mechanism of cytoplasmatic ph regulation in hypoxic maize root tips and its role in survival under...

8/13/2019 Mechanism of Cytoplasmatic pH Regulation in Hypoxic Maize Root Tips and Its Role in Survival Under Hypoxia

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 1 , p p . 3 3 7 9 - 3 3 8 3 , J u n e 1 9 8 4B o t a n y

M e c h a n i s m o f c y t o p l a s m i c pH r e g u l a t i o n i n h y p o x i c m a i z e r o o t t i p sa n d i t s r o l e i n s u r v i v a l u n d e r h y p o x i a( i n v i v o N M R / Z e a m a y s L . / f l o o d i n g t o l e r a n c e / p H - s t a t / e t h a n o l f e r m e n t a t i o n )

J U S T I N K . M. R O B E R T S * , JUDY C A L L I S t , DAVID WEMMER*t, V I R G I N I A W A L B O T t , AND OLEG J A R D E T Z K Y ** S t a n f o r d M a g n e t i c R e s o n a n c e L a b o r a t o r y a n d t D e p a r t m e n t o f B i o l o g i c a l S c i e n c e s , S t a n f o r d U n i v e r s i t y , S t a n f o r d , CA 9 4 3 0 5C o m m u n i c a t e d b y W i n s l o w R . B r i g g s , F e b r u a r y 2 2 , 1 9 8 4ABSTRACT W e s h o w t h a t a t r a n s i e n t l a c t i c f e r m e n t a t i o np r o v i d e s t h e s i g n a l t r i g g e r i n g e t h a n o l p r o d u c t i o n i n h y p o x i cm a i z e r o o t t i p s . T h e s i g n a l i s c y t o p l a s m i c p H . T h i s i n t e r a c t i o nb e t w e e n l a c t i c a n d e t h a n o l i c f e r m e n t a t i o n p e r m i t s t i g h t c y t o -p l a s m i c pH r e g u l a t i o n d u r i n g h y p o x i a - c y t o p l a s m i c pH r e -m a i n i n g n e a r n e u t r a l i t y f o r s e v e r a l h o u r s . M u t a n t r o o t s u n -a b l e t o s y n t h e s i z e e t h a n o l c a n n e i t h e r r e g u l a t e c y t o p l a s m i c pHn o r m ai nt a in ATP l e v e l s d u r in g e x t e n d e d p e r i o d s o f h y p o x i aa n d , l i k e v e r t e b r a t e t i s s u e s , a r e l e s s t o l e r a n t o f h y p o x i a t h a nn o r m a l m a i z e . T h i s i n d i c a t e s t h a t c y t o p l a s m i c pH r e g u l a t i o n i sa n i m p o r t a n t f a c t o r i n s u r v i v a l u n d e r h y p o x i a .C e r t a i n h i g h e r p l a n t t i s s u e s , s u c h a s m a i z e r o o t s , a l t h o u g hr e q u i r i n g o x y g e n f o r n o r m a l f u n c t i o n i n g , c a n s u r v i v e l o n gp e r i o d s ( > 1 8 h r ) o f a n a e r o b i o s i s 1 , w i t h g l y c o l y s i s c o n t i n u -i n g d u r i n g m o s t o f t h i s p e r i o d 2 , 3 . M o s t v e r t e b r a t e t i s s u e s ,o n t h e o t h e r h a n d , c a n s u r v i v e o n l y s h o r t p e r i o d s o f h y p o x i a( < 2 h r ) , a f t e r w h i c h g l y c o l y s i s i s g r e a t l y i n h i b i t e d , a n d i nm o s t c a s e s i r r e v e r s i b l e c e l l d a m a g e o c c u r s 4 , 5 . T h i s d i f f e r -e n c e b e t w e e n p l a n t s a n d a n i m a l s c a n n o t b e d u e s i m p l y t o t h el o w e r m e t a b o l i c r a t e s o f t e n s e e n i n p l a n t s : t h e m a i z e r o o tt i p s ( a t 2 5 0 C ) u s e d i n t h i s s t u d y r e s p i r e f i v e t i m e s t h e r a t e o f ar e s t i n g man ( a t 3 7 0 C ) a n d a b o u t h a l f t h e r a t e o f a r e s t i n gm o u s e ( a t 3 7 0 C ) 6 . I t i s p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t t h e a b i l i t yo f h i g h e r p l a n t s t o u n d e r g o a m a i n l y e t h a n o l i c f e r m e n t a t i o n 2 , 3 , 7 - 9 ) , r a t h e r t h a n t h e e x c l u s i v e l y l a c t i c f e r m e n t a t i o ns e e n i n h i g h e r a n i m a l s , i s t o some d e g r e e r e s p o n s i b l e f o rt h e i r a b i l i t y t o w i t h s t a n d l o n g p e r i o d s o f h y p o x i a . W e c o n -s i d e r e d t h i s v i e w a f t e r s h o w i n g t h a t t h e c y t o p l a s m i c pH o fm a i z e r o o t t i p s f a l l s t o a s t a b l e v a l u e - 0 . 5 pH u n i t b e l o wa e r o b i c v a l u e s w i t h i n 2 0 m i n a f t e r t r a n s f e r t o a n a na er o b ice n v i r o n m e n t ( 1 0 ) . T h i s b e h a v i o r i s i n c o m p l e t e c o n t r a s t t oa c t i v e , h y p o x i c v e r t e b r a t e t i s s u e s , w h e r e c y t o p l a s m i c pHf a l l s t h r o u g h o u t h y p o x i a b e c a u s e o f c o n t i n u o u s l a c t i c a c i da c c u m u l a t i o n ( 4 , 1 1 , 1 2 ) u n t i l g l y c o l y s i s c e a s e s . T h u s , i nh y p o x i c v e r t e b r a t e t i s s u e s , e n e r g y p r o d u c t i o n ( g l y c o l y s i s )l e a d s t o c y t o p l a s m i c a c i d o s i s , w h i c h e v e n t u a l l y i n h i b i t s c o n -t i n u e d e n e r g y p r o d u c t i o n ; i n p l a n t s , c o n t i n u e d e n e r g y p r o -d u c t i o n d o e s n o t i n v o l v e g e n e r a t i o n o f a c i d ( o t h e r t h a n c a r -b o n d i o x i d e ) , a n d s o n o i n h i b i t i o n o f g l y c o l y s i s d u e t o a c i d o -s i s i s o b s e r v e d .W e d e s c r i b e h e r e t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c y t o p l a s m i cpH i s r e g u l a t e d , a n d e t h a n o l p r o d u c t i o n i n d u c e d , i n h y p o x i cm a i z e r o o t t i p s . T h e m e c h a n i s m i s c o n s i s t e n t w i t h i n v i t r od a t a ( 1 3 , 1 4 ) . W e a l s o s h o w t h a t r o o t t i p s o f m u t a n t s t h a t l a c kt h e a b i l i t y t o m a k e e t h a n o l d u r i n g h y p o x i a - a n d h a v e d e -c r e a s e d v i a b i l i t y - c a n n o t r e g u l a t e c y t o p l a s m i c pH b u t i n -s t e a d , l i k e v e r t e b r a t e t i s s u e s , u n d e r g o c y t o p l a s m i c a c i d i f i c a -t i o n t h r o u g h o u t h y p o x i a .

