Master rad

Određivanje antioksidativnih karakteristika odabranih vrsta lubenica i dinja

Student Mentor Jelena Stanković dr Violeta Mitić

Niš, 2019

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA HEMIJU

Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u istraživačkim labaratorijama Katedre za analitičku i fizičku hemiju, Departmana za hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu. Veliku i iskrenu zahvalnost, ovom prilikom upućujem svojoj mentorki dr Violeti Mitić na izboru teme, stručnim savetima, ukazanom strpljenju i razumevanju. Posebnu zahvalnost ovom prilikom iskazala bih dr Jeleni Nikolić i Mariji Dimitrijević na nesebičnoj pomoći i beskrajnom strpljenju prilikom celokupne izrade ovog master rada. Najsrdačnije se zahvaljujem članu komisije, prof. dr Vesni P. Stankov-Jovanović, na korisnim savetima i sugestijama u završnoj fazi izrade koje su doprinele samom kvalitetu master rada. Zahvalnost dugujem i svim ostalim profesorima i saradnicima koje sam tokom studiranja upoznala, sa kojima sam sarađivala i od kojih sam mnogo naučila o hemiji i o životu. Zajedno smo došli do ovog kraja, koji predstavlja tek jedan novi uzbudljiv početak. Hvala baki i deki, zato što su bili uz mene, verovali u mene i pružali mi ogromnu podršku svo ovo vreme.

Posebno se zahvaljujem svom bratu Mihailu, jer sam na njega uvek i za sve mogla da računam. Na kraju se zahvaljujem svojim roditeljima na svestranoj pomoći i na tome sto su mi pomogli da shvatim da je u životu važno postavljati ciljeve i ne odustajati od započetog.

Sadržaj

1. Uvod …………………………………………………………………………………... 12. Teorijski deo …………………………………………………………………………... 3

2.1. Slobodni radikali …………………………………………………………………. 32.2. Oksidativni stress ………………………………………………………………… 52.3. Reaktivne vrste kiseonika ………………………………………………………… 62.4. Reaktivne vrste azota ……………………………………………………………. 82.5. Antioksidansi ……………………………………………………………………. 9

2.5.1. Primarna i sekundarna antioksidativna zaštita …………………………. 122.5.2. Fenolna jedinjenja ……………………………………………………… 162.5.3. Flavonoidi ………………………………………………………………. 18

2.6. Dinja i lubenica …………………………………………………………………... 212.7. UV-VIS spektrofotometrija………………………………………………………. 23

2.7.1.  UV-VIS spektrofotometar ……………………………………………… 262.8. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti ………………………………. 28

2.8.1. Metoda za određivanje ukupnog sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC) …………………………………………………. 30

2.8.2. Metoda određivanje ukupnog sadržaja flavonoida (Total flavonoid content – TFC) ………………………………………………………….

30

2.8.3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radical assay) . 312.8.4. ABTS metoda (Scavengig of 2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat)

Radical Assay) …………………………………………………………... 32

2.8.5. FRAP metoda (Ferric Reducing Antioxidant Power Assay) …………… 332.8.6. Ukupna redukciona moć TRP (Total reducing power) ………………… 342.8.7. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity) …………………… 34

3. Eksperimentalni deo …………………………………………………………………... 363.1. Aparatura i pribor ………………………………………………………………… 363.2. Korišćeni reagensi ………………………………………………………………... 363.3. Priprema ekstrakta lubenice i dinje ………………………………………………. 373.4. Metoda određivanja antioksidativne aktivnosti …………………………………. 41

3.4.1. Odredjivanje ukupnih fenola (TPC) …………………………………………. 413.4.2. TFC metoda …………………………………………………………………. 413.4.3. DPPH metoda ………………………………………………………………... 413.4.4. ABTS metoda ………………………………………………………………... 413.4.5. FRAP metoda ………………………………………………………………... 423.4.6. TRP metoda …………………………….……………………………………. 423.4.7. CUPRAC metoda ……………………………………………………………. 42

4. Rezultati i diskusija …………………………………………………………………… 444.1.Određživanje sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC) u

uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja ………………………………... 444.2.Određivanje sadržaja flavonoida (Total Flavonoid Content TFC)

uzorcimametanolnih ekstrakata lubenica i dinja ………………………………… 46

4.3.Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja primenom DPPH metode ……………………………………….

48

4.4. Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja primenom ABTS metode ……………………………………….

50

4.5.Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja primenom FRAP metode ……………………………………….

52

4.6.Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja primenom TRP metode ………………………………………….

54

4.7.Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja primenom CUPRAC metode …………………………………… 56

5. Zaključak …………………………………………………………………………...... 596. Literatura ……………………………………………………………………………. 61

Uvod

1 

1. Uvod

Antioksidansi su materije koje štite organizam od nepovoljnog uticaja slobodnih radikala.

