of gene

expression in the activation of

lymphocyte and endothelial cells. We

are analyzing the mechanisms that

integrate extracellular signal

transduction with the activation of

transcription factors which regulate

specific gene expression programs.

A major goal of our research is the

characterization of the molecular

mechanisms that control the subcellular

localization of the NFAT family of

transcription factors. This family is

composed of at least four members that

are found in the cytoplasm of resting

cells and translocate to the nucleus in

response to calcium signals triggered

upon cell activation. Initially, this

process involves the calcineurin-

mediated dephosphorylation of NFAT,

and later on , once calcium signals are

curtailed NFAT is exported from the

nucleus to the cytoplasm through the

action of nuclear kinases not completely

identified. We have demonstrate that

the activation of p38 and JNK results in

the nuclear exclusion and

transactivation of NFAT, respectively.

We are mapping the NFAT regions that

interact with MAPKs to perform site

directed mutagenesis of the NFAT sites

phosphorylated by MAPKs to further

identify the mutants that result in

changes in the shuttling of NFAT

members in vivo. These analyses may

help to define new mechanisms by

which eukaryotic transcription factors

are deactivated and contribute to the

identification of new therapeutic targets

for immnosuppression. As an additional

aim, by using mass spectrometry and

stable transfectants overexpressing the

different family members we are

analyzing the cellular complexes that

integrate NFAT-interacting proteins.

In endothelial cells, we are analyzing the

signaling pathways and the role of

transcription factors involved in the

activation induced by Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF), a

very potent mitogen and angiogenic

factor for endothelial cells. Recently, we

have found that VEGF induces the

transcriptional activation of NFAT in

human endothelial cells, which is

required for Cyclooxygenase-2 –gene

expression. Given the role of this gene

in angiogenesis and cancer, we are

analyzing the effect of NFAT inhibitors in

corneal angiogenesis in mice and on the

ability of endothelial cells to form

capillary-like structures. Initially, we

have found that the inhibition of NFAT by

Cyclosporin A results in the selective

inhibition of VEGF-mediated

angiogenesis. These results have also

encouraged us to investigate whether

NFAT inhibitors display therapeutic

properties in diseases that occurs with

neovascularization mediated by VEGF

such as the diabetic and the prematurity

retinopathies.

57

Publicaciones /Publications:

Armesilla AL, Lorenzo E, Gómez del Arco P,

Martínez-Martínez S, Alfranca A, and Redondo JM.

(1999) “VEGF activates Nuclear factor of activated

T cells (NFAT) in human endothelial cells; a role for

tissue factor gene expression”. Mol. Cell. Biol.,

19,2032-2043

Lauzurica P, Martínez-Martínez S, Marazuela M,

Gómez del Arco P, Martínez AC, Sánchez-Madrid F,

and Redondo JM. (1999) “Pyrrolidine dithiocarbamate

protects mice from LPS or TNF-induced lethal

shock. Eur. J. Immunol. 29,1890-1900

Ogueta, S., Rogado R, Moreno F, Redondo JM and

Vázquez J. (2000). Identification of

Phosphorylation sites in proteins by nanospry-

quadrupole ion trap mass spectrometry. J.Mass

Spectrom. 35.556-565

Gomez del Arco, P., S. Martinez-Martinez, J.L.

Maldonado, Ortega-Perez I., and Redondo J.M.

(2000). A role for p38 MAPK pathway in the

nuclear shuttling of NFAT1 J.Biol.Chem 275,

13872-13878.

Iñiguez, M.A., S. Martínez-Martínez, C. Punzón,

J.M. Redondo and Fresno M (2000). An essential

role of NFAT in the regulation of the expression of

cyclooxygenase-2 gene in human Tlymphocytes. J.

Biol. Chem. 275, 23627-23635.

Tesis doctorales/ Doctoral theses

Pablo Gómez del Arco “Función de las MAP

Quinasas en la regulación de la actividad de los

factores de transcripción AP-1 y NFAT en

linfocitos. Efecto de Agentes antioxidantes”:

Autónoma de Madrid. Sobresaliente Cum laude.

Sara Martínez Martínez “Interferencia de los

Ditiocarbamatos con la función de los factores de

transcripción NFAT y NFKB: Inmunosupresión y

shock séptico” Universidad Autónoma de

Madrid.1999. Sobresaliente Cum laude.

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

Replicación del DNA de ø29

El objetivo del trabajo es profundizar en elconocimiento del mecanismo de iniciaciónde la replicación del DNA de ø29 medianteproteína terminal (TP), así como de lasproteínas implicadas en replicación.

El estudio de las secuencias necesariaspara la iniciación de la replicación medianteTP y la elongación del DNA de ø29 hamostrado que se requiere una repeticiónterminal de dos nucleótidos en los extremosdel DNA para ambos procesos. Por otraparte, los residuos Asn80 y Tyr82 en la TP,así como el posible dominio "coiled coil"que está en su proximidad, son elementosde reconocimiento de los orígenes dereplicación del DNA de ø29. Además, existeun reconocimiento específico de losorígenes mediante la interacción entre laDNA polimerasa y la TP paterna.

Los residuos I8 y A44 de la proteína p6 deø29, que es una proteína tipo histona, estánimplicados en la formación de dímeros. Unamutación en uno de estos residuos produceuna disminución de la capacidad de unióna los extremos del DNA de ø29 y deactivación de la iniciación de la replicación.

Mediante proteolisis parcial de la DNApolimerasa de ø29 hemos demostrado queel DNA y la TP se unen al mismo sitio deunión de DNA de doble banda y protegenlas mismas regiones de la DNA polimerasa.Por otra parte, dicha polimerasa corrige loserrores de polimerización usando unmecanismo intracelular, es decir, el extremodel "primer" va desde el sitio activo depolimerización al de exonucleasa 3'–5' sindisociarse del DNA. También hemosdemostrado que los residuos Tyr59, His61y Phe69 de la DNA polimerasa de ø29 estánimplicados en la estabilización correcta delextremo del "primer" en el sitio activoexonucleasa 3'–5'. En el extremo C-terminal,el Asp332, presente en una región

específica de DNA polimerasas que iniciancon TP, se requiere en la polimerasa deø29 para la interacción funcional con la TPiniciadora.

Por mutagenesis dirigida estamosestudiando la relación estructura-funciónde las proteínas SSB de ø29 y GA-1, quese requieren en el proceso de elongaciónde la replicación.

Hemos demostrado que la proteína p1, quese asocia a membranas, interacciona conla TP iniciadora. Hemos propuesto unmodelo para la inciación de la replicacióndel DNA de ø29 in vivo en el cual elreplisoma viral se une a una estructuraformada por la proteína p1 unida amembranas.

Mediante el uso de técnicas defluorescencia, hemos demostrado quedurante la replicación tiene lugar unarelocalización dinámica del DNA de ø29.La proteína p16.7 de ø29, que es unaproteína integral de membrana y estáimplicada en la replicación del DNA de ø29,interviene en dicho proceso de relocalizacióndel DNA.

Transcripción del DNA de ø29

La proteína reguladora p4 de ø29 activa elpromotor tardío A3 estabilizando la uniónde la RNA polimerasa (RNAP) como uncomplejo cerrado. Una mutación en elresiduo Glu297 en el dominio C-terminalde la subunidad alfa de la RNAP de Bacillussubtilis desestabiliza la formación decomplejos abiertos en el promotor A3.

La proteína viral p6, que se requiere parala iniciación de la replicación del DNA deø29, tiene un efecto pleiotrópico. Por unaparte, reprime el promotor temprano C2.Además, en presencia de la proteínareguladora p4, reprime el promotortemprano A2c y activa el promotor tardíoA3.

Jefe de Línea/Group Leader:

Margarita Salas

Personal Científico /Scientific

Personnel:

Alicia Bravo, Ana Camacho,

José Miguel Hermoso.

Becarios Postdoctorales

/Postdoctoral Fellows:

Ana Abril, Ana Bonnin,

Paola Crucitti, Emmanuelle Dufour,

Ralf Eisenbrandt, Belén Illana,

Wilfried Meijer, Javier Saturno,

Verónica Truniger, Miguel de Vega.

Becarios Predoctorales

/Predoctoral Students:

Belén Calles, Irene Gascón,

Víctor González-Huici,

José A. Horcajadas, Alejandro Serna-

Rico, Gema Serrano

Técnicos de Investigación

/Technical Assistance:

José M. Lázaro,

Angeles Martínez, Laurentino Villar.

Estudiantes /Students:

Laura Pérez

Científicos Visitantes/Visiting

Scientists:

Arjan Brenkman.

Deparment of Physiological chemistry.

Universiteitsweg Utrecht.

The Netherlands

Replicación y transcripción del DNA delbacteriófago ø29

C.8

58

Margarita Salas– Socia de Honor de la Sociedad Española de Bioquímica

y Biología Molecular (1999–).

– Distinción de la Fundación Ciencias de la Salud en

Virología (1999).

– Académica de Honor de la Real Academia de Medicina

de Santa Cruz de Tenerife (1999–)

– Premio L’Orèal-UNESCO for “Women in Science” (1999).

– Premio Hipócrates 2000. Fundación Marathon (2000).

– Doctora Honoris Causa por la Universidad Politécnica

de Madrid (2000).

– Premio Nacional de Investigación Santiago Ramón y

Cajal (1999).

– Nombrada Española Universal por la Fundación

Independiente (2000).

– Co-dirigió el curso: "Los retos actuales de la Biología

Molecular" de la Escuela de Biología Molecular "Eladio

Viñuela" Universidad Internacional Menéndez Pelayo

(2000).

Premios y Distinciones/ Prizes and Distinctions

Replication and transcription ofbacteriophage ø29

Research Summary

Replication of ø29 DNA

The aim of the research is to get furtherinsight in the mechanism of initiation ofø29 DNA replication primed by theterminal protein (TP) as well as on theproteins involved in replication.

The study of the sequences needed forprotein-primed initiation and elongationof ø29 DNA replication has revealed thata terminal repetition of two nucleotidesat the DNA ends is the major requirementfor both initiation and elongation. On theother hand, residues Asn80 and Tyr82 inthe TP, as well as the putative coiled coildomain close to them, are recognitionelements of the ø29 DNA replicationorigins. In addition, specific recognitionof the origins is brought through aninteraction between DNA polymerase andparental TP.

Amino acid residues I8 and A44 in theø29 histone-like protein p6 have beenshown to be involved in dimer formation.Mutation in these residues results in areduced capacity to bind the ø29 DNAends and to activate the initiation of ø29DNA replication.

We have analyzed ø29 DNA polymeraseby partial proteolysis with the finding thatboth, DNA and TP, fit in the same double-stranded DNA binding channel and protectthe same regions of ø29 DNA polymerase.On the other hand, we have shown thatø29 DNA polymerase edits thepolymerization errors using anintramolecular pathway; that is, the primerterminus travels from the polymerizationto the 3'–5' exonuclease active siteswithout dissociation from the DNA. Wehave also shown that amino acid residuesTyr59, His61 and Phe69 of ø29 DNApolymerase are involved in the proper

stabilization of the primer-terminus at the3'–5' exonuclease active site. At the C-terminal domain, Asp332 present in aspecific region of protein-primed DNApolymerases, is required in ø29 DNApolymerase for the functional interactionwith the primer TP.

By site-directed mutagenesis we arestudying the structural and functionalrelationship of the ø29 and GA-1 SSBproteins, required for the elongation ofreplication.

The membrane-associated protein p1 hasbeen shown to interact with the primerTP. A model for initiation of in vivo ø29DNA replication has been proposed inwhich the viral replisome attaches to amembrane-associated p1-basedstructure.

By using immunofluorescence techniques,a dynamic relocalization of ø29 DNAduring replication has been shown tooccur. The ø29 integral membrane proteinp16.7, involved in ø29 DNA replication,plays a role in the latter process.

Transcription of ø29 DNA

Phage ø29 regulatory protein p4 activatesthe viral late promoter A3 by stabilizingthe binding of RNA polymerase (RNAP)as a closed complex. Mutation at Glu297in the C-terminal domain of the Bacillussubtilis RNAP alpha subunit destabilizesthe formation of open complexes at theA3 promoter.

The viral protein p6, required for theinitiation of ø29 DNA replication, has apleiotropic effect. On the one hand, itrepresses the early C2 promoter. Inaddition, in the presence of the regulatoryprotein p4, it represses the early A2cpromoter and activates the late A3promoter.

59

Publicaciones /Publications:

Salas M. (1999) Bacillus phage ø29. In: Encyclopedia of Virology, second

edition. R.G. Webster and A. Granoff (eds.). Saunders Scientific Publications,

Vol. 1 pp. 119-130.

Truniger V., Blanco L. and Salas M. (1999) Role of the "YxGG/A" motif

of ø29 DNA polymerase in protein-primed replication. J.Mol.Biol., 286,

57-69.

Camacho A. and Salas M. (1999) Effect of mutations in the "Extended -

10" motif of three Bacillus subtilis σA-RNA polymerase-dependent

promoters. J. Mol. Biol. 286, 683-693.

Illana B., Lázaro J.M., Gutiérrez C., Meijer W.J.J., Blanco L. and Salas

M. (1999) Phage ø29 terminal protein residues Asn80 and Tyr82 are

recognition elements of the replication origins. J. Biol. Chem. 274, 15073-

15079.

Bonnin A., Lázaro J.M., Blanco L. and Salas M. (1999) A single tyrosine

prevents insertion of ribonucleotides in the eukaryotic-type ø29 DNA

polymerase. J.Mol.Biol. 290, 241-251.

Horcajadas J.A., Monsalve M., Rojo F. and Salas M. (1999) The switch

from early to late transcription in phage GA-1: characterization of the

regulatory protein p4G. J.Mol.Biol. 290, 917-928.

M. de Vega, L. Blanco and M. Salas (1999) Processive proofreading and

spatial relationship between polymerase and exonuclease active sites of

bacteriophage ø29 DNA polymerase. J. Mol. Biol. 292, 39-51.

Abril A.M., Marco S., Carrascosa J.L., Salas M. and Hermoso J.M. (1999)

Oligomeric structures of the phage ø29 histone-like protein p6. J. Mol.Biol.

292, 581-588.

Salas M. (1999) Mechanisms of initiation of linear DNA replication in

prokaryotes. Genet. Eng. 21, 159-171.

Elías-Arnanz M. and Salas M. (1999) Resolution of head-on collisions

between the transcription machinery and bacteriophage ø29 DNA

polymerase is dependent on RNA polymerase translocation. EMBO J.

18, 5675-5682.

Elías-Arnanz M. and Salas M. (1999) Functional interactions between a

phage histone-like protein and a transcriptional factor in regulation of ø29

early-late transcriptional switch. Genes Dev. 13, 2502-2513.

Truniger V., Blanco L. and Salas M. (2000) Analysis of ø29 DNA polymerase

by partial protelysis: Binding of terminal protein in the double-stranded

DNA channel. J. Mol. Biol. 295, 441-453.I.

Gascón I., Gutiérrez C. and Salas M. (2000) Structural and functional

comparative study of the complexes formed by viral ø29, Nf and GA-1

SSB proteins with DNA. J.Mol.Biol. 296, 989-999.

Gascón I., Lázaro J.M. and Salas M. (2000) Differential functional behavior

of viral ø29, Nf and GA-1 SSB proteins. Nucl. Acids Res, 28, 2034-2042.

González-Huici V., Lázaro J.M., Salas M. and Hermoso J.M. (2000)

Specific recognition of parental terminal protein by DNA polymerase for

initiation of protein-primed DNA replication. J. Biol.Chem. 275, 14678-

14683.

Abril A.M. , Salas and Hermoso J.M. (2000) Identification of residues

within two regions involved in self-association of viral histone-like protein

p6 from phage ø29. J.Biol. Chem. 275, 26404-26410.

Meijer W., Lewis P.J., Errington J. and Salas M. (2000) Dynamic

relocalization of phage ø29 DNA during replication and the role of the viral

protein p16.7. EMBO J. 19, 4182-4190.

Bravo A., Illana B. and Salas M. (2000) Compartmentalization of phage

ø29 DNA replication: Interaction between the primer terminal protein and

the membrane-associated protein p1. EMBO J. 19, 5575-5584.

Dufour E., Méndez J., Lázaro J.M., de Vega M., Blanco L. and Salas M.

(2000) An aspartic acid residue in TPR-1, a specific region of protein-

priming DNA polymerases, is required for the functional interaction with

primer terminal protein. J.Mol.Biol. 304, 289-300.

de Vega M., Lázaro J.M. and Salas M. (2000) Phage ø29 DNA polymerase

residues involved in the proper stabilisation of the primer-terminus at the

3'-5' exonuclease active site. J.Mol.Biol. 304, 1-10.

González-Huici V., Salas M. and Hermoso J.M. (2000) Sequence

requirements for protein-primed initiation and elongation of phage ø29

DNA replication. J.Biol.Chem. 275, 14678-14683.

Camacho A. and Salas M. (2000) Pleitropic effect of protein p6 on the

viral cycle of bacteriophage ø29. J. Bacteriol. 182, 6927-6932.

Serna-Rico A., Illana B., Salas M. and Meijer W.J.J.. (2000) The putative

coiled coil domain of the ø29 terminal protein is a major determinant

involved in recognition of the origin of replication. J. Biol. Chem. 275,

.40529-40538.

Miguel de Vega José: "Análisis mutacional del centro

activo exonucleasa 3'–5 de la DNA polimerasa del

bacteriófago ø29". (1998). Apto cum laude.

Javier Saturno de la Villa: "Análisis mutacional del

centro activo de polimerización de la DNA polimerasa

del bacteriofago ø29". Universidad Autónoma de

Madrid (1999). Sobresal iente cum laude.

Ana Abril Gallego: "Autoasociación de la proteína p6

del bacteriófago ø29 de Bacillus subtilis". Universidad

Autónoma de Madrid (2000). Sobresaliente cum laude.

José Antonio Horcajadas Almansa: "Control de la

transcripción del bacteriófago GA-1 de Bacillus".

Universidad Autónoma de Madrid (2000). Sobresaliente

cum laude.

Tesis/ Theses

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

Uno de los objetivos de nuestra línea es el

estudio de los mecanismos de replicación

del DNA del virus de la peste porcina

africana (VPPA) y de los enzimas que

participan en dicho proceso. Este estudio

tiene un interés especial debido a la

estructura del genoma viral, que está

cerrado covalentemente mediante enlaces

terminales, y a la existencia de una fase

replicativa nuclear durante el ciclo infectivo.

Nuestros resultados sugieren que la

replicación del DNA viral tiene lugar por un

mecanismo de iniciación de novo con la

síntesis de fragmentos pequeños en el

núcleo que se convierten posteriormente

en moléculas de mayor tamaño en el

citoplasma. Estas moléculas originan

concatémeros diméricos que se resolverían

para generar el DNA genómico maduro con

horquillas terminales.

Nuestros estudios tienen también como

finalidad comprender los procesos de

ensamblaje de la partícula viral y los

mecanismos implicados en la diseminación

del virus. Estos estudios se están abordando

mediante la utilización de virus

recombinantes que expresan

induciblemente proteínas estructurales y la

caracterización de genes virales que

participan en los distintos pasos

morfogenéticos. Uno de estos genes

codifica por la proteasa implicada en el

procesamiento de las poliproteínas del virus

que forman parte del dominio intermedio

de la partícula viral. La caracterización de

este enzima, que pertenece a la familia de

cisteín proteasas que procesan proteínas

sumoiladas, permitirá comprender mejor el

papel que juega el procesamiento de las

poliproteínas en la morfogénesis del virus.

Otro objetivo de nuestro trabajo es investigar

los mecanismos que utiliza el virus para

evadir los sistemas de defensa del huésped.

Hemos demostrado recientemente que el

gen viral homólogo al IAP celular tiene una

función anti-apoptótica, modulando la

actividad de la caspasa-3 celular. Una

función similar parece poseer la proteína

pEP153R del VPPA que contiene un

dominio de lectinas tipo C y es homóloga

al CD44 celular. Además, esta proteína está

implicada, junto con el homólogo viral del

CD2, en el fenómeno de hemadsorción

inducido en células infectadas. El control

del factor de transcripción NFkB por los

homólogos virales del IkB e IAP es otro de

los aspectos relacionados con la evasión

de la respuesta inmune que está siendo

estudiado en nuestro laboratorio.

Jefe de Línea / Group Leader:

María Luisa Salas

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Ángel L. Carrascosa, Yolanda Revilla,

Javier M. Rodríguez, José Salas

Becarios Postdoctorales / Postdoctoral

Fellows:

Germán Andrés, Ramón García,

Riccardo Missich, Clara Rodríguez

Becarios Predoctorales / Predoctoral

Fellowships:

Alí Alejo, Juán Francisco Aranda,

Ana Cebrián, Beatriz Cubelos,

Carolina Epifano, Inmaculada Galindo,

Gema Rojo

Técnicos de Investigación / Technical

Assistance:

María José Bustos, María Luisa Nogal

Virus de la peste porcina africanaC.9

60

La morfogénesis del VPPA tiene lugar en zonas discretas del citoplasma denominadas factorías virales. las

partículas intracelulares del VPPA adquieren sus envueltas internas del retículo endoplásmico, que se

colapsa, generándose así las membranas precursoras virales. A continuación, se forma la cápsida sobre

una de las caras de la envuelta interna. Sobre la otra cara se ensambla simultáneamente el dominio

intermedio. posteriormente, se ensamblaría el material nucleoproteico que forma el nucleoide. Finalmente,

se liberan las partículas virales maduras hacia el espacio extracelular mediante un proceso de gemación

en la membrana plasmática, adquiriéndose durante este proceso una envuelta externa.

African swine fever virus

Research Summary

One objective of our research line is the

study of the mechanisms of African swine

fever virus (ASFV) DNA replication and

of the enzymes involved in this process.

This study is of particular interest due to

the structure of the viral genome, which

contains covalently closed ends, and to

the existence of a nuclear replicative

phase during the infective cycle. Our

results suggest that the replication of the

viral DNA occurs by a de novo initiation

mechanism with the synthesis of small

fragments in the nucleus which are then

converted into larger size molecules in

the cytoplasm. These molecules originate

dimeric concatemers which are resolved

to generate the mature genomic DNA

with terminal cross-links.

Our studies are also directed to

understand the assembly processes of

the viral particle and the mechanisms

involved in virus dissemination. We are

approaching these studies by using ASFV

recombinants that inducibly express

structural proteins and by characterizing

viral genes that participate in the different

morphogenetic steps. One of these genes

codes for the protease involved in the

processing of the viral polyproteins which

constitute the core-shell domain of the

viral particle. The characterization of this

enzyme, which belongs to the cystein

protease family specific for sumoylated

proteins, will allow to understand the role

of polyprotein processing in virus

morphogenesis.

Another objective of our work is to

investigate the mechanims used by the

virus to evade the host defense systems.

We have recently shown that the virus

gene homologous to the cellular IAP has

an anti-apoptotic function, modulating the

activity of the cellular caspase-3. A similar

function has been demonstrated for the

ASFV protein pEP153R that contains a

C-type lectin-like domain and is

homologous to cellular CD44.

Furthermore, this protein is involved,

together with the viral CD2 homolog, in

the hemadsorption phenomenon induced

in infected cells. The control of the

transcription factor NFkB by the viral

homologs of IkB and IAP is another aspect

related to the immune response evasion

which is being studied in our laboratory.

61

Publicaciones /Publications:

Carrascosa, A.L., Bustos, M. J., Galindo, I., and Viñuela, E. (1999). Virus-

specific cell receptors are necessary, but not sufficient, to confer cell susceptibility

to African swine fever virus. Archiv. Virol. 144, 1309-1321.

Salas, J., Salas, M. L., and Viñuela, E. (1999). African swine fever virus: a

Missing link between poxviruses and iridoviruses? en Origin and Evolution of

Viruses. Eds. E. Domingo, R. G. Webster, and J. J. Holland, Academic Press,

London, pp. 467-480.

Salas, M. L. (1999). African swine fever virus, en Encyclopedia of Virology,

2nd Edition. Eds. R. Webster and A. Granoff, Academic Press, London, pp.

30-38.

Rojo, G., García-Beato, R., Viñuela, E., Salas, M. L. y Salas, J. (1999).

Replication of African swine fever virus DNA in infected cells. Virology 257,

524-536.

Alejo, A., Andrés, G., Viñuela, E. y Salas, M. L. (1999). The African swine fever

virus prenyltransferase is an integral membrane trans-geranylgeranyl diphosphate

synthase. J. Biol. Chem 274, 18033-18039.

Oliveros, M., García-Escudero, R., Alejo, A., Viñuela, E., Salas, M. L., y Salas,

J. (1999). African swine fever virus dUTPase is a highly specific enzyme

required for efficient replication in swine macrophages. J. Virol. 73, 8934-8943.

Dixon, L. K., Costa, J. V., Escribano, J. M., Rock, D. L., Viñuela, E., and

Wilkinson, P. J. (2000). The Asfarviridae, en Virus taxonomy. Seventh Report

of the International Committee for the Taxonomy of viruses. Eds. M. H. V. Van

Regenmortel, C. M. Fauquet, D. H. L. Bishop, E. B. Carsten, M. K. Estes, S.

M. Lemon, J. Maniloff, M. A. Mayo, D. J. McGeoch, C. R. Pringle, y R. B.

Wickner. Academic Press, New York, San Diego.

Galindo, I., Almazán, F., Bustos, M. J., Viñuela, E. y Carrascosa, A. L. (2000).

African swine fever virus EP153R open reading frame encodes a glycoprotein

involved in the hemadsorption of infected cells. Virology 266, 340-351.

Galindo, I., Viñuela, E. y Carrascosa, A. L. (2000). Characterization of the

African swine fever virus protein p49: a new late structural polypeptide. J. Gen.

Virol. 81, 59-65.

García-Escudero, R. y Viñuela, E. (2000). Structure of African swine fever

virus late promoters: Requirement of a TATA sequence at the initiation region.

J. Virol. 74, 8176-8182.

Roy, G., Lombardía, M., Palacios, C., Serrano, A., Cespón, C., Ortega, E.,

Eiras, P., Lujan, S., Revilla, Y. y Gonzalez-Porqué, P. (2000). Mechanistic

Aspects of the induction of apoptosis by lauryl gallate in the murine B-cell

lymphoma line Wehi 231. Arch. Biochem. Biophys. 383, 206-214.

Rodríguez, J. M., Agudo, M., Van Damme, J., Vanderkerckhove, J. y Santarén,

J. F. (2000). Polypeptides differentially expressed in imaginal discs define the

peroxiredoxin family of genes in Drosophila. Eur. J. Biochem. 267, 487-497.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Inmaculada Galindo Barreales: "Naturaleza y papel del receptor celular del

virus de la peste porcina africana. Caracterización de los genes virales B438L

y EP153R". Universidad Autónoma de Madrid. 1999. Calificación: Sobresaliente

cum laude.

Ana Cebrián Baux: "La proteína pA179L del VPPA: un inhibidor de apoptosis".

Universidad Autónoma de Madrid. 1999. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Ma Gema Rojo Carrascosa: "Estudio de la replicación del ADN del virus de

la peste porcina africana. Migración de mitocondrias a las áreas de ensamblaje

del virus". Universidad Autónoma de Madrid. 1999. Calificación: Sobresaliente

cum laude.

Alí Alejo Herberg: "Estudio de la geranilgeranilpirofosfato sintasa codificada

por el virus de la peste porcina africana". Universidad Autónoma de Madrid.

1999. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Premios y Distinciones/ Prizes andDistinctions

Eladio Viñuela

Medalla de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (1999)

Medalla de la Universidad Autónoma de Madrid (1999)

Laboratorio "Eladio Viñuela" en el Centro de Investigación en Sanidad Animal

del INIA (1999)

Medalla de la Junta de Extremadura (1999)

Creación del Escuela de Biología Molecular "Eladio Viñuela" en la Universidad

Internacional Menéndez Pelayo

Edificio "Eladio Viñuela" en el Campus de la Universidad de Extremadura

(2000)

ASFV morphogenesis takes place in discrete cytoplasmic ares designated the viral factories. Intracellular

ASFV particles acquire thei inner envelopes from the endoplasmic reticulum, wich is collapsed to give rise

to precursor viral membranes. Subsecuently, the capsid is gradually assembled on one side of the inner

envelope whereas the core shell forms beneath the opposite face. At the time the particle is closing, the

nucleoprotein material of the nucleoid would become engulfed. Finally, the intracellular particles are released

from the cell by budding at the plasma membrane, thus acquiring the extracellular envelope.

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

El objetivo general de nuestro grupo durante

los últimos años se ha centrado en el

entendimiento de los mecanismos que

determinan la diversificación de un precursor

hematopoyético multipotencial en

precursores restringidos a un linaje celular

concreto.

En particular, nos hemos centrado en los

precursores hematolinfoides que colonizan

el timo humano, y en las rutas madurativas

de generación de tres linajes celulares:

linfocitos T, células dendríticas (DC) y células

“natural killer” (NK). Mediante estudios

fenotípicos ex vivo, hemos identificado

precursores intermediarios de cada uno de

los tres linajes, cuyo potencial

hematopoyético y relaciones precursor-

progenie han sido analizados tras el

establecimiento de los sistemas de

diferenciación in vitro apropiados.

Este sistema experimental, junto con la

optimización de técnicas de manipulación

genética de precursores hematopoyéticos

por transducción retroviral, nos ha permitido

analizar la implicación de genes de interés

en procesos madurativos concretos.

El objetivo final es llegar al conocimiento

de los programas genéticos implicados en

la especificación de cada linaje

hematolinfoide.

Durante los dos últimos años, nos hemos

centrado en el linaje T, y en la función del

gen que codifica para la cadena pTα del

pre-receptor T (pre-TCR).

El desarrollo de sistemas de diferenciación

basados en cultivos organotípicos

humano/ratón (hu/mo FTOC), nos ha

permitido establecer relaciones precursor-

progenie e identificar un nuevo estadio

intratímico, caracterizado como

CD4+CD8αα+, en el que se inducen

importantes procesos madurativos

específicos de las células Tαβ, entre ellos:

1) el reordenamiento de los genes del locusTCRβ , 2) la expresión en membrana del

pre-TCR, 3) la adquisición del heterodímero

CD8αβ, y 4) la selección y expansión de

la población intratímica CD4+CD8αβ+,

proceso conocido como selección β, que

determina finalmente el reordenamiento en

el locus TCRα y la expresión del TCRαβmaduro.

En la actualidad estamos analizando el

efecto de la sobre-expresión de dos formas

de procesamiento alternativo de pTα en la

determinación de los linajes Tαβ, DC y NK.

Jefe de Línea/Group Leader:

María Luisa Toribio

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Susana Rojo

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Marina García Peydró,

Almudena R. Ramiro,

César Trigueros

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Yolanda R. Carrasco,

Virginia G. de Yébenes,

Aura Carreira,

María de las Nieves Navarro

Técnico de Investigación/ Technical

Assistance :

Vanesa López

Desarrollo del sistema linfohematopoyéticohumano

C.10

62

Análisis por microscopía de contraste de fase (arriba) o de fluorescencia (abajo) de

células dendríticas generadas in vitro a partir de precursores multipotenciales CD34+

intratímicos transducidos con vectores retrovirales portadores del gen EGFP.

Development of the humanlymphohematopoietic system

Research Summary

Our main interest in the last few years

has focussed on the mechanisms that

control commitment of a multipotent

hematopoietic progenitor into intermediate

lineage-restricted precursors.

Particularly, we have approached the

study of the developmental potential of

the earliest hematolymphoid precursors

that colonize the human thymus, with the

final aim of understanding the

mechanisms that control their

diversification into three distinct cell

lineages: T lymphocytes, dendritic cells

(DC) and natural killer (NK) cells.

Phenotypic studies had led to the

identification of distinct intermediate

progenitor subsets that have been isolated

ex vivo and analyzed for their T, NK, and

DC potential, in the corresponding in vitro

differentiation assays. The availability of

such experimental systems, in

combination with the development of gene

transfer approaches of human

hematopoietic precursors, based on

retroviral transduction, has allowed us to

analyze the involvement of critical genes

in particular maturation events.

Our final aim is the understanding of the

genetic programs involved in

hematolymphoid lineage-specification.

In the last two years, we have focussed

on the T-cell pathway, and on the

functional role of the gene encoding the

pre-T-cell receptor (pre-TCR) pTα chain.