M A T E R I A L S AND METHODSE x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d w i t h - = 1 . 5 - g s a m p l e s o f 2-mmh y b r i d m a i z e (W W x B r 3 8 ( o b t a i n e d f r o m C u s t o m a i ze R e -s e a r c h , D e c a t e u r , I L ) r o o t t i p s e x c i s e d f r o m 2 - d a y - o l d s e e d -l i n g s , p e r f u s e d a s d e s c r i b e d i n t h e f i g u r e l e g e n d s ( 1 0 ) .NADH f l u o r e s c e n c e ( 1 5 ) w a s m e a s u r e d i n a P e r k i n - E l m e rf l u o r o s p e c t r o p h o t o m e t e r ; l i g h t e m i t t e d a t 9 0 t o t h e e x c i t a -t i o n b e a m w a s c o l l e c t e d ; e x c i t a t i o n 3 6 6 2 n m , e m i s s i o n4 7 0 5 n m ; t h e e x c i t a t i o n a n d e m i s s i o n s p e c t r a o f t h i s f l u o -r e s c e n c e p e a k a r e v e r y s i m i l a r t o t ho se o f p u r e NADH i ns o l u t i o n . T h e r a t e o f e t h a n o l p r o d u c t i o n w a s d e t e r m i n e d b ye n z y m a t i c a n a l y s i s ( 1 6 ) o f t h e e f f l u e n t , c o l l e c t e d b y f r a c t i o nc o l l e c t o r ; v i r t u a l l y i d e n t i c a l r e s u l t s w e r e o b t a i n e d i f f l o wr a t e s w e r e k e p t c o n s t a n t t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t , o n l yo x y g e n t e n s i o n b e i n g c h a n g e d ( d a t a n o t s h o w n ) . C y t o p l a s -m i c pH w a s e s t i m a t e d b y 3 1 P NMR ( 1 7 - 1 9 ) , f r o m t h e c h e m i -c a l s h i f t 8 o f t h e c y t o p l a s m i c i n o r g a n i c p h o s p h a t e r e s o -n a n c e ( 2 0 ) , u s i n g t i t r a t i o n c u r v e s o f p h o s p h a t e s o l u t i o n s a p -p r o x i m a t i n g t o e x p e c t e d i n t r a c e l l u l a r c o m p o s i t i o n ( 1 0 , 1 8 ) .3 1 p c h e m i c a l s h i f t s a r e r e f e r e n c e d t o 0 . 5 M m e t h y l e n e d i -p h o s p h o n a t e w i t h 5 mM e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d i nH 2 0 , b r o u g h t t o pH 8 . 9 w i t h T r i s b a s e . S p e c t r a w e r e o b -t a i n e d o n a m o d i f i e d B r u k e r H X S - 3 6 0 s p e c t r o m e t e r o p e r a t -i n g a t 1 4 5 . 7 MHz. 1 3 C NMR s p e c t r a o f m e t h y l r e s o n a n c e s i n2-mm m a i z e r o o t t i p s p e r f u s e d w i t h 5 0 mM [ 1 - _ 3 C ] g l u c o s e( 9 0 e n r i c h m e n t ) w e r e o b t a i n e d w i t h t h e s a m e s p e c t r o m e -t e r . S p e c t r a w e r e o b t a i n e d w h i l e i r r a d i a t i n g t h e m e t h y l p r o -t o n s . 3 C c h e m i c a l s h i f t s a r e g i v e n r e l a t i v e t o t e t r a m e t h y l s i -l a n e a t 0 p p m . 1 3 C m e t h y l a s s i g n m e n t s w e r e m a d e o n t h eb a s i s o f c h e m i c a l s h i f t s ; t h e i n t e n s i t i e s o f p e a k s w e r e c o p -s i s t e n t w i t h c o n c e n t r a t i o n s o f l a c t a t e a n d a l a n i n e d e t e r m i n e de n z y m a t i c a l l y ( 1 6 ) i n r o o t t i p e x t r a c t s ( d a t a n o t s h o w n ) . R o o tt i p s w e r e p e r f u s e d w i t h 0 . 1 mM C a S O 4 t o d e p l e t e e n d o g e -n o u s s u g a r ( 2 1 ) p r i o r t o p e r f u s i o n w i t h [ 1 - 1 3 C ] g l u c o s e , a n dt h i s p e r f u s i o n c o n t i n u e d f o r 3 h r b e f o r e t h e e x p e r i m e n t sw e r e i n i t i a t e d . S e e f i g u r e l e g e n d s f o r p e r f u s i o n d e t a i l s . T h es e e d l i n e s d e s c r i b e d i n F i g s . 5 a n d 6 w e r e a g i f t f r o m M .F r e e l i n g ( D e p a r t m e n t o f G e n e t i c s , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a ,B e r k e l e y ) ; t h e y w e r e p r o p a g a t e d a t S t a n f o r d , i n t h e s a m ef i e l d , i n t h e s u m m e r o f 1 9 8 2 .