Slobodni radikali svakodnevno nastaju u ljudskom organizmu. Reaguju sa najbližim stabilnim

molekulima pri čemu im oduzimaju elektrone. Na taj način destabilizovan molekul postaje slobodni

radikal, a reakcija postaje lančana što se rezultuje stvaranjem sve većeg broja slobodnih radikala koji

oštećuju ćelije organizma. Slobodni radikali su molekuli sa jednim ili vise nesparenih (slobodnih)

elektrona, koji teže da postanu stabilni, tako što bi “oduzeli” elektron nekom drugom molekulu.

Proces nastanka slobodnih radikala u ćelijama je neprekidan i “slučajan”. On je vezan za normalne

metaboličke reakcije. Biološki važni molekuli proteini, nukleinske kiseline i masti pod uticajem

slobodnih radikala, pretrpe oštećenje, i zato gube svoju funkciju i nepovoljno utiču na biohemijske

procese u organizmu. Na taj način pokreću štetnu reakciju koja se naziva oksidativni stres. Samim

tim, ćelije gube svoj integritet i postaju nefunkcionalne ili očtećene. Slobodni radikali se često vežu

i za genetski materijal i uzrokuju teška oštećena ćelija, što dovodi do niza oboljenja.

Genetika, pol, godine života, a prevashodno navike u ishrani utiču na količinu antioksidanasa u

organizmu, a samim tim i na njegovu sposobnost odbrane od uticaja slobodnih radikala. Antioksidansi

sprečavaju starenje, smanjuju rizik od raka, štite od pojave srčanih, plućnih i drugih oboljenja,

visokog krvnog pritiska i td. Zbog zagađenosti životne sredine i brzog načina života uloga

antioksidanasa za ljudsko zdravlje je od izuzetnog značaja.

Antioksidansi iz hrane imaju važnu ulogu u kontroli uticaja štete uzrokovane slobodnim

radikalima. Svaki nutrijent je unikatan u smislu strukture i antioksidativne funkcije. U supstance sa

potvrđenom antioksidativnom aktivnošću spadaju vitamin E, vitamin C, karotenoidi, selen, lipoinska

kiselina, koenzim Q10 i td. Najbolji izvor pomenutih supstanci je ishrana bogata svežim voćem i

povrćem (luk, paradajz, šargarepa, lubenica, spanać, grožđe, dinja, bobičasto voće, kelj, grašak, soja,

i orašasti plodovi). U letnjim mesecima posebnu pažnju privlače lubenice i dinje. Ove namirnice

sadrže velike količine fitonutrijenata od kojih treba izdvojiti vitamin C, likopen, vitamin E,

karotenoide i minerale. Lubenica i dinja povoljno utiču na organizam i sprečavaju oboljenja kao što

su anemija, astma, hemoroidi, pad imuniteta, stres, celulit, kamen i pesak u bubrezima.

Cilj ovog master rada bio je određivanje sadržaja ukupnih fenola i flavonoida kao i

antioksidativnih karakteristika odabranih vrsta lubenica i dinja često konzumiranih u Srbiji primenom

DPPH, ABTS, TRP, FRAP i CUPRAC metoda.

Teorijski deo

3 

2. Teorijski deo

2.1. Slobodni radikali

Molekul koji sadrži jedan ili više nesparen elektron naziva se slobodan radiklal (Halliwel B. i

sar., (2004)). Takvi molekuli su reaktivni i neselektivni. U zavisnosti od naelektrisanja mogu biti

pozitivni ili negativni (radikal katjoni i radikal anjoni), ali isto tako mogu biti i elektroneutralni.

Slobodni radikali nastaju homolitičkim raskidanjem veze (termolizom, fotolizom, zračenjem visoke

energije) ili oksidoredukcionim procesima.

U prooksidanse se ubrajaju različite hemijske vrste koje u biološkim i hemijskim sistemima

uzrokuju ili ubrzavaju reakcije oksidacije. Reaktivne prooksidativne vrste se dele na reaktivne

slobodnoradikalske i neradikalske vrste (oksidaciona sredstava koja lako prelaze u slobodne

radikale). Najvažnije reaktivne vrste kiseonika (ROS-od engl. reactive oxygen species), hlora (RCS-

od engl. reactive chlorine species) i azota (RNS RNS - od engl. reactive nitrogen species) prikazane

su u Tabeli 1 (Halliwel B. i sar., (2004)).

Slobodni radikali nastaju: termolizom, dejstvom elektromagnetnog zračenja, redoks reakcijama,

enzimskim reakcijama i hemijskim procesima.

