Relationships of the Woody Medicago Species (Section Dendrotelis) Assessed by

Molecular Cytogenetic AnalysesTugas Presentasi oleh : Yacobus Sunaryo

Medicago arborea

Medicago citrina

INTRODUCTIONMedicago adalah genus dari famili legume (Fabaceae) yang termasuk spesies penting secara ekonomi dan pertanian (yaitu M. sativa, alfalfa) dan model organisme untuk biologi legume (M. truncatula).

Berlainan dengan medicago yang lain, yang merupakan semak/herbal semusim/annual atau tahunan/perennial, golongan Dendrotelis meliputi herbal/semak berkayu yang dapat mencapai tinggi 4 m, dengan batang perennial (keras) yang memilki lingkar tahun batang dan kulit yang dibentuk oleh kambium (Small and Jomphe, 1989).Tiga diantaranya adalah M. arborea, M. citrina dan M. strasseri.

Tiga medics berkayu tersebut adalah polyploid, M. arborea dan M. strasseri adalah tetraploid (2n=32; Falistocco (1987) dan Gonza´lez-Andre´s (1999), dan M. citrina hexaploid (2n = 48; Boscaiu et al., 1997).

BEBERAPA CONTOH TAMPILAN TANAMAN MEDICAGO

Medicago truncatula

Medicago arborea Medicago citrina

Medicago sativa, alfafa

AIMS OF THE STUDYKajian ini dimaksudkan untuk mengevaluasi: (a) susunan molekuler citogenetik dari ribosomal loci (45S dan 5S) (b) hubungan genomik antara medicago golongan Dentrotelis melalui

teknik in situ hibridisasi (FISH: Fluorescence in Situ Hybrization dan GISH: Genomic in Situ Hybrization).

Pendekatan tersebut memiliki potensi untuk berperan:(1) mengevaluasi hubungan taksonomi dari spesies Dentrotelis (2) mendapat kejelasan terhadap asal auto atau allopoliploid dari

hexaploid M. citrina, (3) mengevaluasi tingkat variasi infraspesifik yang berhubungan dengan

ribosomal loci pada spesies insular tertentu (M. citrina)

MATERIALS AND METTHODSPlant material

M. arborea, M. citrina dan M. strasseri diperoleh dari populasi di lapangan atau dari kebun botani (Tabel 1). Spesies yang lain dari golongan Medicago, M. marina, yang secara filogenetik dekat dengan anggota golongan Dendrotelis (Downie et al., 1998; Juan, 2002), digunakan sebagai pembanding.

Tabel 1. Spesies dan asal bahan yang digunakan dalam penelitian ini dan jumlah chromosome dari bahan yang dianalisa

Asal bahan Jumlah chromosome

Medicago arborea

Medicago strasseri

Medicago citrine

Medicago marina L.

Botanical Garden of ValenciaUniversityBotanical Garden of ValenciaUniversityCarbrera, Ses Bledes islet(Balearic Islands)Ibiza, Es Malvins islet(Balearic Islands)Ibiza, S’Espartar islet(Balearic Islands)Grossa islet(Columbretes Islands)La Mona islet (Iberian Peninsula)Mareny de Vilches (France)

2n = 32

2n = 32

2n = 48

2n = 48

2n = 48

2n = 48

2n = 48

2n = 16

CHROMOSOME PREPARATIONBiji-biji dikecambahkan pada agar 0,6% di dalam Petridis pada suhu 20oC

Pucuk akar yang sedang tumbuh aktif dipisahkan dari bibit (dipotong) dan diperlakukan pendahuluan dengan 0,002 M 8- hydroxyquinoline selama 2 jam pada suhu 20-25oC dan kemudian selama 2 jam pada suhu 4oC

Pucuk akar dimasukkan dalam campuran etanol : asam asetat (3 :1) dan disimpan pada suhu 20oC sampai digunakan

Pucuk akar dicuci dalam 10 mM citrate buffer, pH 4,6, dan kemudian digerus dalam campuran 2% (v/v) selolosa (Calbiochem) dalam citrate buffer, pH 4,6, dan 20 % pectinase (berasal dari Aspergilus niger) dalam 40% gliserol dalam 10 mM citrate buffer, pH 4,6, selama 1 jam pada suhu 37oC. (Prosedur keseluruhan dibuat berdasarkan Zhong et al. (1996) untuk mempersiapkan nukleat dan chromosome pada in situ hibridisasi

Slide diwarnai dengan larutan 4 % Giemsa yang dilarutkan dengan 0,2 M So¨rensen phosphate buffer, pH 6.9.