The development of human/mouse fetal

thymic organ cultures (hu/moFTOC) has

allowed us to establish T-lineage

precursor-product relationships, and to

identify a novel intrathymic population,

characterized as CD4+CD8αα+, that

represents a critical pre-T cell stage. In

fact, we have shown that several T-cell

specific maturation events are induced

at this developmental point, including: 1)

rearrangements at the TCRβ locus , 2)

membrane expression of the pre-TCR

complex, 3) acquisition of the CD8αβheterodimer, and 4) selection and

expansion of CD4+ CD8αβ+ pre-T cells,

a process termed β selection, that finally

results in TCRα gene rearrangement and

surface expression of the mature TCRαβ.

We are presently analyzing the role that

overexpression of two pTα spliced

isoforms could play on T, DC, and NK cell

commitment.

63

Publicaciones /Publications:

Valentin, H., Azocar, O., Horvat, B., Williems, R., Garrone,

R., Evlashev, A., Toribio, M.L., and Rabourdin-Combe,

Ch.(1999). Measles virus infection induces terminal

differentiation of human thymic epithelial cells. J. Virol.

73: 2212-2221.

Carrasco, Y.R., Trigueros, C., Ramiro, A.R., de Yébenes,

V.G., and Toribio, M.L. (1999). β selection is associated

with the onset of CD8β chain expression on

CD4+CD8αα+ pre-T cells during human intrathymic

development. Blood 94: 1-9.

Zapata, D.A., Pacheco-Castro, A., Torres, P.S., Ramiro,

A.R., San José, E., Alarcón, B., Alibaud, L., Rubin, B.,

Toribio, M.L., and Regueiro, J.R. (1999). Conformational

and biochemical differences in the TCR/CD3 complex of

CD8 versus CD4 mature lymphocytes revealed in the

absence of CD3γ. J. Biol. Chem. 274: 35119-35128.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

César Trigueros. “Estadios pre-T en la diferenciación

intratímica humana: Caracterización bioquímica del

complejo pre-TCR”. Universidad Autónoma de Madrid.

1999. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Almudena Rodríguez Ramiro. “Análisis de la expresión

y función de pre-TCRα durante el desarrollo intratímico

humano. Caracterización de los procesos moleculares

asociados a la selección β. Universidad Autónoma de

Madrid. 2000. Calificación: Sobresaliente cum laude.

Bright-field (top) and fluorescense (bottom) microscopic images of a typical dendritic cell generated in

vitromfrom EGFP- transduced CD34+ intrathymic progenitors. Original magnification x 630.

Inmunología y VirologíaImmunology and Virology

Resumen de Investigación

La función de los antígenos HLA de clase

I es presentar péptidos a los linfocitos T

citotóxicos (CTL). Tres aspectos se

investigan en nuestro laboratorio: papel en

autoinmunidad, alorreactividad, y defensa

inmune.

HLA-B27 y espondilitis anquilosante

(AS). Esta artropatía afecta principalmente

a individuos HLA-B27+ y se asocia a ciertos

alotipos (B*2705, B*2704), pero no a otros

(B*2706, B*2709). El análisis de los

repertorios peptídicos de subtipos asociados

diferencialmente a AS sugiere que: 1) la

asociación de B*2705 a AS podría radicar

en solo un 10% de su repertorio peptídico;

2) B*2704 y B*2706 difieren en su afinidad

por péptidos con Tyr C-terminal y en su

especificidad por la posición 3. Estos

estudios tienden a definir las características

de posibles ligandos artritogénicos de HLA-

B27.

Base molecular y antagonismo de la

alorreactividad. Los CTL alorreactivos,

responsables en parte del rechazo agudo

de trasplantes, reconocen péptidos,

generalmente desconocidos, unidos al

aloantígeno de clase I. Hemos caracterizado

el primer ligando de HLA-B27 implicado en

alorreactividad (Figura 1) y establecido que:

1) el proteasoma lo genera directamente y

factores adicionales limitan la presentación

de péptidos relacionados, 2) la estructura

pep t íd i ca es esenc ia l pa ra e l

alorreconocimiento, pero algunas posiciones

toleran cambios conservativos, 3) la

sustitución de Pro5 (Figura 1) conlleva

pérdida de alorreactividad e induce

antagonismo. Estos estudios se encaminan

a una interpretación molecular de la

alorreactividad y a su inmunomodulación

específica.

Evolución diferencial del polimorfismo

de HLA en poblaciones no relacionadas.

Es posible evaluar la contribución del

polimorfismo de HLA a la defensa inmune

por su evolución en poblaciones dispares.

Hemos analizado la especificidad peptídica

de alotipos de HLA-B39 originados en Africa

(B*3910) y Sudamérica (B*3905, B*3909).

B*3910 posee una mutación que lo

aproxima a HLA-B53, asociado en Africa a

p r o t e c c i ó n c o n t r a m a l a r i a . E n

Sudamerindios, cuyo limitado repertorio

fundador de alelos HLA-B experimentó una

intensa evolución local, las nuevas variantes

de HLA-B39 poseen una especificidad

peptídica más próxima a alotipos ausentes

en dichas poblaciones. Ello produce una

diversificación funcional efectiva de HLA y,

presumiblemente, mayor capacidad

defensiva.

Ligandos naturales de HLA con

modificaciones post-traduccionales.

Estas son frecuentes en el proteoma, pero

poco conocidas en ligandos de HLA. Hemos

identificado N-acetilación y dimetilación

asimétrica de arginina en dichos péptidos.

La primera demuestra que el grupo amino-

terminal libre, una característica canónica

de ligandos de clase I, no es imprescindible.

La dimetil-Arg es frecuente en proteínas

nucleares pero nueva en ligandos de HLA.

En nuestro péptido, está en posición central

y flanqueada por cuatro residuos de Gly.

Presumiblemente, constituye gran parte de

la superficie peptídica accesible al TCR y

es antigénicamente crucial.

Jefe de Línea/Group Leader:

José A. López de Castro

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Stefan Krebs; José R. Lamas; Mercè

Martí; Alberto Paradela.

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Iñaki Alvarez; Marina García-Peydró;

Violeta Gómez; Verónica Montserrat;

Manuel Ramos; Laura Sesma; Jesús

Yagüe.

Estudiantes/Undergraduate

Students:

Miguel Marcilla.

Científicos Visitantes/Visiting

Scientists:

James Archer (Royal London Hospital,

U.K.)

Inmunología de los antígenos dehistocompatibilidad

C.11

62b

Figura 1. Modelo molecular del complejo B*2705 (blanco)/peptido alorrectivo RRFFPYYV

(azul). Los residuos peptídicos involucrados en la unión a HLA están ocultos.

Figure 1. Molecular model of B*2705 (white) in complex with the alloreactive peptide

RRFFPYYV. Peptide residues involved in HLA-B27 binding are hidden.

José Ramón Lamas López: “Base molecular de la especificidad peptídica de HLA-B27.”Universidad Autónoma de Madrid, 1999. Calificación: Sobresaliente "cum laude" porunanimidad.

Alberto Paradela Elizalde: “Caracterización bioquímica del procesamiento ypresentación de determinantes aloantigénicos por HLA-B27”. Universidad Autónomade Madrid, 1999. Calificación: Sobresaliente "cum laude" por unanimidad.

Marina García-Peydró: ”Base molecular y modulación del reconocimiento aloespecíficode HLA-B27 por linfocitos T citotóxicos”. Universidad Autónoma de Madrid, 2000.Calificación: Sobresaliente "cum laude" por unanimidad

Jesús Yagüe Gallardo: “Modulación de la especificidad peptídica por el polimorfismode HLA-B39. Implicaciones evolutivas y presentación de ligandos con modificacionespost-traduccionales”. Universidad Autónoma de Madrid, 2000. Calificación: Sobresaliente"cum laude" por unanimidad

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Immunology of histocompatibility antigens

63b

Publicaciones /Publications:

Marina, A., García, M.A., Albar, J.P., Yagüe, J., López de Castro,

J.A., and Vázquez, J. High-sensitivity analysis and sequencing

of peptides and proteins by quadrupole ion trap mass

spectrometry. J. Mass Spectr. 34: 17-27 (1999).

Yagüe, J., Ramos, M., Vázquez, J., Marina, A, Albar, J.P., and

López de Castro, J.A. The South Amerindian allotype HLA-

B*3909 has the largest known similarity in peptide specificity

and common natural ligands with HLA-B27. Tissue Antigens

53: 227-236 (1999).

Krebs, S., Rognan, D, and López de Castro, J.A. Long range

effects in protein-ligand interactions mediate peptide specificity

in the human major histocompatibility antigen HLA-B27 (B*2701).

Protein Science 8: 1393-1399 (1999).

Poenaru, S., Lamas, J.R., Folkers, G., López de Castro, J.A.,

Seebach, D., and Rognan, D. Nonapeptide analogs containing

(R)-3-hydroxybutanoate and -homoalanine oligomers: synthesis

and binding affinity to a class I major histocompatibility complex

protein. J. Med. Chem. 42: 2318-2331 (1999).

Dedier, S., Lamas, J.R., Poenaru, S., Folkers, G., López de

Castro, J.A., Seebach, D., and Rognan, D. Structure-based

design of nonnatural ligands for the HLA-B27 protein. J. Recept.

Signal Transduct. Res. 19: 645-657.

García-Peydró,M., Martí, M., and López de Castro, J.A.. High

T-cell epitope sharing between two HLA-B27 subtypes (B*2705

and B*2709) differentially associated to ankylosing spondylitis.

J. Immunol. 163: 2299-2305 (1999).

Lamas, J.R., Paradela, A., Roncal, F. and López de Castro,

J.A. The peptide specificity of HLA-B27 subtypes differentially

associated to ankylosing spondylitis is modulated at multiple

anchor positions. Arthritis Rheum. 42: 1975-1985 (1999).

García-Peydró, M., Paradela, A., Lamas, J.R., and López de

Castro, J.A.. Peptide presentation to an alloreactive CTL clone

is modulated through multiple mechanisms involving polymorphic

and conserved residues in HLA-B27. J. Immunol. 163: 6060-

6064 (1999).

Martí, M., Alvarez, I., and López de Castro, J.A. A molecular

insight on the association of HLA-B27 with

spondyloarthropathies. Curr. Rheumatol. Reports 1: 78-85

(1999).

Paradela, A., Alvarez, I., García-Peydró, M., Sesma, L., Ramos,

M., and López de Castro, J.A. Limited diversity of peptides

related to an alloreactive T-cell epitope in the HLA-B27-bound

peptide repertoire results from restriction at multiple steps along

the processing-loading pathway. J. Immunol. 164: 329-337

(2000).

García-Peydró, M., Rognan, D., and López de Castro, J.A..

Limited plasticity in the recognition of peptide epitope variants

by an alloreactive CTL clone correlates directly with conservation

of critical residues and inversely with peptide length. Tissue

Antigens 55: 289-295 (2000).

Yagüe, J., Alvarez, I., Rognan, D. Ramos, M., Vázquez, J.,

and López de Castro, J.A. An N-acetylated natural ligand of

human histocomaptibility leucocyte antigen (HLA)-B39: classical

major histocompatibility complex class I proteins bind peptides

with a blocked NH2-terminus in vivo. J. Exp. Med. 191:2083-

2092 (2000)

Alvarez, I., and López de Castro, J.A. HLA-B27 and

immunogenetics of spondyloarthropathies. Curr. Op. Rheumatol.

12: 248-253 (2000).

Publicaciones /Publications:

Urvater, J.A., McAdam, S.N., Loehrke, J.H., Allen, T.M., Moran,

J.L., Rowell, T.J., Rojo, S., López de Castro, J.A., Taurog, J.D.,

and Watkins, D. I. A high incidence of Shigella-induced arthritis

in a primate species: Major Histocompatibility Complex class

I molecules associated with resistance and susceptibility, and

their relationship to HLA-B27. Immunogenetics 51:314-325

(2000)

Yagüe, J., Ramos, M., Ogueta, S., Vázquez, J., and López de

Castro, J.A. Peptide specificity of the Amerindian B*3905

allotype: molecular insight into selection mechanisms driving

HLA class I evolution in indigenous populations of the Americas.

Tissue Antigens 56: 385-391 (2000).

Yagüe, J., Vázquez, J., and López de Castro, J.A. A post-

translational modification of nuclear proteins, NG,NG-dimethyl-

Arg, found in a natural HLA class I peptide ligand. Protein

Science 9: 1-8 (2000).

García-Peydró, M., Paradela, A., Albar, J. P., and López de

Castro, J.A. Antagonism of direct alloreactivity of an HLA-B27-

specific CTL clone by altered peptide ligands of its natural

epitope. J. Immunol. 165: 5680-5685 (2000).

Research Summary

HLA class I proteins present peptides to

cytotoxic T lymphocytes (CTL). Our

laboratory is focused on three issues: role

in autoimmunity, alloreactivity, and

immune defence.

HLA-B27 and ankylosing spondylitis

(AS). This disease affects mainly HLA-

B27+ individuals. It is associated to some

allotypes (B*2705, B*2704), but not to

others (B*2706, B*2709). Analysis of the

peptide repertoires from subtypes

differentially associated to AS suggests

that: 1) association of B*2705 to AS may

be related to just about 10% of its peptide

repertoire; B*2704 and B*2706 differ in

their affinity for peptides with C-terminal

Tyr and in their specificity for residues at

position 3. These studies aim to defining

putat ive ar thr i togenic pept ides.

Molecular basis and antagonism of

alloreactivity. Alloreactive CTL are

involved in acute graft rejection. They

recognise generally unknown peptides

bound to the allo-class I molecule. We

have identified the first HLA-B27 ligand

involved in alloreactivity (Figure 1) and

established that: 1) it is directly generated

by the proteasome, whereas additional

factors limit presentation of related

peptides, 2) the structure of the peptide

is essential for allorecognition, but at some

positions conservative changes are

tolerated, 3) changing Pro5 (Figure 1)

abolishes allorecognition and induces

antagonism. Goals of these studies are

to achieve a molecular understanding

and specific immunomodulation of

alloreactivity.

Dif ferent ia l evolut ion of HLA

p o l y m o r p h i s m i n u n r e l a t e d

populations . It is possible to assess the

contribution of HLA polymorphism to

immune defence through its evolution in

distinct populations. We analysed the

peptide specificity of HLA-B39 allotypes

from Africa (B*3910) and South America

(B*3905, B*3909). B*3910 has a mutation

that makes this subtype closer to HLA-

B53, an antigen associated with protection

against malaria in Africa. In South-

Amerindians, whose limited repertoire of

founder HLA-B alleles experienced an

intense local evolution, new HLA-B39

variants are closer in their peptide

specificity to class I allotypes absent from

this population. This implies an effective

functional diversification of HLA and,

presumably, increased defensive capacity.

Post-translational modifications in

natural HLA ligands.

Post-translational modifications are

frequent in the proteome, but little known

in HLA ligands. We have identified N-

acetylat ion and asymmetric Arg

dimethylation in these peptides. The

former modification demonstrates that a

free amino-terminus, a canonical feature

of class I ligands, is not necessarily

essential. Dimethyl-arg is frequent in RNA-

binding nucleoproteins, but novel among

HLA ligands. In our peptide, it is located

in a central position and is flanked by four

Gly residues. Presumably, it contributes

most of the accessible peptide surface

and is antigenically crucial.

D

NeurobiologíaNeurobiology

D.1 Microtubulos

D.2 Mecanismos de transducción;modulacion por Neuropeptidose implicaciones farmacológicas

D.3 Bases moleculares de laneurotransmisión glicinérgica*

D.4 Regulación de la expresión delgen de la apolipoproteína E

D.5 Bases moleculares de laadaptación al ejercicio y de laplasticidad muscular

D.6 Mecanismos de señalización yregulación de receptoresacoplados a proteínas G.

D.7 Interacción de los nucleotidosde guanina con los receptoresionotrópicos de glutamato

D.8 Mecanismos de envejecimientoy neurodegeneracion

D.9 Neuropatología molecular de laenfermedad de Alzheimer

D.10 Bases Moleculares de laPlasticidad Neuronal

D.1 Microtubules

D.2 Transduction mechanisms;modulation by neuropeptides andpharmacological implications

D.3 Molecular basis of the glycinergicneurotransmission*

D.4 Regulation of the apolipoproteinE gene expression

D.5 Molecular bases of the adaptationto exercise and of skeletal muscleplasticity

D.6 G protein-coupled receptorssignaling and regulatorymechanisms.

D.7 Interaction of guanine nucleotideswith ionotropic glutamatereceptors

D.8 Mechanisms of ageing andneurodegeneration

D.9 Molecular neuropathology ofAlzheimer’s disease

D.10 Molecular basis of neuronal plasticity

Resumen de Investigación

Durante este bienio los objetivos de

nuestro laboratorio han sido el estudio de

la función de las proteínas microtubulares

en el desarrollo de la forma neuronal; la

implicación de la proteína asociada a los

microtúbulos, tau, en procesos de

degeneración neuronal (tauopatías); y el

análisis de la regeneración de axones de

neuronas del sistema nervioso central.

En el primer objetivo se ha caracterizado

un ratón deficiente en la proteína asociada

a los microtúbulos (MAPs) conocida como

MAP1B, la primera MAP que se expresa

“in situ” en una neurona. Los resultados

obtenidos indican que la deficiencia de

dicha proteína afecta a la normal

elongación axonal. Este tipo de análisis

sigue realizándose actualmente.

En el segundo objetivo se han estudiado

tres de las características específicas de

la proteína tau, que se encuentra presente

en los cerebros de pacientes con la

enfermedad de Alzheimer u otras

tauopatías; su hiperfosforilación, su

deficiente unión a los microtúbulos y su

agregación aberrante para dar lugar a

polímeros filamentosos. Sobre el primer

punto se ha observado que el grado de

fosforilación de tau puede afectar no solo

a su unión con microtúbulos sino a su

asociación con la membrana plasmática.

Adicionalmente se ha observado que en

un tipo de tauopatía, la demencia

frontotemporal asociada al cromosoma 17

(FTDP-17), mutaciones en la proteína tau

pueden dar lugar a cambios en su nivel de

fosforilación. Por otra parte, en dicha

proteína tau mutada se encuentra

alterada la interacción de tau con los

microtúbulos, una alteración que también

puede ocurrir por la fosforilación de la

proteína normal y basada en la

fosforilación de las proteínas, que puede

afectar a la morfología neuronal (como se

describe en otro trabajo). El tercer punto,

es decir la agregación anormal de la

proteína tau, se ha estudiado in vitro,

habiéndose observado que la proteína tau

mutada en determinados residuos, posee

una mayor capacidad para agregar que la

proteína no mutada. Adicionalmente, se

observó que la proteína tau

hiperfosforilada, pero no la modificada,

puede polimerizar en presencia de un

producto de la peroxidación lipidica que se

produce durante el envejecimiento, el

hidroxinonenal (HNE).

Finalmente, los estudios sobre

regeneración axonal indicaron que, tras

realizar lesiones medulares en rata, se

obtenía regeneración axonal, y

recuperación funcional, tras ser

transplantada la rata lesionada (en la zona

de la lesión) con células de glia

envolvente.

Jefe de Línea / Group Leader:

Jesús Avila de Grado

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Rosario Armas Portela, Javier Díaz

Nido, Felix Hernández Pérez,

Filip Lim, Juan José Lucas Lozano,

Esteban Montejo de Garcini, Mar Pérez

Martínez, Almudena Ramón Cueto,

Marina Sánchez García

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Montserrat Arrasate Iragui, Christian

González Billault, Carlos Sánchez

Martín

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Marta Agudo Barriuso, Gretchen Lorio

García, Esther Martín Aparicio, Mª

Auxiliadora Parrales Mena, Silvia

Sánchez Muñoz, Laura Sayas

Casanova

Técnicos de investigación /

Technical Assistance:

Raquel Cuadros Catalan, Paloma

López Abengozar

Estudiantes / Undergraduate Students:

Matthias Engelke, Elsa Champion

Científicos Visitantes / Visiting Scientist:

Claudio Coello

(McGill University, Montreal)

Margarita Alvarez de la Rosa (Yale

University, New Haven)

MicrotubulosD.1NeurobiologíaNeurobiology

66

Tesis Doctorales/ Doctoral ThesesChristian González Billault: “Análisis funcional

de la proteína asociada a microtubulos 1B.

Aspectos celulares y moleculares”.

Sobresaliente cum laude. Noviembre 2000.

Montserrat Arrasate Iragui: “La proteína tau:

localización subcelular, interacción con

nuevas proteínas y agregación patológica”.

Sobresaliente cum laude. Diciembre 2000.

Colaboraciones con la Industria /Collaborations with Industry

Proyectos de colaboración con Synthelabo y

Pharma Mar

Premios y Distinciones / AwardsPremio al grupo: medalla de oro de la

Comunidad de Madrid

Neurona de hipocampo de ratón, en un estado inicial de desarrollo, teñida con anticuerpos

contra tubulina.

Developping mouse hippocampal neuron, stained with tubulin antibodies.

Ramón-Cueto, A. and Avila, J. (1999). Two modes of microtubule-

associated protein 1B phosphorylation are differentially regulated

during peripheral nerve regeneration. Brain Res. 815, 213-226.

Fanarraga, M., Aloria, K., Avila, J. and Zabala, J.C. (1999). Expression

of unphosphorylated class III beta tubulin isotype in neuroepithelial

cells evidences neuroblast commitment and differentiation. Europ.

J. Neurosci. 11, 517-527.

Arrasate, M., Pérez, M., Armas-Portela, R. and Avila, J. (1999).Polymerization of tau peptides into fibrillar structures. The effect ofFTDP-17 mutations. FEBS Lett. 446, 199-202.

Sayas, L., Moreno-Flores, M.T., Avila, J. and Wandosell, F. (1999).The neurite retraction induced by lysophosphatidic acid increasesAlzheimer’s disease-like tau phosphorylation. J. Biol. Chem. 274,37046-37052.

Mu–oz-Monta–o, J.R., Lim, F., Moreno, F.J., Avila, J. and D’az Nido,J. (2000). Glycogen synthase kinase 3 regulates axonal outgrowthin cultured neurons. J. Alzh. Disease 1, 361-378.

Gong, C.X., Wegiel, J., Lidsky, T., Zuck, L., Avila, J., Wisniewski,H., Grundke-Iqbal, I. and Iqbal, K. (2000). Regulation ofphosphorylation of neumonal microtubule associated proteins MAP1Band MAP2 by protein phosphatase 2A and 2B in rat brain. BrainRes. 853, 299-309

Arrasate, M., Pérez, M. and Avila, J. (2000). Tau dephosphorylationat tau 1 site correlates with its association to cell membrane.Neurochem. Res. 25, 43-50.

Cuadros, R., Montejo de Garcini, E., Wandosell, F., Faircloth, G.,Fern‡ndez-Sousa, J.M. and Avila, J. (2000). The marine compoundspisulosine, an inhibitor of cell proliferation, promotes the disassemblyof actin stress fibers. Cancer Lett. 152, 23-29.

Bullido, M.J., Aldudo, J., Frank, A., Goria, F., Avila, J. and Valdivieso,F. (2000). A polymorphism in the tau gene associated with risk forAlzheimer’s disease. Neurosc. Lett. 278, 49-52.

Ram—n Cueto, A., Cordero, M.I., Santos Benito, F. and Avila, J.(2000). Functional recovery of paraplegic rats and motor axonregeneration in their spinal cords by olfactory ensheating glia. Neuron25, 425-435.

Sánchez-Martín, C., Ledesma, D., Dotti, C. and Avila, J. (2000).Microtubule associated protein 2 located in growth cones of rathippocampal neurons is highly phosphorylate at its proline-richregion. Neuroscience 101, 885-893.

Sánchez, C., Pérez, M. and Avila, J. (2000). GSK3β-mediatedphosphorylation of the microtubule associated protein 2C (MAP2C)prevents microtubule bundling. Europ. J. Cell Biol. 79, 252-260.

Pérez, M., Lim, F., Arrasate, M. and Avila, J. (2000). The FTDR17linked mutation R406W abolishes the interaction of phosphorylatedtau with microtubules. J. Neurochem. 74, 2583-2589.

González Billault, C. and Avila, J. (2000). Molecular geneticapproaches to microtubule associated protein function. Histol.Histopathol. 15, 1177-1183.

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Quintana, C., Lancin, M., Marhic, C., Perez, M., Martin-Benito, J.,Avila, J. and Carrascosa, J. L. (2000). Initial studies with highresolution TEM and electron energy loss spectroscopy studies offerritin cores extracted from brain of patients with progressivesupranuclear palsy and Alzheimer disease. Cell and Mol. Biol. 46,807-820.

Takeda, A., Smith, M. A., Avila, J., Nunomura, A., Siedlak, S. L.,Zhu, X., Perry, G. and Sayre, L. M. (2000). In Alzheimer's disease,heme oxygenase is coincident with Alz50, an epitope of tau inducedby 4-hydroxy-2-nonenal modification. J. Neurochem. 75, 1234-1241.

Avila, J. (2000). Tau aggregation into fibrillar polymers: taupathies.FEBS Lett. 472, 89-92.

González Billault, C., Demandt, E., Wandosell, F., Torres, M. Bonaldo,P., Stoykova, A., Chowdhung, K., Gruss, P., Avila, J. and Sáncez,M. (2000). Perinatal lethality of microtubule associated protein 1B,deficient mice expressing alternative isoforms of the protein at lowlevels. Mol. Cell Neurosci. 16, 408-421.

Jiménez, C., Armas Portela, R., Mellado, M., Rodríguez Frade, J.M.,Collard, J., Serrano, A., Martínez, A.C., Avila, J. and Carrera, A.C.(2000). Role of P13 regulatory subunit in the control of actinorganization and cell migration. J. Cell Biol. 151, 249-261.

Microtubules

Publicaciones /Publications:

Research summary

During the years 1999-2000 we have

developed three objectives in our

laboratory: the role of microtubule

proteins in neural morphology

development; the role of microtubule

associated protein, tau, in

neurodegenerative disorders

(tauopathies); and the analysis of

axonal regeneration in central neurons

system neurons.

For the first objective a mouse,

deficient in microtubule associated

protein MAP1B was characterized. We

studied that protein since it is the first

MAP that is expressed “in situ” in a

neuron. Our results indicated that in

MAP1B deficient mouse it is a

reduction in axonal elongation

compared with that observed in the

normal countepart. These studies

continue at the present time.

For the second objective we have

analysed the three specific

characteristics of tau protein present in

the brain of Alzheimer´s disease

patients (or in other tauopathies); its

hyperphophorylation; its deficient

interaction with microtubules and its

aberrant aggregation into filamentous

polymers. About the first point we have

found that the phosphorylation level of

tau protein may affect not only to its

binding to microtubules but also to its

association with the plasma

membrane. Also, its has been found

that in one type of tauopathy,

frontotemporal dementia linked to

chromosome 17 (FTDP-17), mutations

in tau protein could change the level of

protein phosphorylation. Additionaly,

the mutated tau protein binds to

microtubules in a different way than

normal tau. Also, it has been found that

in normal protein, changes in its level of

phophorylation, correlate with changes

in neural morphology.

The development of the third point,

aberrant tau aggregation, has been

studied by in vitro analysis. Our results

indicates that FTDP-17 tau protein,

mutated at some specific residues,

shows a higher capacity for self

aggregation than normal protein. Also,

it was observed that

hyperphosphorylated tau protein, but

not unmodified tau, is able to assemble

in the presence of a product,

hydroxynonenal (HNE), raised from

lipid peroxidation, a process that could

occur in Alzheimer´s disease patients,

since is related with aging.

Finally, our studies on axonal

regeneration showed that after

performing spinal cord lesions in rat,

olfactory ensheating glia

transplantation, at the lesion site,

results in axonal regeneration, (and

functional recovery), of the lesioned

rats.

67

Lucas, J.J., Hernández, F. and Avila, J. (1999). Nuclear localization

of β catenin in adult mouse thalamus correlates with low levels of

GSK-3β. Neuroreport 10,2699-2703.

Alvarez de la Rosa, M., Nilsen, J., Avila, J. and Naftolin, F. (1999).

Effect of estrogen in tau protein isoforms expression in PC12. Mol.

Biol. Cell. 10, 373a (Abst.).

Alvarez, G., Muñoz-Montaño, J.R., Satrustegui, J., Avila, J., Bogonez,

E. and Diaz-Nido, J. (1999). Lithium protects cultured neurons

against β amyloid induced neurodegeneration. FEBS Lett. 453, 260-

264.

Fanarraga, M.L., Parraga, M., Aloria, K., del Mazo, J., Avila, J. and

Zabala, J.C. (1999). Regulated expression of p14 (cofactor A) during

spermatogenesis. Cell Motil. Cytoskeleton 43, 243-254.

García-Pérez, J., Avila, J. and Diaz-Nido, J. (1999). Lithium induces

morphological differentiation of mouse neuroblastoma cells. J.

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Zambrano, R., Briones, E., Avila, J. and García Ballesta, J.P. (1999).

Phosphorylation of P'1 serine inhibits peptide bond sensitivity to

Staphylococcus aureus V8 protease. Arch. Biochem. Biophys. 368,

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Muñoz-Montaño, J.R., Moreno, F.J., Avila, J. and Diaz-Nido, J.

(1999). Downregulation of glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β)

protein expression during neuroblastoma IMR-32 cell differentiation.

J. Neurosci. Res. 55, 278-285.

Moreno, F.J., Bagnat, M., Lim, F. and Avila, J. (1999). OP18/stathmin

binds near the C-terminus of tubulin and facilitates GTP binding.

Eur. J. Biochem. 262, 557-562.

Armas-Portela, R., Parrales, M.A., Albar, J.P., Martinez-A, C. and

Avila, J. (1999). Distribution and characteristics of βII tubulin-enriched

microtubules in interphase cells. Exp. Cell. Res. 248, 372-380.

Hoenicka, J., Perez, M., Perez-Tur, J., Barabash, A., Godoy, M.,

Vidal, L., Astarloa, R., Avila, J., Nygaard, T. and Yebenes, J.G.

(1999). The tau gene A0 allele and progressive supranuclear palsy.

Neurology 53,1219-1225

Pérez, M. and Avila, J. (1999). The expression of casein kinase 2α'

and phosphatase 2A activity. Biochim. Biophys. Acta 1449, 150-

156.

Publicaciones /Publications:

Resumen de Investigación

El objetivo principal del proyecto de

investigación lo constituye el estudio de

los mecanismos de transducción

implicados en la acción de la endotelina

(ET), así como la implicación de agentes

farmacológicos específicos. Los objetivos

particulares de este proyecto han sido:

a) Estudio del efecto de la ET en el

metabolismo de lípidos y fenómeno de

fosforilación-defosforilación. Los estudios

llevados a cabo han confirmado el

mecanismo de acción de la ET a través

del ciclo PI-PA; de manera paralela se ha

iniciado un análisis de los esfingolípidos

como otro posible mecanismo de

transducción. Se ha demostrado también

la participación de la proteína quinasa C y

de la fosforilación de alguno de sus

sustratos específicos como la MARCKS

en la acción de la ET, estableciéndose de

manera paralela la relación existente

entre el neuropéptido y la fosforilación de

proteínas en restos de tirosina; en este

sentido se ha comprobado la acción de la

ET en la fosforilación de dos proteínas de

adhesión a través de la activación de

receptores tipo B. Asimismo, se ha

estudiado la translocación de

fosfoproteína fosfatasas y la generación

del sistema cAMP por acción del

neuropéptido.

b) Estudio de la funcionalidad de la

barrera hematoencefálica a nivel de

sistemas de transducción. Se han

obtenido nuevos datos acerca de la

acción de la ET modulando el efecto de la

histamina a través de receptores tipo A.

c) Estudio de la participación de

mediadores en la acción de la ET. Se ha

analizado el papel de ciertos mediadores

(PAF y NO) en la acción de la ET,

estableciéndose el papel del PAF en

sistema nervioso a nivel de la modulación

de isoformas de proteína quinasa C,

proteínas de adhesión, metabolismo de

esfingolípidos y la posible relación con el

sistema NO-cGMP; de manera particular

algunos de estos aspectos han sido

analizados en núcleos aislados.

d) Estudio de la modulación de los

sistemas de transducción mediante

agentes farmacológicos.

