mbk 1 ders1 giriş

8/8/2019 MBK 1 ders1 giri

1/21

MOLEKLER BYOLOJDEMOLEKLER BYOLOJDEKULLANILAN YNTEMLER IKULLANILAN YNTEMLER I

DERS 1DERS 1

Prof. Dr. Dr. ule ARIProf. Dr. Dr. ule ARIMolekler Biyoloji ve GenetikMolekler Biyoloji ve Genetik

BlmBlm

20052005--20062006


2/21

Molekler biyolojiMolekler biyolojiMolekler dzeyde biyolojik olaylar,Molekler dzeyde biyolojik olaylar,

eitli hcresel sistemler arasndakieitli hcresel sistemler arasndakietkileimleri inceleretkileimleri inceler DNA, RNA, proteinlerDNA, RNA, proteinler

Arasndaki ilikiler Arasndaki ilikiler

EtkileimlerEtkileimler Etkileimlerin nasl dzenlendiiEtkileimlerin nasl dzenlendii

alma konulardralma konulardr


3/21

Molekler biyologlarMolekler biyologlarGenetikGenetik

BiyokimyaBiyokimyaBiyofizikBiyofizik

tekniklerini kullanrlartekniklerini kullanrlar

Bu farkl disiplinler i iedirBu farkl disiplinler i iedir


4/21

Molekler biyolojiMolekler biyoloji -- dierdier

biyolojik bilimler ilikisibiyolojik bilimler ilikisi

genlerproteinler

ilev

Biyokimya

Molekler

biyoloji

Genetik


5/21

19501950--1960lar1960larMolekler hcre bileenlerininMolekler hcre bileenlerininTanmlanmasTanmlanmas

zolasyonuzolasyonu

KullanmlarKullanmlar

olas hale gelmitir.olas hale gelmitir.


6/21

Molekler hcre bileenleri;Molekler hcre bileenleri;DNADNA genetik bilgi deposugenetik bilgi deposu

RNARNA transkripsiyon, translasyontranskripsiyon, translasyonProteinlerProteinler yapsal ve enzimatikyapsal ve enzimatikbileenlerbileenler


7/21

Molekler hcre bileenleriMolekler hcre bileenleri

(DNA,RNA ve Proteinler)(DNA,RNA ve Proteinler) ileilemolekler almalarmolekler almalar

Biyolojik olaylarn mekanizmalarnnBiyolojik olaylarn mekanizmalarnn

anlalmasanlalmasBiyoteknolojiBiyoteknoloji -- TpTp

-- Tarm & HayvanclkTarm & Hayvanclk

-- GdaGda-- evre & Enerjievre & Enerji


8/21

Nkleik Asitlerin zolasyonuNkleik Asitlerin zolasyonuYap ve ilevlerinin aydnlatlmasYap ve ilevlerinin aydnlatlmas

Gen anlatmGen anlatm

Gen anlatmnn dzenlenmesiGen anlatmnn dzenlenmesi Genetik mhendisliiGenetik mhendislii

Genomik ve proteomik almalarGenomik ve proteomik almalar

Bu amalar iin ncelikle nkleik asitlerin yksekBu amalar iin ncelikle nkleik asitlerin ykseksaflkta izole edilmeleri gerekirsaflkta izole edilmeleri gerekir


9/21

DNA zolasyonuDNA zolasyonu DNA hcrede proteinler, katyonlar yardmylaDNA hcrede proteinler, katyonlar yardmyla

younlam durumda bulunuryounlam durumda bulunur

Proteinlerle ilikisi ilevleri gereidirProteinlerle ilikisi ilevleri gereidir R:R: gen anlatmgen anlatm -- dzenleyici proteinlerdzenleyici proteinler

transkripsiyontranskripsiyon -- RNA polimerazlarRNA polimerazlar

hasar onarmhasar onarm -- DNA polimeraz, DNADNA polimeraz, DNAligazligazbakteriyofajbakteriyofaj -- protein klfprotein klf


10/21

DNA saflatrlmasnn temelDNA saflatrlmasnn temel

aamalaraamalar1)1) Hcre eperi ve membranlarnn paralanarak yksekHcre eperi ve membranlarnn paralanarak yksek

molekl arlkl DNAnn serbestletirilmesimolekl arlkl DNAnn serbestletirilmesi2)2) Denatrasyon veya proteoliz yoluyla DNADenatrasyon veya proteoliz yoluyla DNA--proteinprotein

kompleksinin zlmesikompleksinin zlmesi3)3) DNAnn dier molekllerden ayrlmasDNAnn dier molekllerden ayrlmas

alma amacna (klonlama, dizi analizi vb.) balalma amacna (klonlama, dizi analizi vb.) bal

olarakolarak ileri saflatrma yntemlerininileri saflatrma yntemlerinin uygulanmasuygulanmasFarkl DNA molekllerinin (Farkl DNA molekllerinin (kromatografik,kromatografik,spektrofotometrik yntemlerlespektrofotometrik yntemlerle) fraksiyonlandrlmas) fraksiyonlandrlmas


11/21

Prokaryotik DNA zolasyonuProkaryotik DNA zolasyonu

Bakteri DNAs asal (Bakteri DNAs asal (kromozomalkromozomal) ya da) ya daekstrakromozomalekstrakromozomal (plazmit,bakteriyofaj)(plazmit,bakteriyofaj)oluuna bal olarak farkl yntemlerleoluuna bal olarak farkl yntemlerleizole edilirizole edilir