RESULTS AND DISCUSSIONT i m e C o u r s e o f F e r m e n t a t i o n E n d P r o d u c t s D u r i n g H y p o x -i a . A l t h o u g h m e t a b o l i c c h a n g e s i n p l a n t s a r e l a r g e l y c o m -p l e t e a f t e r 3 0 m i n o f h y p o x i a 8 , 2 2 - 2 4 ) , t h e r e a r e n o p u b -l i s h e d d a t a o n t h e a c c u m u l a t i o n o f f e r m e n t a t i o n e n d p r o d -u c t s w i t h m o r e t h a n t h r e e t i m e p o i n t s i n t h i s p e r i o d . H e r e w ed e s c r i b e t h e a p p e a r a n c e o f t h e s e e n d p r o d u c t s i n d e t a i l .F i g . 1 s h o w s t h e k i n e t i c s o f NADH f l u o r e s c e n c e , e t h a n o l

A b b r e v i a t i o n : A DH , a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e .t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f C h e m is t r y , U n iv e r s it y o f W a s h i n g -t o n , S e a t t l e , WA 9 8 1 9 5 .3379

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h er e b y m a r k e d a d v e r t i s e m e n ti n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


2/5

P r o c . N a t L . A c a d . S c i . USA 8 1 ( 1 9 8 4 )j2min a

Fluorescence

( b )E t h a n o l

cC y t o p l a s m i c p H0

0J

( bt e> ,0o

7 . 4- 7 . 2

- 7 . 0 X

6 . 8T0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0T i m e , m i n

F I G . 1 . T i m e c o u r se o f NADH f l u o r e s c e n c e ( a ) , r a t e o f e t ha n o lp r o d u c t i o n ( b ) , a n d c y t o p l a s m i c pH ( c ) i n p e r f u s e d m a i z e r o o t t i p sd u r i n g h y p o x i a , d e t e r m i n e d i n v i v o . R o o t t i p s were i n i t i a l l y p e r f u s e da t 5 0 m l- mi n- ' w it h 0 2 -s a t u r a t e d 5 0 mM g l u c o s e / 0 . 1 mM C a S O 4 .A f t e r 2 0 m i n , t h e y were p e r f u s e d a t 4 m l - m i n - ' w i t h t h e same s o l u -t i o n now s a t u r a t e d w it h N 2 -p r o d u c t i o n , a n d c y t o p l a s m i c pH i n p e r f u s e d m a i z e r o o t t i p sd u r i n g an a e r o b i c / a n a e r o b i c t r a n s i t i o n . T h e r a p i d i n c r e a s e( = 2 m i n ) i n NADH l e v e l s i n h y p o x i a i n d i c a t e s a r a p i d i n h i b i -t i o n o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n . T h u s , r e d u c t a n t f o r l a c -t a t e o r a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e i s a v a i l a b l e e a r l y i n h y p o x i a .