Jefe de Línea / Group Leader:

Edgardo Catalán

Becarios Predoctorales / Graduate

Students :

Eduardo Latorre

Técnicos de Investigación /

Technical Assistance :

Victoria Mora-Gil

Mecanismos de transducción; modulación porNeuropeptidos e implicaciones farmacológicas

D.2NeurobiologíaNeurobiology

68

Pérez-Alvarez, M.J., Calcerrada, M.C., Catalán, R.E.

and Martínez, A.M. (1999). Phosphorylation of

MARCKS by endothelin in rat cerebral cortex slices.

Neurosci. Res. Commun. 24, 155-162.

Calcerrada, M.C., Miguel, B.G., Catalán, R.E. and

Martínez, A.M. (1999). Sphingosylphosphorylcholine

increases calcium concentration in isolated brain

nuclei. Neurosci. Res. 33, 229-232.

Pérez, M.J., Calcerrada, M.C., Catalán, R.E. and

Martínez, A.M. (1999). Endothelin stimulates tyrosine

phosphorylation of p125FAK and p130Cas in rat cerebral

cortex. Neurochem. Int. 34, 483-490.

Calcerrada, M.C., Catalán, R.E., Pérez-Alvarez, M.J.,

Miguel, B.G. and Martínez, A.M.(1999). Platelet-

activating factor stimulation of p125FAK and p130Cas

tyrosine phosphorylation in brain. Brain Res. 835, 275-

281.

Latorre, E., Aragonés, M.D., Fernández, I. and Catalán,

R.E. (1999). Platelet-activating factor modulates brain

sphingomyelin metabolism. Eur. J. Biochem. 262, 308-

314.

Hernández, F., Catalán, R.E. and Martínez A.M. (1999).

Endothelin enhances adenosine and isoprenaline

elevated cyclic AMP levels in rat cerebellar slices.

Peptides 20, 1115-1122.

Calcerrada, M.C., Catalán, R.E. and Martínez A.M.

(1999). Glutamate release is involvead in PAF-

increased cyclic GMP levels in hippocampus. Biochem.

Mol. Biol. Int. 47, 529-535.

Calcerrada, M.C., Pérez, M.J., Catalán, R.E. and

Martínez, A.M. (1999). Modulation of protein kinase C

isoforms by PAF in cerebral cortex, Prostagl. Lipid Med.

58, 19-27.

Catalán, R.E., Gargiulo, L., Martínez, A.M. and Liras, A.

(1999). Endothelin-1 effect on tyrosine phosphory-

lation and on tyrosine phosphatase (PTP-1C)

translocation in rabbit platelets. J. Receptor Signal

Transduct. Res. 19, 909-925.

Pérez-Alvarez, M.J., Calcerrada, M.C., Hernández, F.,

Catalán, R.E. and Martínez, A.M. (2000). Endothelin-1

increases isoprenaline enhanced cyclic AMP levels in

cerebral cortex. Regul. Peptides 88, 41-46.

Liras, A., Catalán, R.E. and Martínez, A.M. (2000).

Synergistic effect of endothelin-1 and serotonin in

rabbit platelets: effect on tyrosine phosphorylation.

Thromb. Res. 100, 325-331.

Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Mata, F., Aller, P.,

Clemente, R., Catalán, R.E. and Martínez, A.M. (2000).

Differential redistribution of protein kinase C isoforms

by cyclic AMP in HL60 cells. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 274, 596-602.

Hernández, F., Martínez, A.M., Piedra, D. and Catalán,

R.E. (2000). Endothelin inhibits histamine-induced

cyclic AMP accumulation in bovine brain vessels.

Microvasc. Res. 60, 49-54.

Transduction mechanisms; modulation byneuropeptides and pharmacological implications

Publicaciones /Publications:

Research summary

The main goal of this project is to study

the biochemical mechanisms at the

transduction level involved in the action

of neuropeptides, in particular

endothelin (ET), and the involvement of

new pharmacological agents. In this

regard, the particular objectives are:

a) Study of the effect of ET on lipid

metabolism and the phosphorylation-

dephosphorylation phenomenon. Our

data have confirmed that the

mechanism of action of ET involves the

PI-PA cycle. The involvement of

sphingolipids as other transduction

mechanism has been analyzed. The

involvement of protein kinase C and the

phosphorylation of some specific

substrates as MARCKS has also been

demonstrated. Furthermore, the

relationship between the neuropeptide

and the phosphorylation of tyrosine

proteins has been studied; in this

regard, the action of ET on the

phosphorylation of two adhesion

proteins through the activation of type

B receptors has been observed.

The translocation of phosphoprotein

phosphatase and the generation of the

cAMP system have been studied.

b) Functioning of the blood-brain

barrier mainly at the transduction level.

New data about the modulation of the

histamine action through type A

receptors by ET, have been obtained.

c) Study of the involvement of

mediators in the mechanism of action

of ET. The role of mediators such as

PAF and NO in the action of ET has

been studied. The role of PAF in the

nervous system, on protein kinase C

isoforms, adhesion proteins,

sphingolipid metabolism and the NO-

cGMP system has been analyzed; in

particular, some of these aspects have

been studied in isolated nuclei.

d) Modulation of the transduction

systems by pharmacological agents.

69

Resumen de Investigación

El neurotransmisor glicina ejerce dos

funciones en el SNC de vertebrados.

Actúa como inhibidor a través de la

interacción con receptores de glicina

sensibles a estricnina en médula espinal y

tallo cerebral y tiene además un papel

excitador al actuar como co-agonista de

glutamato sobre receptores NMDA en

corteza e hipocampo. Ambas funciones

requieren un estricto control de la

concentración de glicina extracelular. Este

cometido es llevado a cabo por los

transportadores específicos de glicina

localizados en la membrana plasmática

de neuronas (GLYT2) y células gliales

(GLYT1). Alteraciones funcionales de la

neurotransmisión glicinérgica están

relacionados con desórdenes en la

actividad neuromuscular y en la función

cognitiva. La posibilidad de desarrollar

una farmacología mediante la que se

pueda modular la actividad de los

transportadores de glicina y por tanto la

cantidad de neurotransmisor en el espacio

sináptico es de un enorme interés

terapeútico. El desarrollo de fármacos

específicos requiere del conocimiento, a

nivel molecular, de la estructura,

mecanismo funcional y regulación de las

proteinas dianas. Esto último constituye el

objetivo de nuestro grupo.

Con respecto a la relación estructura-

función, mediante mutaciones puntuales y

utilizando técnicas bioquímicas y

electrofisiológicas, hemos identificado

dominios y residuos de GLYT2 implicados

en el mecanismo de transporte. Por otra

parte, mediante técnicas de microscopía

electrónica e inmunocitoquímica hemos

determinado la expresión de GLYT2 en el

sistema auditivo durante el desarrollo, lo

que ha sugerido una participación de este

transportador en el proceso de

maduración de sinapsis glicinérgicas.

En cuanto a la regulación de estas

proteinas, hemos demostrado una

interacción física y funcional entre la

proteina SNARE sintaxina 1A y los

transportadores GLYT1 y GLYT2.

Sintaxina 1A parece regular el tráfico de

estas proteinas entre el compartimento

intracelular y la membrana plasmática.

Utilizando clones de lineas celulares HEK

293 que expresan de forma estable

GLYT1 y GLYT2, hemos descrito efectos

diferenciales sobre la actividad y/o

expresión en la membrana plasmática de

estas proteinas por parte de algunos

compuestos con actividad antidepresiva

(amoxapina) y sedativa/tóxica (etanol).

Bases moleculares de la neurotransmisiónglicinérgica

D.3NeurobiologíaNeurobiology

70

Jefe de Linea/Group Leader:

Carmen Aragón*

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Beatriz López-Corcuera

Becario Postdoctoral/ Postdoctoral

Fellow:

Arjan Geerlings

Becarios predoctorales / Graduate

Students:

Rodrigo Martinez-Maza,

Julia Ponce,

Amparo Fornés

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Enrique Núñez

Estudiantes/Undergraduate

Students: :

Jesús Romero, Ruth Espinosa

Científico Visitante/Visiting Scientific :

Juan Madoz (Instituto de Petroquímica

y Catálisis, CSIC)

*Jefe de Línea Asociado

Estructura de transportadores para neurotransmisores.

Structure of neurotransmitter transporters.

Molecular basis of the glycinergicneurotransmission

Publicaciones /Publications:

Research summary

Glycine plays a dual role in the SNC of

vertebrates. In the spinal cord and

brain stem glycine acts as an inhibitory

neurotransmitter on the postsynaptic

glycine receptors sensitive to

strychnine. Moreover, glycine

potentates the action of glutamate on

the NMDA glutamate receptors in the

cortex and the hippocampus. For both

glycine functions, the extracellular

levels of glycine must be finely

regulated. The removal of glycine is

accomplishes through specific

transporters located both in the plasma

membrane of neurons (GLYT2) and

the fine glial processes (GLYT1).

Dysfunction in any of the mentioned

glycine roles in neurotransmission

would lead to neurological disorders

associated with musculoskeletical

activity, or in cognitive functions.

Therefore, a new role for the glycine

transporters as targets of therapeutic

drugs is now emerging. The

development of a specific

pharmacology requires a knowledge at

the molecular level, of the

structure/function relationship and the

regulation of the GLYT1 and GLYT2

glycine transporters from CNS. This

represents the aim of the group.

By point mutations and by using

biochemical and electrophysiological

techniques, we have identified

structural domains and amino acid

residues of GLYT2 involved in the

intrinsic mechanism of glycine

transport. By electronic microscopy

and immunocitochemistry techniques,

we have study the expression of

GLYT2 during development in the rat

central auditory system. The onset of

GLYT2 suggest that the transporter

molecules participate in the process of

early synapse maduration during

development. As far as the regulation

properties of the transporters is

concern, we have demonstrated a

functional and physical interaction

between GLYT1 and GLYT2 and the

SNARE protein syntaxin 1A in COS

cells and in rat brain tissue. Sintaxin 1A

regulates the intracellular trafficking of

these proteins.

We have described differential effects

of tricyclic antidepressant

drugs(amoxapine) and ethanol on the

activity and/or plasma membrane

expression of the recombinant GLYT1

and GLYT2 glycine transporters.

GLYT2 modulation may account for the

sedative and psychomotor side effects

of amoxapine. Changes induced by

ethanol on these transporters may

contribute to understand the molecular

mechanism of ethanol intoxication.

71

Friauf, E., Aragón, C., Lohrke, S., Westenfelder, B and

Zafra, F. 1999. Developmental expression of the

glycine transporter GLYT2 in the auditory system of

rats suggests involvement in synapse maturation. J.

Comp. Neurol. 412, 17-37.

Ponce, J., Biton, B., Benavides, J., Avenet, P.and

Aragón, C. (2000). Transmembrane domain III plays an

important role in ion binding and permeation in the

glycine transporter GLYT2. J. Biol. Chem. 275, 13856-

62.

Geerlings, A, López-Corcuera, B. and Aragón C.

(2000). Characterization of the interactions between

the glycine transporters GLYT1 and GLYT2 and the

SNARE protein syntaxin 1A. FEBS Lett. 470, 51-4

Núñez, E., López-Corcuera, B., Vázquez ,J., Giménez,

C., Aragón, C. (2000). Differential effects of the tricyclic

antidepressant amoxapine on glycine uptake mediated

by the recombinant GLYT1 and GLYT2 glycine

transporters.Br. J. Pharmacol.129, 200-6.

Núñez, E., López-Corcuera, B., Martínez-Maza, R.and

Aragón, C. (2000). Differential effects of ethanol on

glycine uptake mediated by the recombinant GLYT1

and GLYT2 glycine transporters. Br. J. Pharmacol. 129,

802-10.

López-Corcuera, B., Martínez-Maza, Núñez, E.,

Geerlings, A., and Aragón, C. (2000). Glycine

transporters in the central nervous system. Recent

Res. Dev. Neurochem. 3, 161-173.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Julia Ponce: “Clonaje de un nuevo transportador de

glicina de sistema nervioso central. Estudio de la

relación estructura-función de la proteína”. Universidad

Autónoma de Madrid. 1999. Sobresaliente cum laude.

Rodrigo Martínez: “Caracterización funcional de

dominios estructurales del transportador neuronal de

glicina GLYT2”. Universidad Autónoma de Madrid.

2000. Sobresaliente cum laude.

Jefe de Linea/Group Leader:

Cecilio Giménez,

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Francisco Zafra

Becarios predoctorales / Graduate

Students:

Julia Ponce,

Irene Poyatos,

Enrique Salero

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Enrique Núñez

D.4

72

NeurobiologíaNeurobiology

Resumen de Investigación

La apolipoproteína E está codificada en el

cromosoma 19 y presenta tres isoformas

(E2, E3 y E4) que corresponden a tres

alelos del gen. Aparte de sus funciones en

el transporte y metabolismo de lípidos

plasmáticos, ApoE desempeña

importantes papeles en el sistema

nervioso, tanto en la respuesta del mismo

a daños neurológicos, como en la

patogénesis de la enfermedad de

Alzheimer. Estas funciones dependen de

manera crítica de la isoforma alélica. Los

niveles de ApoE parecen jugar un papel

esencial en estas funciones fisiológicas, y

de hecho este gen esta sometido a una

fina regulación por factores nutricionales,

hormonales, específicos de tejido y de

desarrollo ontogénico. Además, responde

de forma dramática a diversos daños

neurales, presumiblemente en respuesta

a señales activadas por la lesión, tales

como las citoquinas o quimioquinas

proinflamatorias. Estas respuestas son

mediadas por la unión de una serie de

factores de transcripción tanto a la región

promotora proximal como a la distal,

aunque muchos de ellos están

pobremente caracterizados, en especial

los relacionados con el sistema nervioso.

En nuestro laboratorio intentamos

identificar y caracterizar los componentes

de esta maquinaria transcripcional.

En los últimos dos años hemos

encontrado tres sitios de unión para los

factores de transcripción ZIC1 y ZIC2 que

regulan tanto construcciones artificiales

del promotor ApoE como el gen

endógeno. Las proteínas ZIC parecen

tener un importante papel en el desarrollo

embrionario, aunque sus genes diana no

se conocen. Mediante la utilización de

microarrays de cDNA hemos encontrado

que aparte de ApoE, muchos otros genes

son regulados por Zic. Algunos de los

cambios de expresión detectados podrían

explicar el fenotipo observado en la

holoprosencefalia tipo 5, una

malformación debida a mutaciones en

ZIC2. En la actualidad continuamos la

busqueda de factores de transcripción

que regulen el gen ApoE, en especial en

las respuestas a factores asociados con el

daño neural y los especificos de tejido y

del desarrollo.

Regulación de la expresión del gen de laapolipoproteína E

Estructura genómica y proteica de la lipoproteína E

Friauf, E., Aragón, C., Lohrke, S., Westenfelder,

B and Zafra, F. (1999). Developmental

expression of the glycine transporter GLYT2

in the auditory system of rats suggests

involvement in synapse maturation. J. Comp.

Neurol. 412, 17-37.

Poyatos, I., Ruberti, F., Martinez-Maza, R.,

Giménez, C., Dotti, C.G.and Zafra, F. (2000)

Polarized distribution of glycine transporter

isoforms in epithelial and neuronal cells.

Mol.Cell. Neurosci. 15, 99-111.

Núñez, E., López-Corcuera, B., Vázquez , J.,

Giménez, C., Aragón, C. (2000). Differential

effects of the tricyclic antidepressant

amoxapine on glycine uptake mediated by the

recombinant GLYT1 and GLYT2 glycine

transporters.Br. J. Pharmacol.129, 200-206.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Julia Ponce: “Clonaje de un nuevo

transportador de glicina de sistema nervioso

central. Estudio de la relación estructura-

función de la proteína”. Universidad Autónoma

de Madrid. 1999. Sobresaliente cum laude.

Irene Poyatos: “Mecanismos implicados en el

tráfico intracelular, localización y regulación

de los transportadores de glicina”. Universidad

Autónoma de Madrid. 2000. Sobresaliente

cum laude.

Research Summary

ApolipoproteinE (apoE) is encoded

by a single gene on chromosome 19

with three isoforms (E2, E3 and E4)

arising from three alleles at the gene

locus. Apart from its functions on the

transport and metabolism of plasma

lipids, apoE has emerged as an

important molecule in the nervous

system playing a key role in

response to injurious agents

causing neuronal damage, or in

Alzheimer disease. As all the above

mentioned functions of apoE are

isoform-specific, and depend of the

level of the expression of the

protein, the APOE gene is under a

fine and complex regulation

including dietary, hormonal,

ontogenic and tissue-specific

factors. Moreover, its expression

raises dramatically after nerve

injuries, probably in response to the

release of cytokines or chymiokines

as modulator inflammatory

mediators. All the regulatory

responses of APOE are mediated

by interactions of a number of

proteins which bind to both proximal

and distal regions of the APOE gene

promoter. The identification and

characterization of components

involved in this transcriptional

machinery constitutes the aim of our

group.

In the last two years, we have

identified three binding sites for the

transcription factors ZIC1 and ZIC2

able to trans-stimulate chimeric

constructions or endogenous

expression of apoE. Although Zic

proteins seem to be involved in the

embryonic development, further

clarification of its natural targets still

would be necessary. By using cDNA

microarrays we have found that,

apart of APOE, other genes are

regulated by Zic. Some of the

observed changed gene expression

patterns may explain the

holoprosencepfaly 5 phenotype, a

inherited disease related to Zic

mutations. Currently we are

interested in finding new

transcription factors involved in the

regulation of apoE, specially those

associated to neural injury and in

development.

73

Regulation of the apolipoprotein E geneexpression

Publicaciones /Publications:

Genomic and proteinic structure of the lipoprotein E

Jefe de Linea / Group Leader:

Rafael Manso Martínez

Doctorandos / Graduate Students:

Beatriz González Alonso,

Pilar Negredo Madrigal (desde Abril de

2000)

D.5

74

NeurobiologíaNeurobiology

Resumen de Investigación

El interés investigador del laboratorio seha centrado en tres aspectos. Un primeraspecto se refiere a la caracterización defactores y mecanismos implicados en laadaptación al ejercicio crónico,considerando el posible papel de larespuesta celular de estrés y la participaciónde las proteínas de estrés en este proceso.

La expresión incrementada de algunasproteínas de estrés proporciona un soportemolecular para entender la forma en queel músculo esquelético puede incrementarsu tolerancia al ejercicio, aún antes de quese observen otros cambios fenotípicos. Laadaptación de células no contráctiles, comolas del hígado, podría implicar señales quese liberan durante la actividad física, seaen el músculo o en otros tejidos, que sedistribuyen por todo el organismo. Lainducción de la respuesta celular de estréstras ejercicio en células hepáticas, podríaexigir la intervención de hormonas de estrésquizás con la participación de otrosmensajeros celulares entre los que, por sufunción reguladora de la inflamación y laremodelación tisular, se están estudiandolas citoquinas. El segundo de los objetivos

investigadores del laboratorio se dirige adeterminar el mecanismo molecularresponsable de la diversidad de variantesde las isoformas lenta y rápida de lascadenas ligeras reguladoras de la miosina(rMLCs) de músculo estriado, considerandola posibilidad de fosforilación múltiple.

El interés de este estudio es doble, ya quepodría contribuir a entender el papel de lasdiferentes isoformas de las rMLCs y de susestados fosforilados en el ciclo decontracción-relajación muscular y aestablecer una posible correlación entreestas variantes y las isoformas conocidasde las cadenas pesadas de miosina en elmúsculo esquelético adulto. El terceraspecto se refiere a la influencia de factoresneurales y hormonales en la expresión deproteínas contráctiles y de estrés en elmúsculo esquelético, utilizando para ellomodelos de ratas ejercitadas,cordotomizadas y estimuladaseléctricamente (a través del nervio) conpatrones definidos de impulsos.

Bases moleculares de la adaptación alejercicio y de la plasticidad muscular

Publicaciones /Publications:

González, B., R. Hernando y R. Manso. (1999)

Caracterización de la respuesta celular de

estrés inducida por el ejercicio: Efecto de la

aplicación de un programa incremental de

entrenamiento en tapiz rodante. Serie Icd,

Investigaciones en Ciencias del Deporte 23,

69-94

González, B., R. Hernando and R. Manso.

(2000). Stress proteins of 70 kDa in chronically

exercised skeletal muscle. Pflügers Arch-Eur.

J. Physiol. 440, 42-49

González, B., R. Hernando and R. Manso.

(2000). Anabolic steroid and gender-dependent

modulation of cytosolic HSP70s in fast- and

slow-twitch skeletal muscle. J. Steroid Biochem

Molec Biol. 74, 63-71

Molecular bases of the adaptation to exerciseand of skeletal muscle plasticity

75

Research Summary

The research interest of the laboratory wasdirected toward three main objectives. Oneof the research aims was to characterizefactors and mechanisms involved in wholeorganism adaptation to chronic exercise,considering the possible role of the cellularstress response and the participation ofstress proteins in this process. Expressionof increased levels of some stress proteinsprovides molecular support to understandingthe way skeletal muscle fibres increase theirtolerance to exercise, even before otherphenotypic changes may be observed.

Adaptation of non-contractile cells, such asthose of the liver parenchyma, could involvesignals that are liberated during physicalactivity from skeletal muscle or other tissuesand are distributed through the wholeorganism. Induction of the cellular stressresponse following exercise in the liver,could require increased levels of stresshormones, eventually associated with thepresence of other intercellular messengers.Due to their putative regulatory role ininflammation and tissue remodelling, therole of some cytokines is being the object

of consideration. A second research aimwas directed towards an understanding ofthe mechanism involved in generating thediversity of variants of the fast and slowisoforms of the regulatory myosin light chains(rMLCs) that we have detected in differentskeletal muscle types of various mammals,considering the possibility of multiplephosphorylation.

The interest of this study is dual, to interpretthe role of the different rMLC-isoforms andof their phosphorylation states in the cross-bridge cycle and to determine the possiblecorrelation between rMLC-variants and theknown isoforms of the myosin heavy chainsin adult skeletal muscle. A third researchaim concerns the effects of neural andhormonal factors in defining the expressionof contractile and stress proteins in skeletalmuscle, using models of exercising rats,spinal cord transection and indirect (throughthe nerve) electrical stimulation with definedimpulse-patterns.

Resumen de investigación

Los receptores acoplados a proteínas G

(GPCR) median las acciones de múltiples

mensajeros que controlan la diferenciación,

proliferación y función celular. Además de

con proteínas G heterotriméricas, los GPCR

activados interaccionan con quinasas de

receptores acoplados a proteínas G (GRKs)

y con las proteínas moduladoras

denominadas arrestinas. Estas proteínas

desempeñan diversos papeles muy

importantes: desacoplan los GPCR de las

proteínas G (desensibilización); promueven

la internalización y reciclaje de receptores;

y permiten el reclutamiento de otras

proteínas celulares, iniciando así nuevas

vías de señalización, como la modulación

de cascadas de quinasas mitogénicas

(MAPK) por GPCR. Por tanto, GRKs y

arrestinas son tanto moduladores como

componentes esenciales de la transducción

de señales mediada por GPCR. Nuestro

laboratorio tiene especial interés en el

estudio de su papel en el sistema

cardiovascular y en células del sistema

inmune, ya que alteraciones en GRKs se

han asociado a situaciones de fallo cardiaco

congestivo, hipertrofia cardiaca o

hipertensión, así como a procesos

inflamatorios.

En este contexto, los principales objetivos

de nuestro grupo son: 1) profundizar en las

interrelaciones funcionales entre las GRKs

y componentes de las vías de señalización

desde GPCR a cascadas MAPK; 2)

investigar los principales mecanismos que

gobiernan la actividad y expresión de GRKs

y arrestinas; 3) identificar nuevos sustratos

y funciones celulares para GRKS; y 4)

comprender el papel de GRKs en procesos

de migración celular en respuesta a

quimioquinas y en el desencadenamiento

y progresión de patologías cardiovasculares,

para así contribuir a la identificación de

nuevas dianas y estrategias terapeúticas.

Así, durante este periodo nuestro laboratorio

ha identificado la fosforilación de GRK2 por

c-Src y MAPK, lo que puede alterar la

actividad de esta quinasa, promover su

degradación por la vía del proteasoma y

modular la interacción de GRK2 con Gq.

También hemos descrito alteraciones en

los niveles de GRKs en hipotiroidismo,

estudiado en detalle la regulación de la

actividad transcripcional del promotor del

gen GRK2 humano en células del sistema

cardiovascular y caracterizado el patrón de

expresión de GRK2 en el desarrollo

embrionario del ratón. Se han identificado

a las fosducinas como nuevos sustratos

solubles de GRK, y se ha avanzado en el

estudio de los mecanismos y regulación de

la señalización de distintos GPCRs (ß-

adrenérgicos y de quimioquinas) a cascadas

MAPK. Además de este tema principal,

nuestro grupo colabora con otros

laboratorios del Centro en el estudio de la

relación entre sistemas de señalización

celular y procesos alterados en la

enfermedad de Alzheimer.

Jefe de Línea / Group leader:

Federico Mayor, jr.

Personal Científico / Scientific

personnel:

Ana Ruiz-Gómez

Catalina Ribas

Cristina Murga (desde Abril 2001)

Becarios Postdoctorales /

Post-doctoral Fellows:

Esperanza Morato

Petronila Penela

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Ana Elorza

M. Carmen Jiménez

Susana Sarnago

Sandra Peregrín

Antonio Sobrado

Técnico de investigación / Technical

Assistance:

Ramón Campos

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

Stefania Mariggio (Consorzio Mario

Negri Sud, Italia)

Modelo propuesto para la implicación de ß-arrestina y Src en la degradación de GRK2

Proposed model for the ß-arrestin and c-Src-mediated degradation of GRK2

Mecanismos de señalización y regulación dereceptores acoplados a proteínas G.

D.6

76

NeurobiologíaNeurobiology

Sarnago, S., Elorza, E. and Mayor, F., Jr. (1999) Agonist-

dependent phosphorylation of the G protein-coupled

receptor kinase 2 (GRK2) by Src tyrosine kinase. J. Biol.

Chem. 274, 34411-34416

Avila, J. and Mayor, F., Jr. (1999) Eladio Viñuela, pioneer

of molecular biology in Spain. (Obituary) Nature 400, 822

Mayor, F., (1999) Jr. Mecanismos de regulación de

receptores acoplados a proteínas G. en Transducción

de señales como diana farmacológica. (J.M. Baeyens y

A. Zorzano, editores). Monografías Dr. Antonio Esteve,

Barcelona

Ramos-Ruiz, R., Penela, P., Penn, R.B. and Mayor, F.,

Jr. (2000) Analysis of the human G protein-coupled

receptor kinase 2 (GRK2) gene promoter. Regulation by

signal transduction systems in aortic smooth muscle

cells. Circulation 101, 2083-2089

Elorza, A., Sarnago, S. and Mayor, F., Jr. (2000) Agonist-

dependent modulation of G protein-coupled receptor

kinase 2 by mitogen-activated protein kinases. Mol.

Pharmacol. 57, 778-783

Penela, P., Alvarez-Dolado, M., Muñoz, A. and Mayor,

F., Jr. (2000) Expression patterns of the regulatory proteins

G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) and ß-

arrestin 1 during rat postnatal brain development. Effect

of hypothyroidism. European J. Biochem. 267, 4390-

4396

Sefton, M., Blanco, J.M., Penela, P., Mayor, F., Jr. and

Nieto, A.M. (2000) Expression of the G protein-coupled

receptor kinase 2 during early mouse development. Mech.

of Development 98, 127-131

Ruiz-Gómez, A., Humrich, J., Murga, C., Quitterer, U.,

Lohse M.J., and Mayor, F., Jr. (2000) Phosphorylation of

phosducin and phosducin-like protein by G protein-

coupled receptor kinase 2. J. Biol. Chem. 275, 29724-

29730

G protein-coupled receptors signaling andregulatory mechanisms.

Publicaciones /Publications:

Research Summary

G protein-coupled receptors (GPCR)

mediate the actions of a variety of

messengers that modulate cell function,

proliferation and differentiation. Activation

of GPCR leads to its interaction with at

least two kinds of proteins: heterotrimeric

G proteins and GRKs (G protein-coupled

receptor kinases), which in turn promote

the binding of arrestins. GRKs and

arrestins play different important roles:

they uncouple GPCR from G proteins

(desensitization); promote GPCR

internalization and recycling; and allow

the recruitment of other cellular proteins,

thus triggering new signaling pathways,

such as the modulation of MAPK

cascades by GPCR. Therefore, GRKs

and arrestins can be considered as both

regulators and key components of the

GPCR signal transduction pathways. Our

laboratory is specially interested in

understanding the role of these proteins

in the cardiovascular system and in

immune cells, since alterations in GRKs

levels have been related to congestive

heart failure, cardiac hypertrophy or

hypertension, and to inflammatory

processes.

In this context, the main objectives of our

group are: 1) to study the functional

relationships among GRKs and different

components of the GPCR signaling

pathways leading to the activation of

MAPK cascades; 2) to investigate the

mechanisms governing the activity and

expression levels of GRKs and arrestins;

3) to identify new substrates and cellular

functions for GRKs; and 4) to understand

the role of GRKs in chemokine-induced

cell migration and in the triggering and

progression of cardiovascular diseases,

thus contributing to the identification of

new therapeutic targets and strategies.

Along these lines, our laboratory has

reported during this period the

phosphorylation of GRK2 by c-Src and

MAPK, that leads to changes in kinase

activity, promotes its degradation by the

proteasome pathway and modulates the

GRK2/Gq interaction. We have also

described changes in GRK2 levels in

hypothyroidism, investigated the

modulation of the transcriptional activity

of the human GRK2 gene promoter in

cardiovascular cells, and characterized

the GRK2 expression pattern in the mouse

embryo. We have identified the

phosducins as new cellular targets for

GRKs, and we have investigated in detail

the mechanisms and regulation of ß-

adrenergic and chemokine receptor

signaling to MAPK cascades. In addition

to this main effort, our laboratory

collaborates with other groups in our

Center in the study of relationships

between signal transduction pathways

and cellular alterations in Alzheimer's

disease.

77

La estimulación de receptoresß2AR promueve la redistribuciónde ß-arrestina.Células 293 que expresan Flag-ß2AR y ß-arrestina2-GFP seincubaron en ausencia (C) opresencia de isoproterenol 10µMdurante 5 min y la localización delreceptor y la ß-arrestina se analizómediante microscopía confocal,utilizando anticuerpos monoclonalesanti-Flag (color rojo), o lafluorescencia de ß-arrestina-GFP(color verde).

ß2AR stimulation promotesß-arrestin translocation .293 cells expressing Flag ß2AR andß-arrestin2-GFP were incubated inthe absence (C) or presence of10µM isoproterenol for 5 min, andthe localization of these protein wasanalyzed by confocal microscopyusing anti-Flag monoclonalantibodies (red color) or thefluorescence of ß-arrestin-GFP(green color)

Resumen de Investigación

Tras caracterizar la afinidad de los

nucleótidos de guanina (GNs: GMP y

análogos lentamente hidrolizables de GDP

y GTP) por los receptores ionotrópicos de

glutamato (iGluRs) (ver Memoria anterior),

hemos analizado la relevancia fisiológica

de dicha interacción mediante paradigmas

experimentales que ponen de relieve la

modulación funcional de los iGluRs por los

GNs. Así, utilizando registros eléctricos (con

fijación de potencial) en ovocitos quiméricos

de Xenopus, que incorporan fragmentos de

membranas celulares de retina de pollo,

hemos demostrado que la interacción de

los GNs con el receptor de AMPA se traduce

en un claro efecto antagonista de las

respuestas del receptor al agonista kainato.

Otro ensayo de la activación de los

receptores de AMPA, kainato y NMDA,

midiendo la entrada de 45Ca2+ mediada por

los respectivos agonistas, en explantes de

retina embrionaria de pollo, confirma este

antagonismo funcional. A la vista de estos

resultados hemos valorado la capacidad

neuroprotectora de los GNs frente a la

excitotoxicidad de los agonistas

glutamatérgicos en tres protocolos

experimentales. Así, los GNs protegen

contra la toxicidad derivada de la adición

directa de agonistas al medio, o de la

supresión del Ca2+ (que hipersensibiliza el

receptor de NMDA), en explantes de retina

embrionaria de pollo y, más

específicamente, el GMP protege contra

las convulsiones causadas por la inyección

intracerebroventricular de ácido quinolínico

(agonista específico del receptor de NMDA)

en ratones.

