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Material disponível no site http://www.ufsm.br/larp
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) ou Thin Layer Chromatography (TLC)
Prof. Renato Zanella (UFSM)
A cromatografia em camada delgada é outra forma de cromatografia onde o
material adsorvente fica sobre um vidro, alumínio ou filme plástico.
A separação pode ser convenientemente expressa como um fator de retardo
ou fator de retenção (Rf), definido como:
Rf A = dA/dS e Rf B = dB/dS 0 ≤ Rf ≤ 1
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- Rf difícil de reproduzir pois depende de:
natureza e granulometria do adsorvente
natureza do eluente, grau de ativação, técnica do operador, T e
quantidade amostra.
- Câmaras de eluição (tanque, sandwich, HPTLC); Preparo das placas
- Avaliação qualitativa, Avaliação semi-quantitativa
O exemplo de cromatografia mais clássico é a cromatografia em papel
onde uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical. O
papel é composto por moléculas extremamente longas chamadas celulose. A
celulose é um polímero polar com muitas regiões de altas e baixas
densidades de elétrons. A cromatografia em papel é uma das técnicas mais
simples e que requerem menos instrumentos para realização, porém também
apresenta as maiores restrições para realização em termos analíticos.
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Aplicação
ou
Eluição Resultado
Exemplos de aplicação:
Cromatograma de 10 óleos essenciais. Placa revelada com vanilina.
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CCD Bidimensional (Eluição efetuada em duas direções com solventes
diferentes)
CCD de clorofila Pigmentos utilizados em tinta de marcador preto (A), amarelo (B) e vermelho (D) são os mesmos. Vamos investigar se a tinta do marcador verde (C) é um corante só ou uma combinação.
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Revelação empregando derivatização pós-cromatográfica
Se as substâncias na placa não forem ativas em UV, a absorbância ou
fluorescência pode ser gerada pela imersão ou spray de reagentes
adequados, chamados reveladores.
Imersão para derivatização é indicada para:
� Aumentar a reprodutibilidade em determinações quantitativas
� Aumentar a proteção ambiental/higiene industrial
� Evitar contaminação do ambiente de trabalho
Revelação
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Contraceptivos
1 = cholesterol 4 = estriol 7* = contraceptive 2 10 = alpha norgestrel
2 = beta-estradiol 5 = diethyl stilbestrol 8 = progesterone 11 = cortisol
3 = estrone 6* = contraceptive 1 9 = norethindrone
Rf values
contraceptive 1 0.36, 0.25, 0.03
contraceptive 2 0.92, 0.35, 0.2, 0.02
cholesterol 0.75
beta-estradiol 0.25
estrone 0.5
estriol 0.05
diethyl stilbestrol 0.24
progesterone 0
norethindrone 0.4
alpha-norgestrel 0.6
cortisol 0
Based on a comparison of Rf values
and colorimetric identification, I
deduce that both unknown
contraceptives contain norethindrone
and beta-estradiol. Unfortunately, the
progesterone, estriol, and cortisol
standards did not give very clear
marks on the silica gel paper.
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Cromatografia de aminoácidos em papel
Na cromatografia em papel, por exemplo, a resolução de uma mistura de
solutos sobre um papel de filtro pode depender de uma variedade de
fenômenos, tais como adsorção à superfície do papel, troca iônica ou na
partição entre solventes.
Os aminoácidos podem ser separados por cromatografia em papel devido a
sua solubilidade que os diferentes tipos desta substância apresentam pela
água de hidratação ao redor das fibras de celulose e pela fase orgânica
móvel que flui através destas fibras. A solubilidade relativa dos aminoácidos
nestas duas fases pode ser mudada por alterações na polaridade do
solvente, ou no pH da solução, o qual irá alterar o estado iônico dos
aminoácidos. Sob um conjunto adequado de condições, então, cada
molécula de uma mistura irá se deslocar a uma diferente velocidade sobre a
fase estacionária e estará a uma distância específica de um do ponto de
origem, quando cessar o fluxo de solvente.