DNA PROBES AND LABELLING FOR FISHDua famili multigen dari rDNA dilokalisir dengan dua DNA probes yang berbeda. Klon pTa71 adalah potongan 9-kb EcoRI yang mengandung 18S–5,8S–26S rDNA gen dan daerah intergenic spacer dari Triticum aestivum (Gerlach and Bedbrook, 1979)

5S rDNA dilokalisir menggunakan klon pTa794, yang mengandung 410-bp BamHI potongan dari gen 5S rDNA dan intergenic spacer dari T. aestivum (Gerlach and Dyer, 1980)

Potongan 5S rDNA diamplifikasi dengan primer universal M13 bolak balik. Hasil PCR dimurnikan menggunakan perangkat filter (Millipore) Montage PCR Centrifugal. Probe pTa71 dan pTa794 dilabeli baik dengan digoxigenin-11dUTP maupun biotin-11-dUTP dengan translasi pemotongan berdasarkan protokol pabrik (Roche, Germany)

FISHProtokol dilakukan berdasarkan Chiavarino et al. (2000) dengan sedikit modifikasi. Chromosome yang telah disiapkan disimpan pada suhu 37oC selama satu malam yang diikubasi dalam RNase A (1 µg mL–1) dalam 2x SSC selama 1 jam pada suhu 37oC. Selanjutnya slide dicuci tiga kali selama 5 menit dalam 2xSSC, masukkan dalam 4% paraformaldehide dalam 1xSSC selama 10 menit pada temperature kamar, dicuci tiga kali selama 5 menit dalam 2xSSC, kemudian didehidrasi dalam etanol dan udara kering secara berurutan. Sebelum hibridisasi, chromosome yang telah disiapkan di denaturisasi dalam 7%(v/v) formamide dalam 2xSSC pada suhu 68oC selama 2 menit, dehidrasi melalui serangkaian etanol dingin-membeku dan udara kering

Campuran hibridisasi, mengandung 2 µg mL21 dari setiap probe berlabel (45S rDNA and 5S rDNA) didenaturisasi dengan pendidihan selama 10 menit, ditaruh diatas es selama 7 menit, dan tambahkan ke dalam chromosome denaturisasi yang telah disiapkan. Hibridisasi dilaksanakan selama satu malam pada suhu 37oC di dalam kamar/ruang lembab. Setelah hibridisasi berakhir slide dicuci dilakukan dua kali selama dua menit pada suhu 42oC dalam 2xSSC, dan dua kali selama 5 menit pada suhu 42oC dalam 0,1xSSC, dan tiga kali selama 3 menit pada suhu 42oC dalam 2xSSC. Deteksi Digoxigenin-labelled probe dibuat dengan antibody anti-digoxigenin yang digabungkan dengan fluorescein isothiocyanate (Roche). Deteksi Biotin-labelled probe dibuat dengan streptavidin yang digabungkan dengan Texax Red (Vector Laboratories)

Setelah deteksi, slide dicuci dua kali selama 5 menit pada suhu 37oC dan satu kali pada temperature kamar di dalam deteksi penyangga/buffer [4_ SSC, 0.2% (v/v) Tween 20]. Terakhir, slide dihilangkan warnanya dengan DAPI dan dikumpulkan di dalam Vectashield (Vector Laboratories). Tanda/signal hibridisasi dianalisis menggunakan mikroskop epifluorescence Olympus, dengan filter set yang sesuai, dilengkapi dengan camera digital Olympus Camedia C-2000-Z. Tampilan/image dioptimalisasi untuk kecerahan dan kontras yang terbaik dengan software imageprocessing (Adobe Photoshop v. 7.0)

GENOMIC DNA PROBES FOR GISH

Total DNA genomic dari daun muda dari M. arborea dan M. strasseri diisolasi menggunakan protocol CTAB yang dimodifikasi oleh Doyle dan Doyle (1987). Untuk percobaan yang menggunakan genomic blocking, potongan/fragment DNA, panjang 100-300 bp, diperoleh dengan autoclaving total genomic DNA dari masing-masing spesies

Probe DNA dari M. arborea dan M. strasseri dilabel dengan digoxigenin-dUTP and biotin-dUTP, secara berurutan, melalui nick tranlasi yang mengikuti instruksi pembuatan (Roche)

DNA berlabel dari M. arborea dan M. strasseri , digunakan untuk analisis hubungan genomic dengan chromosome dari M. citrine, dicampur dalam kombinasi yang berbeda dengan blocking DNA tak berlabel dari spesies lain pada konsentrasi 50-fold excess dan 70-fold excess, dari DNA Escherichia coli. Dimana kedua species yang digunakan pada percobaan genomic probe yang sama digunakan konsentrasi yang sama

GISHMetode in situ hibridisasi mengikuti Leitch et al. (1994) dan Schwarzacher and Heslop Harrison (2000)

Campuran hibridisasi mengandung 2 µg mL–1 dari masing-masing digoxigenin dan biotin-labelled genomic DNA, 50% (v/v) formamide, 10% (v/v) dextran sulfat dan 2_SSC dan blockin DNA tak berlabel (50-dan 70-fold excess) didenaturisasi dengan mendidihkan selama 10 menit kemudian ditempatkan di atas es selama 7 menit