En función de estos resultados estamos

diseñando, mediante modelización

molecular, una nueva línea de antagonistas

de glutamato que interaccionarían con los

iGluRs de la misma forma que lo hace el

GMP.

Jefe de Línea / Group Leader:

Galo Ramírez

Personal Científico / Scientific

personnel:

Ana Barat

Jesús Mendieta (Dr. contratado / under

contract)

Becario Predoctoral / Predoctoral

Fellow:

Javier S. Burgos

Técnicos de Invest igación /

Technical Assistance:

José Luis García-Mira

Interacción de los nucleotidos de guanina conlos receptores ionotrópicos de glutamato

D.7

78

NeurobiologíaNeurobiology

Interaction of guanine nucleotides withionotropic glutamate receptors

Research Summary

After confirmation and characterization

of the affinity of guanine nucleotides (GNs:

GMP and slowly hydrolyzable analogs of

GDP and GTP) for ionotropic glutamate

receptors (iGluRs) (see previous Report)

we have studied the physiological

meaning of such interaction in

experimental paradigms geared to

evidence a functional modulation of

iGluRs by GNs. Voltage-clamp recordings

in chimeric Xenopus oocytes,

incorporating chick retinal cell

membranes, show that GNs antagonize

kainate responses in AMPA receptors, in

a dose–dependent manner. GNs also

block agonist-induced 45Ca2+ inflow in

chick embryonic whole retinal explants.

In view of this consistent antagonistic

behavior we have analyzed the possible

neuroprotective properties of GNs in three

different excitotoxicity protocols. Thus,

GNs efficiently protect against the toxicity

caused by glutamatergic agonists added

to the medium in high concentrations, or

by Ca2+ omission (which destabilizes the

NMDA receptor), in chick embryonic whole

retinal explants. Furthermore, GMP blocks

convulsive crises caused by

intracerebroventricular injections of

quinolinic acid (a NMDA receptor-specific

agonist) in mice.

Taking into account these results we are

designing a new line of glutamate

antagonists that interact with the active

site of the iGluRs in the same way as

GMP does.

79

Publicaciones /Publications:

Aleu, J., Barat, A., Burgos, J., Solsona, C., Marsal, J.

and Ramírez, G. (1999) Guanine nucleotides, including

GMP, antagonize kainate responses in Xenopus oocytes

injected with chick cerebellar membranes. J. Neurochem.

72, 2170-2176.

Tasca, C.I., Burgos, J.S., Barat, A., Souza, D.O. and

Ramírez, G. (1999) Chick kainate binding protein lacks

GTPase activity. NeuroReport 10, 1981-1983.

Ramírez, G. (1999) La excitotoxicidad en la patología

del sistema nervioso central: mecanismos y estrategias

terapéuticas. En, Miguel Kreisler, In memoriam. Clínica

Puerta de Hierro 1997-1998, pp. 133-143.

Burgos, J.S., Barat, A., and Ramírez, G. (2000) Guanine

nucleotides block agonist-driven 45Ca2+ influx in chick

embryo retinal explants. NeuroReport 11, 2303-2305.

Burgos, J.S., Barat, A., and Ramírez, G. (2000) Cl- -

dependent excitotoxicity is associated with 3H2O influx in

chick embryonic retina. NeuroReport 11, 3779-3782.

Burgos, J.S., Barat, A., and Ramírez, G. (2000) Ca2+ -

dependent kainate excitotoxicity in the chick embryonic

neural retina ex vivo. NeuroReport 11, 3855-3858.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Burgos, Javier S. (2000). Interacción de los nucleótidos

de guanina con los receptores ionotrópicos de glutamato.

Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid.

Sobresaliente cum laude.

Resumen de Investigación

Nuestro laboratorio estudia los

mecanismos moleculares del

envejecimiento, neurodegeneración y

neuro-regeneración en el sistema

nervioso central y la resistencia a la

insulina en la vejez.

La regulación celular de calcio en

neuronas cerebrales se desajusta en la

vejez, particularmente la distribución de

calcio en mitocondrias. Las proteinas

responsables de esta distribución se

desconocen aún, y estamos intentando

identificarlas mediante la información

disponible tras la secuenciación de

genomas completos. Así hemos

encontrado Aralar1 y citrin/Aralar2, dos

isoformas del primer transportador de

metabolitos mitocondrial regulable por

calcio. Estamos ahora estudiando la

función transportadora de estas

proteinas y su papel en neuronas.

Para entender el papel de la mitocondria y

los transportadores mitocondriales en

neurodegeneración, estamos estudiando

la muerte neuronal producida por la

exposición a beta-amiloide, el péptido que

se acumula en las placas seniles en la

enfermedad de Alzheimer. Estudiamos los

sucesos tempranos que conducen a la

muerte celular en este modelo incluyendo

la activación de caspasas, y el papel de la

provisión de sustratos a la mitocondria en

la regulación de la muerte celular por

necrosis o apaptosis.

Un instrumento prometedor para evitar la

degeneración del SNC se basa en el uso

de células troncales neurales para el

diseño de terapias de reemplazamiento

celular, así como terapia génica ex vivo,

como la transferencia génica de factores

neurotróficos. Hemos desarrollado las

condiciones para la expansión e

inmortalización de estas células, para

generar lineas neurales útiles en estudios

bioquímicos y moleculares, que además

mantienen propiedades adecuadas para

su transplante cerebral. Además, como

estas lineas siguen siendo multipotentes,

estamos explorando como instruir a estas

células para seguir programas de

diferenciación específcos de los linajes de

neuronas, astrocitos o oligodendrocitos

humanos.

La resistencia a la insulina del

envejecimiento implica múltiples

modificaciones en la transducción de la

señal de la insulina en adipocitos.

Estamos estudiando las vías de

señalización implicadas en las acciones

lipogénica y antilipolítica de la insulina en

adipocitos. Además, como hormona

relacionada con la obesidad y la insulina,

estamos estudiando a la leptina, para

conocer si sus acciones en células diana

se modifican en animales viejos y

pudieran contribuir a la alteración de la

homeostasis metabólica de la vejez.

Jefe de Linea / Group leader:Jorgina Satrústegui

Personal Cientifico / ScientificPersonnel:Elena Bogónez,Jose M. Carrascosa,Alberto Martinez-Serrano

Becarios Postdoctorales /Postdoctoral Fellows:Ana Villa, Milagros Ramos, BeatrizPardo (desde Marzo 2000)

Becarios Predoctorales / GraduateStudents:Gema Alvarez, Yasmin Fermín,Francisco Javier Rubio, SantiagoCavero, Beatriz Navarro, CarlosBueno, Coralia Perez, BelénPrados (hasta Octubre 2000).

Estudiantes de Licenciatura /Undergraduate Students:Carmen Galián (Marzo 1999-Octubre2000 ), Vera Martos (Marzo 1999-Octubre 2000), Ivan Andres Chignier(Octubre 1999 a Junio 2000).

Tecnicos de Investigación /Technical Assistance:Bárbara Sesé, Inmaculada Ocaña(desde Enero 2000).

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:Araceli del Arco (Universidad deCastilla-la-Mancha)Miguel Hernández-Carrasquilla(Conserjería de Salud, ComunidadAutónoma de Madrid)

Mecanismos de envejecimiento yneurodegeneracion

D.8

80

NeurobiologíaNeurobiology

Mechanisms of ageing and neurodegeneration

Research Summary

Our laboratory is interested in the study

of the molecular mechanisms of ageing,

neurodegeneration and neuro-

regeneration in the central nervous

system, and in the study of insulin

resistance in ageing.

Calcium regulation in neurons becomes

impaired during ageing, and calcium

handling by neuronal mitochondria is

particularly affected. The proteins

responsible for calcium handling in brain

mitochondria are still unknown, and we

are attempting to identify these proteins

with the use of the information available

from the sequencing of complete

genomes. We have thus found Aralar1

and citrin/Aralar2, two isoforms of the

first mitochondrial metabolite carrier

known to be regulated by calcium. We

are currently studying the transporter

function of these proteins, and their role

in neuronal function in health and

disease.

To understand the role of mitochondria

and mitochondrial carriers in

neurodegeneration, we are studying

neuronal death obtained by exposure to

beta-amyloid, the peptide that

accumulates in senile plaques

characteristic of Alzheimer’s disease.

We are currently analyzing the early

events that trigger cell death in this

paradigm, the activation of caspases,

and the role of metabolite supply to

mitochondria as means of regulation of

cell death by necrosis or apoptosis.

A promising tool to prevent CNS

degeneration relies in the use of

multipotent neural stem cells for the

design of cell replacement- and ex vivo

gene- therapies, such as gene transfer

of neurotrophic factors. We are

presently using human derived neural

stem cells and have set up conditions to

expand and immortalize them, to

generate cell lines useful for

biochemistry and molecular biology

studies, while retaining optimal

properties for their transplantation to the

brain. In addition, as these cell lines are

still multipotent, we are exploring how to

instruct them to follow specific

developmental programs for human

neurons, astrocytes and

oligodendrocytes.

Insulin resistance during ageing

involves a number of modifications in

insulin signal transduction cascade in

adipocytes. We are now exploring the

pathways involved in the lipogenic and

antilipolitic actions of insulin in

adipocytes. In addition, as an obesity-

and insulin- related hormone, we are

studying leptin, to investigate whether

its actions in target cells are modified in

old rats and may contribute to the

altered homeostasis of ageing.

81

Publicaciones /Publications:

Alvarez, A., Muñoz-Montaño, JR., Satrustegui, J., Avila, J.,Bogónez, E., and Diaz-Nido, J. (1999) Lithium protectscultured neurons against -amyloid-inducedneurodegeneration. FEBS Lett. 453, 260-264.

Rubio FJ., García-Simón MI., Kokaia Z., Lindvall O., delArco A., Satrústegui J. and Martínez-Serrano A. (1999)BDNF-gene transfer to the mammalian brain using CNS-derived neural precursors. Gene Therapy, 6, 1851-1866.

Del Arco, A., Agudo, M., & Satrústegui, J. (2000)Characterization of a second member of the subfamily ofcalcium binding mitochondrial carriers expressed in humannon-excitable tissues. Biochem J. 345, 725-732.

Sanz, R., del Arco, A., Ayuso, C., Ramos, C., andSatrústegui, J. (2000) Assignment of the calcium-bindingmitochondrial carrier gene ARALAR1, to humanchromosome band 2q31 by in situ hybridization.Cytogenetics and Cell Genetics 89, 143-4.

Ruiz F, Alvarez G, Ramos M, Hernandez M, Bogonez E,Satrústegui J. (2000) Cyclosporin A targets involved inprotection against glutamate excitotoxicity. Eur JPharmacol. 404, 29-39.

Villa A, Snyder EY, Vescovi, A and Martínez-Serrano A(2000) Establishment and properties of a growth factordependent, perpetual neural stem cell line from the humanCNS. Experimental Neurology, 161, 67-84.

Dissen GA, Lara HE, Leyton V, Paredes A, Hill DF, CostaME, Martinez-Serrano A and Ojeda SR (2000) Intraovarianexcess of nerve growth factor increases androgen secretionand disrupts estrous cyclicity in the rat. Endocrinology,141,1073-1082.

Rubio JF, Villa A, Navarrro B, Bueno C and Martínez-Serrano A (2000) Genetically perpetuated Human NeuralStem Cells engraft and differentiate into the adultmammalian brain. Molecular and Cellular Neuroscience, 16,1-13.

Martínez-Serrano A, Villa A, Navarro B, Rubio FJ and BuenoC (2000) Human neural progenitor cells: Better blue thangreen?. Nature Medicine, 6, 2-3.

Tesis doctorales/ Doctoral theses

Mª Isabel Garcia Simón. Caracterización del antiportadorH+/Ca2+ y otros posibles transportadores mitocondrialesdependientes de calcio. Generación de herramientas parasu identificación mediante estudios de diferenciación yregulación de calcio en células neurales. Diciembre 1999.Universidad Autónoma de Madrid. Sobresaliente CumLaude.

Gema Alvarez Nieto. Sucesos tempranos en laneurodegeneración inducida por el péptido -amiloide en unmodelo de cultivo primario de neuronas..Octubre 2000.Universidad Autónoma de Madrid. Sobresaliente CumLaude.

Resumen de Investigación

La de Alzheimer es una enfermedad

compleja resultante de la interacción entre

una serie de factores genéticos y no

genéticos. El alelo 4 de la apolipoproteína

E (APOE, gen; ApoE, proteína) es el factor

genético más relevante en cuanto al riesgo

para la forma senil de la enfermedad de

Alzheimer (EA); de los otros genes

asociados con la EA, son de especial interés

el de la proteína relacionada con el receptor

de LDL (LRP) y el de la α-2 macroglobulina

(A2M), ya que dichas proteínas están

funcionalmente relacionadas con la ApoE

y con la proteína precursora del péptido

beta amiloide (Aβ), la APP. La manera en

la que participan ApoE, LRP y A2M en la

patogénesis de la EA es aún desconocida,

aunque una serie de evidencias sugieren

que las alteraciones estructurales, o en los

niveles de cualquiera de ellas, podrían

provocar un desequilibrio de sus

interacciones, interferiendo en el correcto

aclaramiento del Aβ y generando agregados

tóxicos para las neuronas. Si esto es cierto,

estas proteínas compondrían un módulo

funcional, y los polimorfismos en cada uno

de los genes podrían modular el riesgo

asociado a los demás. Con el fin de estudiar

la contribución de APOE, LRP y A2M al

riesgo de EA y las posibles interacciones

entre ellos, hemos llevado a cabo un estudio

de polimorfismos en una muestra caso-

control de EA esporádica. El estudio mostró

que los polimorfismos en la región

codificante y promotora de APOE están

asociados con susceptibilidad para la EA.

También se observó interacción entre estos

dos polimorfismos, sugiriendo que el efecto

combinado de la estructura y los niveles de

apoE es relevante en relación con la EA.

Los datos indican que el sexo modula el

riesgo asociado a polimorfismos en el

promotor de APOE y en el gen LRP,

sugiriendo que estos genes pueden ser, al

menos en parte, responsables del menor

riesgo de EA observado en los varones

respecto a las mujeres. El estudio de un

polimorfismo en el gen tau mostró que un

alelo de éste está asociado con riesgo para

EA en individuos portadores del alelo apoE4,

lo que sugiere que el efecto combinado de

ApoE y tau es relevante en relación con la

patogénesis de la EA.

Además de los estudios genéticos, estamos

desarrollando modelos celulares y animales

de la EA mediante manipulación genética

de los factores de susceptibilidad para la

enfermedad.

Jefe de Línea / Group Leader:

Fernando Valdivieso

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Mª Jesús Bullido,

José A. López-Guerrero

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Jesús Aldudo,

Mª Jesús Artiga,

María Recuero

Becarios Predoctorales /

Graduate Students:

María Alonso, Julio Pozueta,

Mª Carmen Ramos,

Elena Serrano

Técnica de Investigación /

Technical Assistance:

Isabel Sastre

Neuropatología molecular de la enfermedadde Alzheimer

D.9

82

NeurobiologíaNeurobiology

Molecular neuropathology of Alzheimer’sdisease

Research Summary

Alzheimer’s disease (AD) appears to be

a complex trait resulting from the

interaction between genetic and non-

genetic factors. The E4 allele of

apolipoprotein E (APOE, gene; ApoE,

protein) is the most important genetic

determinant for late-onset AD; from the

other genes reported as AD risk factors,

the protein related with the LDL receptor

(LRP) and the α2-macroglobulin (A2M)

are of interest, since they are functionally

related with ApoE and with the β-amyloid

peptide (Aβ) precursor (APP). Current

evidences suggest a scenario in which

different isoforms and/or activities of apoE,

APP, and/or A2M could produce a

decreased clearance of Aβ through LRP,

resulting in enhanced A deposition and

toxicity. If this hypothesis is true, functional

polymorphisms in each of these genes

could modulate the AD susceptibility

conferred by the other ones. With the aim

of finding out the contribution of APOE,

LRP and A2M to AD risk and the possible

interactions between them, we have

analysed polymorphisms in a sample of

sporadic AD cases and controls. The

study shows that polymorphisms in the

coding (apoE4) and promoter region of

APOE were associated with AD

susceptibility. Besides, an interaction

between these two types of polymorphism

seems to exist, suggesting that the

combined effect of apoE structure and

levels is relevant in relation with AD. The

study also suggest that gender modulates

AD risk associated with APOE and LRP

polymorphisms, and raise the possibility

that the effect posed by these loci could

be, at least in part, responsible for the

lower AD risk observed in males

compared to females. We also have

analyzed a polymorphism in the tau gene,

and found that is associated with AD risk

in individuals carrying the apoE4 allele,

strongly suggesting that the combined

effect of tau and apoE is relevant in

relation with AD pathogenesis.

In addition to the genetic approach, we

are developing cellular and animal models

of AD by genetic manipulation of

susceptibility factors for the disease.

83

Publicaciones /Publications:

Aldudo, J., Bullido, M.J., Valdivieso, F. (1999). A DGGE method

for the mutational analysis of the coding and proximal promoter

regions of the Alzheimer’s disease presenilin-1 gene". Hum.

Mutat. 14, 433-439

Chen, L., Baum, L., Ng, H.K.,. Chan, L.Y.S, Sastre, I, Artiga,

M. J., Valdivieso, F, Bullido, M. J., Chiu, H.F.K., Pang, C.P.

(1999). Apolipoprotein E promoter and 2-Macroglobulin

polymorphisms are not genetically associated with Chinese

late onset Alzheimer's disease. Neurosci Lett 269:173-177

Garcia MA, Campillos M, Marina A, Valdivieso F,

Vazquez J. (1999). Transcription factor AP-2 activity is

modulated by protein kinase A-mediated phosphorylation.

FEBS Lett 444:27-31

Bullido MJ, Aldudo J, Frank A, Coria F, Avila J, Valdivieso F.

(2000). A polymorphism in the tau gene associated with risk

for Alzheimer's disease. Neurosci Lett 278:49-52

Garcia MA, Campillos M, Ogueta S, Valdivieso F, Vazquez J.

(2000). Identification of amino acid residues of transcription

factor AP-2 involved in DNA binding. J Mol Biol 301:807-16

Bullido MJ, Guallar-Castillón P, Artiga MJ, Ramos MC, Sastre

I, Aldudo J, Frank A, Coria, F, Rodriguez-Artalejo F, Valdivieso

F. (2000). Alzheimer's risk associated with human apolipoprotein

E, alpha-2 macroglobulin and lipoprotein receptor related

protein polymorphisms: absence of genetic interactions, and

modulation by gender. Neurosci Lett 289: 213-6

Bullido MJ, Valdivieso F. (2000). Apolipoprotein E gene promoter

polymorphisms in Alzheimer's disease”. Microsc Res

Tech 50: 261-7

Resumen de Investigación

El funcionamiento normal del sistema

nervioso depende de la capacidad de las

células nerviosas para adaptarse a distintas

situaciones de su entorno. Esta capacidad,

denominada plasticidad neuronal, se

manifiesta especialmente durante el

desarrollo -generación y especificación de

circuitos básicos-, la regeneración que sigue

al daño neuronal -formación de nuevos

contactos sinápticos- y los procesos de

aprendizaje y almacenamiento de

información (Memoria) -en los que se

producen cambios en el número y eficacia

de los contactos sinápticos. El conocimiento

profundo de los mecanismos moleculares

responsables de la plasticidad neuronal

abrirá fundamentadas expectativas en el

desarrollo de tratamientos que promuevan

la recuperación funcional después de

lesiones medulares y en el desarrollo de

tratamientos más eficaces y específicos

para prevenir la neurodegeneración masiva

asociada a las epilepsias.

Nuestro trabajo de investigación se orienta

hacia la comprensión de los mecanismos

moleculares que sustentan el crecimiento

y navegación de axones, su ramificación y

el establecimiento de contactos sinápticos

funcionales. Más concretamente, estamos

interesados en analizar las características

estructurales y funcionales de proteínas

neuronales asociadas a la plasticidad neural.

Durante el período 1999-2000 hemos

trabajado con Neurogranina, una proteína

muy abundante en regiones telencefálicas

de localización dendrítica, y con GAP-43,

una proteína con elevadas tasas de

expresión durante el desarrollo del sistema

nervioso y durante los procesos de

regeneración post-lesión.

Ambas proteínas son firmes candidatas a

intervenir en procesos de plasticidad

neuronal debido a su localización altamente

polarizada en neuronas, su interacción con

calmodulina de modo dependiente de

fosforilación por proteína kinasa C y su

capacidad de modificar el dinamismo del

citoesqueleto de actina, posiblemente a

través de su interacción con fosfolípidos.

Nuestra hipótesis de trabajo propone que

ambas proteínas están implicadas en

promover desorganización del citoesqueleto

de actina en zonas restringidas de la

membrana plasmática, lo cual promueve

una mayor dinamismo del mismo en

respuesta a señales externas y la formación

de frentes de avance (lamelipodios) y

filopodios.

Jefe de Línea / Group Leader:

F. Javier Díez Guerra

Becarios Predoctorales / Predoctoral

Fellowships:

Noa Martín Cófreces

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Paloma Rodríguez Sánchez

Técnicos de Investigación /

Technical Assistance:

Carlos F. Parrondo Vélez

Lorena Barrero Hervás

Pedro Sanz Ballesteros

D.10

84

NeurobiologíaNeurobiology Bases Moleculares de la Plasticidad Neuronal

Molecular basis of neuronal plasticity

Research Summary

The normal operation of the nervous

system depends on the capacity of

nervous cells to adapt to different

situations of its environment. This capacity,

also called neuronal plasticity, is especially

manifested during the development -

generation and specification of basic

circuits -, post-traumatic neuronal

regeneration -formation of new synaptic

contacts - and in the processes of learning

and storage of information (Memory) -in

which changes in the number and efficacy

of synaptic contacts take place. A deeper

knowledge of the molecular mechanisms

responsible for neuronal plasticity will

open new horizons in the development

of treatments that promote functional

recovery after medullary lesions and in

the development of more effective and

specific treatments to prevent the massive

neurodegeneration associated to the

epilepsies.

Our investigation effort is focused at the

understanding of the molecular

mechanisms responsible of axonal growth

and orientation, its ramification and the

establishment of functional synaptic

contacts. More specifically, we are

interested in analyzing the structural and

functional characteristics of proteins

associated to neuronal plasticity. During

the 1999-2000 period we have worked

with Neurogranin, a very abundant protein

in telencephalic regions which localizes

in dendrites, and GAP-43, a protein with

high expression levels during the

development of the nervous system and

post-lesion regeneration processes.

Both proteins are firm candidates to

intervene in processes of neuronal

plasticity based on their highly polarized

localization in neurons, their interaction

with calmodulin which is dependent of

protein kinase C phosphorylation and

their ability to modify the dynamism of

the actin cytoskeleton, possibly through

their interaction with phospholipids.

Our working hypothesis puts forward that

both proteins are implicated in promoting

actin disorganization in restricted areas

of the plasma membrane. This implies

localized increases in cytoskeleton

dynamism and enhanced responses to

external signals that initiate the formation

of lamellipodia and filopodia.

85

Publicaciones /Publications:

Pedro Tejero-Díez, Paloma Rodríguez-Sánchez y F Javier

Díez-Guerra (1999). “ Microscale purification of proteins

exhibiting anomalous electrophoretic migration. Application

to the analysis of GAP-43 phosphorylation” . Analytical

Biochemistry 274, 278-282

Pedro Tejero-Díez, Paloma Rodríguez-Sánchez, Noa

Beatriz Martín-Cófreces and F. Javier Díez-Guerra. (2000).

“bFGF stimulates GAP-43 phosphorylation at Ser41 and

modifies its intracellular localization in cultured

hippocampal neurons”. Molecular and Cellular

Neuroscience 16, 766-780

Tesis doctorales presentadas:

“Implicacion de GAP-43 en la Orientación y Avance del

Cono de Crecimiento en Neuronas de Hipocampo en

Cultivo. Análisis de su Fosforilación y Localización

Subcelular”, Dr. Pedro Tejero Díez, Universidad Autónoma

de Madrid, Facultad de Ciencias, Marzo, 1999,

Sobresaliente Cum Laude.

“Estudio Funcional e Neurogranina: Participación en

Mecanismo de Plasticidad Neuronal”, Dr Paloma

Rodríguez Sánchez, Universidad Autónoma de Madrid,

Facultad de Ciencias, Noviembre, 1999, Sobresaliente

Cum Laude.

ERegulación de laexpresión génica

E.1 Molecular parasitology

E.2 Gene expression in human Tlymphocytes

E.3 Molecular biology ofextremophilicmicroorganisms

E.4 Genome maintenance andvariability: enzymology ofDNA repair.

E.5 Estructura y función delribosoma

E.6 Protein synthesis and itsregulation in eukaryotes

E.7 Gene expressionStreptomyces and yeast

E.8 Hormonal regulation of geneexpression

E.9 Chromatin structure andtranscription

E.10 Cell envelopes

E.11 Molecular basis of metabolic diseases

E.12 Bacterial Cell Division andAntibiotics Resistance

E.13 Biotechnology and geneticsof extreme thermophilicbacteria

E.14 Regulation of the tissue-specific gene expression

E.15 Internal initiation oftranslation in eucarioticmRNAs

Regulation ofgene expresion

E.1 Parasitología molecular

E.2 Expresión génica en linfocitosT humanos

E.3 Biología molecular demicroorganismos extremofilos

E.4 Mantenimiento y variabilidaddel genoma: enzimología de lareparación de DNA.

E.5 Estructura y función delribosoma

E.6 Síntesis de proteínas y suregulación en eucariontes

E.7 Expresión génica enStreptomyces y levaduras

E.8 Regulación de la actividadgenética por hormonas

E.9 Estructura cromatínica ytranscripción

E.10 Envolturas celulares

E.11 Bases Moleculares de lasEnfermedades Metabólicas

E.12 División Celular Bacteriana yResistencia a Antibióticos

E.13 Biotecnología y genética debacterias termofilas extremas

E.14 Regulación de la expresióngénica específica de tejido

E.15 Iniciación interna de latraducción en mRNASeucarióticos.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Las especies de Leishmania son protozoos

parásitos, agentes etiológicos de las

Leishmaniosis, un grupo de enfermedades

que afectan a la población de 79 países,

en los que producen unos 400.000 casos

nuevos cada año, existen unos 12 millones

de personas infectadas y 350 millones están

en riesgo de contraer la enfermedad. Los

perros son el principal reservorio de L.

infantum en la cuenca mediterránea, Oriente

Próximo y Centro y Sudamérica. La

prevalencia de la leishmaniosis visceral

canina en la región mediterránea varía

desde el 1 al 37%.

La principal actividad investigadora de

nuestro grupo se dirige hacia la

caracterización de antígenos de L. infantum

y el análisis de los aspectos inmunológicos

del húesped que son inducidos durante la

infección. Hemos identificado a proteínas

evolutivamente conservadas como

antígenos prominentes de Leishmania que

son específicamente reconocidos por los

sueros de humanos y perros con

leishmaniasis visceral (LV). Además,

algunas de estas proteínas (p. ej., las

proteínas de choque térmico (HSP) 70 y

83, y la proteína ribosomal ácida LiP2a)

tienen destacables propiedades

inmunoestimuladoras como son una

actividad adjuvante para producir

anticuerpos frente a proteínas

acompañantes y un efecto mitogénico sobre

esplenocitos de ratones no inmunizados.

Por otro lado, venimos estudiando

parámetros inmunológicos y clínicos

asociados a la infección por L. infantum de

hámsteres dorados como un modelo

experimental que se asemeja a las

infecciones de LV en humanos y cánidos.

Otra parte de nuestra actividad investigadora

se viene realizando en el campo de la

biología molecular de L. infantum. En

particular, estamos estudiando mecanismos

de regulación que, en este parásito, operan

a niveles post-transcripcionales. En estos

estudios estamos empleando los genes de

histonas y de HSP como sistemas modelo.

Nuestro grupo está colaborando con los

Drs. Ignacio Navarrete y Luis C. Gómez-

Nieto (Facultad de Veterinaria, UEX,

Cáceres) en el análisis de la LV canina y

la infección experimental en perros. También

estamos colaborando con la Dra. Carmen

Navarro-Ranninger y el Dr Jose M. Pérez

(Departamento de Química Orgánica, UAM)

en la identificación de las vías bioquímicas

por las que algunos compuestos metálicos

ejercen su actividad antitumoral.

Jefe de Línea / Group Leader:

Carlos Alonso

Personal Científico / Scientific

Personnel:

Jose Mª Requena

Manuel Soto

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

María José Pérez

Becarios Predoctorales /

Graduate Students:

Ana Isabel Rico, Ruth Larreta, Nuria

Parody, Salvador Iborra, Maxy B. de los

Santos

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Miguel A. Fuertes, María D. Doria, Javier

Carrión, Carlos Mey, David Navarro.

Parasitología molecularE.1

88

Macrófago de hámster infectado por L. infantum (Tinción de Giemsa)

Pérez, J.M., Camazón, M., Alvarez-Valdes, A., Quiroga, A.G., Kellnad, L.R.,Alonso, C. and Navarro- aninger, M.C. (1999). Synthesis, characterization andDNA modification induced by a novel Pt(IV)-bis(monoglutarate) complexwhich induces apoptosis un glioma cells. Clin. Biol. Interaction 117, 99-115

Gonzalez, V.M., Fuertes, M.A., Jimenez-Ruiz, A, Alonso, C. and Perez, J.M.(1999). The formation of DNA interstrand-cross-links by a novel Bis-[Pt2-Cl4(diminacene aceturate)2Cl4.4H2O complexes inhibits the B to Z formation.Mol. Pharmacol. 85, 770-778

Planelles, L., Marañon, C., Requena, J.M. and López, M.C. (1999). Phagerecovery by electroporation of naked DNA into host cells avoids the use ofpackaging extracts. Anal. Biochem. 267, 234-235

Soto, M., Requena, J.M., Quijada, L., Perez, M.J., Nieto, C.G., Guzman, F.,Patarroyo, M.E. and Alonso, C. (1999). Antigenicity of the Leishmaniainfantum histones H2B and H4 during canine viscerocutaneous leishmaniasis.Clin. Exp. Immunol. 115, 342-349

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Perez, J.M., Matesanz, A.I., Martin-Ambite, A., Navarro, P., Alonso, C. andSouza, P. (1999). Synthesis and characterization of complexes of p-isopropylbenzaldehyde and methyl 2-pyridyl ketone thiosemicarbazones with Zn(II) andCd(II) metallic centers. Cytotoxic activity and induction of apoptosis in Pam-ras cells. J. Inorg. Biochem. 75, 255-261

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Soto, M., Quijada, L., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Histone synthesisin Leishmania infantum is tightly linked to DNA replication by a translationalcontrol. Biochem. J. 346, 99-105

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Marañon, C., Thomas, M.C., Puerta, C., Alonso, C. and Lopez, M.C. (2000).The stability and maturation of the H2A histone mRNAs from Trypanosomacruzi are implicated in their post-transcriptional regulation. Biochim. Biophys.Acta. 1490, 1-10

Perez-Perez; J., Fernandez-Caldas, E., Marañón, F., Sastre, J., Lluch-Bernal,M., Rodriguez, J. and Alonso, C. (2000). Molecular Cloning of Paramyosin, anew allergen of Anisakis simplex. Allergy Immunol. 642, 1-10

Requena, J.M., Alonso, C. and Soto, M. (2000). Evolutionarily conservedproteins as prominent immunogens during Leishmania infections. Parasitol.Today 16, 246-250

Quijada, L., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Identification ofa putative regulatory element in the 3’-untranslated region that controlsexpression of HSP70 in Leishmania infantum. Mol. Biochem. Parasitol. 110,79-91

Olivares, M., Thomas, M.C., López-Barajas, A., Requena, J.M., García-Pérez,J.L., Angel, S., Alonso, C. and López, M.C. (2000). Genomic clustering of theTrypanosoma cruzi nonlong terminal L1Tc retrotransposon with definedinterspersed repeated DNA elements. Electrophoresis 21, 2973-2982

Larreta, R., Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). Leishmaniainfantum: gene cloning of the GRP94 homologue, its expression asrecombinant protein, and analysis of antigenicity. Exp. Parasitol. 96, 108-115

Soto, M., Alonso, C. and Requena, J.M. (2000). The Leishmania infantumacidic ribosomal protein LiP2a induces a prominent humoral response in vivoand stimulates cell proliferation in vitro and interferon-gamma (IFN-)production by murine splenocytes. Clin. Exp. Immunol. 122, 212-218

Requena, J.M., Soto, M., Doria, M.D. and Alonso, C. (2000). Immune andclinical parameters associated with Leishmania infantum infection in thegolden hamster model. Vet. Immunol. Immunopathol. 76, 269-281

Molecular parasitology

Publicaciones /Publications:

Research summary

Leishmania spp. are protozoan parasites,

etiological agents of Leishmaniasis, a

group of diseases affecting the population

of 79 countries at a rate of 400,000 cases

per year with 12 million currently infected

and 350 million at risk. Dogs are the

major reservoir of L. infantum in the

Mediterranean Basin, the Middle East,

and South and Central America. The

prevalence of canine visceral

leishmaniasis in the Mediterranean

region has been shown to vary from 1

to 37%.