 Slika 1. Nastajanje slobodnih radikala

Slobodni radikali oštećuju sve ćelijske strukture: ćelijsku membranu i ćelijske organele, a najveća

šteta nastaje kada dođe do oštećenja genetskog materijala. Izmena genetskog materjala dovodi do

nastanka malignih oboljenja, a razvijanjem kancerogenih ćelija razvija se tumor. U poslednje vreme

došlo je do epidemije malignih oboljenja. Pretpostavlja se da je to velikim delom uticaj života pod

stersom, izloženosti stanovništva zagađenoj vodi, vazduhu i hrani

4 

Tabela 1. Najvažnije reaktivne slobodnoradikalske i neradikalske vrste

Slobodni radikali Neradikalski oblik

Reaktivne kiseonične vrste (ROS)

superoksid anjon, O2 •-;

hidroksi radikal OH•;

hidroperoksidni radikal, HO2 •;

peroksi radikal, RO2 •;

alkoksi radikal, RO•;

karbonatni radikal CO3•;

ugljendioksidni radikal, CO2•

vodonik peroksid H2O2;

hipobromna kiselina HOBr;

hipohlorna kiselina HOCl;

ozon, O3

singletni kiseonik 1O2;

organski peroksid ROOH;

peroksinitrit ONOO;

peroksinitritna kiselina ONOOH

Reaktive hloridne vrste (RCS)

atomski hlor Cl•;

hipohlorna kiselina HOCl;

nitril (nitronijum) hlorid NO2Cl;

hloramini

Reaktivne azotne vrste (RNS)

azotmonoksidni radikal NO•;

azotdioksidni radikal NO2

peroksinitrit ONOO•-

azotasta kiselina HNO2’

nitrozo katjon NO+;

nitroksidni anjon NO;

dinitrogen tetroksid N2O4;

dinitrogen trioksid N2O3

peroksinitrit ONOO;

peroksinitritna kiselina ONOOH;

nitronijum (nitril) katjon, NO2+;

alkilperoksinitriti, ROONO;

nitril (nitrinijum) hlorid, NO2Cl

5 

2.2. Oksidativni stres

Oksidativni stres je stanje u organizmu kada nije uspostavljena ravnoteža između stvorenih

slobodnih radikala i njihovog neutralisanja od strane antioksidativne zaštite organizma. Nastaje

najčešće u uslovima kada u organizmu postoji povećana količina slobodnih radikala i smanjena

količina antioksidanasa za njihovu neutralizaciju. U takvim uslovima dolazi do niza mnogih oboljenja

(arteroskleroza, kancer, kardiovaskularna oboljenja, astma, artitis, gastritis, dermatitis, dijabetes,

bolesti jetre, bolesti bubrega, Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest itd). 

Oksidativni stres se svrstava u normalnu pojavu (Živković.M, (1998)). Oksidacija je deo

biohemijskog funkcionisanja tela da stvara energiju koja je potrebna za život. U ovim procesima se

stvaraju slobodni radikali koji imaju svoje fiziološke pozitivne funkcije ((Ferreira AR i sar. (2006),

(Halliwell B. i sar. (1987)).

Izvori slobodnih radikala mogu biti endogeni i egzogeni.

U endogene izvore slobodnih radikala spadaju; stres, imunska odbrana, zapaljenja, povrede,

veliko fizičko opterećenje. Glavni izvori endogenih radikala u navedenim uticajima dele se na

enzimske i neenzimske.

U egzogene izvore slobodnih radikala spadaju duvanski dim, lekovi, način ishrane, neka

terapijska i okolna zračenja (Hoyt A i sar., (2008).

Slika 2. Oksidativni stres

6 

2.3. Reaktivne vrste kiseonika (ROS)

Na Zemlji organizmi opstaju zahvaljujući upotrebi molekulskog kiseonika (O2). Metabolički

procesi koji se odvijaju u ćelijama ovih organizama najveći deo kiseonika potpuno redukuju do vode.

Manji procenat ukupnog kiseonika (2-3 %) u ćelijama se transformiše u reaktivne kiseonične vrste

(Kojić D., (2009)) (Slika 2). One su u stanju da reaguju sa osnovnim ćelijskim biomolekulima i

strukturama i na taj način izazovu njihovu inaktivaciju (Halliwell B.i sar., (1985); Mimica D., (1997)).

Metabolit koji je nastao iz molekula kiseonika sadrzi modifikovane atome kiseonika i poseduju veću

reaktivnost od kiseonika u osnovnom molekulskom stanju.

ROS su slobodne radikalske vrste kiseonika koji se sastoje od atoma, molekula ili jona i imaju

jedan ili više nesparenih elektrona u svojoj strukturi (Sayre i sar., (1999); Cadenas E.i sar., (2000);

Božin B., (2009)). Reaktivne vrste kiseonika u organizmu ispoljavaju pozitivna i negativna dejstva.