1 0 0 - 1 2 0

8 0 -1 0 0

6 0 - 8 0

40 - 6 0

2 0 - 4 0

0 - 2 0

W i t h i n t h e f i r s t 2 m i n o f h yp o x ia , c y t o p l a s m i c a c i d i f i c a t i o nb e g i n s a n d , as we r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 1 0 ) , w i t h i n 2 0 m i n o fh y p o x i a , c y t o p l a s m i c pH f a l l s b y - 0 . 5 pH u n i t t o a s t a b l e pHv a l u e ; t h i s new c y t o p l a s m i c pH c a n b e m a i n t a i n e d ( 0 . 1 pHu n i t ) f o r a t l e a s t 1 0 h r ( d a t a n o t s ho w n ) . A f te r a 1 0 - m i n l a g ,e t h a n o l appears i n t h e p e r f u s i o n e f f l u e n t ; e t h a n o l p r o d u c t i o ni n c r e a s e s t o a maximum b y - 3 0 m i n , r e m a i n i n g c o n s t a n tt h e r e a f t e r . No l a c t a t e i s o b s e r v e d i n t h e e f f l u e n t ( d a t a n o ts h o w n ) ; t h i s c o n t r a s t s w i t h many a n i m a l t i s s u e s ( e . g . , musc l e ) , f r o m w h i c h l a c t a t e l e a k s ( 2 5 ) a n d i s m e t a b o l i z e d i n o t h -er a e r o b i c t i s s u e s ( e . g . , l i v e r ) .T h e 1 3 C NMR p a r t i a l s p e c t r a i n F i g . 2 s h o w t h a t t h e c y t o -p l a s m i c a c i d i f i c a t i o n d e s c r i b e d b y F i g . 1 i s d u e t o a t r a n s i e n tl a c t i c f e r m e n t a t i o n . T h u s , t h e m e t h y l s i g n a l d u e t o l a c t a t e ,a r i s i n g v i a g l y c o l y s i s f r o m [ 1 - 1 3 C ] g l u c o s e , r e a c h e s a c o n s t a n ti n t e n s i t y w i t h i n 2 0 m i n o f h y p o xi a. M e t h y l s i g n a l s f r o m a l a -n i n e a n d e t h a n o l a l s o r a p i d l y r e a c h a c o n s t a n t i n t e n s i t y ; t h i sr e s u l t i n d i c a t e s t h a t i n t r a c e l l u l a r e t h a n o l r a p i d l y e q u i l i b r a t e sw i t h t h e p e r f u s i o n m e d i u m . A l a n i n e m o s t p r o b a b l y a r i s e sf r o m t r a n s a m i n a t i o n o f p y r u v a t e v i a g l u t a m i c - p y r u v i c t r a n s -a m i n a s e ; d e c r e a s e s i n g l u t a m a t e a n d i n c r e a s e s i n a - k e t o g l u -t a r a t e h a v e b e e n o b s e r v e d i n a n o x i c b u c k w h e a t s e e d l i n g s 7 .I t i s c l e a r f r o m F i g . 1 t h a t t h e r a t e o f e t h a n o l p r o d u c t i o nc o n t i n u e s t o i n c r e a s e c o n s i d e r a b l y ( > 2 - f o l d ) l o n g a f t e r c y t o -p l a s m i c pH h a s s t a b i l i z e d - i . e . , a f t e r l a c t i c a c i d p r o d u c t i o nh a s s t o p p e d . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e P a s t e u r e f f e c t i n t h i s t i s -sue ( 2 ) o c c u r s s e v e r a l m i n u t e s a f t e r f e r m e n t a t i o n r e a c t i o n sb e g i n , n o t a t t h e s a m e t i m e . T h i s p h e n o m e n o n w i l l b e d i s -c u s s e d e l s e w h e r e .C o n t r o l o f L a c t a t e a n d E t h a n o l P r o d u c t i o n . I n v i t r o s t u d i e s( 1 3 , 1 4 ) h a v e s h o w n l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e t o h a v e a n a l k a -l i n e pH o p t i m u m , w h e r e a s p y r u v a t e d e ca r b o x y l as e ( w hi ch

0 . 8

. S 0 . 6 -Ec n

0 . 4 -

z 0.2

0 . 0 -

1 4 . 2 -1 4 . 4 -

C L 1 4 . 6 - 1 4 . 8 -

1 5 . 0 -1 5 . 2 -

zL uz

( a )E t h a n o l

T ,0 0 x C y t o p l a s m i c p H

*I t

- 7 . 4- 7 . 27 . 0

- 6 . 8

- 6 . 6

- 6 . 4

0 2 IT LI I . I I I I .2 5 2 0

6 , PPM15

F I G . 2 . 1 3 C NMR s p e c t r a ( 9 0 . 5 MHz) o f m e t h y l r e s o n a n c e s i n 2 -mm m a i z e r o o t t i p s p e r f u s e d w i t h 5 0 mM [ 1 - ' 3 C ] g l u c o s e ( 9 0 o en -r i c h m e n t ) a t 4 0 m l - m i n - ' . H y p o x i a was i n d u c e d b y p e r f u s i n g w i t hN 2 - s a t u r a t e d 5 0 mM g l u c o s e a t 4 m l - m i n - ' . Resonances ar e a s s i g n e dt o l a c t a t e ( p e a k 1 , e t h a n o l ( p e a k 2 ) , and a l a n i n e ( p e a k 3 ) .

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 12 0Time min

F I G . 3 . Time c o u r s e f o r r a t e o f e t ha n o l p r o d u c t i o n ( a ) a n d c y t o -p l a s m i c pH ( b ) i n m a i z e r o o t t i p s p e r f u s e d i n i t i a l l y as i n F i g . 1 . A f t e r2 0 m i n , r o o t t i p s were p e r f u s e d w i t h 0 2 - s a t u r a t e d 5 0 mM g l u c o s e /0 . 1 mM C a S O 4 a c i d i f i e d t o pH 3 w i t h H 2 S O 4 ( a ) ( a s a c o n t r o l f o r l o we x t e r n a l p H ) o r w i t h 0 2 - s a t u r a t e d 5 0 mM g l u c o s e / 0 . 1 mM C a S O 4w i t h 2 . 5 mM ( o ) o r 5 mM ( A ) a c e t i c a c i d , a l l a t 4 0 m l - m i n - ' . A f t e r af u r t h e r 2 5 m i n , a l l t h r e e s a m p l e s were p e r f u s e d w i t h N 2 - s a t u r a t e d 5 0mM g l u c o s e / 0 . 1 mM C a S O 4 a t 4 m l -m in - ' .

3 3 8 0 B o t a n y : R o b e r t s e t a l

0 . 8 -E 0 . 6 -co0

0 . 4 - 0 . 2 -E1 1 4 0 . 0 -

1 4 . 2 -1 4 . 4 -.