The main research activity of our group

is directed towards the characterization

of L. infantum antigens and the

understanding of host immunological

aspects elicited by the infection. We have

identified evolutionarily conserved

proteins as prominent Leishmania

antigens that are specifically recognized

by sera from both humans and dogs with

visceral leishmaniasis (VL). Furthermore,

some of these proteins (e.g., heat-shock

proteins (HSP) 70 and 83, and acidic

ribosomal protein LiP2a) possess

remarkable immunostimulatory

properties such as adyuvant activity to

induce antibody production against an

accompanying protein and mitogenic

effect on splenocytes from unprimed

mice. On the other hand, we are studying

immunological and clinical parameters

associated with the L. infantum infection

in Golden hamsters as the experimental

model mimicking the human and canine

VL infections.

Another part of our research activity is

being developed in the field of the

molecular biology of L. infantum. In

particular, we are studying mechanisms

of gene regulation that, in this parasite,

are operating at these post-transcriptional

levels. In this studies were are using

histone and HSP genes as system

models.

Our group is collaborating with Dr Ignacio

Navarrete and Dr Luis C. Gómez-Nieto

(Facultad de Veterinaria, UEX, Cáceres)

on the analysis of canine VL and the

experimental infection in dogs. Also, we

are collaborating with Dr Carmen

Navarro-Ranninger and Dr Jose M.

Pérez (Departamento de Química

Orgánica, UAM) in the identification of

the biochemical pathways by which

certain metallic compounds exert their

antitumour activity.

89

Hamster macophage infected by L. Infantum (Giemsa staining)

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

La compartimentalización de las

membranas celulares en microdominios o

balsas (“rafts”) es un nuevo concepto en

biología. A diferencia de la mayor parte de

las membranas celulares, que están

constituidas fundamentalmente por

fosfolípidos y empaquetadas de una

manera desordenada, los microdominios

de membrana enriquecidos en glicolípidos

y colesterol (GEM) parecen adoptar una

estructura más ordenada. La captación

selectiva de proteínas en el Golgi en este

tipo de balsas fue propuesta inicialmente

como modelo para explicar la segregación

y posterior transporte de proteínas de

nueva síntesis a la superficie apical de las

células epiteliales polarizadas. Mas

recientemente, este modelo ha sido

extendido como un mecanismo general

para el reclutamiento específico de

proteínas implicadas en otros procesos

celulares.

El proteolipido MAL, una proteína integral

de membrana expresada de forma

diferencial durante la ontogenia de los

linfocitos T, se expresa también en células

formadoras de mielina y en células

epiteliales polarizadas. En todos estos

tipos celulares la proteína MAL ha sido

identificada como un componente de los

microdominios ricos en glicolípidos y

colesterol. Uno de los logros más

sobresalientes de nuestro grupo en los

últimos años ha sido la demostración del

papel de MAL como un componente

esencial de la maquinaria integral de

proteínas implicada en el transporte apical

de células epiteliales polarizadas MDCK y

FRT. Teniendo en cuenta este papel

central de MAL en el transporte apical, y la

existencia de una familia de proteínas, la

“familia MAL de proteolípidos”,

relacionada con MAL, nuestros objetivos

presentes son: 1) el esclarecimiento del

mecanismo por el que MAL promueve el

transporte apical en células epiteliales

polarizadas, 2) la identificación en

linfocitos T de rutas de transporte

semejantes a la mediada por MAL en

células epiteliales, y 3) la caracterización

bioquímica y funcional de nuevos

miembros de la familia MAL de

proteolípidos que pudieran desempeñar

también un papel como maquinaria de los

microdominios ricos en glicolípidos y

colesterol en otros procesos celulares.

Expresión génica en linfocitos T humanosE.2

90

Jefe de Línea / Group Leader:

Miguel A. Alonso

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Jaime Millán

Susana Guerra (desde 1-7-00)

Fernando Martín (desde 1-9-00)

Becarios Predoctorales /

Graduate Students:

Rosa Puertollano (hasta 1-9-99)

Fernando Martín-Belmonte

María del Carmen de Marco

Alicia Batista (desde 1-4-99)

Estudiante de la Escuela Taller/

Workshop School Student

Sergio Gómez (desde 1-6-2000)

Gene expression in human T lymphocytes

Publicaciones /Publications:

Research summary

The compartmentation of cellular

membranes in microdomains or rafts is

an emerging concept in cell biology.

Unlike the bulk of membranes, which

are enriched in phospholipids and

packed in a disordered state, glycolipid

and cholesterol-enriched membrane

(GEM) rafts appear to be packed in a

liquid-ordered state. Recruitment of

specific proteins into GEM rafts in the

Golgi was initially proposed to explain

the segregation and subsequent

transport of newly synthesized apical

proteins in polarized epithelial cells,

and more recently has been extended

as a general mechanism to

concentrate specific proteins for

processes such as intracellular protein

transport and signaling.

The MAL proteolipid is a 17-kDa

integral membrane protein, initially

identified in our laboratory as a protein

specifically expressed during T cell

differentiation, is expressed also in

myelin-forming cells and epithelial

polarized cells. In all these cell types,

MAL has been found to be selectively

present in GEM rafts. One of the major

achievements of our group in the last

two years has been the identification of

the MAL proteolipid as an essential

component of the integral protein

machinery for raft-mediated apical

transport in epithelial renal MDCK and

thyroid FRT cells. Keeping in mind this

central role of MAL in apical transport

and the existence of a family of

proteins, the “MAL proteolipid family”,

highly related to MAL, our current

objectives are: 1) the elucidation of the

molecular mechanism by which MAL

promotes apical transport in epithelial

cells, 2) the identification in T cells of

GEM raft-mediated pathways of

transport reminiscent of that of apical

transport in polarized epithelial cells,

and 3) the biochemical and functional

characterization of novel members of

the MAL proteolipid family which,

similar to MAL, might play a role as

machinery for cellular processes

mediated by GEM rafts.

91

Puertollano, R., Martín-Belmonte, F., Millán, J., de

Marco, M. C., Albar, J. P., Kremer, L., and Alonso, M. A.

(1999) The MAL proteolipid is necessary for normal

apical transport and accurate sorting of the influenza

virus hemagglutinin in Madin-Darby canine kidney

cells. J. Cell Biol. 145, 141-151.

Puertollano, R., and Alonso, M. A. (1999) MAL, an

integral element of the apical sorting machinery, is an

itinerant protein that cycles between the trans-Golgi

network and the plasma membrane. Mol. Biol. Cell 10,

3435-3477.

Copie-Bergman, C., Gaulard, P., Maouche-Chrétien,

L., Brière, J., Alonso, M. A. Roméo, P.-H., and Leroy, K.

(1999) The MAL gene is expressed in primary

mediastinal large B-cell lymphoma. Blood 94, 3567-

3575.

Puertollano, R., and Alonso, M. A. (1999) Substitution

of the two carboxyl-terminal serines by alanine causes

retention of MAL, a component of the apical sorting

machinery, in the endoplasmic reticulum. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 260, 188-192.

Luque, C. M., Lallena, M.-J., Pérez-Ferreiro, C. M., de

Isidro, Y., de Cárcer, G., Alonso, M. A. and Correas, I.

(1999) The N-terminal 209-aa domain of high

molecular weight 4.1R isoforms abrogates 4.1R

targeting to the nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,

14925-14930.

Puertollano, R., Menéndez, M., and Alonso M. A.

(1999) Incorporation of MAL, an integral protein

element of the machinery for the glycolipid and

cholesterol-mediated apical pathway of transport, into

artificial membranes requires neither of these lipid

species. Biochem. Biophys. Res. Commun. 266, 330-

333.

Martín-Belmonte, F., López-Guerrero, J. A., Carrasco,

L., and Alonso, M. A. (2000) The amino-terminal nine

amino acid sequence of poliovirus capsid VP4 protein

is sufficient to confer N-myristoylation and targeting to

detergent-insoluble membranes. Biochemistry 39,

1083-1090.

Martín-Belmonte, F., Alonso, M.A., Zhang,, X., and

Arvan, P. (2000) Thyroglobulin is selected as luminal

cargo protein for apical transport via detergent-

resistant membranes in epithelial cells. J. Biol. Chem.

275, 41074-41081.

Martín-Belmonte, F., Puertollano, R., Millán, J., and

Alonso, M.A. (2000) The MAL proteolipid is necessary

for the overall apical delivery of membrane proteins in

the polarized epithelial Madin-Darby canine kidney and

Fischer Rat thyroid cell lines. Mol. Biol. Cell 11, 2033-

2045.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Rosa Puertollano Moro: “El Proteolípido MAL como

Componente de la Maquinaria de Transporte Apical de

Células Epiteliales Polarizadas”. Universidad

Autónoma de Madrid. 1999. Sobresaliente cum laude.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

El grupo de Biología Molecular de

extremófilos posee distintas líneas de

investigación, cuyos objetivos principales

se resumen a continuación:

- Biohidrometalurgia: ecología, biología

molecular y biotecnología de

microorganismos que se desarrollan en

ambientes acidófilos, con especial énfasis

en los aspectos aplicados de los mismos

(biominería, biodesulfuración de carbones,

secuestro específico de metales,

fitorremediación)

- Ecología microbiana de ambientes

extremos terrestres como modelos de vida

de interés astrobiológico: geomicrobiología

del Río Tinto y de las lagunas hipersalinas

de la Mancha (en colaboración con el Centro

de Astrobiología).

- Funciotipo: estudio de la evolución

funcional del ribosoma utilizando inhibidores

de la traducción con distinta especificidad.

- Caracterización estructural y funcional de

chaperonas de haloarqueas.

- Metanogénesis: tratamiento anaerobio de

aguas contaminadas, con especial énfasis

en la caracterización de inhibidores del

proceso y en la degradación de compuestos

recalcitrantes en condiciones anaerobias.

- Cambios en la expresión global de genes

de dinoflagelados nocivos sometidos al

stress de fosfato: a) identificación y

clonación de proteínas relacionadas con la

producción de toxinas PSP por diferentes

especies del género Alexandrium, y b)

desarrollo de kits para la deteccion de

dinoflagelados toxicos productores de

toxinas diarreicas (DSP) contaminates de

alimentos de origen marino.

- Sistemas enzimáticos en el control de

hongos fitopatogénicos.

Biología molecular de microorganismosextremofilos

E.3

92

Jefe de Línea/Group Leader:

Ricardo Amils

Personal Científico / Scientific

Personnel

Irma Marín, Francisco Santamaría;

José Luis Sanz

Becarios Posdoctorales /

Posdoctoral Fellows:

Consuelo Durán, Angéles Aguilera,

Felipe Gomez*

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Elena González-Toril,

Elayne Culubret,

Patricia Rojas,

Enrique Marín,

Javier Chichón,

Eva Lospitao

Emiliano Díaz,

Moustafa Malki

Técnicos de Investigación/

Technical Assistance:

Nuría Rodriguez*,

Raquel Mesa,

Juan Francisco Morales,

Raquel García

Científicos Visitantes/ Visiting

Scientists:

Antonio Lazcano (U. Autónoma de

Mexico),

Ana Mª Amaro (U. de Chile), Violaine

Bonnefoy (CNRS Marsella),

Linda Amaral Zettler (Marine Biological

Laboratories, Woods Hole),

Erik Zettler (Marine Biological

Laboratories, Woods Hole).

*Miembros del Centro de Astrobiología

(CAB)

Molecular biology of extremophilicmicroorganisms

Publicaciones /Publications:

Research summary

The Extremophiles group has different

research projects in which the main

objectives are the following:

- Biohydrometallurgy: ecology, molecular

biology and biotechnology of acidophilic

microorganisms, with special emphasis

in their applied potential (biomining, coal

biodesulfurization, specific heavy metal

sequestering, fitoremediation).

- Microbial ecology of terrestrial extreme

environments as models of

astrobiological interest:

greomicrobiology of the Tinto River and

hypersaline ponds from la Mancha (in

colaboration with the Centro de

Astrobiología).

- Functiotype: ribosomal functional

evolution using translational inhibitors

with different specificity.

- Structural and functional

characterization of haloarchaeal

chaperons.

- Methanogenesis: anaerobic

wastewater treatment with special

emphasis in the characterization of

inhibitors of the process and the

degradation of recalcitrant compounds

in anaerobic conditions.

- Changes in the global expression of

genes from toxic dinoflagellates under

phosphate stress: a) identification and

cloning of the proteins related with the

production of PSP by different species

of the genus Alexandrium, and b)

development of kits for the detection of

toxic dinoflagelates responsible of DSP

in sea food.

- Enzymatic systems involve in the

control of fitopathogenic fungi.

93

D. Cid, R. Sanz, I. Marín, H. de Greve, J.A. Ruiz SantaQuiteria, R. Amils, R. de la Fuente. (1999) Characterizationof nonenterotoxigenic Escherichia coli strains producingF17 fimbriae isolated from diarrheic lambs and goat kids.J. Clin. Microbiol, 37: 1370-1375.

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R. Sanz, I. Marín, J.A. Ruiz-Santa-Quiteria, J.A. Orden,D. Cid, R.M. Diez, K.S. Silhadi, R. Amils, R. de la Fuente.(2000) Catalase deficiency in Staphylococcus aureussubsp. anaerobius is associated with natural loss-of-function mutations within the structural gene. Microbiol.,146: 465-475.

J.L. Sanz, N. Rodriguez, J. Ferrer, A. Moreno, J.L. Berna(2000) Evaluation of the inhibition potential of linearalkylbenzene sulfonate (LAS) to the methanogenicprocess. The Clear View, 6: 26-30.

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E.N. Culubret, M. Luz, R. Amils, J.L. Sanz (2000)Biodegradation of 1,1,1,2-tetrachloroethane undermethanogenic conditions. En “VI Latin-american WorkshopWastewater anaerobic treatment”, pp. 215-220.

Tesis Doctorales/ Doctoral thesesPatricia Rojas. “Tratamiento y post-tratamiento deefluentes ganaderos”, U. Autónoma de Madrid, septiembre2000, Apto cum laude.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

El interés de nuestra línea de investigación

se centra actualmente en la identificación

de nuevas DNA polimerasas de reparación

de DNA en mamíferos, cuyo papel podría

ser muy relevante tanto para el

mantenimiento de la estabilidad genómica,

como para proporcionar un cierto grado de

variabilidad, necesario en determinados

genes como en el caso de los receptores

de antígeno, pero indeseable en su

contribución a incrementar el fenotipo

mutador que se haya asociado a una gran

mayoría de procesos tumorales.

En nuestro laboratorio hemos identificado

dos nuevas DNA polimerasas eucarióticas,

denominadas Pol lambda y Pol mu, que

pertenecen al grupo de DNA polimerasas

homólogas a la Pol beta, implicada

específicamente en la reparación del DNA

nuclear (ver figura).

El análisis de expresión de la Pol lambda,

tanto murina como humana, sugiere su

participación específica en células

germinales, en reparación de DNA asociada

a la meiosis, y un papel mas general en

células somáticas, en la reparación de

dobles roturas en la cadena de DNA. El

análisis bioquímico de la Pol lambda

humana expresada en E. coli demuestra

su analogía funcional con la Pol beta,

compartiendo propiedades de distributividad

y relativa fidelidad de inserción, ambas

compatibles con una función en reparación

de DNA. Estamos estudiando alteraciones

de expresión y polimorfismos de la Pol

lambda humana que pudieran tener relación

con el desarrollo de determinados tumores.

La Pol mu, 42% idéntica (aminoácidos) a

la TdT, es una DNA polimerasa de muy baja

fidelidad de copia (mutador), capaz de

introducir un elevado número de

mutaciones, tanto "in vitro" como "in vivo".

El análisis de expresión de la Pol µ sugiere

su participación específica en el proceso

de hipermutación somática de los genes

de inmunoglobulinas. Estamos analizando

la contribución de la Pol mu al desarrollo

de los linfomas B en los que el proceso de

hipermutación somática está activo.

Mantenimiento y variabilidad del genoma:enzimología de la reparación de DNA.

E.4

94

Jefe de Línea/Group Leader:

Luis Blanco Dávila

Becarios Posdoctorales /

Posdoctoral Fellows:

Orlando Domínguez López (hasta Enero

2000)

Tomas Kirchhoff

Esther García Palomero (desde Julio

2000)

Rosario Sabariegos Jareño (desde Julio

2000)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

José Ruiz Pérez

Miguel García Díaz

Estudiantes / Students:

Josana Rodríguez Sánchez (hasta

Septiembre 2000)

Raquel Juárez Santos (desde

Septiembre 2000)

Genome maintenance and variability:enzymology of DNA repair.

Publicaciones /Publications:

Research summary

Our reserach interest is the identification

of novel mammalian DNA polymerases

involved in DNA repair and variability.

These novel enzymes are predicted to

be relevant to maintain the equilibrium

between genome stability and the levels

of variability required, not only for

evolution, but also for the normal

function of specific genes. Moreover,

disregulation of these enzymes could

be responsible for the mutator phenotype

associated to carcinogenesis.

We have identified two novel eukaryotic

DNA polymerases named Pol lambda

and Pol mu, that belong to the DNA

polymerase family X, whose paradigm

is Pol beta, a polymerase specifically

involved in nuclear DNA repair (see

figure).

Expression analysis of both murine and

human Pol lambda indicated its specific

participation in DNA repair associated

to meiosis, together with a more general

role in double-strand break DNA repair

in somatic cells. Biochemical analysis

of Pol lambda demonstrated its functional

analogy to Pol beta, sharing similar

properties and base-discrimination

parameters that are compatible with its

function in DNA repair. Alterations of

expression and single-nucleotide

polymorphisms associated to human

Pol lambda potentially related with

tumorogenesis, are being studied.

Pol mu shares 41% amino acid identity

with terminal transferase (TdT). Our

biochemical analyses demonstrated that

Pol mu is an error-prone DNA

polymerase that behaves as a strong

DNA mutator, both in vitro and in vivo.

Expression analysis suggest that Pol

mu plays a specific role in somatic

hypermutation of inmunoglobulin genes.

We are analyzing the contribution of Pol

mu to the development of those B-cell

lymphomas that are constitutively

hypermutating their inmunoglobulin

genes.

95

V. Truniger, L. Blanco and M. Salas (1999) Role ofthe "YxGG/A" motif of ø29 DNA polymerase inprotein-primed replication. J. Mol. Biol., 286, 57-69.

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O. Domínguez, J.F. Ruiz, M. García-Díaz, M. Laín,M. González, C. Martínez-A., A. Bernad and L.Blanco (2000) DNA polymerase mu (Polµ,homologous to TdT, could act as a DNA mutatorin eukaryotic cells. The EMBO J. 19, 1731-1742.

M. García-Díaz, O. Domínguez, L.A. López-Fernández, T. Laín de Lera, M.L. Saníger, F.J. Ruiz,M. Párraga, M.J. García, T. Kirchhoff, J. del Mazo,A. Bernad and L. Blanco (2000) DNA polymeraselambda (Pol ?), a novel eukaryotic DNA polymerasewith a potential role in meiosis. J. Mol. Biol. 301,851-867.

Patentes/ Patents

Título : "DNA polimerasa lambda, un nuevo marcadortumoral”.Inventores (p.o. de firma): Luis Blanco, AntonioBernad, Orlando Domínguez y Miguel García-Díaz.Nº de solicitud : P9902169. País de prioridad :España. Fecha de prioridad : 8 de Octubre de 1999.Entidad titular : CSIC. International patentapplication No : PCT/GB00/03784.

Título : "DNA polimerasa mu (Pol µ), una DNApolimerasa mutadora”. Inventores (p.o. de firma):Luis Blanco. N.º de solicitud : P200000517. Paísde prioridad : España. Fecha de prioridad : 3 deMarzo de 2000. Entidad titular: CSIC.

La familia X de DNA polimerasa humanas. Los cuatro DNA polimerasas presentas cuatro subdominios denominados:

“8 kDa”, “dedos” (F), “palma” (P), “pulgar” (T), que se indican en verde, amarillo, rojo y magenta, respectivamente.

Además, las DNA polimerasas Pol lambda, Pol mu y TdT comparten un dominio adicional, denominado BRCT (indicado

en azul) que probablemente juega un papel regulador. La porción equivalente a la Pol beta (core) se encuadra sobre

fondo oscuro. Las barras blancas indican secuencias adicionales en los distintos subdominios.

The Pol X family of DNA polymerases. All members have the same four subdomains, named: “8 kDa”, “fingers” (F),

“palm” (P) and “thumb” (T), indicated in green, yellow, red and magenta, respectively. Additionally, Pol lambda, Pol mu

and TdT also share an additional subdomain, named BRCT (shown in blue), that likely has a regulatory role. The generally

conserved Pol β core is shown as a dark box. The presense of additional sequences is indicates by the white bars.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de investigación

Papel del Tallo Ribosómico y del Centro

GTPasa como Reguladores de la

Traducción en S.cerevisiae.

A.- Estudio de la dinámica de las

interacciones entre los diferentes

componentes del tallo, (P0, P1α, P1β, P2α,

P2β, L12) y de ellos con los factores del

sobrenadante y con compuestos inhibidores.

Se usan técnicas de puenteo químico,

espectroscopía de fluorescencia clásica

(colaboración con Dr. J. Jameson, Univ.

Hawaii), de fluorescencia de dos fotones

(colaboración con Dr. Gratton Univ, Illinois).

Se realizan en paralelo estudios con

Aspergillus fumigatus para entender su

resistencia a antifúngicos inhibidores del

centro GTPasa

B.- Caracterización de los tres dominios

funcionales de la proteína P0.

La proteína P0 es el componente central

del tallo ribosómico desempeñando

simultáneamente tres funciones esenciales:

1.- Se une el RNA en el centro GTPasa; 2.-

Forma un complejo con las proteínas P1

y P2; 3.- Interacciona con los factores

solubles. Se están caracterizando funcional

y estructuralmente los dominios

responsables de cada una de estas

funciones. Se utilizan técnicas de genética

y biología molecular (deleciones,

mutaciones puntuales, etc) y bioquímicas

(doble híbrido, cambio de movilidad de

bandas en gel, etc).

C.- Caracterización de mRNAs cuya

traducción es regulada por la composición

del tallo ribosómico. Se utilizan cepas

mutantes con alteraciones en el tallo y

técnicas de microarrays y de proteómica.

D.- Regulación de la síntesis y ensamblaje

del tallo ribosómico. Se ha identificado un

mecanismo que implica degradación por

proteasas especificas que se intentan

identificar.

Análisis del genoma de S. cerevisiae(dirigido por M. Remacha).

Completado el análisis sistemático, donde

se generaron deleciones en 30 genes, se

ha profundizado en la función de dos de

ellos. Ydl097c es una proteína esencial,

constituyente del proteasoma. Su ausencia

produce un arresto en G2/M por un defecto

celular en la degradación de ciclinas.

Ydl100p es una proteína periférica de

membrana implicada en homeostasis de

metales. En el caso de zinc, su localización

celular depende de la presencia/ausencia

de metal, regulando la endocitosis del

receptor de alta afinidad Zrt1.

Jefe de Línea / Group leader:

Juan Pedro García Ballesta

Personal Científico / Scientific Staff:

Miguel Remacha

Técnico de investigación / Technical

Assistance:

Mari Carmen Fernández Moyano

Becarios Postdoctorales / Post-

doctoral Fellows:

Cruz Santos, Gretel Nusspaumer,

Esther Guarinos

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Sonia Zúñiga, Pilar Parada, Patricia

González Santamaría, Jorge Pérez

Fernández, De-yi Qiu, Alberto García

Marcos

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

David Jameson (30 dias), Dept.

Biología Molecular, Univ. de Hawaii,

USA

M. Helms (30 dias), Dept. Biología

Molecular, Univ. de Hawaii.

Dra. Sophia Kouyanou, (30 dias) Dept.

Biología, Universidad de Atenas

Estructura y función del ribosomaE.5

96

M.E. Gagou, M.A. Rodriguez-Gabriel, Ballesta, J.P.G. and Kouyanou,

S. (1999) Isolation and expression of genes encoding the acidic

ribosomal phosphoproteins P1 and P2 of the medfly Ceratitis capitata.

Gene, 226, 365-373.

S. Zúñiga, J. Boskovic, A. Jimenez, J.P.G. Ballesta, M. Remacha

(1999) Disruption of six Saccharomyces cerevisiae novel genes and

phenotypic analysis of the deletants. Yeast 15, 945-953.

M.A. Rodriguez-Gabriel, G. Bou, E. Briones, R. Zambrano, M.

Remacha, and J.P.G. Ballesta (1999) Structure and function of the

stalk, a putative regulatory element of the yeast ribosome. Role of

stalk protein phosphorylation. Folia Microbiol. 44, 153-163.

R. Zambrano, E. Briones, J. Avila and J.P.G. Ballesta (1999)

Phosphorylation of P1 serine inhibits peptide bond sensitivity to

Staphylococcus aureus V8 protease. Arch. Biochem. Biophys. 368,

207-209.

J.P.G. Ballesta, M.A. Rodriguez-Gabriel, G. Bou, E. Briones, R.

Zambrano, M. Remacha (1999) Phosphorylation of yeast ribosomal

stalk. Functional effects and enzymes involved in the process FEMS

Microbiol. Lett. 23, 537-550.

S. Zúñiga, J. Boskovic, J.M. Garcia-Cantalejo, A. Jimenez, J.P.G.

Ballesta, M. Remacha (1999) Deletion of 24 open reading frames

from chromosome XI from Saccharomyces cerevisiae and phenotypic

analysis of the deletants. Gene, 233, 141-150.

M.A. Rodriguez-Gabriel, M. Remacha, y J.P.G.Ballesta (2000) The

RNA interacting domain but not the protein interacting domain is

highly conserved in ribosomal protein P0 J. Biol. Chem. 275, 2130-

2136.

G. Bou, M. Remacha y J.P.G. Ballesta (2000) Ribosomal stalk

protein phosphorylating activities in Saccharomyces cerevisiae. Arch.

Biochem. Biophys. 375, 83-89.

M.E. Gagou, M.A. Rodriguez-Gabriel, J.P.G. Ballesta, S. Kjouyanou

(2000) The ribosomal P-proteins of the merfly Ceratitis capitata form

a heterogenous stalk structure interacting with the endogenous P-

proteins, in conditional P0-null strains of the yeast Saccharomyces

cerevisiae Nucleic Acid Res. 28, 736-743

M. Gómez-Lorenzo, C.M.T. Spahn, R.K. Agrawal, R.A. Grassucci,

P. Penczek, K. Chakraburtty, J.P.G. Ballesta, J.L. Lavandera, J.F.

Garcia-Bustos, J. Frank (2000) Threre-dimensional cryo-localization

of EF2 in the Saccharomyces cerevisiae 80S ribosome at 17.5Å

resolution. EMBO J. 19, 2710-2718.

J. Zurdo, P. Parada, A. van den Berg, G. Nusspaumer, A. Jimenez-

Diaz, M. Remacha, J.P.G. Ballesta (2000) Assembly of

Saccharomyces cerevisiae stalk: Binding of P1 proteins is required

for the interaction of P2 proteins. Biochemistry 39, 8929-8934.

J. Zurdo, C. Gonzalez, J.M. Sanz, M. Rico, M. Remacha, J.P.G.

Ballesta (2000) Structural differences between Saccharomyces

cerevisiae ribosomal protein P1 and P2 support their functional

diversity. Biochemistry 39, 8935-8943.

G. Nusspaumer, M. Remacha and J.P.G. Ballesta (2000)

Phosphorylation and N-end region of the yeast ribosomnal prtoein

P1 mediate its degradation, which is prevented by protein P2 EMBO

J. 19, 6075-6084.

C. Briones and J.P.G. Ballesta (2000) Conformational changes

induced in the S. cerevisiae GTPase associated RNA by ribosomal

stalk components and a translocation inhibitor. Nucleic Acid Res.

28, 4497-4505.

Structure and function of the ribosome

Publicaciones /Publications:

Research Summary

Role of the ribosomal stalk and the

GTPase center as translation regulators

in S. Cerevisiae.

A.- Dynamic of interactions among the

different stalk components (P0, P1α, P1β,

P2α, P2β, L12) and the supernatant

factors, and effect of inhibitors. Chemical

cross-linkig, classic fluorescence

spectroscopy (in collaboration with D. J.

Jameson , Univ. of Hawaii) as well as

two-photons flourescence (in

collaboration with Dr. E, Gratton, Univ, of

Illinois) are being used. Similar parallel

studies are being carried out using

Aspergillus fumigatus, trying to understand

its resistance to antifungals that inhibit

the ribosomal GTPase Center.

B.- Characterization of the three functional

domains in the ribosomal stalk protein

P0.

Protein P0 is the central component of

the ribosomal stalk and carries out three

essential functions: 1.- Binds to rRNA at

the GTPase center; 2.- Forms a complex

with proteins P1 and P2; 3.- Interacts with

the supernatnat factors. We are

functionally and structurally characterizing

the protein domains involved in each one

of these functions using genetic and

molecular biology approaches (deletions,

site directed mutations, ect) as well as

biochemical techniques (two-hybrids, gel

band-shifts, etc).

C.- Ribosomal stalk-dependent

translational regulation. Characterization

of mRNAs whose translation is affected

by the ribosomal stalk composition using

stalks mutant strains with microarrays

and proteomic techniques.

D.- Regulation of the synthesis and

assembly of the ribosomal stalk. We have

studying in detail a recently found

regulatory mechanisms that differentially

control stalk components by degradation

with specific proteases.

Analysis of the S. cerevisiae genome.

(Directed by M. Remacha)

A systematic analysis by gene deletion

of 30 genes was completed. Two of them,

Ydl097c and Ydl100p, have been studied

in more detail. Ydl097c encodes an

essential proteasomal protein whose

deletion causes a G2/M cell arrest due

to a deffect in cyclin degradation.

Ydlo100p is a peripheral membrane

protein involved in metal homeostasis. In

the case of Zn, the metal directs its cellular

location by regulating the high affinity

receptor Zrt1 endocytosis.

97

Tesis Doctorales/ Doctoral thesesEl tallo ribosómico de S. cerevisiae. Estudio estructural

y funcional. Esther Guarinos Viñals, 1999, Universidad

Autonóma de Madrid, Sobresaliente cum laude

Control de la expresión de las proteínas ribosómicas

P1/P2 en S. cerevisiae. Gretel Nusspaumer da Costa,

1999, Universidad Autónoma de Madrid, Sobresaliente

cum laude.

Análisis funcional de seis ORFs de Saccharomyces

cerevisiae. Implicación de YDL100c en la homeostasis

de metales. Sonia Zúñiga Lucas. 2000, Universidad

Autonóma de Madrid, Sobresaliente cum laude.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Control de la traducción por las eIF-2 αquinasas

Cuatro proteínas quinasas diferentes

regulan la traducción en células eucarióticas

fosforilando el eIF2α en el residuo Ser-51.

Estas son, el inhibidor regulado por hemina

(HRI); la proteína quinasa dependiente de

RNA (PKR); la proteína quinasa del retículo

endoplásmico (PERK) y el GCN2. Estas

proteínas quinasas se activan por distintos

estímulos, a saber: el HRI, por deficiencia

de hemina: la PKR, por RNA de doble

cadena; la PERK, por estrés del retículo

endoplásmico y el GCN2 de S. cerevisiae,

por limitación de aminoácidos. Previamente,

nosotros clonamos el homólogo del GCN2

de embriones de Drosophila (DGCN2) y

demostramos que su expresión está

regulada durante el desarrollo. Ahora,

hemos continuado la búsqueda de nuevos

miembros de esta familia de proteínas

quinasas. Hemos identificado el primer

homólogo del GCN2 en mamíferos

(MGCN2). La escasez de suero aumenta

la fosforilación del eIF-2α en células 293T

humanas transfectadas con MGCN2.