Nastale kao sporedni proizvod normalnog metabolizma kiseonika, ROS igraju važnu ulogu u ćelijskoj

signalizaciji. Tako leukociti koriste ROS kao odbrambeni mehanizam u borbi protiv

mikroorganizama zbog citotoksične aktivnosti koju te čestice pokazuju. S druge strane, jako su

nestabilne i veoma reaktivne, zbog čega mogu izazivati lančane reakcije u organizmu. Sadrže

nesparene elektrone što im omogućava da reaguju sa drugim molekulima, stvarajući tako nove

radikale. Nastajanje ROS-a odvija se u organizmu u nizu kataboličkih i anaboličkih procesa: u

respiratornom lancu, oksidacijom ćelijskih biomolekula (tiola, hidrohinona, kateholamina,

oksihemoglobina), dejstvom enzima (ksantin oksidaze, lipooksigenaze, prostaglandin sintetaze i dr.),

i dejstvom dvovalentnih metalnih jona.

Slika 3. Nastajanja ROS-a i njihovo dejstvo

7 

Hiperprodukcija reaktivnih kiseoničnih vrsta može biti indukovana različitim endogenim

(proces respiracije, aktivnost fagocita, autooksidacija biomolekula) i egzogenim (jonizujuće i UV-

zračenje, kontaminirani vazduh, alkohol, ksenobiotici, pojedini lekovi, itd.) faktorima. U toku

odvijanja metaboličkih procesa nastaju jaki oksidansi kao što su superoksidni anjon radikal (O2•-),

vodonik peroksid (H2O2), peroksil radikal (ROO•) i hidroksil radikal (OH•). Jedinjenja koja nastaju

tokom reakcije su toksične kiseonične vrste u organizmu i nazivaju se pro-oksidansi (Gutteridge JM.

i sar., (1985); Arai S. i sar., (1987)).

Sa druge strane, jedinjenja koja smanjuju štetan uticaj pro-oksidanasa, njihovo stvaranje i

reakcije su antioksidansi (NADPH, GSH, vitamin C i vitamin E). Sa razvojem evolucije, razvijeni su

zaštitni mehanizmi koji sprečavaju nastanak ili razvoj već nastale pro-oksidativne vrste. Uticajem

različitih endogenih i/ili egzogenih faktora koji deluju na organizam, ova ravnoteža može da se naruši,

odnosno može da dođe do povećanog nastajanja pro-oksidanata i/ili smanjenja antioksidativne zaštite

organizma.

8 

2.4. Reaktivne vrste azota

U slobodnoradikalske reaktivne vrsta azota ubrajaju se azotmonoksidni radikal NO•

azotdioksidni radikal NO2• nitratni radikal, NO3•, dok su najvažnije neradikalske reaktivne vrste

nitrozil katjon, NO+ nitroksidni anjon, NO-. Od nabrojanih reaktivnih vrsta azota (RNS) najvažniji je

azot-monoksid radikal (NO ), koji je jedan od najproučavanijih molekula uopšte. To je mali molekul

koji sadrži jedan nespareni elektron u 2πy* razvezujućoj orbitali. Vreme trajanja ove čestice je

izuzetno kratko - svega nekoliko sekundi. Primarno se sintetiše u endotelnim ćelijama, ali i u

neutrofilima, makrofagama, Kupferovim ćelijama, nadbubrežnoj žlezdi, kao i u nervnim elijama.

Veoma je reaktivan i ima ulogu signalnog molekula u raznim fiziološkim procesima, uključujući

neurotransimisiju, regulaciju krvnog pritiska, relaksaciju glatke muskulature, regulaciju imunog

sistema NO• nastaje u biološkim tkivima pri konverziji L-arginina u L-citrulin pod dejstvom

azotoksid sintaze (tri izoenzima) uz odgovarajuću količinu kiseonika-

Sa superoksid anjon radikalom, gradi visoko toksični peroksinitritni radikal (ONOO-) koji se u

kiseloj sredini može transformisati u peroksinitritnu kiselinu (ONOOH), a dalje u OH radikal

(Squadrito GL. i sar,1998), (Dröge W., (2002)). Ovaj process dovodi do indukcije oksidativnog stresa.

Primarni ćelijski slobodni radikali, superoksid anjon radikal (O2•–) i azot-oksid (NO•), su vrlo

reaktivni i brzo mogu da proizvedu seriju novih slobodnih radikala. Tako, na primer, superoksid-

dismutaza (SOD) omogućava brzo razlaganje superoksid anjon radikala i nastanak vodonik-peroksida

(H2O2), koji je neradikalski agens, ali koji u reakciji sa Fe2+ prelazi u hidroksilni radikal (OH•). Smatra

se da je toksičnost NO radikala posledica njegove sposobnosti da produkuje OH radikal. Osim toga,

superoksid anjon radikal i azot-oksid međusobno brzo reaguju, formirajući peroksinitrit a potom i

ostale reaktivne azotne vrste. Pod dejstvom ONOOH dolazi do oksidacije SH-grupa proteina, lipidne

peroksidacije, iniciranja lančanih reakcija u DNK lancu, kao i do prekida DNK lanca.