0 . 0

e m 1 4 . 6 -1 4 . 8 -

0

O * I p o o l I


3/5

P r o c . N a t L . A c a d . S c i . USA 8 1 ( 1 9 8 4 ) 3 3 8 1c a t a l y z e s t h e f i r s t r e a c t i o n l e a d i n g t o e t h a n o l f r o m p y r u v a t e )h a s a n a c i d pH o p t i m u m . T h i s r e s u l t , a n d w o r k w i t h p e a s e e de x t r a c t s , l e d D a v i e s e t a l . ( 1 4 ) t o s u g g e s t t h a t i n h y p o x i cp l a n t s i t i s c y t o p l a s m i c pH t h a t c o n t r o l s w h i c h f e r m e n t a t i o ne n d p r o d u c t i s f o r m e d . T h e y p o s t u l a t e d t h a t i n i t i a l l y l a c t i ca c i d i s f o r m e d i n t h e a l k a l i n e c y t o p l a s m , t h e r e s u l t a n t l o w -e r e d c y t o p l a s m i c pH t h e n i n h i b i t s f u r t h e r l a c t i c a c i d p r o d u c -t i o n w h i l e a c t i v a t i n g p y r u v i c d e c a r b o x y l a s e , l e a d i n g t o e t h a -n o l p r o d u c t i o n . T h e r e s u l t s p r e s e n t e d a b o v e a r e e n t i r e l yc o n s i s t e n t w i t h t h i s v i e w a n d l e d u s t o d e v i s e a c r i t i c a l t e s t .I f a l o w c y t o p l a s m i c pH i s r e q u i r e d f o r e t h a n o l f o r m a t i o n ,o n e w o u l d p r e d i c t t h a t a c i d i f i c a t i o n o f t h e c y t o p l a s m o f a e r o -b i c r o o t t i p s w i l l l e a d t o a s h o r t e r l a g i n e t h a n o l p r o d u c t i o no n c e NADH b e c o m e s a v a i l a b l e i n h y p o x i a . F i g . 3 s h o w s t h a tt h e p r e d i c t i o n i s f u l f i l l e d : a 2 . 5 o r 5 mM a c e t i c a c i d p r e t r e a t -m e n t r e d u c e s o r e l i m i n a t e s , r e s p e c t i v e l y , t h e l a g i n e t h a n o lp r o d u c t i o n i n h y p o x i a . N o r m a l l y , e t h a n o l p r o d u c t i o n i s n o ts t i m u l a t e d b e f o r e c y t o p l a s m i c pH f a l l s t o pH - 6 . 9 ( F i g s . 1a n d 3 . T h e 2 . 5 mM a c e t i c a c i d t r e a t m e n t r e s u l t s i n a c y t o -p l a s m i c p H , p r i o r t o h y p o x i a , t h a t i s s l i g h t l y h i g h e r t h a n pH6 . 9 a n d d o e s n o t c o m p l e t e l y e l i m i n a t e t h e l a g i n e t h a n o l p r o -d u c t i o n ( F i g . 3 . T h e 5 mM a c e t i c a c i d t r e a t m e n t r e s u l t s i n ac y t o p l a s m i c pH l o w e r t h a n pH 6 . 9 ( F i g . 3 ) a n d c o m p l e t e l ye l i m i n a t e s t h e l a g . T h i s r e s u l t i n d i c a t e s t h a t t h e r e i s a s h a r p l yd e f i n e d t h r e s h o l d o f c y t o p l a s m i c pH a b o v e w hi ch e t h a n o l i cf e r m e n t a t i o n d o e s n o t o c c u r . T h e a b r u p t a c c e l e r a t i o n i n e t h -a n o l p r o d u c t i o n t h a t f o l l o w s t h e l a g ( F i g s . 1 a n d 3 ) a l s o s u g -g e s t s a s h a r p t h r e s h o l d . N o t e t h a t t h e k i n e t i c s o f e t h a n o l p r o -d u c t i o n a f t e r 2 0 m i n o f h y p o x i a ( w h e n l a c t i c a c i d p r o d u c t i o nn o r m a l l y c e a s e s ) a r e n o t a f f e c t e d s i g n i f i c a n t l y b y t h e a c e t i ca c i d p r e t r e a t m e n t ( F i g . 3 . T h i s r e s u l t , t o g e t h e r w i t h t h e o b -s e r v a t i o n t h a t ATP l e v e l s d e c r e a s e b y n o m o r e t h a n 25d u r i n g t h e a c e t i c a c i d t r e a t m e n t s ( d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t st h a t t h e a c e t i c a c i d t r e a t m e n t i s n o t t o x i c .N o t o n l y d o e s a n a c e t i c a c i d p r e t r e a t m e n t r e s u l t i n e a r l i e re t h a n o l p r o d u c t i o n i n h y p o x i a b u t i t a l s o s u p p r e s s e s l a c t a t ef o r m a t i o n ( F i g . 4 . T h u s , 1 3 C NMR p a r t i a l s p e c t r a o f r o o tt i p s f e d [ 1 - 1 3 C ] g l u c o s e a n d p r e t r e a t e d w i t h 5 mM a c e t i c a c i d