Hemos clonado la PERK de embriones de

Drosophila y su expresión también está

regulada durante el desarrollo y además,

su actividad en células S2 es sensible a

estrés del retículo endoplásmico.

Finalmente, hemos caracterizado los dos

primeros genes que codifican por una nueva

subfamilia de eIF-2α quinazas en

Schizosaccharomyces pombe (SEK1 y

SEK2). Ahora, estamos interesados en

determinar los mecanismos de regulación

y las funciones de estas nuevas eIF-2αquinasas en el control traduccional de

proteínas reguladoras del crecimiento en

células eucarióticas.

Proteínas implicadas en el

reconocimiento y unión del mRNA al

ribosoma durante la iniciación de la

traducción y su papel en el desarrollo y

crecimiento celular.

Las proteínas eIF (eukaryotic initiation factor)

4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B forman parte de

un complejo proteico implicado en el

reconocimiento y unión del mRNA al

ribosoma. Resultados previos de nuestro

laboratorio permitieron el aislamiento y

caracterización de eIF4E y eIF4G de

Drosophila, así como la clonación y

caracterización de los genes

correspondientes, iniciándose el estudio de

su expresión. Recientemente hemos

completado la clonación y expresión durante

el desarrollo de los genes eIF4A y eIF4B.

Actualmente nuestros intereses se centran

en la caracterización bioquímica de los

factores eIF4A y eIF4B de Drosophila y,

especialmente, en el posible papel de eIF4E,

eIF4G, eIF4A y eIF4B en la regulación

traduccional de genes implicados en el

desarrollo de Drosophila. Con este fin

estamos utilizando mutantes defectivos en

cada una de estas proteínas y moscas

transgénicas que las sobreexpresan en

distintas condiciones. También deseamos

detectar mRNAs cuya traducción se active

preferentemente en células en cultivo que

sobreexpresan eIF4E o eIF4G. Con estos

abordajes experimentales esperamos

identificar genes implicados en la regulación

del crecimiento celular y/o en el desarrollo

embrionario, que estén regulados a nivel

de su traducción.

Jefe de Línea / Group Leader:

César de Haro, José M. Sierra

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Juan José Berlanga

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Mónica Elías, Greco Hernández (hasta

31-Agosto-1999), Saturnino Herrero,

Natalia Pomar

Técnico de Investigación /

Technical Assistance:

José Alcalde

Síntesis de proteínas y su regulación eneucariontes

E.6

98

Expresión de la PERK de Drosophila durante el desarrollo embrionario

(N. Pomar, J.J. Berlanga, S. Campuzano, and C. de Haro)

Expression of Drosophila PERK during embryonic development (N.

Pomar, J.J. Berlanga, S. Campuzano, and C. de Haro)

Protein synthesis and its regulation ineukaryotes

Research Summary

Translational control by eIF-2 α kinases

Four distinct protein kinases regulate

translation in eukaryotic cells by

phosphorylating eIF2α at Serine-51. There

are the heme-regulated inhibitor (HRI);

the interferon inducible RNA-dependent

kinase (PKR); the endoplasmic reticulum

(ER)-resident kinase (PERK) and the

GCN2 kinase. These kinases are

activated by distinct stimuli as follows :

HRI, by heme deficiency; PKR, by the

occurrence of double-stranded RNAs;

PERK, by ER stress and GCN2 of S.

cerevisiae by amino acid deprivation.

Previously, we cloned the GCN2 kinase

from Drosophila (DGCN2) and

demonstrated that its expression is

developmentally regulated.

We have continued with the search for

new members of this family of kinases.

We found the first mammalian GCN2

homolog (MGCN2). Serum starvation

increased eIF2α phosphorylation in

MGCN2-transfected human 293T cells.

Also, we cloned the Drosophila PERK

homolog (DPERK). Expression of DPERK

transcripts is also developmentally

regulated and the endogenous DPERK

activity from Drosophila S2 cells is

sensitive to ER stress. Finally, we have

characterized the first two genes of a new

subfamily of eIF2α kinases from

Schizosaccharomyces pombe (SEK1 and

SEK2). We are now interested in

determining which are the regulatory

mechanisms and the functions of these

novel eIF2α kinases in the translational

control of key growth regulatory proteins

in eukaryotic cells.

Proteins involved in the recognition

and binding of the mRNA to the

ribosome during translation initiation

and their role on development and cell

growth.

The proteins eIF (eukaryotic initiation

factor) 4E, eIF4G, eIF4A y eIF4B are part

of a protein complex involved in the

recognition and binding of the mRNA to

the ribosome. Previous results from our

laboratory led to the isolation and

characterization of eIF4E and eIF4G from

Drosophila, as well as the cloning and

characterization of the corresponding

genes, beginning the study of their

expression. Recently, we have finished

the cloning and expression during

development of the genes eIF4A and

eIF4B. At present, our aims are the

biochemical characterization of Drosophila

eIF4A and eIF4B factors and, especially,

the study of the possible role of eIF4E,

eIF4G, eIF4A y eIF4B on the translational

regulation of the genes involved in

Drosophila development. To this end, we

are using mutants lacking each of these

proteins and transgenic flies

overexpressing them at different

conditions. Also, we want to detect

mRNAs whose translation is preferentially

activated in culture cells overexpressing

eIF4E or eIF4G. Based on these

experimental approaches, we hope to

identify genes involved in cell growth

regulation and/or embryonic development

regulated at the translational level.

99

Publicaciones /Publications:

Berlanga, J.J., Santoyo, J., and de Haro, C. (1999)

Characterization of a mammalian homolog of the GCN2

eukaryotic initiation factor 2α kinase. Eur. J. Biochem.

265, 754-762

Muñoz, F., Martín, M. E., Manso-Tomico, J., Berlanga,

J. J., Salinas, M., and Fando, J. L. (2000) Ischemia-

induced phosphorylation of initiation factor 2 in

differentiated PC12 cells. Role for initiation factor 2

phosphatase. J. Neurochem. 75, 2335-2345

Tesis Doctorales/ Doctoral theses

Greco Hernández Ramírez: “Estructura y expresión de

los genes de Drosophila de los factores de iniciación de

la traducción involucrados en la unión del mRNA al

ribosoma”. Universidad Autónoma de Madrid. 1999.

Calificación: Apto cum laude.

Saturnino Herrero: "Clonaje y caracterización de nuevas

eIF2α quinasas reguladas por hemina". Universidad

Autónoma de Madrid. 2000. Calificación : Sobresaliente

cum laude.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Se ha continuado el estudio del cluster

pur, determinante de la ruta de biosíntesis

de puromicina en Streptomyces alboniger.

El gen pur4 se ha comprobado que

participa en la ruta biosintética mediante

deleción y complementación génicas. Se

supone que su producto introduce un

grupo –NH2 en la posición 3’ de la

adenosina para dar lugar a 3’-amino-3’-

desoxiadenosina. De acuerdo con esto,

un mutante pur4- produce puromicina al

ser complementado por 3’-amino-3’-

desoxiadenosina. El gen pur6 de este

cluster determina un producto (Pur6) que

participa en esta ruta biosintética, como

se ha demostrado por deleción y

complementación génicas. Pur6 se ha

expresado en Escherichia coli, con una

solubilidad muy limitada, y en

Streptomyces lividans. Se ha demostrado

que es una sintetasa del tipo de las

péptidosintetasas no ribosómicas, ya que

lleva a cabo la unión de 3’-amino-3’-

desoxiadanosina y tirosina formando un

enlace amida entre los grupos 3’-amino y

carboxilo de estos dos precursores,

respectivamente. Esta reacción da lugar

al esqueleto carbonado de puromicina

(tridesmetilpuromicina). Sin embargo,

Pur6 también es capaz de realizar esta

misma unión pero utilizando N6,N6-dimetil-

3’-amino-3’-desoxiadenosina como

sustrato. En este caso se obtiene O-

desmetilpuromicina, un intermediario que

se supone derivado de

tridesmetilpuromicina. Esta relativamente

baja especificidad no es sorprendente

dentro de los enzimas biosintéticos de

antibióticos. Ambas reacciones requieren

ATP y Mg2+, como es característico de las

péptidosintetasas. En relación al cluster

de biosíntesis del nucleósido A201A,

relacionado químicamente con

puromicina, de Streptomyces capreolus

se ha completado la secuenciación del

posible cluster génico a201A. Esto ha

permitido establecer una hipotética ruta

de biosíntesis de este antibiótico.

En relación a la biosíntesis de puromicina

en cultivos de S. alboniger, se ha

comprobado que el fosfato desreprime la

represión de esta biosíntesis inducida por

glucosa.

En relación a levaduras se han terminado

los proyectos EUROFAN I y II,

estudiándose la funcionalidad de una

variedad de ORFs de función

desconocida. Además se ha continuado la

preparación de levaduras industriales con

capacidad amilolítica y obtenido

organismos panaderos con este fenótipo.

Se ha estudiado la actividad del promotor

del gen SWA2 de Schwanniomyces

occidentalis en S. cerevisiae y analizado

su regulación por fuente de carbono. En la

secuencia de este promotor se han

localizado dos motivos implicados en

represión catabólica, no reconocidos por

la proteína Mig1 de S. cerevisiae. Se ha

aislado y secuenciado el gen de

Schwanniomyces occidentalis homólogo

a Mig1 de S. cerevisiae.

Jefe de Línea / Group leader:

Antonio Jiméndez

Personal Científico /

Scientific Personnel:

María Fernández-Lobato

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Eloísa Sanz Martínez,

Natalia Martínez Romero (hasta Junio

2000)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Juan Alva Rabanal (hasta Octubre

2000),

Teresa A. Carmona,

Dolores Marín Alberdi (hasta Julio 2000,

Irene Saugar Gómez,

Mercedes Tiemblo (hasta Julio 2000)

Tecnicos de Investigación /

Technical Assistance:

Bárbara Asunción Martín Redondo

Científicos Visitantes / Visiting

Scientists:

María Josefa Elena Fernández-

Fernández

Expresión génica en Streptomyces y levadurasE.7

100

Gene expression in Streptomyces and yeast

Research Summary

The study of the pur cluster, which

determines the biosynthetic pathway of

the puromycin antibiotic in

Streptomyces alboniger, was continued.

Gene deletion and complementation

experiments proved that the pur4 gene

is implicated in this pathway. It was

hypothesized that the Pur4 enzyme

catalyzes the linking of a –NH2 group to

the 3’ position of adenosine to produce

3’-amino-3’-deoxyadenosine. Indeed,

cultures of a pur4- mutant produced

puromycin in the presence of 3’-amino-

3’-deoxyadenosine. Similarly to pur4,

the pur6 gene was shown to determine

an ezyme of the pathway. The Pur6

enzyme was expresed in Escherichia

coli as a poorly soluble His-tailed protein

and in Streptomyces lividans. It links 3’-

amino-3’-deoxyadenosine and tyrosine

by forming an amide bond between the

3’-amino and the carboxyl group of

these two intermediaries, respectively,

giving rise to the carbon backbone of

puromycin (tridemethylpuromycin). In

addition, Pur6 is able to perform this

bond by using N6,N6-dimethyl-3’-amino-

3’-deoxyadenosine as a substrate. This

renders O-demethylpuromycin, an

intermediary presumed to derive from

tridemethylpuromycin. This relatively

low specificity of Pur6 is not unfrequent

in enzymes of secondary metabolism.

Both rections require ATP and Mg2+ as

it is characteristic of non ribosomal

aminopeptidases. Therefore, it was

concluded that Pur6 pertains to this

group of enzymes.

Sequencing of the a201a cluster, which

encodes the A201A biosynthetic

pathway from Streptomyces capreolus,

was completed. This has permitted to

propose a hypothetical biosynthetic

pathway for A201A. This

aminonucleoside antibiotic is chemically

related to puromycin. Indeed, a201a

contains all the genes encoding the

common biosynthetic moiety, N6,N6-

dimethyl-3’-amino-3’-deoxyadenosine,

between both drugs. Moreover, three of

the homologous genes (pur4, pur5 and

pur10) from S. capreolus complement

the relevant mutants from S. alboniger.

On a different subject, the glucose-

induced repression of puromycin

biosynthesis by S. alboniger, was

shown to be derepressed by phosphate.

This finding widen up initial results on

this repression.

Concerning yeasts, the EUROFAN I and

II projects of the EU were ended.

The functionality of a variety of ORFs of

unknown function was studied.

Furthermore, the preparation of

industrial yeasts with amylolytic function

was pursued and baker’s yeast strains

expressing this phenotype were

obtained. Activity of Schwanniomyces

occidentalis SWA2 gene promoter as

expressed in S. cerevisiae was studied

and its regulation by the carbon source

analysed. It carries two motives, which

could be implicated in catabolic

repression. However, they are not

recognized by the Mig1 protein from

Saccharomyces cerevisiae. A

Schwanniomyces occidentalis gene

which is homologous to Mig1 from S.

cereisiae was cloned.

101

Publicaciones /Publications:

L. del Pozo, L. Osaba, J. Corchero and A. Jiménez.

(1999). “A single nucleotide change in the MNR1

(VCX1/HUM1) gene determines resistance to

manganese in Saccharomyces cerevisiae”. Yeast, 15,

371-375

S. Zúñiga, J. Boskovic, A. Jiménez, J. P. G. Ballesta and

M. Remacha. “Disruption of six Saccharomyces

cerevisiae novel genes and phenotypic analysis of the

deletants”. YEAST 15, 945-953 (1999).

S. Zúñiga*, J. Boskôvic*, A. Jiménez, J. P. G. Ballesta

and M. Remacha (1999). “Deletion of twenty four ORFs

from chromosome XI from Saccharomyces cerevisiae

and phenotypic analysis of the deletants”. GENE 233,

141-150 *Estos dos autores contribuyeron igualmete a

este trabajo.

J. C. Espinosa, M. A. Rubio, E. Fernández, J. A. Tercero

and A. Jiménez. (1999). “The pur7 gene from the

puromycin biosynthetic pur cluster of Streptomyces

alboniger encodes a nudix hydrolase”. J. Bacteriol. 181,

4914-4918.

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Irene Saugar Gómez. “Caracterización del clúster

génico a2a de la ruta biosintética del antibiótico A201A

de Streptomyces capreolus”. Universidad Autónoma de

Madrid. 2000. Apto Cum Laude.

Teresa de los Ángeles Carmona Delgado. “Estudio de

la actividad del promotor del gen SWA2 de

Schwanniomyces occidentalis expresado en

Saccharomyces cerevisiae. Regulación por fuente de

carbono”. Universidad Autónoma de Madrid. 2000. Apto

cum Laude.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Nuestro objetivo es el estudio de los

mecanismos moleculares de la acción de

las hormonas esteroides así como de la

hormona polipeptídica prolactina.

Regulación por hormonas esteroides

del gen de la uteroglobina (UG).

El gen de uteroglobina (UG) se expresa

en varios tejidos del conejo y de otros

mamíferos. En cada tejido el gen es

regulado específicamente por una

determinada hormona, entre las que están

los glucocorticoides, la progesterona y los

estrógenos. Un elemento de respuesta a

estrógenos (ERE) y varios posibles

elementos de respuesta a

glucocorticoides/progesterona

(GRE/PRE) se han observado en el

promotor a –0,26 Kb y a 2,6 Kb

respectivamente. Varios estudios han

demostrado que todos esos elementos de

respuesta pueden ser modulados por

otros factores de transcripción que se

unen a diferentes sitios en el promotor de

ug. Nosotros nos hemos centrado de

varias E-box (sitios de unión de factores

de transcripción HLH) presentes en el

promotor. Nuestros estudios indican que

una de esas E-box, localizada cerca de la

TATA-box, une dos factores nucleares y

que ese elemento parece ser importante

en la determinación de la expresión

específica de tejido del gen ug. Nuestros

estudios también indican que otra E-box

es necesaria para la adecuada inducción

del gen por estrógenos. Nosotros también

investigamos la actividad de los GRE/PRE

del gen de ug en el contexto de diferentes

promotores. Los resultados indican que la

estructura de los promotores es de gran

importancia para la respuesta hormonal.

Mecanismos moleculares de la acción

de la prolactina.

La hormona polipeptídica prolactina (PRL)

ejerce numerosos efectos en múltiples

células blanco, incluyendo la estimulación

del crecimiento y la diferenciación. Uno de

nuestros objetivos es entender los

mecanismos moleculares que envuelven

la proliferación celular inducida por PRL.

Nuestros resultados indican que este

efecto esta mediado a través de la

activación de sitios AP-1. Esta activación

es debida a un incremento en el contenido

de c-Jun de los complejos

transcripcionales AP-1. La proliferación

inducida por PRL de células epiteliales

mamarias esta inhibida por

glucocorticoides con un decrecimiento

concomitante del contenido de c-Jun. La

regulación del sitio AP-1 parece ocurrir a

través de una activación dependiente de

PRL de la quinasa de c-Jun (JNK),

mientras que los glucocorticoides

previenen la activación de JNK. Así, la

proliferación celular inducida por PRL,

parece ocurrir por la activación de JNK,

que a su vez activa los elementos

transcripcionales de un sitio de unión AP-

1 y este proceso es inhibido por

glucocorticoides de una manera no

dependiente de la unión a DNA.

Jefe de Línea / Group Leader:

Antonio Nieto

Personal Científico / Scientific

Staff:

J. Predestinación García-Ruiz

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Marta Riffo, Eva Obregón

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Aparicio Aguilar,

Karla Solorzano,

Henry Rivera,

Isabel Olazábal,

Samuel Ogueta

Técnico de Investigación /

Technical Assistance:

Carlos García

Regulación de la actividad genética porhormonas

E.8

102

Estructura esquemática de la uteroglobina.

Hormonal regulation of gene expression

Research Summary

Our aim is the study of the molecular

mechanisms of action of steroid

hormones as well as of the polypeptide

hormone prolactin.

Steroid hormone regulation of the

uteroglobin (UG) gene.

The UG gene is expressed in several

tissues of the rabbit and other

mammals. In each tissue a determined

hormone, including glucocorticoids,

progesterone and estrogens,

specifically regulates the gene. An

estrogens response element (ERE) and

several putative glucocorticoid/

progesterone response elements

(GRE/PRE) have been observed in the

promoter at -0,26 Kb and -2,6 Kb,

respectively. Several studies have

demonstrated that all these response

elements can be modulated by other

transcription factors that bind at different

sites in the ug promoter. We have

focused on several E-box (binding sites

for HLH transcription factors) present in

the promoter. Our studies indicated that

one of these E-box, located close to the

TATA-box, bind two nuclear factors and

that element appear to be important in

determining the tissue-specific

expression of ug. Our studies also

indicated that other E-box is necessary

for an adequate induction of ug by

estrogens. We are also investigating the

activity of the GRE/PRE of ug in the

context of different promoters. The

results indicate that the structures of the

promoters are of great importance for

the hormonal response.

Molecular mechanisms of action of

the prolactin.

The polypeptide hormone prolactin

(PRL) exerts numerous effects on

multiple target cells, including

stimulation of growth and differentiation.

One of our goals is to understand the

molecular mechanisms involved in the

PRL-induced cell proliferation. Our

results indicate that this effect is

mediated through activation of AP-1

sites. This activation is due to an

increase in the c-Jun content of AP-1

transcriptional complexes. The PRL-

induced proliferation of mammary

epithelial cells is inhibited by

glucocorticoids with a concomitant

decrease of c-Jun content. The

regulation of the AP-1 site appears to

occur through a PRL-activation of c-Jun

kinase (JNK) while glucocorticoids

prevent the activation of JNK. Thus,

PRL-induced cell proliferation appears

to occur by activation of JNK that, in

turn, activates the transcriptional

elements of an AP-1 binding site and

this process is inhibited by

glucocorticoids in a DNA-binding

independent manner.

103

Publicaciones /Publications:

Ogueta, S., Olazabal, I., Santos, I., Delgado-Baeza, E.

and García Ruiz,J.P. (2000). Transgenic mice

expressing bovine GH develop arthritic disorder and

self-antibodies. J. of Endocrinology. 165, 321-328

Olazabal, I., Muñoz, J., Ogueta, S., Obregón, E., and

García-Ruiz, J.P. (2000). Prolactin (PRL)-PRL receptor

system increases cell proliferation involving JNK (c-Jun

amino terminal kinase) and AP-1 activation: inhibition

by glucocorticoids. Mol. Endocrinology. 14, 564-575

Riffo, M. and Nieto, A. (1999). Lysophosphatidylcholine

induces changes in physicochemical, morphological,

and functional properties of mouse zona pellucida: a

possible role of phospholipase A2 in sperm-zona

pellucida interaction. Mol. Reprod. Dev. 53, 68-76

García, C. and Nieto, A. (1999). Two progesterone-

dependent endometrial nuclear factors bind to an E-box

in the rabbit uteroglobin gene promoter: involvement in

tissue-specific transcription. Arch. Biochem. Biophys.

362, 301-308

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Isabel Olazabal Olarreaga: “ Efecto proliferativo de la

prolactina en células epiteliales y sus mecanismos

moleculares.” Universidad Autónoma de Madrid. 1999.

Calificación: Sobresaliente cum laude.

Samuel Ogueta Villarreal: “ Nuevo sistema regulador de

los tejidos articulares de la rodilla humana y murina.

Regeneración del cartílago articular.” Universidad

Autónoma de Madrid. 2000. Calificación: Sobresaliente

cum laude.

Schematic structure of uteroglobin.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Nuestro objetivo es el esclarecimiento en

cromatina de las relaciones básicas entre

estructura y función transcripcional,

utilizando para ello moldes

oligonucleosómicos definidos, ensamblados

sobre DNA con secuencias posicionantes

de nucleosomas regularmente espaciadas,

y un sistema sencillo y eficiente de

transcripción in vitro. Antes de 1999,

estudiamos los efectos sobre la

transcripción de la ausencia de los dímeros

H2A·H2B y los producidos por la acetilación

o la eliminación de los dominios histónicos

terminales. Durante los últimos dos años,

hemos investigado cómo se afecta la

elongación de las cadenas de RNA al

incorporarse a los moldes

oligonucleosómicos las histonas H1/H5,

las cuales interaccionan con el DNA

espaciador estabilizando la fibra de 30 nm.

La unión de H1/H5 podría afectar la

eficiencia transcripcional a tres niveles:

nucleosomas individuales, fibra de 30 nm

y agregados de las cadenas

oligonucleosómicas.

Para investigar estas posibilidades, se

determina paralelamente el grado de

compactación y la eficiencia transcripcional

de los distintos moldes en condiciones

salinas apropiadas para obtener diferentes

niveles de plegamiento. La formación de la

fibra de 30 nm requiere un nivel alto de

ocupación de las secuencias posicionantes.

Como la presencia de cada octámero de

histonas inhibe parcialmente el proceso de

elongación, el molde de DNA con 18

secuencias posicionantes anteriormente

empleado es inadecuado para estudiar el

efecto sobre la transcripción de la fibra de

30 nm, ya que la ocupación por octámeros

de 15 de las 18 secuencias posicionantes

inhibe totalmente la sintesis de RNA.

Para evitar este problema, se han empleado

especies de DNA semejantes a la ya

utilizada pero con solo 8 y 12 secuencias

posicionantes. En contra de lo inicialmente

esperado, la incorporación de H5 en las

cadenas oligonucleosómicas no parece

afectar la eficiencia de éstas como moldes

de transcripción, ni siquiera cuando H5

estabiliza la fibra de 30 nm.

Jefe de Línea / Group Leader:

Enrique Palacián

Personal Científico / Scientific Staff:

Francisco Hernández

Técnicos de Investigación / Technical

Assistance:

Santiago Arenas,

Miguel Ángel Sánchez

Estudiante / Students :

Gonzalo Gómez

E.9

104

Estructura cromatínica y transcripción

Chromatin structure and transcription

Research Summary

The purpose of our research is to

elucidate the relationships between

chromatin structure and transcriptional

function. To accomplish this goal we use

defined oligonucleosome templates,

assembled on DNA containing regularly

spaced nucleosome positioning

sequences, and a simple and efficient in

vitro transcription system. Prior to 1999

we studied the effects on transcription

caused by the absence of H2A·H2B

dimers, and by acetylation or elimination

of the histone tail domains.

During the last two years, our group has

investigated how elongation of RNA

chains is affected by the incorporation of

histones H1/H5 into oligonucleosome

templates. H1/H5 bind to the linker DNA

stabilizing the 30-nm fiber. Binding of

H1/H5 might affect the transcriptional

efficiency of the templates at three

different levels: individual nucleosomes,

30-nm fiber, and aggregates of

oligonucleosomal chains. To investigate

these posibilities, the degree of

compaction and the transcription efficiency

of oligonucleosome templates were

determined in paralell under the salt

conditions required to obtain different

compaction levels. Formation of the 30-

nm fiber requires a high level of

occupancy of the positioning sequences,

and the binding of each histone octamer

partially inhibits the elongation process.

Therefore, the DNA template with 18

positioning sequences, which was that

previously employed, is unsuitable to

study the effect of the 30-nm fiber on

transcription, since the binding of histone

octamers to 15 of the 18 positioning

sequences totally inhibits RNA synthesis.

To avoid this problem, similar DNA species

with only 8 and 12 positioning sequences

were used. Against the expected results,

incorporation of histone H5 into the

oligonucleosomal chains does not appear

to affect their efficiency as transcription

templates, even when H5 stabilizes the

30-nm fiber.

105

Publicaciones /Publications:

Chirinos, M., Hernández, F., and Palacián, E. (1999)

Transcription of DNA templates associated with histone

(H3·H4)2 tetramers. Arch. Biochem. Biophys. 370, 222-

230

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

El tema de estudio de la linea es la biología

de la envoltura celular bacteriana, como

principal elemento morfogenético, de

relación con el medio y con otros otros

organismos y como sitio de acción de

agentes antibacterianos. En este contexto

nuestro trabajo se centra en los siguientes

aspectos:

a) Morfogénesis de Escherichia coli y

Salmonella typhimurium; Continuamos

nuestros estudios sobre la generación y

función de regiones topologicamente

diferenciadas en el sáculo y en la membrana

externa de la bacteria. Hemos demostrado

la existencia de regiones de larga vida

media y metabolicamente inertes en ambas

estructuras cuya génesis esta asociada al

fenómeno de división celular. Estamos

estudiando las bases estructurales y

metabólicas de las heterogeneidades asi

como su relevancia en la morfogénesis

bacteriana.

b) Adaptaciones y participación de la

envoltura bacteriana en la colonización de

células eucarióticas, y establecimiento de

estados de persistencia, por Salmonella

typhimurium. La envoltura celular de S.

typhimurium sufre cambios estructurales

radicales durante las primeras etapas del

proceso de colonización de células

eucarióticas, fenómeno base de la

patogenia de dicho organismo. Estamos

estudiando la relevancia de tales fenómenos

en la progresión de la infección, en la

multiplicación intracelular y en la capacidad

de persistencia de S. typhimurium. También

estamos estudiando la participación en

dichos procesos de una ámplia serie de

enzimas relacionadas con el metabolismo

del sáculo que se caracterizan por su

redundancia y dispensabilidad en cultivos

in vitro.

c) Cambios adaptativos en la estructura y

enzimología del sáculo de Helicobacter

pylori asociados a la generación de formas

cocoides. H. pylori sufre un drástico cambio

morfológico y fisiológico en respuesta a

condiciones de estress que implica la

generación a partir de bacterias con

morfología helicoidal de unas formas

cocoides, que posiblemente representan

una forma de resistencia asociada a la

transmisión del patógeno. Anteriormente

hemos demostrado cambios sustanciales

en el metabolismo de la pared reminiscentes

de los descritos en la esporulación de

Bacillus. Estamos estudiando la enzimología

del proceso, y la posibilidad de explotar la

singularidad de las reacciones para el

desarrollo de antibacterianos de alta

especificidad.

Jefe de Línea / Group Leader:

Miguel Angel de Pedro Montalban

Personal Científico / Scientific Staff:

Francisco García del Portillo

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Graciela Pucciarelli Morrone.

Ana Dopazo González.

Ana María Alonso.

Antonio Cebriá.

Amparo Haro Castuera.

Silvia Gutierrez Erlandsson.

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Katysulla Costa

Marina Martínez-Moya.

María José Rodríguez. Miguel Angel

Serrano Melgar

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Juliana de la Rosa (1999)

Nuria Gómez López.

Maria Teresa Villalba Villacorta

E.10

106

Envolturas celulares

Demostracion de heterogeneidades topológias durante el crecimeinto del sáculo en

un mutante amiABC de S. typhimurium. Rojo: regiones inertes. Verde: regiones de

inserción zonal de precursores. Amarillo: regiones de inserción difusa de precursores.

Cell envelopes

Research Summary

The research topic of the group is the

biology of the bacterial cell envelope, as

the main element in morphogenesis and

relation with both the environment and

other organisms, and as site of action of

antibacterial agents. Our investigations

are focused on the following directions:

a) Morphogenesis of Escherichia coli; we

continue our investigations on the

generation and function of topologically

differentiated regions in the bacterial

sacculus and outer membrane. The

existence of long lived, metabolically

inert regions in both structures has been

positively demonstrated. Generation of

such regions is intimately linked with

bacterial division. At present we are

working on the structural and metabolic

basis of the heterogeneity as well as on

the evaluation of its relevance for bacterial

morphogenesis.

b) Adaptive modifications and involvement

of Salmonella typhimurium bacterial

envelope in eukaryotic cell colonization,

and in the establishment of the

persistence state. S. typimurium cell

envelope is severely modified during the

early stages of eukaryotic cell colonization,

a key process for Salmonella

pathogeneicity. We are currently

investigating the relevance of envelope

alterations for the outcome of the infection,

for intracellular proliferation and for the

persistence ability of S. typhimurium. The

possible involvement on S. typhimurium

pathogeneicity of cell wall metabolizing

enzymes is also under study.

c) Adaptive modifications in the structure

and enzymology of Helicobacter pylori

sacculus associated to the generation of

coccoid forms. Under stress conditions

H. pylori undergoes a morphological

transition from the vegetative spiral form

into a coccoid shape. Coccoid cells may

represent a resistance form mediating

transmission and spreading of the

pathogen. We have shown that during

the transition the cell wall is substantially

modified in a way reminiscent in some

aspects of endospore formation in

Bacillus. At present we are studying the

enzymology of the process, and the

possibility to exploit the uniqueness of

the process to search for high specificity

antibacterials.

107

Publicaciones /Publications:

García-del Portillo, F., M.G. Pucciarelli, y J. Casadesús

(1999). DNA methylase mutants of Salmonella

typhimurium show defects in protein secretion, cell

invasion, and M cell cytotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 96:11578-11583.

García-del Portillo, F. (1999). Pathogenic interference

with host vacuolar trafficking. Trends in Microbiology

7:467-469.

Hilbert, F., F. García-del Portillo y E.A. Groisman. (1999).

A periplasmic D-alanyl-D-alanine dipeptidase in the Gram

negative bacterium Salmonella enterica. J. Bacteriol.

181:2158-2165.

Costa, K., G. Bacher, G. Allmaier, M.G. Domínguez-Bello,

L. Engstrand, P. Falk, M.A. de Pedro, y F. García del

Portillo. (1999) The morphological transition of

Helycobacter pylori cells from spiral to coccoid is preceded

by a substantial modification of the cell wall. J. Bacteriol.

181:3710-3715.

Quintela, J.C., P. Zöllner, F. García del Portillo, G. Allmaier,

y M.A. de Pedro. (1999) Cell wall structural divergence

among Thermus spp. FEMS Microbiol. Lett. 172:223-

229.

Quintela,J.C.; F.G. del Portillo; E. Pittenauer, G. Allmaier,

de Pedro,M.A.(1999) Peptidoglycan fine structure of the

radiotolerant bacterium Deinococcus radiodurans Sark.

J. Bacteriol. 181:334-337

Tesis Doctorales/ Doctoral Theses

Martinez-Moya, M. (1999). “Estudio del fenómeno de

persistencia intracelular de Salmonella typhimurium en

células eucariotas no fagocíticas”. Tesis Doctoral.

Marzo 1999. Universidad Autónoma de Madrid.