Primarno mesto oksidacije NO je lipidni dvosloj membrane pošto su NO i O2 lipofilni molekuli.

Pošto je u hidrofobnom okruženju redukovani sadržaj H2O, glavni proizvod oksidacije NO sa O2 je

N2O3 čiji je primarni efekat nitrozovanje tj. nitrozativni stres. Nitrozovanjem amina nastaju

nitrozamini, koji su potencijalni kancerogeni. Nitrozovanjem SH grupa u proteinima, nastaju S-

nitrozotioli, pri čemu što za posledicu može da ima inhibiciju enzimske aktivnosti. N2O3 može da

dovede do dezaminacije azotnih baza u DNK, čime se menja struktura DNK i dolazi do mutacija.

9 

2.5. Antioksidansi

Antioksidansi su supstance koje imaju sposobnost suprotstavljanja štetnom efektu fiziološkog

procesa oksidacije u živim organizmima (Halliwel B., (1990)). Antioksidansi blokiraju proces

oksidacije ‘’neutrališući’’ slobodne radikale. Pri tome, sami antioksidansi postaju oksidovani.

antioksidans slobodni radikal

Slika 4. Mehanizam stabilizacije slobodnog radikala antioksidansom

Prvi stepen ćelijskog odgovora na oksidativni stres je antioksidativna odbrana i aktiviranje

sistema za reparaciju ćelijskih struktura oštećenih dejstvom slobodnih radikala. Iako živi organizmi

podležu starenju izazvanom dejstvom prooksidanasa, minimalna akumulacija oštećenih ćelijskih

komponenata se postiže višestrukim dejstvom antioksidativnih jedinjenja i enzima koji repariraju ili

uklanjaju oštećene komponente. Antioksidansi in vivo deluju tako što se sami oksiduju da bi zaštitili

važne ćelijske komponente od oksidacije ili katalitički konvertuju prooksidanse u manje reaktivna

jedinjenja, a takođe i razlažu i uklanjaju oksidacione proizvode. Na slici 5. je šematski prikazana

antioksidativna odbrana ćelijskog sistema.

Antioksidansi koji se nalaze u in vivo sistemima se generalno mogu svrstati u tri grupe:

enzimi;

metaloproteini;

niskomolekularni antioksidansi.

Definiciju o antioksidansima koja je trenutno važeća i najbolja dali su Halliwell i sar., (1990) po

kojoj je antioksidans supstanca koja, prisutna u malim koncentracijama u odnosu na supstrat koji se

oksiduje, značajno odlaže ili inhibira oksidaciju supstrata. Međutim, ova definicija ima i niz

nedostataka (Packer, (1994)). Ona je pogodna za molekule malih molekulskih masa, ali ne uzima u

obzir dejstvo enzima i metaloproteina kao antioksidanasa.

10 

Slika 5. Intracelularna organizacija antioksidativnog odbrambenog sistema.

Podela antioksidanasa može se izvršiti na više načina.

Po načinu delovanja na ljudski organizam klasifikovali su ih (Shi H. i sar. (2001)) na:

preventivne - sprečavaju nastanak slobodnih radikala;

"skevndžer" - poseduju sposobnost da "hvataju" slobodne radikale;

"reparacione" - deluju posebnim mehanizmima, obnavljajući ili uklanjajući oštećene vitalne

biomolekule koji nastaju u uslovima oksidativnog stresa. U "reparacione" antioksidanse

ubrajaju se fosfolipaze, proteaze, enzimi koji obnavljaju DNK, transferaze, itd.

Prema rastvorljivosti u vodi antiksidansi se dele na:

hidrosolubilne (vitamin C, mokraćna kiselina, bilirubin, albumin, glutation, neki polifenoli) i

iposolubilne (vitamini E i A, karotenoidi, neki polfenoli).

Prema mestu nastajanja antioksidansi se mogu podeliti na:

endogene

egzogene

Endogeni antioksidansi predstavljaju antioksidanse koji nastaju u ljudskom organizmu, dok se

egzogeni unose putem hrane ili lekova. Fenolna jedinjenja su jedna od najvažnijih grupa prirodnih

egzogenih antioksidanasa, čija je aktivnost uslovljena strukturnim karakteristikama.

Egzogeni antioksidansi mogu biti prirodne ili sintetičke supstance koje imaju sposobnost da se

suprotstave oksidaciji ili da inhibiraju reakcije koje iniciraju reaktivne vrste. U prirodne antioksidanse

ubrajaju se vitamin A, C i E, karotenoidi, minerali: selen i cink, bioflavonoidi, koenzim Q, likopen,

11 

dok od sintetičkih treba izdvojiti butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT),

propilgalat (PG) i tercbutilhidrohinon (TBHQ).