Os aminoácidos não absorverem luz no comprimento de onda visível, assim
a reação de ninhidrina é usada para este propósito por que reage com
grupamentos amino livres produzindo um composto colorido (usualmente
púrpura). Diversos aminoácidos, contudo, produzem diversas tonalidades de
cores com a ninhindrina, o que pode ajudar em sua identificação. A reação
da ninhindrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a
reação com a tirosina produz uma coloração azul metálica.
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CROMATOGRAFIA de ADSORÇÃO
....fenómeno de superfície que ocorre na interfase, implicando interacções
dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, pontes de hidrogénio, complexos p
FE: Adsorvente FM: Eluente
Sílica: silanol SiO2.xH2O; Alumina: Al3+, 02-
Influenciada por:
• Natureza da FE
• Solubilidade substâncias FM
• Capacidade adsorção na FE para cada substância
FE Inorgânicas:
• Sílica • Alumina ácida, básica ou neutra • Florisil
FE Orgânicas:
• Celulose • Poliamidas • “Sephadex”
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Poder adsorvente das fases estacionárias
Poder adsorvente da silica (maior afinidade = maior retenção = menor Rf)
Polaridade dos solventes
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“Efeito de Bordo” = Saturação da Câmara Deficiente ou Excesso de amostra
HPTLC – High Performance Thin Layer Chromatography
Instrumental TLC usada para descrever uma técnica moderna, instrumental e
de alta performance, onde a avaliação é feita através de equipamentos e
software
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Princípio do Método
Separação de misturas de compostos moleculares através da migração
diferencial dos mesmos entre duas fases: uma fixa (ou estacionária) e outra
móvel, que desliza sobre a primeira.
Ou também pode ser expresso como um procedimento de separação
microanalítico no qual os componentes de uma mistura são transportados
para diferentes distâncias em uma placa recoberta com uma fina camada de
material poroso. A espessura da camada pode variar de 100 a 250 mm.
A placa que serve de suporte em geral é de vidro, mas pode ser de plástico
ou de alumínio. A camada que recobre a placa recebe o nome de fase
estacionária e em geral é constituída de sílica gel.
O mecanismo de transporte é um solvente e é conhecido como fase móvel.
Primeiro a amostra é dissolvida em um solvente adequado, então, uma certa
alíquota desta solução é aplicada na região de partida e o conjunto é seco.
A placa de TLC/HLTPC é então colocada em uma câmara de
desenvolvimento ou cuba, o qual contém o solvente.
Inicia-se o que chamamos de desenvolvimento cromatográfico onde os
componentes da amostra são influenciados pela ação de duas forças,
opostas entre si:
Capilaridade: é a responsável pelo avanço do solvente ou fase móvel sobre
a fase estacionária que contém a amostra.
Interação: tão logo se inicia a migração da fase móvel, a amostra é
dissolvida e começa a ser arrastada pela fase móvel. Neste momento
aparecem forças de interação entre os componentes da amostra e a fase
estacionária. Estas forças de interação se opõem à força de arraste da fase
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móvel (capilaridade) retardando o avanço dos componentes da amostra.
Este retardo não ocorre da mesma forma para os diversos constituintes
presentes na amostra aplicada. Forças de interação como dipolo induzido,
pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals tomam parte neste processo,
fazendo ocorrer mecanismos de separação como adsorção, dispersão e
troca iônica.
Diferenças entre Placas de TLC e HPTLC
Placas comercialmente já preparadas são mais indicadas pois garantem boa
reprodutibilidade, devido à homogeneidade da aplicação da fase estacionária
no suporte.
Na tabela abaixo estão as diferenças entre as placas TLC e HPTLC
TLC HPTLC
Tamanho médio de
partículas 10 – 15 µm 5 – 7 µm
Distribuição de partículas Larga Estreita
Espessura da placa 250 µm 100, 200 µm
Número máximo de
amostras 12 36 – 72
Distância de migração 100 – 150 mm 30 – 50 mm
Tempo de migração 30 – 200 min 3 – 20 min
Quantidade de solvente 50 mL 5 – 10 mL
Limite de detecção Abs 100 – 1000 ng
Fluor 1 – 100 ng
Abs 10 – 100 ng
Fluor 0,1 – 10 ng