2 3I\/6 0 - 8 0

4 4 0 - 6 0

2 0 - 4 0

0- 2 0

s h o w l i t t l e o r n o l a c t a t e - m e t h y l s i g n a l w h e n m a d e h y p o x i c ,w h e r e a s t h e e t h a n o l - m e t h y l s i g n a l i s s t r o n g . W e a t t r i b u t e t h ef u r t h e r c y t o p l a s m i c a c i d i f i c a t i o n s e e n when a c e t i c a c i d -t r e a t e d t i s s u e b e c o m e s h y p o x i c ( F i g . 3 ) t o t h e a c e t i c a c i d ;h y p o x i a w i l l i n h i b i t c o m p l e t e l y t h e p r i n c i p a l m e a n s f o r c o n -s u m i n g p r o t o n s r e l e a s e d w h e n a c e t i c a c i d e n t e r s t h e c e l l -n a m e l y , i t s c o n v e r s i o n t o K r e b s c y c l e i n t e r m e d i a t e s a n dt h e i r o x i d a t i o n t o C O 2 ( a n d w a t e r ) , t h i s a c i d e s c a p i n g f r o mt h e c e l l .W e c o n c l u d e t h a t o n c e NADH b e c o m e s a v a i l a b l e f o l l o w -i n g i n h i b i t i o n o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n , t h e f o r m a t i o n o fl a c t a t e a n d e t h a n o l i s r e g u l a t e d b y c y t o p l a s m i c p H : l o w c y -t o p l a s m i c pH f a v o r s e t h a n o l a n d h i g h pH f a v o r s l a c t a t e .T h u s , t h e s e t w o p a t h w a y s c o n s t i t u t e a p H - s t a t ( 2 6 , 2 7 )t h a t a u t o m a t i c a l l y c o n t r o l s c y t o p l a s m i c pH i n h y p o x i a . O n l yi f t h e C O 2 p r o d u c e d d u r i n g e t h a n o l i c f e r m e n t a t i o n i s p r e -v e n t e d f r o m e s c a p i n g f r o m t h e t i s s u e , b y s e a l i n g t h e r o o t t i p so f f c o m p l e t e l y i n a s m a l l v o l u m e , w i l l t h i s p H - s t a t f a i l a n dc y t o p l a s m i c pH f a l l ( 1 0 ) .A d h - 1 I s R e q u i r e d f o r C y t o p l a s m i c pH R e g u l a t i o n D u r i n gH y p o x i a . A l t h o u g h e t h a n o l p r o d u c t i o n i s p r i m a r i l y r e g u l a t e da t t h e l e v e l o f p y r u v a t e d e c a r b o x y l a s e , r e g e n e r a t i o n o f NAD+i s r e q u i r e d f o r c o n t i n u e d e t h a n o l i c f e r m e n t a t i o n . T h i s r e g e n -e r a t i o n i s c a t a l y z e d b y a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( A D H ) .T h e r e a r e t w o l o c i t h a t e n c o d e ADH a c t i v i t y i n m a i z e . I na e r o b i c r o o t s , ADH-1 i s t h e p r e d o m i n a n t i s o z y m e p r e s e n t( 2 8 ) . A f t e r 3 - 4 h r o f h y p o x i a , r o o t s b e g i n t o s y n t h e s i z e b o t hADH-1 a n d ADH-2 1 . A e r o b i c m a i z e r o o t t i p s , h o m o z y -g o u s f o r a m u t a t i o n a t t h e A d h - J l o c u s [ d e n o t e d S 5 6 5 7 ( 2 8 ) ]r e s u l t i n g i n n o ADH-1 e n z y m e , c o n t a i n


4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 1 ( 1 9 8 4 )( a ) Adh ( b ) A d h 4