Ilustration of topological heterogeneities in growing sacculi of an amiABC S. typhimurium

mutant strain. Red: Inert regions. Green: zonal insertion of new precursors. Yellow:

diffusse insertion of precursors.

Resumen de Investigación

Los objetivos principales de esta línea de

investigación consisten en la caracterización

de los genes implicados en distintas

enfermedades metabólicas, sus variantes

alélicas y el efecto de las mismas sobre la

relación estructura-función de las enzimas

codificadas.

Durante este periodo se ha continuado con

el estudio de las bases moleculares de la

fenilcetonuria (PKU), ampliando el estudio

epidemiológico a distintas regiones

españolas y a otras poblaciones, analizando

la relación fenotipo-genotipo y desarrollando

la metodología necesaria para expresar

mutaciones en sistemas eucariotas y

procariotas que permitan definir qué

mutaciones afectan al plegamiento,

ensamblaje y estabilidad de la proteína

PAH. Otros abordajes experimentales

aplicados con éxito han sido los ensayos

de doble híbrido para estudiar la interacción

entre subunidades PAH y ensayos de pulso-

caza en sistemas libres de células

(transcripción-traducción acopladas) para

estudiar la estabilidad de las proteínas

mutantes. Estos estudios se complementan

con el análisis estructural y modelado

molecular de las mutaciones en las

estructuras cristalinas disponibles de las

formas activas de la PAH.

Asimismo, se ha continuado con el análisis

genético de la acidemia propiónica,

identificando mutaciones en los genes

implicados PCCA y PCCB. El análisis de

la correlación genotipo-fenotipo ha permitido

asociar la presencia de determinadas

mutaciones que se pueden predecir como

nulas funcionalmente, con la forma más

severa de la enfermedad, mientras que

algunas mutaciones de cambio de

aminoácido tienden a estar relacionadas

con la presentación tardía (más suave) de

la enfermedad. Por otra parte, se ha

analizado el efecto de mutaciones PCCA

y PCCB mediante distintos sistemas

(síntesis in vitro e importe mitocondrial,

doble híbrido) demostrando un defecto de

estabilidad intramitocondrial para la

mutación PCCA M348K y delimitando la

región carboxilo terminal de la proteína

PCCB implicada en la interacción

homomérica β−β.

En el último año se han caracterizado las

bases moleculares de la 3-metil-crotonil

glicinuria, identificando los dos genes

implicados mediante búsquedas

bioinformáticas (BLAST) en las bases de

datos públicas, clonaje de los cDNAs

humanos candidatos, caracterización de la

estructura genómica de ambos genes e

identificacón de mutaciones en pacientes.

Jefe de Línea / Group Leader:

Magdalena Ugarte

Personal Científico / Scientific Staff:

Mª José García Muñoz,

Begoña Merinero,

Belén Pérez,

Celia Pérez-Cerdá,

Pilar Rodríguez-Pombo,

Lourdes Ruiz Desviat.

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Silvia Muro ,

Pedro Ruiz Sala.

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Margarita Castro,

Sonia Clavero Alejandra Gámez, Jon

A. Gangoiti,

Fernando García,

Mª Angeles Martínez,

Angel L. Pey

Técnico de Investigación / Technical

Assistance:

Mª Jesús Ecay,

Mar Infante,

Rocío Martín,

Rosa Navarrete,

Ascensión Sánchez,

Paloma Sanz.

E.11

108

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Bases Moleculares de las EnfermedadesMetabólicas

Molecular basis of metabolic diseases

Research Summary

The main research interests are the

characterization of genes involved in

metabolic diseases and of their variant

alleles and the effect on the structure-

function relationship of the encoded

enzymes.

During this period we have continued with

the study of the molecular basis of

phenylketonuria (PKU), characterizing

the mutational spectrum of different

Spanish regions and other populations,

analyzing the genotype-phenotype

correlations and setting up the techniques

for the expression of mutations in

eukaryotic and prokaryiotic systems which

allow us to define those mutations

affecting folding, assembly and stability

of the PAH protein.Two-hybrid assays

analyzing the interactions between

subunits and pulse-chase experiments in

cell-free systems (coupled transcription-

translation) to study mutant protein stability

have also been successfully performed.

All these studies are completed with the

structural analysis and molecular

modelling of the mutations on the available

crystal structures of the active PAH forms.

We have also progressed on the genetic

analysis of propionic acidemia, identifying

mutations in the two genes involved,

PCCA and PCCB. The study of the

genotype-phenotype correlation has

revealed that certain potentially null

mutations are associated with the most

severe form of the disease, while some

missense mutations are associated with

a late presentation (mild form) of the

disease.We have also analyzed the effect

of PCCA and PCCB mutations in different

systems (in vitro synthesis and

mitochondrial import, two hybrid assays),

demonstrating a defect in

intramitochondrial stability for the M348K

PCCA mutation, and the involvement of

the carboxy-terminal region of PCCB in

the homomeric β−β interaction between

beta subunits.

During the last year we have

characterized the molecular basis of 3-

methyl-crotonyl glicinuria, identifying the

genes after bioinformatic searches

(BLAST) in public databases, cloning the

human candidate cDNAs, characterization

of the genomic structure of both genes

and identification of mutations in patients.

109

Publicaciones /Publications:

Richard E., Desviat L.R., Pérez B., Pérez-Cerdá C. and Ugarte M. (1999).

“Genetic heterogeneity in propionic acidemia patients with α-subunit defects.

Identification of five novel mutations, one of them causing instability of the

protein”. Biochimica et Biophysica Acta 1453:351-358.

Muro, S., Perez-Cerdá, C., Rodríguez-Pombo, P., Pérez, B., Briones, P., Ribes,

A., Ugarte, M. (1999) “Feasibility of DNA-based methods for prenatal diagnosis

and carrier detection of propionic acidemia”. J. Med. Genetics, 36(5):412-414.

Pérez B., Desviat L.R., De Lucca M., Cornejo V., Raimann E. and Ugarte

M. (1999) “Molecular characterization of phenylalanine hydroxylase

deficiency in Chile”. Human Mutation Mutation in Brief 243. On line.

Desviat L.R., Pérez B., Gámez A., Sánchez A., García M.J., Martínez-

Pardo M., Marchante C., Bóveda D., Baldellou A., Arena J., Sanjurjo P.,

Fernández A., Cabello M.L. and Ugarte M. (1999) .“Genetic and phenotypic

aspects of phenylalanine hydroxylase deficiency in Spain. Molecular survey

by regions”. Eur. J. Hum. Genet. 7:386-392.

Muro S., Rodríguez-Pombo P., Pérez B., Pérez-Cerdá C., Desviat, W.

Sperl L.R., Skladal D., Sass J. O. and Ugarte M. (1999) “Identifacation of

novel mutations in the PCCB gene in European Propionic Acidemia

Patients”. Hum. Mut. Mutation in Brief 253. On Line.

Ugarte M., Pérez-Cerdá C., Rodriguez-Pombo P., Desviat L.R., Pérez B.,

Richard E., Muro S., Campeau E., Ohura T. (1999)“An overview of mutations

in the PCCA and PCCB genes causing propionic acidemia”, R.A. Gravel.

Hum. Mut. 14:275-282.

Martínez-Pardo M., Suares L., Díaz M.C. y García M.J. (1999) “Enfermedades

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Merinero B., Pascual Pascual S.I., Pérez-Cerdá C., Gangoiti J., Castro M., García

M.J., Pascual Castroviejo I., Vianey-Saban C., Andresen B., Gregersen N., Ugarte

M. (1999) “Adolescent myopatic presentation in two sisters with very long-chain

acyl CoA dehydrogenase deficiency”. J. Inher. Metab. Dis. 22:802-810

Pérez B., Desviat LR., Martínez-Pardo M., Garcia MJ. y Ugarte M. (1999)

“Fenilcetonuria:30 años de investigación y prevención”. Premio Real

Academia de Farmacia 1998. Anales de la Real Academia de Farmacia,

65:271-304.

Pérez- Cerdá C., Merinero B., Rodriguez-Pombo P., Pérez B., Desviat

LR., Muro S., Richard E., García MJ, Gangoiti J., Ruiz-Sala P., Sanz P.,

Briones P., Ribes A., Martinez-Pardo M., Campistol J.,Perez M., Lama R.,

Murga ML, Lema T.-Garret A. Verdu and Magdalena Ugarte (2000) “Potencial

Relationship between genotype and clinical outcome in propionic acidemia

patients. Eur J Hum Genet 8:187-194.

Muro S., Pérez B., Rodríguez-Pombo P., Desviat L.R., Pérez Cerdá C. y

Ugarte M. (2000) “Mutations affecting the β−βhomomeric interaction in

propionic acidaemia: An approach to the determination of the β−propionil

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Gámez A., Pérez B., Ugarte M. and Desviat L.R. (2000) “Expression

analysis of phenylketonuria mutations. Effect on folding and stability of the

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Busquets C., Merinero B., Christensen E., Gelpí J., Campistol J., Pineda

M., Fernández-Alvarez E., Prats J., Sans A., Arteaga R., Martí M., Campos

J., Martínez-Pardo M., Martínez-Bermejo A., Ruiz-Falcó ML., Vaquerizo

J., Orozco M., Ugarte M., Coll M.J., Ribes A. (2000) “Glutaryl-CoA

dehydrogenase deficiency in Spain: Evidence for two groups of patients,

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Ulla Rüetschi, Roberto Cerone, Celia Pérez-Cerdá, Maria Cristina Schiaffino,

Sue Staanding, Magdalena Ugarte, Elisabeth Holme. (2000) “Mutations

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Tesis Doctorales/ Doctoral theses

Silvia Muro Galindo “Caracterización molecular delgen PCCB. Análisis y expresión de mutacionescausantes de Acidemia Propiónica”. UniversidadAutónoma de Madrid. Sobresaliente “Cum Laude”.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Nuestro equipo tiene centrado su interés,

desde su creación como línea

independiente, en el análisis, bajo

diversas aproximaciones moleculares, de

dos importantes procesos celulares en

bacterias, como son la septación durante

la división celular, y la aparición de los

diversos mecanismos de resistencia a

antibióticos β-lactámicos. Una gran parte

de los enzimas implicados en estos

procesos se encuentran agrupados en un

cluster denominado dcw (division and cell

wall), donde se incluyen, entre otros, los

genes mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3),

ftsW y ftsZ. El estudio de la regulación de

la expresión de estos genes del cluster y

la determinación funcional de MraW en

Escherichia coli son dos aspectos que

hemos desarrollado en este periodo.

Además, hemos ampliado el estudio a una

serie de estirpes patógenas en humanos y

de interés medioambiental, tales como

Shigella, Salmonella, Pseudomonas,

Mycoplasma y Thermus, con vistas a ser

utilizados como dianas para la búsqueda y

desarrollo de nuevos antimicrobianos

La proteína FtsZ es un componente

esencial del anillo septal para la división

bacteriana. Este anillo, con estructura que

presenta analogías al citoesqueleto

eucariota, parece ser un componente

universal para el mecanismo de división.

Dado que Acholeplasma laidlawwii tiene

todas las características de la célula

procariota mínima y algunos de los

procesos de las bacterias con envoltura,

es un modelo prometedor para el estudio

de los principios básicos del proceso de

división. En este periodo hemos iniciado el

estudio de esta proteína en este

microorganismo.

Tras la publicación de la secuencia

completa del genoma de Escherichia coli

se ha hecho patente la presencia de

genes parálogos para las PBPs no

previamente identificados por estudios

bioquímicos. Uno de estos genes codifica

para la β-lactamasa cromosómica de tipo

C (ampC), que no está presente en

Salmonella, en contraste con otros

miembros de la familia

Enterobacteriaceae, como Escherichia,

Citrobacter, o Enterobacter. Hemos

analizado esta proteína desde el punto de

vista génetico, enzimático y fisiológico, y

encontrado evidencia de la actividad

enzimática y de la implicación en el

proceso de invasión celular.

El peptidoglicano septal se sintetiza por la

proteína PBP3, que aporta la actividad

transpeptidasa (crosslinking) asociada a

otra proteína, posiblemente PBP1B, que

aporta la actividad transglicosilasa

(elongación de cadena). A pesar de los

esfuerzos de varios grupos para la

cristalización y determinación de la

estructura de estas proteínas, aun no se

han conseguido resultados positivos. No

obstante hemos avanzado en el

conocimiento de la estructura modular y

funcionalidad de cada dominio.

Los logros esenciales en los dos últimos

años han sido: 1.- Mejor definición como

gen esencial para mraW del cluster dcw

de Escherichia coli. 2.-Identificación de los

productos metilados por la actividad metil-

transferasa de la proteína MraW. 3.-

Caracterización del gen ftsZ de

Acholeplasma laidlawii y de su producto

génico. 4.- Purificación y caracterización

de los dos módulos catalíticos, glicosil-

transferasa y acil-transferasa, de la

proteína PBP1b polimerizadora de

peptidoglicano de la pared de Escherichia

coli. 5.- Análisis del coste biológico que

supone la producción de la proteína AmpC

para la supervivencia intracelular de

Salmonella enterica serotipo Typhimurium

Personal Científico / ScientificPersonnel:Juan Alfonso Ayala Serrano

Becarios Predoctorales /GraduateStudents:Julian Alberto FerrerasGuillermo Cobas PupoJose di ConzaBeatriz Lara ArnaudSilvina Sara DongarráAlfonso Alexander AguileraJenny Dussan Garzón

Técnicos de Investigación /Technical Assistance:Juliana de la RosaJose Manuel Rodríguez VadilloRodrigo Guardián Sevilla

Científicos visitantes / VisitingScientist:Dr. Sergei Borksenious (Academia Rusade Ciencias, San Petersburgo, Rusia)Dr. Gabriel Gutkind (Universidad BuenosAires, Argentina)Bouli Ali Diallo (Universite de Niamey,Niger)Felipe Fernández Cuenca (Universidadde Sevilla)Alma Hernández de Rojas (InstitutoProductos Lacteos, Oviedo)Dr. Claudine Parquet Universite deParis-Sud, Francia)Paz Bellido Armenteros (Universidad deNavarra)Jose Bravo (University of California,Irvine)

E.12

110

División Celular Bacteriana y Resistencia aAntibióticos

Relación de homologías entre las distintas PBPs de Salmonella Typhi. Los números

indican el puntaje obtenido con la utilización del programa BLASTA. La ausencia de

flecha entre dos proteínas indica un valor de E mayor de 2e-10.

Homology relationship among the different PBPs of Salmonella Typhi. The numbers

indicate the radio values obtained by the BLASTA program. Absence of an arrow

between two proteins indicates a value of E higher than 2e-10.

Bacterial Cell Division and AntibioticsResistance

Research Summary

Our main interest, from the initial step as

an independent group, is the analysis under

diverse molecular approaches of two

important cellular processes in bacteria,

i.e. septation during cell division and the

appearance of different resistance

mechanisms to β-lactam antibiotics. Most

of the gene coding for these enzymes

involved on these processes are grouped

in a so called dcw cluster (division and cell

wall), that include, among others, the genes

mraZ, mraW, mraR, pbpB (PBP3), ftsW

and ftsZ. The study of the regulation of the

expression of these genes, and the

functional characterization of the MraW

protein has been two aspects with special

emphasis during this period. Also, we have

extended this type of studies to pathogenic

and environmental strains, as Salmonella,

Shigella, Pseudomonas, Mycoplasma and

Thermus, which will allow the search and

development of new antimicrobial agents.

The FtsZ protein is an essential

component of the bacterial cell division

ring. This cytoskeleton-like ring is

believed to be the universal way of

bacterial division. Acholeplasma laidlawii

possesses all features of the minimal cell

and some traits of cell-wall bacteria and

seems to be a promising object for study

of basic principles of the bacterial division

process. In this period we have started

the analysis of this protein in this model

microorganism.

After the complexion of the Escherichia

coli genome sequence, it has become

apparent that some paralogous PBP

genes have not been identified previously

by the biochemical methods. One of

these genes codes for a chromosomal

type C β-lactamase, which is not present

in Salmonella, in contrast with other

members of the Enterobacteriaceae

family, i.e. Escherichia, Citrobacter or

Enterobacter. We have analyzed this

protein from the genetic, enzymatic and

physiological point of view, and we have

found evidence for the enzymatic activity

and the involvement on the cellular

invasion process.

Septal peptidoglycan is synthesized by

the penicillin-binding protein PBP3. This

protein holds the transpeptidase activity

(crosslinking) in the C-terminal domain,

and associates with another protein,

probably PBP1B, which supplies the

transglycosylase activity (chain

elongation). In spite of the big effort of

several groups to crystallize and to

determine the 3D structure of these

proteins, there are no positive results.

However, we have advanced on the

knowledge of the modular structure and

functionality of each domain of both

proteins.

Our main achievements in the last two

years were: 1.-Further characterization of

mraW, as an essential gene at the dcw

cluster of Escherichia coli. 2.-.

Identification of the methylated product

by the methyltransferase activity of the

MraW protein. 3.- Characterization of

Acholeplasma laidlawii ftsZ gene and its

gene product. 4.- Characterization of the

two catalytic, glycosyl transferase and

acyl transferase, modules of the cell wall

peptidoglycan polymerizing penicillin-

binding protein 1b of Escherichia coli. 5-

Analysis of the biological cost of AmpC

production for Salmonella enterica

serotype Typhimurium

111

Publicaciones /Publications:

Carrión M., M. Gómez, R. Merchante-Schubert , S.

Dongarrá and J.A. Ayala*. 1999. mraW, an essential gene

at the dcw cluster of Escherichia coli codes for a

cytoplasmic protein with methyltransferase activity.

Biochimie 81: 879-888.

Kukelova A.V., A. Yu. Malinin, J.A. Ayala* and S.N.

Borchsenius 1999. Characterization of Acholeplasma

laidlawii ftsZ gene and its gene product. Biochem. Biophys.

Research Comm. 262(1): 44-49.

Terrak M., T.K. Gosh, J. van Heijenoort, J. Van Beeumen,

M. Lampilas, J. Aszodi, J.A. Ayala, J.M. Ghuysen and M.

Nguyen-Distèche 1999. The catalytic, glycosyl transferase

and acyl transferase, modules of the cell wall peptidoglycan

polymerizing penicillin-binding protein 1b of Escherichia

coli. Mol. Microbiol. 34(2): 350-364.

Morosini M.I., J.A. Ayala, F. Baquero, J.L. Martínez and J.

Blázquez. 2000. Biological cost of AmpC production for

Salmonella enterica serotype Typhimurium. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy. 44(11): 3137-3143.

Tesis Doctorales/ Doctoral Thesis

Título: Actividad transglicosilasa del dominio B de la

penicillin-binding protein 3 y su proteína helper FtsW en

Escherichia coli Beatriz Lara Arnaud, Facultad de

Ciencias, Departamento de Biología Molecular,

Universidad Autónoma de Madrid 1999.

SOBRESALIENTE CUM LAUDE

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Durante los dos años anteriores hemos

centrado el trabajo de nuestro grupo de

investigación tanto en aspectos básicos de

la biología de Thermus thermophilus, como

en aplicaciones biotecnológicas de enzimas

y sistemas reguladores de expresión génica

de este organismo. En su vertiente básica,

hemos continuado nuestros estudios sobre

la regulación de la expresión del gen de la

capa S (slpA) y en el análisis del

agrupamineto génico para la respiración

de nitrato (nar), localizado en un plásmido

conjugativo autotransferible.

En el primer tema, hemos determinado

que las proteínas SlrA y SlpM, implicadas

en la regulación transcripcional de slpA,

pueden ser secretadas a través de la

membrana al igual que la proteína que

regulan. También hemos confirmado in vivo

la implicación de secuencias no traducidas

de slpA en su regulación transcripcional

y traduccional mediante el aislamiento de

mutantes de deleción en estas regiones.

Respecto al agrupamiento nar hemos

confirmado la cotranscripción de 7 genes

desde un promotor (Pnar), regulado por

nitrato y anoxia, en vez de los 4 que

aparecen en el resto de los organismos

analizados hasta ahora. Nuestros datos

demuestran que los dos últimos genes del

agrupamiento funcionan como

antiportadores nitrato/nitrito mutuamente

reemplazables in vivo. Actualmente estamos

analizando el posible papel del primer gen

del operón, un citocromo C dihemo

periplásmico, en la regulación por oxígeno

de este promotor.

A nivel aplicado, hemos transferido al sector

privado varias enzimas termoestables

purificadas (chaperoninas, pirofosfatasas,

DNAligasas) y plásmidos de clonaje y/o de

expresión para Thermus sp. Para el

desarrollo de éstos, hemos empleado

replicones autónomos aislados y

caracterizados por nuestro grupo, y

elementos de control de la expresión

obtenidos de los trabajos en biología básica

de T. thermophilus anteriormente

comentados. Uno de nuestros objetivos

prioritarios en este campo consiste en el

desarrollo de sistemas de expresión

termófilos que pudieran ser empleados

como factoría celulares para la expresión

de enzimas termófilas complejas.

Jefe de Línea / Group Leader:

José Berenguer

Becarios Predoctorales /

Graduate Students:

Cristina Vallés,

Pablo Castán,

Renata Moreno,

Felipe Cava (desde Octubre del 99),

Olga Zafra (desde Octubre del 99),

Edy Caro (desde Enero de 2000),

Martin Eckar (Noviembre a

Diciembre de 2000).

E.13

112

Biotecnología y genética de bacterias termofilasextremas

Micrografía confocal de los cuerpos multicelulares (MB’s) formados en mutantes de expresión de la capa S.

La detección se llevó a cabo in situ con un sustrato fluorogénico de una fosfatasa alcalina. El interior libre

de células de cada MB es equivalente al espacio periplásmico de bacterias Gram negativas.

Confocal microscopy micrograph of multicellular bodies (MB’s) from S-layer expression mutants of Thermus

thermophilus. The image was obtained by using a fluorescent substrate from thermostable alkaline phosphate

engineered to be overexpressed in the mutant. The intercellular space within each MB is functionally equivalent

to the periplasmic space of Gram negative bacteria.

Biotechnology and genetics of extremethermophilic bacteria

Research Summary

In the last two years we have focused

our work on both, basic research projects

on the biology of Thermus thermophilus,

and biotechnological applications of

enzymes and gene expression systems

for this microorganism. On the basic side,

we have continued our work on the

regulation of the gene encoding the S-

layer protein (slpA) and on the analysis

of the gene cluster for nitrate respiration

(nar), which is included in a self-

transferable conjugative plasmid.

In the first topic, we have demonstrated

that the SlrA and SlpM proteins, which

are implicated in the transcriptional

regulation of slpA, can be secreted

through the membrane as the protein

which expression they regulate does.

Also, we have confirmed the implication

of untranslated sequences of slpA in its

transcriptional and translational regulation

in vivo through the isolation of adequate

deletion mutants.

In relation to the nar cluster, we have

confirmed the co-transcription of 7 genes

from a nitrate and anoxia regulated

promoter (Pnar) instead of the 4 which

are found in all the microorganisms so

far studied. Our data demonstrate that

the last two genes of this cluster function

as nitrite/nitrate antiporters which can

replace each other in vivo. At present, we

are analyzing the putative implication of

the first gene of the nar operon, which

encodes a periplasmic di-heme

cytochrome C, in the regulation by oxygen

of its promoter.

From the applied point of view, we have

transferred to a private company different

thermophilic enzymes (chaperonins,

pyrophosphatase, DNA-ligase) and

plasmids for cloning and/or expression

in Thermus sp. For the development of

these plasmids, we have used

autonomous replicons isolated and

characterized by our group, and elements

for the control of the expression which

were obtained from the basic work above

commented. One of our priority objectives

on this field is the development of a

thermophilic expression system that could

be used as cell factory for the production

of complex thermophilic enzymes.

113

Publicaciones /Publications:

de Grado, M., Castán, P. y Berenguer J. (1999). A

high-transformation efficiency cloning vector for

Thermus thermophilus. Plasmid, 42: 241-245.

Fernández-Herrero, L. A. y J. Berenguer. (2000). Secretion

and assembly of regular surface structures in Gram-

negative bacteria. FEMS Microbiol. Rev, 24: 21-44

Ramírez, S., Moreno, R., Zafra, O., Castán, P., Vallés.

C., y J. Berenguer. (2000). Two nitrate/nitrite transporters

are encoded within the mobilizable plasmid for nitrate

respiration of Thermus thermophilus HB8. J. Bacteriol.

182: 2179-2183

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

El objetivo general de nuestra línea de

investigación es el estudio a nivel

molecular de la expresión génica

específica de tejido en células humanas.

Nuestro sistema modelo principal lo

constituye el gen humano HGH-N que se

transcribe específicamente en la hipófisis

anterior y que se localiza en el

cromosoma 17q23.3 dentro del locus

"HGH-HPL". A este locus pertenecen

genes que comparten una gran homología

de secuencia pero que se transcriben en

tejido placentario: HGH-V, HPL-3 y HPL-4.

Asimismo, hemos iniciado el estudio de

los mecanismos de restricción especifica

de tejido de otro locus génico humano:

"HLH-HCG", localizado en el cromosoma

19q13.3 y que también presenta un patrón

de expresión tisular semejante: hipófisis

vs placenta. Para ello se están analizando

las regiones promotoras y enhancers de

estos genes, identificando los elementos

que confieren restricción de expresión

específica de tejido, así como la

purificación de los factores de

transcripción que las regulan.

Otra área de desarrollo dentro de nuestra

línea de investigación, es la puesta a

punto de técnicas de análisis de expresión

diferencial de mRNAs: "Differential

Display RT-PCR" y DNA Microarrays" que

nos ha permitido establecer dos nuevos

objetivos:

(1) Identificación y clonaje de genes

específicamente expresados en tumores

hipofisarios humanos, que nos permitirán

profundizar en los mecanismos

moleculares de expresión génica

hipofisaria, así como en el desarrollo de

nuevos marcadores de progresión tumoral

hipofisaria.

(2) Identificación y caracterización de

genes específicamente expresados en

tejido endometrial humano durante la

"ventana" de implantación, para clonar

nuevos genes marcadores de

implantación embrionaria.

Jefe de Línea / Group Leader:

José Luis Castrillo Díez

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Oscar Jiménez-Mateo

Becarios Predoctorales /

Graduate Students:

Silvia Avila Flores

Olga Bassy Alvarez

Martha Díaz Gallardo

Job García Liévana

Angelina Rodríguez Torres

Marina Romero Prado

E.14

114

Regulación de la expresión génicaespecífica de tejido

DNA Microarrays

El patrón de expresión génica específico en células deendometrio humano, se estudió utilizando sondas cDNAsmarcadas con 33P a partir de RNA total de células deendometrio humano. Los filtros de cDNAs (porción)humanos incluyen duplicados para cada cDNA. Nosotroshemos analizado simultáneamente la expresión de 375genes humanos en endometrio humano receptivo y no-receptivo. Los filtros fueron expuestos (phosphor screen)y mediante análisis densitométrico, se estudió el patrónde expresión génico diferencial.

DNA microarrays

Gene expression profiling using 33P-labeled cDNAprobes prepared from total RNA of human endometrialcells. The Atlas Arrays shown here (portion) includeduplicate spots of each cDNA. We have analyzed thedifferential expression of 375 human cDNAs in receptiveversus non-receptive human endometrium. Themembranes were exposed to a phosphor screen andthe differential gene expression patterns were analyzedby densiometric analysis.

Regulation of the tissue-specific geneexpression

Research Summary

The overall goal of this project is to

study at molecular level the tissue-

specific gene expression in human cells.

Our working model is the human growth

hormone gene (HGH-N) specifically

transcribed in the anterior pituitary and

mapped at chromosome 17q23.3 in the

"HGH-HPL" locus. This is a gene-cluster

with other four closely related genes

(HGH-V, HPL-3 y HPL-4), but

specifically transcribed in placenta

tissue. In addition, we started the study

of the tissue-specific transcriptional

control of the human "HLH-HCG" locus,

located at chromosome 19q13.3, and

also expressed in pituitary or placenta

tissues. We are analyzing the promotor

and enhancer regions, identifying the

cis-DNA elements, and cloning the

transcription factors involved in the

tissue-specific transcriptional control.

A new area of research and

development in our laboratory, is to set-

up new approaches to study differential

expression of mRNAs: DD-RTPCR and

DNA Microarrays techniques. We are

involved in two new goals: (1)

Identification and cloning of genes

specifically expressed in human

pituitary tumours. This approach can

lead us to improve our understanding of

pituitary gene-expression control, and

use this knowledge to develop new

therapeutic agents; (2) Identification of

genes diferentially expressed in

receptive versus non-receptive human

endometrium. Using two cell lines with

extreme receptive phenotype and

screening genome-wide gene

expression using DNA Microarrays and

DD-RTPCR, we are finding new genes

involved in the receptive or non-

receptive status. This approach can

lead us to improve our understanding of

endometrial receptivity and use this

knowledge to optimize it in infertility

patients or to alter it as an interceptive

procedure.

115

Publicaciones /Publications:

Castrillo, J.L. and Barrera-Saldaña,H.A. (1999) "El gen

HGH-N y su regulacion hipofisaria". Ciencia, 1 (4) 333

Castrillo,J.I., Dueñas,M., Bassy,O., Castrillo,J.L. and

Ugalde,U. (1999) "Use of Aspergillus Nidulans amds

gene as a dominant selectable marker in non-

conventional Kluyveromyces yeasts" Current Genetics,

35 (3-4), 447

Valin, A., Cosano, J., Castrillo, J.L. And Esbrit, P. (1999)

"Parathyroid hormone-related protein [107-139]

induces c-Fos expression and AP-1 activity in

osteoblastic osteosarcoma UMR-106" Bone, 23, 14

Martínez-Conde, A., Mayor, P., García-Uría, J.,

Castrillo, J.L. And Jiménez, O. (2000) "A new mRNA

homologous to 60-Kd Ss-A/Ro/RNPAA mRNA is highly

expressed in a GH producing human pituitary tumor" J.

Endocrinol.,167, 40

Martin, J., Avila, S., Jimenez, O., Mayor, P. Martínez, A.,

Pellicer, A., Castrillo, J.L. And Simon, C.(2000).

"Differential Gene Expression in high versus low

endometrial receptivity status" Fertility & Sterility, 74, 91

Jiménez, O., Martínez-Conde, A., García-Uría, J.,

Castrillo, J.L. And Mayor, P. (2000) "Mitochondrial genic

expression in GH-secreting pituitary tumors"

J. Endocrinol.,167, 41

Tesis Doctorales/ Doctoral Thesis

Ana Güell Ferré. "El factor de transcripción GHF-1/PIT-

1 y su interacción con los receptores nucleares de

hormonas". Abril-1999.

Differential display (DD-RT-PCR)

Geles de alta resolución DD-RT-PCR usando RNAstotales extraídos de tumores hipofisarios humanos y

analizados usando diferentes combinaciones de oligosespecíficos y aleatorios. Todas las reacciones DD-PCRsse realizaron y cargaron en duplicado para verificar sureproducibilidad. La representación diferencial de los

cDNSs permite detectar patrones específicos deexpresión génica. Nosotros hemos purificado 120 bandasexpresadas diferencialmente. Un 25% han sido clonadasy secuenciadas. Hemos identificado los genes mediante

análisis informático y estamos en la actualidadprofundizando en los estudios funcionales.

High resolution Differential Display (DD-RT-PCR) gelusing total RNAs from human pituitary tumors, analyzedwith different anchored and arbitary primer pairs. All DD-PCRs are run and loaded on the gel in duplicate to verifypattern reproducibility. Differential display of the cDNA

preparations shows distinct patterns of gene expression.We have currently purified 120 differentially expressedbands. Approximately 25% of them have been cloned

and sequenced. We are identifying the genes by computeranalysis before go forward with functional analysis.

Regulación de laexpresión génica

Regulation of geneexpression

Resumen de Investigación

Algunos mRNAs eucarióticos que son

traducidos en condiciones de estrés celular

agudo (apoptosis, infecciones virales, etc.)

contienen en su region 5´ no traducida

elementos que dirigen la entrada del

ribosoma a un codon de iniciación interno,

denominados IRES. Los objetivos de

nuestro grupo se han centrado en 1)

identificar regiones estructurales del IRES

del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y

hepatitis C (HCV) esenciales para su

actividad, 2) identificar interacciones del

IRES con proteínas celulares que reclutan

la maquinaria de traducción a las cercanías

del AUG iniciador, 3) determinar el valor

predictivo de la secuencia del IRES y NS5

en pacientes afectados de hepatitis C con

la respuesta al tratamiento combinado de

interferón y ribavirina, y 4) estudiar el

mecanismo de selección del AUG iniciador

de la traducción dependiente de IRES.