Slika 6. Sintetički antioksidansi

Vitamin E (α-Tokoferol)

Vitamin C i Koenzim Q10

Slika 7. Prirodni antioksidansi

Upotreba sintetičkih antioksidanasa je zabranjena u nekoliko zemalja zbog neželjenih mutagenih,

kancerogenih i teratogenih efekata koje ispoljavaju. Takođe, upotreba sintetičkih antioksidanasa je

ograničena, zbog sve većih zahteva potrošača za hranom bez aditiva. Zato poslednjih nekoliko

decenija veliki broj istraživanja bio je usmeren prema identifikaciji novih antioksidanasa iz prirodnih

izvora.

12 

2.5.1. Primarna i sekundarna antioksidativna zaštita

Mehanizam delovanja antioksidativne zaštite aerobnih organizama obuhvata primarnu i

sekundarnu antioksidativnu zaštitu.

U primarnu antioksidativnu zaštitu spadaju:

Superoksid-dismutaza (SOD);

Citosolna superoksid dismutaza (Cu, Zn-SOD);

Mitohondrijska superoksid dismutaza (Mn-SOD);

Vanćelijska (kstracelularna dismutaza (Ec-SOD));

Katalaza (CAT);

Glutation peroksidaza (GPx).

Superoksid-dismutaza (SOD) je grupa enzima koji opstaju u anaerobnim uslovima. Ulogu

imaju u procesima katalize reakcije dismutacije superoksid anjon-radikala do vodonik peroksida i

molekulskog kiseonika. U zavisnosti od obavljanja funkcije postoji više vrsta superoksid-dismutaza

koje se razlikuju po vrsti metala koji se nalazi u aktivnom centru (Cu, Mn, Zn, Fe, Ni).

Put kojim se može napisati SOD-katalizovana dismutacija superoksida za Cu, Zn SOD može se

opisati sledećim reakcijama:

Cu2+-SOD + O2− → Cu+-SOD + O2 (redukcija bakra; oksidacija superoksida)

Cu+ -SOD + O2− + 2H + → Cu2

+-SOD + H2O2 (oksidacija bakra; redukcija superoksida)

Opšti obrazac, koji se primenjuje na sve različite oblike koordinacije metala može se napisati na

sledeći način:

M(n+1) -SOD + O2−→ Mn+-SOD + O2

Mn+-SOD + O2−+ 2H+→ M(n+1) -SOD + H2O2.

Gde je : M = Cu (n=1);Mn (n=2);Fe (n=2);Ni (n=2).

Slika 8. Proces delovanja superoksid - dozmutaze (SOD) u procesu antioksidativne zaštite

13 

Citosolna bakar-cink superoksid dismutaza (CuZnSOD, protein SOD1) je veliki protein

koji sadrži bakar i cink, i prisutan je u citosolu, nukleusu, peroksizomima i mitohondrijskom

intermembranskom prostoru ljudskih ćelija. Aktivno redoks mesto predstavlja Cu, a za stabilizaciju

strukture aktivnog mesta važan je Zn.

Mn-SOD (Mitohondrijska superoksid dismutaza) nalazi se u formi tetramera i smeštena je

u mitohondrijama. Njena funkcija se ispoljava u procesima diferencijacije ćelija, genezi tumora, kao

i zaštiti od plućne intoksikacije izazvane hiperoksikacijom.

Ec-SOD (Vanćelijska (ekstracelularna dismutaza)) je smeštena u vanćelijskom prostoru.

U svom aktivnom centru sadrži Cu i Zn i prisutna je u zidu arterija van ćelija. Istraživanja ukazuju da

je ovaj enzim prisutan u dva oblka, ali je samo jedan od njih aktivan.

Uloga SOD-a je u tome da zaštiti NO sintetisan od strane endotelnih ćelija. Superoksidni anjon

može da stupi u reakciju sa azot monoksidom pri čemu nastaje toksičan peroksinitritni anjon (ONOO-

).

O2.-+ NO.→ ONOO-

Može se zaključiti da SOD kao antioksidans koji štiti NO, ima važnu protektivnu ulogu u

nastanku arteroskleroze i drugih kardiovaskularnih bolesti.

Katalaza (CAT) je tetramer koji u svakoj subjedinici sadrži hem grupu kao deo aktivnog

centra enzima. Učestvuje u katalizi razgradnje vodonik-peroksida do molekulskog kiseonika i vode.