12/21

Prokaryotik kromozomal DNAProkaryotik kromozomal DNA

zolasyonuzolasyonuAAMA 1AAMA 1Hcre duvarnn zayflatlmas:Hcre duvarnn zayflatlmas:

Fiziksel yntem: dondurupFiziksel yntem: dondurup--zmezmeKimyasal yntem: lizozim uygulamasKimyasal yntem: lizozim uygulamaskelatr (kelatr (EDTAEDTA))kullanmkullanm

Lizozim:Lizozim: Kelatr:Kelatr: metalmetaliyonlarnniyonlarnnbalanmasn artrarakbalanmasn artrarakkelmeyi hzlandrankelmeyi hzlandrankimyasal ajanlarkimyasal ajanlar


13/21


zolasyonuzolasyonuAAMA 2AAMA 2

Hcre zarnn paralanmas:Hcre zarnn paralanmas:

1.1. Fiziksel yntemler:Fiziksel yntemler: HomojenizasyonHomojenizasyon

UltrasonikasyonUltrasonikasyon

Ozmotik okOzmotik ok


14/21



Hcre zarnn paralanmas:Hcre zarnn paralanmas:

2.2. Kimyasal yntemler:Kimyasal yntemler: Deterjan kullanmDeterjan kullanm SDSSDS (sodyum dodesil(sodyum dodesil

slfat)slfat) SDS pH ve uygun iyonSDS pH ve uygun iyonkonsantrasyonunda lipoproteinlerle birleir,konsantrasyonunda lipoproteinlerle birleir,

membranlarn lipoprotein ksmlarn sudamembranlarn lipoprotein ksmlarn sudaznr hale getirirznr hale getirirHCRE PARALANIR (HCRE PARALANIR (LZZLZZ))


15/21



RNAnn paralanmas iinRNAnn paralanmas iin RNAazRNAaz

Proteinlerin paralanmas iinProteinlerin paralanmas iin ProteazlarProteazlarKalan proteinler ve oligopeptitler iinKalan proteinler ve oligopeptitler iin fenolfenol--

kloroform ekstraksiyonukloroform ekstraksiyonu


16/21



DNA ieren fazn alkolle (Etanol) ktrlmesiDNA ieren fazn alkolle (Etanol) ktrlmesi

DNA gzle grlebilir, camDNA gzle grlebilir, cam

ubua sarlr !!!ubua sarlr !!!


17/21


zolasyonuzolasyonuleri saflatrmalarleri saflatrmalar

Diyaliz ile kalntlarn uzaklatrlmasDiyaliz ile kalntlarn uzaklatrlmas

CsClCsCl22 derecelenme santrifgasyonuderecelenme santrifgasyonu

Kromatografik ayrmKromatografik ayrm


18/21

Ekstrakromozomal DNAEkstrakromozomal DNA

zolasyonuzolasyonuKromozomal DNA uzaklatrlr !!!Kromozomal DNA uzaklatrlr !!!

Bakteriyofaj DNAs izolasyonu:Bakteriyofaj DNAs izolasyonu:

1.1. nfekte olmu bakteriden fajnfekte olmu bakteriden fajpartikllerinin izolasyonu ilepartikllerinin izolasyonu ilekromozomal DNAnn eliminasyonukromozomal DNAnn eliminasyonu

2.2. Proteaz ve/veya fenol uygulamasProteaz ve/veya fenol uygulamas3.3. leri saflatrmalarleri saflatrmalar


19/21


zolasyonuzolasyonuPlazmit DNAs izolasyonu:Plazmit DNAs izolasyonu:Kromozomal DNA izolasyonuna benzer !Kromozomal DNA izolasyonuna benzer !

1.1. ((Hcre eperi ve membranlarnnHcre eperi ve membranlarnnparalanarak yksek molekl arlklparalanarak yksek molekl arlklDNAnn serbestletirilmesiDNAnn serbestletirilmesi)) veve

2.2. ((Denatrasyon veya proteoliz yoluylaDenatrasyon veya proteoliz yoluylaDNADNA--protein kompleksinin zlmesiprotein kompleksinin zlmesi))aamalaraamalar ayndr.ayndr.


20/21


zolasyonuzolasyonuPlazmit DNAs izolasyonu:Plazmit DNAs izolasyonu:FARK;FARK; kromozomal ve plazmit DNAskromozomal ve plazmit DNAs

konfigrasyonlarnn fark nedeniyledir.konfigrasyonlarnn fark nedeniyledir.Plazmit DNAs:Plazmit DNAs: halkasal ve sper dnmldr.halkasal ve sper dnmldr.

Kromozomal ve plazmit DNAlarnnKromozomal ve plazmit DNAlarnndenatrasyonlarn (yksek scaklk, pH gibi)denatrasyonlarn (yksek scaklk, pH gibi)

takiben renatrasyon srelerinin farklartakiben renatrasyon srelerinin farklarayrma iin kullanlr.ayrma iin kullanlr.R:R: pH 12pH 12--12.5 plazmit DNAs denatre olmaz12.5 plazmit DNAs denatre olmaz


21/21

Plazmit DNAsPlazmit DNAs

mbk 1 ders1 giriş

Documents