Estos estudios han sido claves para

entender la biología de los elementos IRES,

identificar regiones contra las que dirigir

drogas antivirales, así como potenciar el

uso de IRES en vectores de expresión

bicistrónicos.

La demostración de interacciones terciarias

RNA-RNA entre dominios del IRES de

FMDV in vitro, en condiciones que se

asemejan a las de una infección, tiene

implicaciones biológicas de gran relevancia.

El dinamismo encontrado en la formación

de estos complejos que depende de la

concentración de RNA, de la temperatura

y de las condiciones iónicas del ensayo,

sugiere que la eficiencia de traducción a lo

largo del ciclo infeccioso podría estar

modulada por cambios en la interacción

RNA-RNA entre dominios.

Recientemente hemos mapeado el sitio de

interacción de los factores de iniciación de

la traducción eIF4B y eIF4G en la región

3´ del IRES de FMDV. En particular, la

interacción de eIF4G es esencial para la

actividad del IRES, existiendo una

correlación perfecta entre caída de actividad

y pérdida de la interacción con eIF4G. Con

estos datos hemos propuesto un modelo

(Figura 1) por el que el IRES estaría

conectado directamente con eIF4G, que a

su vez interaccciona con eIF3 y éste con

la subunidad 40S del ribosoma.

JJefe de Línea / Group Leader:

Encarnación Martínez-Salas

Personal científico / Scientific Staff:

Ricardo Ramos Ruiz

Becarios Postdoctorales /

Postdoctoral Fellows:

Esther Lafuente Duarte

Sonia López de Quinto

(desde enero 2000)

Becarios Predoctorales / Graduate

Students:

Sonia López de Quinto

(hasta enero 2000)

Olga Fernández Miragall

Técnicos de laboratorio / Technical

Assistance :

Emilio Cano Cabezas

E.15

116

Iniciación interna de la traducción en mRNAseucarióticos.

Representación esquemática de las interacciones RNA-RNA y RNA-proteína

en el IRES de FMDV. eIF4G, eIF4B, eIF3 y eIF2 corresponden a los factores

de iniciación de la transducción; PTB, polypirimidin binding protein; 40S, la

subunidad pequeña del ribosoma.

Internal initiation of translation in eucarioticmRNAs

Research Summary

A subset of eukaryotic mRNAs which are

translated under acute cellular stress (viral

infections, apoptosis, etc., ) usually contain

long 5´untranslated regions, known as

IRES, involved in directing ribosomal entry

to an internal start codon. The research

interests of our group have been focused

to 1) the study of essential structural

regions in the IRES of foot-and-mouth

disease virus (FMDV) and hepatitis C

(HCV), 2) the identification of RNA-protein

interactions involved in the recruitment

of the translational machinery to the

vicinity of the start codon, 3) to determine

the predictive value of the HCV IRES

sequence as well as the NS5 region with

the response to the combined treatment

of interferon plus ribavirin, and 4) to

identify the parameters affecting start

codon selection in IRES-dependent

translation initiation. The results obtained

have provided new insights into the

biology of IRES elements, including the

identification of key regions that constitute

essential targets for antiviral drugs.

Additionally the understanding of IRES-

mediated translation is crucial to its use

in bicistronic expression vectors.

We have identified long-range RNA

interactions between separated domains

of the IRES in vitro, under conditions

which resemble the viral infection

environment. Complex formation was

dependent upon RNA concentration,

temperature and ionic conditions. The

dynamism observed in these interactions

may be of important biological relevance

to govern translational efficiency during

the changes in ionic conditions observed

along the viral infection cycle.

Recently we have mapped the interaction

site of the eukaryotic initiation factors

eIF4B and eIF4G in the 3´ region of the

FMDV IRES. Interestingly, the eIF4G-

IRES interaction is a key determinant of

IRES activity, as shown by the correlation

between eIF4G interaction and IRES

activity in FMDV IRES mutants. In

agreement with these results we have

proposed a working model to explain

IRES-dependent translation initiation

(Figure 1). In essence, the eIF4G protein

binds directly to the RNA sequence of the

IRES element and to eIF3, which in turn

is linked to the 40S ribosomal subunit.

117

Publicaciones /Publications:

López de Quinto S. and Martínez-Salas, E. (1999).

"Involvement of the aphthovirus RNA sequence located

between both functional AUGs in start codon selection".

Virology 255, 324-336

Martínez-Salas, E. (1999). "Internal ribosome entry site

(IRES) biology and use in gene expression vectors". Curr.

Opin. Biotechnol. 10, 458-464

Ramos, R., and Martínez-Salas, E. (1999) "Long-range

interactions in aphthovirus internal ribosome entry site

elements". RNA 5, 1374-1383

Sáiz, J-C., López de Quinto, S., Ibarrola, N., López-

Labrador, F-X., Sánchez-Tapias, J-M., Rodés, J., and

Martínez-Salas, E. (1999). "Internal initiation of translation

efficiency in different hepatitis C genotypes isolated from

Interferon responder and non-responder patients". Arch.

Virol. 144, 1-15

Ibarrola, N., Moreno-Monteagudo, J.A., Sáiz, M., García-

Monzón, C., Sobrino, F., García-Buey, L., Iacono, O. L.,

Moreno-Otero, R., and Martínez-Salas, E. (1999).

"Response to retreatment with Interferon alpha plus

ribavirin in chronic hepatitis C is independent of the NS5A

gene nucleotide sequence". Amer. J. Gastroenterol. 94,

2487-2495

Martínez-Salas, E. López de Quinto, S., and R. Ramos.

(1999) "Requirement of structural motifs in the internal

ribosome entry site of picornavirus for translation initiation".

Recent Res. Dev. Virol. 1, 173-182

Bigeriego, P., Rosas, M.F., Zamora, E., Martínez-Salas,

E., and Sobrino, F. (1999). "Heterotypic inhibition of foot-

and-mouth disease virus infection by combinations of

RNA transcripts corresponding to the 5´ and 3´ regions"

Antiviral Res. 44, 133-141

López de Quinto S., and Martínez-Salas, E. (2000).

"Interaction of the eIF4G initiation factor with the

aphthovirus IRES is essential for internal translation

initiation in vivo". RNA 6, 1380-1392

Tesis Doctorales/ Doctoral Thesis

"Estudio de las bases moleculares de la iniciación interna

de la traducción en RNAs de picornavirus". Sonia López

de Quinto. Enero, 2000. Universidad Autónoma de Madrid.

Schematic representation of RNA-RNA and RNA-protein interactions in the

FMDV IRES. eIF4G, eIF4B, eIF3 and eIF2 depict translation initiation factors;

PTB, the polypirimidin binding protein; 40S, the small ribosomal submit.

CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR SEVERO OCHOA

Seminarios

Servicios Apoyo a lainvestigación

Lecciones conmemorativas

Seminaries

Research and SupportFacilities

2ooo

120

SeminariosSeminaries

199922 de EneroDr. Carlos Martínez Alonso (CentroNacional de Biotecnología, Madrid)"Control de la inflamación y la infecciónpor HIV.1 por las quimioquinas"

19 de FebreroDr. Peter Parker (Imperial CancerResearch Fund. London)"Dynamics of signal integration throughprotein kinase C"

12 de MarzoDr. Mariano Barbacid (Centro Nacionalde Investigaciones Oncológicas. Madrid)"Análisis genético del ciclo celular in vivo"

21 de AbrilDr. Guido Kroemer (Centre National dela Recherche Scientifique. Paris)"Mitochondrial control of apoptosis"

30 de AbrilDr. Marino Zerial (European MolecularBiology Laboratory. Heidelberg. Alemania)"Regulation of endocytic membrane trafficby rab GTPases"

7 de MayoDr. Martin Raff (MRC Laboratory forMolecular Cell Biology. London)"Timing and cell number control in neuraldevelopment"

14 de MayoDr. Norbert Perrimon (Harvard MedicalSchool. Boston)"The role of heparan sulfate proteoglycansin Drosophila growth factors signaling"

18 de JunioDr. Sergio Moreno (Instituto deMicrobiología-Bioquímica. Salamanca)"Regulación de la entrada y salida delciclo celular: proliferación versusdiferenciación"

1 de OctubreDr. Julien Downward (Imperial CancerResearch Fund, London)"PI 3-kinase, At/PKB and Ras signallingpathways involved in the control of cellproliferation and survival"

19 de OctubreDr Ricardo Miledi (University ofCalifornia, Irvine, USA)Premio Príncipe de Asturias 1999"Ovocitos de rana y receptores GABAc"

3 de DiciembreDr. Luis Serrano (European MolecularBiology Laboratory. Heidelberg )"Diseño automático de proteínas"

200021 de EneroDr. Michael Reth ( Inst i tut fuerImmunobiologie, Freiburg)"The B cell antigen receptor: its structureand signalling function"

4 de FebreroDr. Philippe Sansonetti (Institut Pasteur,París)"The use of molecular and cellular biologyto decipher invasion signals of theintestinal epithelium by Shigella"

3 de MarzoDr. Denis Duboule (Facultad de Ciencias,Universidad de Ginebra, Ginebra)"Function and regulation of mammalianHox genes: a genetic approach"

31 de MarzoDr. Paul Nurse (Imperial CancerResearch Fund, London)"Controlling cell shape in fission yeast"

14 de AbrilDr. Ernst Hafen (Universität Zürich,Zürich)"Insulin signaling and size control inDrosophila"

28 de AbrilDr. Juan Lerma (Instituto Cajal, Madrid)"Fisiopatología de los receptores dekainato: ¿Un enigma resuelto?"

19 de MayoDr. Carlos López Otín (Facultad deMedicina, Universidad de Oviedo)"Análisis de la diversidad funcional deproteasas implicadas en la progresióntumoral"

2 de JunioDr. Tulio Pozzan (University of Padova,Padova)"Spatio temporal aspects of secondmessenger levels in living cells"

17 de NoviembreDr. Bernard Mal issen (Centred'Immunologie, INSERM-CNRS deMarseille-Luminy, Marsella)"Molecular dissection of T cell recognition:from crystals to gene knock-out"

1 de DiciembreDr. Eduardo Soriano (Facultad deBiología, Universidad de Barcelona)Premio Jaime I de Investigación 2000"Factores celulares y moleculares queregulan el desarrollo de conexionesneuronales en el hipocampo"

SEMINARIOS SEVERO OCHOAAVANCES EN BIOLOGÍA MOLECULAR

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SeminariosSeminaries

1999Baro, Arturo M. (Departamento deFísica de la Materia Condensada,Universidad Autónoma de Madrid,Madrid)"La microscopía de proximidad: unatécnica para promover la aproximaciónentre físicos y biólogos"

Berenguer, José (Centro de BiologíaM o l e c u l a r " S e v e r o O c h o a " ,Universidad Autónoma de Madrid,Madrid)"El crecimiento anaeróbico comopropiedad transferible entre bacterias"

Cáceres, Alfredo (Inst i tuto deInvestigación Médica. Mercedes yMartín Ferreyra, Córdoba, Argentina)"Expresión y función de KIF2 en neuronasen desarrollo"

Campuzano, Sonsoles (Centro deBiología Molecular "Severo Ochoa",CSIC-UAM, Madrid)"Drho GAP, un nuevo componente delsistema de transducción de señalesmediado por las Rho GTPasas"

Casares, Fernando (Department ofB iochemis t r y and Mo lecu la rBiophysics, University of Columbia,New York)"Regulación y función del gen dehomothorax en la articulación (HINGE)del ala de Drosophila"

Doskeland, Stein Ove (Department ofAnatomy and Cell Biology, Universityof Bergen, Bergen)"cAMP-kinase and CaM-kinase II:regulation and role in apoptosis"

García Hegardt, Fausto (Facultad deFarmacia, Universidad de Barcelona,Barcelona)"El gen COT: un modelo de trans splicingen mamíferos"

Gutiérrez-Ramos, José Carlos(Millenium Pharmaceuticals, Boston)"Activación y migración de células TH2al pulmón en el asma"

Harsman, Keith (Department ofImmunology and Oncology, CentroNacional de Biotecnología, UniversidadAutónoma de Madrid, Madrid)"DNA microarrays: techniques andapplications"

Hershfield, M.S. (Department ofMedicine, Duke University MedicalCenter, Durham)"Molecular basis of adenosine deaminaseand purine nucleoside phosphorylasedeficiency. Approaches to the therapy"

Izpisua-Belmonte, Juan Carlos (SalkInstitute, La Jolla, California)"How the body tells left from right andarm from leg"

Jochems, Gijs (Baxter, Division HylandImmuno, San Fernando de Henares,Madrid)"Nuevo sistema adenoviral para terapiagénica de la homofilia A"

Kirillov, S. (Institute of MolecularBiology, Universidad de Copenhagen,Copenhagen)"Intimate life of tRNA 3'end adenosine inthe Peptidyl Transferase Centre andElongation Models"

Lamas, Sant iago (Cent ro deInvestigaciones Biológicas, Madrid)"El óxido nítrico como regulador de laexpresión génica"

Larsson, Nils-Goran (Department ofMolecular Medicine Center forMolecular Medicine, KarolinskaHospital, Estocolmo)"Genetic studies of the function ofmitochondrial transcription factor A (Tfam)in the mouse"

Lawrence, Peter A. (M.R.C., Laboratoryof Molecular Biology, Cambridge)"Morphogenesis in the abdomen ofDrosophila"

Malaisse, Willy J. (Laboratorie deMedecine Experimentale, UniversitéLibre de Bruxelles, Bruxelles)"Insulinotropic action of nutrient esters"

Mann, Richard (Columbia University,Nueva York)"Control of hox function and appendagegrowth by homotorax"

M a r s h a k , D a n i e l R . ( O s i r i sTherapeutics, Inc., Johns HopkinsUniversity School of Medicine,Baltimore, Maryland)"Mesenchymal stem cells in regenerativemedicine"

Martin, Graig T. (University ofMassachusetts, Massachusetts)"A structural mechanistic model for theinitiation of transcription by T7 RNApolymerase"

Menéndez Arias, Luis (Centro deBiología Molecular "Severo Ochoa",Universidad Autónoma de Madrid,Madrid)"Transcriptasa inversa del virus de lainmunodeficiencia humana tipo 1:actividad polimerasa y fidelidad de copia"

Moreno, Edgardo (UniversidadNacional de Costa Rica, San José,Costa Rica)

"Invasión de células animales por BrucellaAbortus: genes bacterianos versusGTPasas controladoras del tráficointracelular"

Muñoz, Victor (University of Maryland,College Park, Maryland)

"Estudio del plegamiento de proteínascon un abordaje multidisciplinar"

CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR"SEVERO OCHOA"

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Naranjo, José Ramón (InstitutoCajal del CSIC, Madrid)"Regulación transcripcional directapor calcio: desrrepresión mediadapor DREAM"

Nierhaus, Knud H. (Max PlanInstitut, Berlin)"Identification of the tRNA bindingsites on the ribosome: structural factsand functional constrains"

Nuñez de Castro, Ignacio(Departamento de Bioquímica yBiología Molecular, Facultad deCiencias, Universidad de Málaga,Málaga)"¿Actúa la glutaminasa a la manerade un protooncogén?"

Peláez, Fernando (Merck Shapp &Dohme de España, Madrid)"Descubrimiento de una moléculacon propiedades miméticas deinsulina in vitro y con actividadantidiabética en ratones"

P o z o , J u a n C a r l o s d e l ,(Department of Biology, IndianaUniversity, Indiana)"La ruta de la ubiquitina y RUB1: unnuevo mecanismo de respuestahormonal"

Riesgo Escovar, Juan (Centro deNeurobiología, UniversidadNacional Autónoma de México,México)"La vía de la quinasa de JUN enDrosophila"

Rodés Teixido, Joan (HospitalClínico, Facultad de Medicina,Universidad de Barcelona,Barcelona)"Bases fisiopatológicas para eltratamiento racional de la peritonitisbacteriana espontánea en la cirrosishepática"

Roossinck, Marilyn J. (The S.R.Noble Foundation, Ardmore,Oklahoma)"Exploring the mechanisms of RNAvirus evolution using plant viruses"

Rudomin, Pablo (Centro deInformación y de EstudiosAv a n z a d o s d e l I n s t i t u t oPolitécnico Nacional, México)"Control selectivo del flujo deinformación en las colateralesintraespinales de las f ibrassensoriales de la médula espinal"

Ruiz i Altaba, Ariel (SkirballInstitute, New York UniversityMedical Center, Nueva York)"Hedgehog y gli en el desarrollo delcerebelo"

Salmerón, Andrés (MRC. Mill Hill.,Londres)"Función de la quinasa TPL-2 en laregulación del factor de transcripciónNFB"

Sánchez Ron, José Manuel(Department de Física Teórica,Universidad Autónoma de Madrid,Madrid)"Física y fisiología en el siglo XIX: elcaso de Helmholtz"

Sonenberg, Nahum (Departmentof Biochemistry, Mc Gill University,Montreal)"Translation initiation factors in controlof gene expression, cell growth andtumorigenesis"

Ulloa, Luis (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, NuevaYork)"Mecanismos de transducción deseñal de TGF-b y sus alteracionespatologicas"

Vandekerckhove, Joel (Centro deBiotecnología de Flanders,Universidad de Gent, Gantes)"Rápida identif icación de loscomponentes del proteoma mediantetécnicas MALDI, TOF y MSoperativas en el rango atomolar"

Verdaguer Massana, Nuria (Centrode Investigación y Desarrollo,CSIC, Barcelona)"Estructura y antigenicidad del virusdel resfriado común, serotipo 2"

Wandosell, Francisco (Centro deBiología Molecular "SeveroOchoa", Universidad Autónomade Madrid, Madrid)"Regulación de la elongación yretracción axonal"

2000Bass, Peter (Universi ty ofWisconsin, Medical SchoolMadison, Wisconsin)"Microtubules and neuronal polarity:lessons from mitosis"

Baxt, Barry (Plum Island, AnimalDisease Center, Nueva York)"Characterization of the receptor forvirulence of foot-and-mouth diseaseviruses, the integrin V-ß3"

Borycki, Anne-Gaelle (Universityof Sheffield, DevelopmentalGenetic, Sheffield)"Control of SHH response by WNTsignalling during somitogenesis"

Botas, Juan (Departments ofMolecular and Human Geneticsand Molecular and CellularBiology, Baylor College, Houston)"Drosophila como sistema modelopara estudiar enfermedadesneurodegenerativas"

Burhans, William (DepartmentCancer Genetics, Roswell ParkCancer Institute, Buffalo)"Targeting of DNA replication originsby antitumor drugs"

Cáceres, Javier F. (MRC HumanGenet ics Uni t , Edinburgh,Scotland)"Señales de stress y regulación desplicing alternativo"

Casanova, Jordi (Centro deInvestigación y Desarrollo, CSIC,Barcelona)"Transducción de señal y represióntranscriptional en el embrión deDrosophila"

Clevenger, Charles V. (Departmentof Phatology and LaboratoryM e d i c i n e , U n i v e r s i t y o fPennsylvania Medical Center,Philadelphia)"Novel mechanisms of prolactintransduction"

Cribbs, David (Centre de Biologiedu Développement, CNRS,Toulouse)"Dissecting homeotic function inDrosophila segment and cell identify"

Enrich, Carlos (Facultad deFarmacia , Un ivers idad deBarcelona, Barcelona)"Implicación del compartimentoendocítico en la transducción deseñales"

Galliot, Brigitte (Department ofZoology and Animal Biology,University of Geneva, Suiza)"Hydra, a model system foru n d e r s t a n d i n g a n c e s t r a ldevelopmental mechanisms andregeneration"

García-Marvizón, Juan Carlos(Neuroenteric Disease Program,CURE: Digest ive DiseasesResearch Center, Department ofMedicine, UCLA, Los Angeles,California)"Internalización de los receptores desustancia P y de opiáceos en lafisiología del dolor"

Gebauer, Fátima (EuropeanMolecular Biology Laboratory,Heidelberg)"Translational control of dosagecompensation in Drosophila"

González-Gaitán, Marcos (Max-Planck Institut of Molecular CellBiology and Genetics, Goettingen)"Dpp: formación del gradiente"

Grbic, Miodrag (University ofWestern, Ontario)"Alien wasps and evolution ofdevelopment"

Kerridge, Stephen, IBDM, CNRS,Parc Scientifique de Luminy,Marseille)"Teashirt stories from flies and mice"

Lama, Juan (Department ofMedicine, UCSD, San Diego)"Modulación del receptor CD4 por elvirus de la inmunodeficienciahumana"

Le, Thuy (Depar tment o fBiochemical Genetic, Universityof California (UCSD), San Diego)"Multiple carboxilase deficiency"

Leitges, Michael (Max-Planck-Institut für Immunobiologie,Freiburg)"Approaches to investigate PKCfunction in vivo"

Malhotra, Vivek (Department ofBiology, University of California,San Diego)"Regulating the formation of transportcarrier from the Golgi apparatus"

Mankin, Alexander (Center forPharmaceutical biotechnology-M/C 870, University of Illinois,Illinois)"Peptidyl transferase with prostheticRNA: crippled but alive"

Martin, Paul (Department ofAnatomy and DevelopmentalBiology, University College,Londres)"Wound healing-Lessons from theembryo"

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Servicios deApoyo a laInvestigación

Animalario

Producción y mantenimiento de rata y ratón.

Producción y mantenimiento de estirpestransgénicas y genéticamente modificadasde ratón.

Manipulación animal con equipo deanestesia y campanas de gases.

Laboratorio para infección experimentalcon patógenos nivel P-2.

Celdas para trabajo con diversas especiesanimales.

Laboratorio de criopreservación deembriones y semen.

Fermentación

Equipo para cultivo y recolección demicroorganismos aerobios-anaerobios(fermentadores Chemup de 20 1 y Braunde 30 1).

Equipo para cultivo y recolección demicroorganismos extremófilos (Airlift de100 1 y un reactor agitado STR).

Equipo para fraccionamiento celular demicroorganismos.

Microscopía Electrónica

Preparación de muestras convencionalespara microscopía electrónica detransmisión: fijación química e inclusiónen Epon.

Criofijación en propano o etano líquidos.

Criosustitución e inclusión a bajatemperatura en Lowicryl (K4M, HM20).

Ultramicrotomía convencional.

Crioultramicrotomía.

Inmunomarcado post-inclusiónconjugados de oro coloidal.

Hibridación “in situ” a nivel ultraestructural.

Tinción negativa.

Microscopía de ácidos nucléicos.

Criosecado y criofractura.

Química de Proteínas

Síntesis de péptidos.

Control de calidad de péptidos sintéticosmadiante HPLC y espectrometría demasas.

Secuenciación de Edman de péptidos yproteínas.

Digestión de proteínas y aislamiento depéptidos mediante HPLC.

Análisis de péptidos y proteínas medianteespectrometría de masas tipo MALDI-TOF.

Análisis y secuenciación de péptidosnediante espectrometría de masas tiponanosprey-trampa iónica.

Secuenciación de DNA

Equipo para secuenciación (AppliedBiosystems), PCR y análisis de secuencia.

Los servicios del CBMSO disponende los siguientes equipamientos ytécnicas como apoyo directo a losgrupos de investigación.

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Animal Facility

Breeding and maintenance of rat andmouse.

Breeding and maintenance of transgenicand genetically modified mice.

Animal surgery and manipulation underanesthesia.

Laboratory for experimental infection withP-2 level pathogens.

Embryo and sperm criopreservationfacility.

Fermentation

Facilities for medium-scale growth andharvesting of aerobic microorganisms(Fermentors 20 1 Chemup and 30 1Braun).

Facilities for large scale growth and andharvesting of extremophiles (100 1 Airliftand a STR stirred reactor)

Cellular fractionation of microorganisms.

Electron Microscopy

Conventional processing of samples for“check spelling” of transmission electronmicroscopy.

Plunge cryofixation in liquid propane orethane.

Freeze-substitution and cryoembeddingin Lowicryls.

Conventional ultramicrotomy.

Cryoultramicrotomy.

Postembedding immunogold electronmicroscopy.

Ultrastructural “in situ” hybridization.

Negative staining.

Electron microscopy of nucleic acids.

Freeze-drying and freeze fracture.

Protein Chemistry

Peptide synthesis.

Quality control of synthetic peptides byHPLC and mass spectrometry.

Peptide and protein Edman sequencing.

Protein digestion and HPLC peptidepurification.

Peptide and protein analysis by

MALDI-TOF mass spectrometry.

Peptide and protein analysis andsequencing by nano-spray ion trap massspectrometry.

DNA sequencing

Equipment for DNA sequencing (AppliedBiosystems) and PCR analysis.

Researchand SupportFacilitiesThe following facilities andtechniques are regularly provided bythe Central Services of the CBMSOin direct support of research teams.

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LeccionesConmemorativas

1999-2000

VI Lección Conmemorativa Severo Ochoa

Dr. Joan Massagué

(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York)

"Control Celular por la red TGFß-Smad"

19 de Noviembre de 1999

VII Lección Conmemorativa Severo Ochoa

Dr. J. Schlessinger

(Dept. Of Pharmacology and the Skirball Institute and New YorkUniversity Medical Center)

"Cellular signaling by protein phosphorylation"

20 de Noviembre de 2000

I Lección Conmemorativa Eladio Viñuela

Ponentes:

Margarita Salas (CBMSO), José María Almendral (CBMSO),Antonio Alcamí, (Cambridge University), Jesús Avila (CBMSO),Rafael Blasco (INIA), Luis Enjuanes (CNB), Angel López Carrascosa(CBMSO), José López Carrascosa (CNB), Carlos López-Otín(Universidad de Oviedo), José A. Melero (Carlos III), EnriqueMéndez (CNB), Juan Ortín (CNB), Angel Pellicer (NYU), JavierRey (CIB), José M. Sogo (ETH), Nieves Villanueva (Carlos III),Rafael Yañez (MRC).

Conferencia Plenaria:

Manuel Perucho

(The Burnham Institute)

"Cáncer colorectal de la ruta mutadora"

15 de Febrero de 2000

CENTRO DE BIOLOGÍA MOLECULAR"SEVERO OCHOA"

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M a r t í n e z - A r i a s , A l f o n s o(Departamento de Zoología,Universidad de Cambridge,Cambridge)"Dos actividades del receptor Notchque coordinan señales durante eldesarrollo de Drosophila"

Méndez, Juan (Cold Spring HarborLaboratory, Nueva York)"Control de la replicación del DNAen células humanas"

Méndez, Raú l ( DepartmentM o l e c u l a r G e n e t i c s a n dMicrobiology, University ofMassachusetts, Medical CenterWorcester, Maryland)"Regulación de la traducción duranteel desarrollo temprano de Xenopus"

Milan, Marco (European MolecularBiology Laboratory, Heidelberg)"Regulación temporal de la actividadde apterous en el ala de Drosophila"

Muñoz, David (Servicio deNeurología, Hospital 12 deOctubre, Madrid)"Neuroinflamación en Alzheimer"

Nagata, Toshiyuki (University ofTokyo, Tokyo)"Genes involved in de-diferentiationof plant cells"

Nieto, Angela (Instituto Cajal, CSIC,Madrid)"La familia SNAIL durante eldesarrollo embrionario y la invasióntumoral"

Oppermann, Martin (Departmentof Immunology Georg-August-Universität-Göttingen, Göttingen)"Modulation of signal transductionthrough chemokine receptor CCR5pos t - t r ans l a t i ona l r ecep to rmodification"

P a l m i e r i , F e r d i n a n d o(Departimento Farmaco-Biologico,Universita' di Bari, Bari)"Identification of novel mitochondrialtransporters"

Parras Pardo, Carlos (IGBMC, C.U.de Strasbourg, Strasbourg)"Comparación de la función deMASH1 y neurogenina2 en laespec i f i cac ión de sub t iposneuronales"

P i m e n t e l - M u i ñ o s , F e l i p e(Department of Molecular Biology,Massachusetts General Hospital,Boston, Massachusetts)"Un interruptor molecular paraactivación o apoptosis en células T"

Pompa Minguez, Jose Luis de la(European Molecular BiologyLaboratory, Monterrotondo)"Señal ización intercelu lar ydeterminación de destinos en eldesarrollo embrionario del ratón"

Quin tana, Dav id (HarvardUniversity, Boston)"En busca del iniciador de lareplicación y del replicador del DNAhumano"

Ramón Cueto, Almudena (Institutode Biomedicina, CSIC, Valencia)"Recuperación funcional de ratasparapléjicas mediante trasplante deGlia envolvente olfatoria"

Rando, Robert R. (Department ofB io log ica l and Mo lecu la rPharmacology, Harvard MedicalSchool, Boston)"Specificity in the binding ofaminoglycoside antibiotics to theirRNA receptors"

Rein, Alan (National CenterInstitute - Frederick Cancer,Research and DevelopmentCenter, Frederick, Maryland)"Recent studies on retrovirusassembly"

Rodnina, Marina (Institute ofMolecular Biology, University ofWitten/Herdecke)"GTPase activation of translationfactors on the ribosome"

Rosenblatt, David S. (Division ofMedical Genetics, Royal VictoriaHospital, Montreal, Quebec)"Molecular basis of cobalamines andfolate defects"

Rottem, Sholomo (The HebrewUniversity-Hadassah MedicalSchool, Jerusalem)"Subversion and exploitation of hostcells by mycoplasmas"

Rubin, Bent (UPCM-ERS-1590CNRS, CHU Purpan, Toulouse)"The central role of CD3-Gammachains in normal and pathologic Tcell function"

Ruiz i Altaba, Ariel (DevelopmentalGenetics Program, Skirbal lInstitute, NYU School of Medicine,Nueva York)"Brain tumors, Gli proteins andintegration of signaling"

Saheki, Takeyori (Department ofB i o c h e m i s t r y K a g o s h i m aUniversity, Sakuragaoka)"Entity of a novel urea cycle disorder,type II citrullenemia, caused by defectof a calcium-binding solute carrierprotein, citrin"

San-Martin, Beatriz (Departamentode Zoología, Universidad deCambridge, Cambridge)"Mecanismos de señalización celulardurante el desarrol lo de lamusculatura del intestino posteriorde Drosophila"

Sherman, Fred (Universidad deRochester, Nueva York)"Amino-terminal processing ofeukaryotic proteins"

Stanley, Richard E. (Departmentof Developmental and MolecularBiology, Albert Einstein Collegeof Medicine, Nueva York)"CSF-1 signalling in macrophages"

Tabata, Tetsuya (Institute ofM o l e c u l a r a n d C e l l u l a rBiosciences, University of Tokyo,Tokyo)"Gradient of DPP morphogen activityis shaped by multiple factors"

Therond, Pascal (Centre deBiochimie, Université de Nice. ParcValrose, Nice)"Branching points and redundancyin hedgehog signaling duringembryogenesis"

Thome, Margot (Universitè deLausanne, Suiza)"Molecular analysis of flip function"

Toraño, Alfredo (Instituto CarlosIII, Madrid)"Mecanismos de infección enleishamaniosis"

Toulmé, Jean-Jacques (UniversitéVictor Segalen, Bordeaux)"Combinatorial approach (selex) forthe selection of ligands targeted toviral RNA structures"

Villalba, Martín (La Jolla Institutefor Allergy and Immunology SanDiego, California)"Proliferation and death in T cells:PKC theta or the bad pathway"

Villareal, Luis P. (Irvine ResearchUn i t on An ima l V i ruses ,Department of Molecular Biologyand Biochemistry, University ofCalifornia, Irvine)"Acute and persistent viral lifestrategies and their relationship toemerging disease"

Volpert, Olga V. (Department ofMicrobiology and Immunology, RHLurie Cancer Center NorthwesternUniversity Medical School,Chicago)"Anti-angiogenic signaling bythrombospondin-1"

Von Herrath, Matthias (ScrippsResearch Institute, La Jolla,California)"How viruses can enhance orabrogate autoimmunity"

Wappner, Pablo (FundaciónCampomar, Buenos Aires)"Desarrollo del sistema traqueal yrespuesta a hipoxia en DrosophilaMelanogaster"

Weaver, Scott C. (Center forTropical Diseases, Department of

Pathology, University of TexasMedical Branch, Galveston, Texas)"Mecanismos de emergencia delvirus de la encefalitis equinavenezolana en Latinoamérica"