9 0 - 1 2 0 min N 2

3 0 6 0 min N 2

3

1 0 2 0 3 0

3INITIAL 2 4 m

6

1 0 2 0 3 0- 6 , PP M

F I G . 6 . 3 1 P NMR s p e c t r a ( 1 4 5 . 7 MHz) o f 4 - m m m a i z e r o o t t i p s f r o m A d h- 1 [ S 5 6 5 7 ( 2 8 ) ] ( a ) a n d A d h - J + [ 1 s 2 p ( 2 8 ) ] ( b ) l i n e s , o b t a i n e d o v e r3 0 m i n . R e s o n a n c e s a r e a s s i g n e d t o g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e ( p e a k 1 , c y t o p l a s m i c i n o r g a n i c p h o s p h a t e ( p e a k 2 , v a c u o l a r i n o r g a n i c p h o s p h a t e( p e a k 3 , r P o f ATP ( p e a k 4 ) , a - P o f A T P , U D P - G l c , a n d n i c o t i n a m i d e - a d e n i n e n u c l e o t i d e s ( p e a k s 5 , a n d 3 - P o f ATP ( p e a k 6 ) ( 2 0 ) .i n d u c e d A D H a c t i v i t y ( d a t a n o t s h o w n ) a n d m a k e b a r e l y d e -t e c t a b l e a m o u n t s o f e t h a n o l i n h y p o x i a ( F i g . 5 ) . M o r e o v e r ,w h e n s u c h r o o t t i p s b e c o m e h y p o x i c , t h e s t a b i l i z a t i o n o f c y -t o p l a s m i c pH a t a b o u t pH 6 . 8 s e e n i n n o r m a l r o o t t i p s ( F i g s .1 a n d 5 ) d o e s n o t o c c u r . I n s t e a d , c y t o p l a s m i c pH c o n t i n u e st o f a l l t h r o u g h o u t t h e h y p o x i c t r e a t m e n t ( F i g . 5 ) , p r e s u m a b l yd u e t o a c o n t i n u e d , t h o u g h l o w e r , r a t e o f l a c t a t e p r o d u c t i o n .T h i s l o w e r e d r a t e o f l a c t a t e p r o d u c t i o n e x p l a i n s why ATPv i r t u a l l y d i s a p p e a r s i n t h e h y p o x i c m u t a n t ( F i g . 6 a ) , i n s t e a do f t h e - 6 0 r e d u c t i o n s e e n i n n o r m a l h y p o x ic r o o t t i p s ( F i g .6 b ) ; n o t e t h a t t h e m u t a n t a n d n o r m a l m a i z e l i n e s h a v e v e r ys i m i l a r ATP l e v e l s i n t h e p r e s e n c e o f o x y g e n ( F i g . 6 ) . T h i sr e s u l t i n d i c a t e s t h a t l a c t i c f e r m e n t a t i o n c a n f u l f i l l t h e e n e r -g e t i c n e e d s o f h y p o x i c r o o t t i p s o n l y f o r s h o r t p e r i o d s o f t i m e( - 1 0 m i n ) .T h e s i m i l a r i t y o f t h e s e q u e n c e o f e v e n t s d e s c r i b e d f o r t h em a i z e ADH-1 n u l l t o t h a t s e e n i n i s c h e m i c a n d / o r h y p o x i cv e r t e b r a t e t i s s u e s 4 , 2 9 - 3 1 ) i s s t r i k i n g . I n v e r t e b r a t e s , l a c t i cf e r m e n t a t i o n , l i k e w i s e t h e o n l y m e t a b o l i c o p t i o n f o r r e g e n e r -a t i o n o f NAD+ n e c e s s a r y f o r c o n t i n u e d g l y c o l y s i s , r e s u l t s i na c o n t i n u a l c y t o p l a s m i c a c i d i f i c a t i o n t o pH v a l u e s c l o s e t o 6 ,u n t i l g l y c o l y s i s c e a s e s a n d i r r e v e r s i b l e c e l l i n j u r y r e s u l t s 4 ,1 1 , 1 2 ) . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t s o m e p r o t e c t i o n o f r a th e a r t s f r o m i s c h e m i c d a m a g e was a f f o r d e d b y p r e p e r f u s i n gt h e m w i t h a s t r on g b u f f e r 4 . I n s u c h h e a r t s , t h e r a t e o f c y t o -p l a s m i c a c i d i f i c a t i o n was s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d d u r i n gi s c h e m i a , h i g h g l y c o l y t i c r a t e s w e r e m a i n t a i n e d f o r l o n g e r ,a n d ATP a n d p h o s p h o c r e a t i n e l e v e l s f e l l m o r e s l o w l y ; o nr e p e r f u s i o n , c o m p l e t e r e c o v e r y o f c y t o p l a s m i c p H , A T P ,a n d p h o s p h o c r e a t i n e was s e e n 4 . I t a p p e a r s , t h e n , t h a t t h eg r e a t l y d i m i n i s h e d r e s i s t a n c e o f ADH-1 n u l l s t o h y p o x i a ( 3 2 )i s d u e p r i m a r i l y t o a n i n a b i l i t y t o r e g u l a t e c y t o p l a s m i c p H .T h e e x p l a n a t i o n f o r w h y r o o t s o f p l a n t s p e c i e s d i f f e r i n t h e i ra b i l i t y t o w i t h s t a n d h y p o x i a - a l t h o u g h a p p a r e n t l y a l l u n d e r -g o a m a i n l y e t h a n o l i c f e r m e n t a t i o n 9 , 3 3 , 3 4 ) - r e m a i n s t o b ed e t e r m i n e d .

W e t h a n k D r . M . F r e e l i n g f o r s e e d s a m p l e s a n d u s e f u l d i s c u s -s i o n , D r . P . M . R a y f o r a c c e s s t o l a b o r a t o r y e q u i p m e n t a n d a d v i c e ,a n d t h e C a r n e g i e I n s t i t u t i o n o f W a s h i n g t o n , D e p a r t m e n t o f P l a n tB i o l o g y , f o r u s e o f t h e f l u o r o s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h i s w o r k w a ss u p p o r t e d b y N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n G r a n t s P C M 8 2 - 0 4 8 7 7a n d G P 2 3 6 3 3 a n d N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h G r a n t R R O O 7 1 1 . J . C .i s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h T r a i n i n g G r a n tG M 0 7 2 7 6 - 0 8 .

1 . S a c h s , M . M . , F r e e l i n g , M . O k i m o t o , R . ( 1 9 8 0 ) C e l l 2 0 , 7 6 1 -7 6 8 .2 . N e a l , M . J . G i r t o n , R . E . ( 1 9 5 5 ) Am . J . B o t . 4 2 , 7 3 3 - 7 3 7 .3 . L e b l o v a , S . , Z i m a , J . P e r g l e r o v d , E . ( 1 9 7 6 ) A u s t J . P l a n tP h y s i o l . 3 , 7 5 5 - 7 6 1 .4 . G a r l i c k , P . B . , R a d d a , G . K . S e e l e y , P . J . ( 1 9 7 9 ) B i o c h e m .J . 1 8 4 , 5 4 7 - 5 5 4 .5 . H o c h a c h k a , P . W. ( 1 9 8 0 ) L i f e W i t h o u t O x y g e n : C l o s e d a n dO p e n S y s t e m s i n H y p o x i a T o l e r a n c e ( H a r v a r d U n i v . P r e s s ,C a m b r i d g e , M A ) .6 . G o d d a r d , D . R . B o n n e r , W . D . ( 1 9 6 0 ) i n P l a n t P h y s i o l o g y :A T r e a t i s e , e d . S t e w a r d , F . C . ( A c a d e m i c , New Y o r k ) , V o l .1 A , p p . 2 0 9 - 3 1 2 .7 . E f f e r , W . R . R a n s o n , S . L ( 1 9 6 7 ) P l a n t P h y s i o l . 4 2 , 1 0 4 2 -1 0 5 2 .8 . K o b r , M . J . B e e v e r s , H . ( 1 9 7 1 ) P l a n t P h y s i o l . 4 7 , 4 8 - 5 2 .9 . S m i t h , A . M . a p R e e s , T ( 1 9 7 9 ) P l a n t a 1 4 6 , 3 2 7 - 3 3 4 .1 0 . R o b e r t s , J . K . M . , Wemmer, D . , R a y , P . M . J a r d e t z k y , 0 .( 1 9 8 2 ) P l a n t P h y s i o l . 6 9 , 1 3 4 4 - 1 3 4 7 .1 1 . D a w s o n , M . J . , G a d i a n , D . G . W i l k i e , D . R . ( 1 9 7 8 ) N a t u r e( L o n d o n ) 2 7 4 , 8 6 1 - 8 6 6 .1 2 . H o c h a c h k a , P . W. Mommsen, T . P . ( 1 9 8 3 ) S c i e n c e 2 1 9 ,1 3 9 1 - 1 3 9 7 .1 3 . D a v i e s , D . D . D a v i e s , S . ( 1 9 7 2 ) B i o c h e m . J . 1 2 9 , 8 3 1 - 8 3 9 .1 4 . D a v i e s , D . D . , G r e g o , S . K e n w o r t h y , P . ( 1 9 7 4 ) P l a n t a 1 1 8 ,2 9 7 - 3 1 0 .1 5 . C h a n c e , B . , C o h e n , P . , J o b s i s , F . S c h o e n e r , B 1 9 6 2 S c i -e n c e 1 3 7 , 4 9 9 - 5 0 8 .1 6 . B e r g m e y e r , H . U . ( 1 9 7 4 ) M e t h o d s o f E n z y m a t i c A n a l y s i s ( A c -a d e m i c , New Y o r k ) , 2 n d E d.