Reakcija je dvostepena, potiskuje vezivanje dva molekula vodonik-peroksida:

CAT + H2O2 → Supstrat

Supstrat + H2O2 → CAT + H2O + O2

U procesu katalaze, glutation peroksidaza učestvuje u otklanjanju H2O2. a zatim redukovani

glutation (GSH) oblik u reakciji sa H2O2 prelazi u oksidovani oblik (GSSG) uz nastajanje vode: U

reakciji sa H2O2 redukovani oblik glutationa (GSH)

H2O2 + 2GSH → 2H2O + GSSG 

Glutation peroksidaza (GPx) je tetramerni enzim sa selenom u aktivnom centru koji uklanja

vodonik-peroksid i pri niskim koncentracijama, kada je mala verovatnoća za odigravanje reakcije. Za

neophodno kontinuirano odvijanje potrebna je stalna regeneracija oksidovanog oblika glutationa

(GSSG), to se postiže reakcijom koju katalizuje glutationreduktaza (GR):

GSSG + 2NADPH + H+ → 2GSH + NADP+

14 

Enzim glutation S-transferaza katalizuje vezivanje glutationa preko sulfhidrilnih grupa za

elektrofilne centre hidrofobnih molekula. Molekuli na ovaj način postaju rastvorljiviji u vodi i lakše

se transportuju do vakuole.

U primarnu antioksidativnu zaštitu ubrajaju se i neenzimske supstance kao što su proteini,

transferin i ceruloplazmin, zatim albumin, mokraćna kiselina i bilirubin.

Slika 9. Proces katalizacije glutationreduktaza (GR)

U sekundarnu antioksidativnu zaštitu ubrajaju se niskomolekularna jedinjenja različitog

porekla i karaktera, kao što su: ubihinon, L-askorbinska kiselina, tokoferoli, karotenoidi, fenoli i

njihove kiseline, flavonoidi, derivati hidroksicinamata i dr. Struktura ovih jedinjenja veoma je

raznovrsna, a samim ti su različiti mehanizmi kojima ona ostvaruje svoju aktivnost u sistemu

antioksidativne zaštite. Smatraju se hvatačima ("skevendžeri") slobodnih radikala, donorima protona,

inhibitorima enzimskih sistema, helatorima jona prelaznih metala, itd. Ovde se takodje ubrajaju i

enzimi koji imaju ulogu otklanjanjaoksidativnih oštećenja nukleinskih kiselina, lipida i proteina. Ovi

enzimi obnavljaju oštećene delove DNK, uklanjaju oksidovane masne kiseline membranskih lipida i

kroz procese resinteze obnavljaju oksidovane aminokiseline i protein.

U jedinjenja odgovorna za sekundarnu antioksidativnu zaštitu spadaju:

L-askorbinska kiselina ili vitamin C je najefikasniji redukujući hidrosolubilni antioksidans.

Pri pH=7,4 čak 99,95% vitamina C je u obliku monoanjona AscH- (askorbat), 0,05% kao AscH2 i

0,004% kao dianjon AscH2−. Monoanjon AscH− je donorski antioksidans koji predaje vodonikov

atom reaktivnim slobodnim radikalima R• sa visokim vrednostima redukcionog potencijala (OH•,

RO•, LOO•), formirajući stabilan askorbil radikal, koji u biološkim sistemima nije protonovan

(AscH•), već je prisutan u formi anjona semidehidroaskorbil radikala ili askorbil anjon radikala

(Asc•−). Unosom velikih doza ovog vitamina i u uslovima povećane koncentracije metala, odnosno u

procesu destrukcije tkiva i oslobađanja metala iz kompleksa sa proteinima, vitamin C može delovati

15 

prooksidativno redukujući Fe 3+ u Fe 2+, uslovljavajući Fentonovu reakciju i nastajanje hidroksil

radikala.

Fe 3+ + L-askorbinska kiselina → Fe 2++ dehidroksiaskorbinska kiselina

Fe2+ + H2O2 → OH• + OH- + Fe 2+,

Slika 10. Oksidacija Akskorbinske kiseline

Vitamin E (-tokoferol) je grupa od osam liposolubilnih jedinjenja, koja obuhvata tokoferole

i tokotrienole (Brigelius F. i sar. (1999)). Među različitim formama vitamina E, γ-tokoferol je najčešći

u severno američkoj ishrani, dok α-tokoferol ima taj status u Evropi (Traber, (1998)). γ-Tokoferol se

može naći u kukuruznom ulju, sojinom ulju, margarinu i prelivima za salatu. α-Tokoferol je biološki

najaktivnija forma vitamina E (Bieri E. i sar. (1974)). Ova varijanta vitamina E je zastupljena u ulju

pšeničnih klica, suncokreta i šafranike (Brigelius F. i sar., (1999)). On je u masti rastvoran

antioksidans koji zaustavlja produkciju reaktivnih vrsta kiseonika formiranih tokom oksidacije masti

(Herrera B. i sar, (2001)). Tokoferoli su vrlo rasprostranjeni u hrani. Bogati izvor vitamina E su biljna

ulja, posebno suncokretovo, semenke, bademi, kikiriki, jaja i dr. Preporučene dnevne količine su za

odraslu ženu 8 mg, a za odraslog zdravog muškarca 10 mg.