Ketika kedua probe dan chromosome telah di denaturisasi probe diaplikasikan pada slide dan DNA-DNA in situ hibridisasi dilakukan pada suhu 37oC dalam kamar lembab selama 20 jam

Sesudah hibridisasi slide dicuci dilaksanakan dua kali masing-masing selama 2 menit pada suhu 42oC dalam 2xSSC, dua kali selama 5 menit masing-masing pada 42oC dalam 0,1xSSC, dan tiga kali selama 3 menit masing-masing pada suhu 42oC dalam 2_SSC. Secara khusus larutan pencuci yang digunakan adalah: dua kali selama 2 menit masing-masing pada suhu 42oC dalam 2xSSC, dalam 20% formamide dan 0,1xSSC selama 10 menit pada suhu 42oC, dua kali selama 5 menit masing-masing pada suhu 42oC dalam 2xSSC

RESULTS Gambar 1. FISH dengan probe rDNA 45S (hijau) dan 5S (biru) pada sel pucuk akar Medicago marina (A,B), dan M. arborea (C-F), M. strasseri (G-I) dan M. citrine (J-L). Semua sel diwarnai dengan DAPI (blue). (A) Nucleus interfase Medicago marina menunjukkan dua daerah rDNA 45S (hijau) dan empat daerah rDNA 5S (merah); (B) M. marina, FISH ganda dalam sel metaphase,; (C) M. arborea, nucleus interfase yang menunjukkan perenggangan locus rDNA 45S; (D) M. arborea, sel metaphase yang menunjukkan sub-terminal locus rDNA 45S; (E) M. arborea, sel metaphase yang menunjukkan empat daerah proximal rDNA 5S; (F) M. arborea, FISH ganda pada metaphase, yang menunjukkan dua rDNA 45S dan empat daerah proximal rDNA 5S;

(G) M. strasseri, nuclei interfase yang menunjukkan penggabungan locus 45S; (H) M. strasseri, nucleus interfase yang menunjukkan empat tanda hibridisasi rDNA 5S; (I) M. strasseri, FISH ganda dalam sel metaphase yang menunjukkan empat daerah proximal rDNA 5S (merah) dan dua daerah sub-terminal rDNA 45S (hijau), (J) M. citrine, nucleus interfase yang menunjukkan signal dari rDNA 45S; (K) M. citrine, nucleus interfase yang menunjukkan sepuluh daerah kompak rDNA 5S; (L) M. citrine, sel metaphase dengan signal FISH dari rDNA 5S dan 45S, dua pasang chromosome yang menunjukkan signal sangat kecil hibridisasi 5S. Kepala-panah menunjukkan pasangan chromosome heteromorfik yang mengambarkan intensitas yang berbeda pada signal hibridisasi 45S. Skala bar = 10 mm.

Gambar 2. GISH pada chromosome metaphase dari M. citrina secara serempak dihibridisasi dengan probe genomic M. arborea (A) dan M. strasseri (B). Semua sel diwarnai dengan DAPI (abu-abu). Pada hibridisasi silang M. citrina dipotong pada segmen terminal dan constriction sekunder dari chromosome yang ditempatkan (ditunjukkan dengan anak panah). Skala bar = 10 mm

M. marina diploid (2n -= 16) memiliki satu 45S dan dua 5S loci rDNA, suatu pola yang biasanya terdeteksi pada penelitian sebelumnya dari spesies Medicago diploid. Namun demikian, spesies poliploid dari golongan Dendrotelis terjadi seperti yang diharapkan. Spesies M. arborea dan M. strasseri tetraploid (2n = 32) memiliki satu locus 45S rDNA dan dua loci rDNA5S, sedangkan pada M. citrine hexaploid empat rDNA 45S dan lima rDNA 5S telah terdeteksi. Tidak ada chromosome tunggal dari M. citrina diberi tanda yang sama setelah penggunaan genomic probe dari M. arborea dan M. strasseri. Namun, tanda hibridisasi silang pada M. citrina terbatas pada lengan chromosome terminal dan daerah NOR

CONCLUSIONSHasil FISH mendukung hubungan yang dekat antara M. arborea dan M. strasseri pada spesies tetraploid tersebut, loci NOR pernah mengalami kejadian diploidisasi dengan kehilangan urutan fisik, suatu tampilan citogenik sehingga tidak ditunjukkan pada genus spesies lain.

Jumlah yang banyak dari rDNA loci dan hasil GISH mendukung status khusus untuk M. citrina hexaploid, dan ini diduga bahwa spesies ini bukan autoploid keturunan dari M. arborea atau M. strasseri.

Lebih lanjut, data molekuler citogenic tidak sesuai hipotesis bahwa M. arborea and M. strasseri termasuk dalam asal dari M. citrina.

Peta FISH dapat digunakan sebagai alat yang efisien untuk menentukan konstribusi genomic dari M. citrina pada hybrid somatic dengan spesies medicago yang lain