3 3 8 2 B o t a n y : R o b e r t s e t a L


5/5

B o t a n y : R o b e r t s e t a L1 7 . M o o n , R . B . R i c h a r d s , J . H . ( 1 9 7 3 ) J . B i o l . C h e m . 2 4 8 ,7 2 7 6 - 7 2 7 8 .1 8 . R o b e r t s , J . K . M. , W a d e - J a r d e t z k y , N . J a r d e t z k y , 0 . ( 1 9 8 1 )B i o c h e m i s t r y 2 0 , 5 3 8 9 - 5 3 9 4 .1 9 . R o b e r t s , J . K . M . J a r d e t z k y , 0 . ( 1 9 8 1 ) B i o c h i m . B i o p h y s .A c t a 6 3 9 , 5 3 - 7 6 .2 0 . R o b e r t s , J . K . M . , R a y , P . M . , W a d e- J a r de t zk y , N . J a r -d e t z k y , 0 . ( 1 9 8 0 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 8 3 , 8 7 0 - 8 7 2 .2 1 . S a g l i o , P . H . P r a d e t , A . ( 1 9 8 0 ) P l a n t P h y s i o l . 6 6 , 5 1 6 - 5 1 9 .2 2 . B a r k e r , J . , K h a n , M . A . A . S o l o m o s , T . ( 1 9 6 7 ) New P h y t o l .6 6 , 5 7 7 - 5 9 6 .2 3 . F a i z - u r - R a h m a n , A . T . M . , T r e w a v a s , A . J . D a v i e s , D . D .( 1 9 7 4 ) P l a n t a 1 1 8 , 1 9 5 - 2 1 0 .2 4 . S a g l i o , P . H . , R a y m o n d , P . P r a d e t , A . ( 1 9 8 0 ) P l a n t P h y s i o l .6 6 , 1 0 5 3 - 1 0 5 7 .2 5 . M a i n w o o d , G . W. W o r s l e y - B r o w n , P . ( 1 9 7 5 ) J . P h y s i o l .( L o n d o n ) 2 5 0 , 1 - 2 2 .

P r o c . N a t . A c a d . S c i . USA 8 1 ( 1 9 8 4 ) 3 3 8 32 6 . D a v i e s , D . D . ( 1 9 7 3 ) S y m p . S o c . E x p . B i o l . 2 7 , 5 1 3 - 5 2 9 .2 7 . S m i t h , F . A . R a v e n , J . A . ( 1 9 7 9 ) A n n u . R e v . P l a n t P h y s i o l .3 0 , 2 8 9 - 3 1 1 .2 8 . F r e e l i n g , M . B u c h l e r , J . A . ( 1 9 8 1 ) i n G e n e t i c E n g i n e e r i n g :P r i n c i p l e s a n d M e t h o d s , e d s . S e t l o w , J . K . H o l l a e n d e r , A .( P l e n u m , New Y o r k ) , V o l . 3 , p p . 2 2 3 - 2 6 4 .2 9 . G a d i a n , D . G . , H o u l t , 0 . I . , R a d d a , G . K . , S e e l e y , P . J . ,C h a n c e , B . B a r l o w , C . ( 1 9 7 6 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA7 3 , 4 4 4 6 4 4 4 8 .3 0 . H o l l i s , D . P . , N u n n a l l y , R . L . , T a y l o r , G . J . , W e i s f e l d t , M . L . J a c o b u s , W . E . ( 1 9 7 8 ) J . M a g n . R e s o n . 2 9 , 3 1 9 - 3 3 0 .3 1 . Wemmer, D . , W a d e - J a r d e t z k y , N . , R o b i n , E . J a r d e t z k y , 0 .( 1 9 8 2 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 2 0 , 2 8 1 - 2 8 7 .3 2 . S c h w a r t z , D . ( 1 9 6 9 ) Am . N a t . 1 0 3 , 4 7 9 - 4 8 1 .3 3 . S m i t h , A . M . a p R e e s , T . ( 1 9 7 9 ) P h y t o c h e m i s t r y 1 8 , 1 4 5 3 -1 4 5 8 .3 4 . A l p i , A . B e e v e r s , H . ( 1 9 8 3 ) P l a n t P h y s i o l . 7 1 , 3 0 - 3 4 .

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