Vitamin C redukuje radikal vitamina E na prelazu iz lipidne u vodenu fazu

Slika 11. Vitamin E

16 

2.5.2. Fenolna jedinjenja

Polifenolna jedinjenja predstavljaju široko rasprostranjenu grupu biljnih metabolita koja

mogu biti vrlo jednostavne strukture, kao što su fenolne kiseline, ili vrlo složena polikondenzovana

jedinjenja poput tanina. Zajednička karakteristika fenolnih jedinjenja je da sadrže aromatičan prsten

sa jednom ili više hidroksilnih grupa. Fenolna jedinjenja su veoma značajna kako za organoleptičke

osobine hrane tako i za njene pozitivne zdravstvene efekte. Najvažnija dejstva fenolnih jedinjenja su:

antioksidativno, antibakterijsko i antivirusno.

Slika 12. Fenolna jedinjenja

Iz uzoraka prirodnog porekla od sada je izolovano i identifikovano nekoliko hiljada fenolnih

jedinjenja. Ova jedinjenja spadaju u sekundarne metabolite i obično se ne nalaze u slobodnom obliku,

već u obliku estara, glikozida ili kondenzovanih proizvoda.

Flavonoidi i fenolne komponente mogu da deluju kao snažni antioksidansi (Sakihama i sar.,

2002; Janićijević-Hudomal i sar., (2008)). Antioksidativna aktivnost fenola rezultat je njihove

sposobnosti da budu donori vodonikovog atoma, pri čemu prelaze u manje reaktivne fenoksilradikale

(Huda-Faujan N. i sar., (2009)):

Ph-OH + ROO∙ → Ph-O∙ + ROOH

Ph-OH + ꞏOH → H2O + Ph-O∙

S porastom molekulske mase antioksidativna aktivnost polifenola se smanjuje.

Najčešća klasifikacija fenolnih jedinjenja u osnovi ima broj ugljenikovih atoma vezanih za osnovni

skelet fenola (Tabela 2)

17 

Tabela 2. Glavne strukturne klase fenolnih jedinjenja

Broj C

atoma C

C skelet Klase biljnih fenola

6 C6 prosti fenoli

7 C6-C1 hidroksibenzoati

8 C6-C2 acetofenoni i fenilacetati

9 C6-C3 hidroskicinamati, fenilpropeni,

kumarini i hromoni

10 C6-C4 naftohinoni

13 C6-C1-C6 ksantoni

14 C6-C2-C6 stilbeni i antrahinoni

15 C6-C3-C6 flavonoidi

18 (C6-C3)2 ilignan

30 (C6-C3-C6)2 biflavonoidi

N

(C6) n katehol melanini

(C6-C3) n lignini

(C6-C3-C6) n kondenzovani tanini

Antioksidativnu aktivnost polifenolna jedinjenja ispoljavaju u biološkim sistemima na

različite načine i to:

doniranjem H – atoma, direktnim vezivanjem ("hvatanjem") slobodnih kiseoničnih i azotnih

radikala

heliranjem prooksidativnih metalnih jona (Fe2+, Cu2+, Zn2+ i Mg2+),

aktiviranjem antioksidacijskih enzima,

inhibicijom prooksidativnih enzima (lipoksigenaza, NAD(P)H oksidaza, ksantinoksidaza,

oksidaza, enzimi citohroma P-450)

Fenolna jedinjenja nisu ravnomerno rasprostranjena u biljnim tkivima. Najznačajniji izvori

fenolnih jedinjenja, a time i izvori antioksidanasa su razni napici (crno vino, voćni sokovi, zeleni i

crni čaj, kafa, pivo), kakao, crna čokolada, jezgrasto voće (lešnik, badem, kikiriki), šljive, grožđe,

borovnice, brusnice, kupine, maline, jabuke, masline, soja, integralne žitarice, brokoli, celer itd.

18 

2.5.3. Flavonoidi

Flavonoidi predstavljaju grupu fenolnih jedinjenja 2-fenil-benzopiranske strukture

(Ghasemzadeh A. i sar., (2011); Sandhar H.K. i sar., (2011)). Imaju 15 C atoma raspoređenih u

osnovnoj strukturi C6-C3-C6, od kojih devet pripada benzopiranskom prstenu (benzenov prsten A,

kondenzovan sa piranskim prstenom C). Ostalih šest C-atoma čine benzenov prsten (B) povezan sa

benzopiranskim prstenom (Beecher G.R., (2003)). Moguće su brojne modifikacije osnovne strukture

flavonoida, kao što su dodatne hidroksilacije, dimerizacije, vezivanje neorganskog sulfata. Najvažnija

modifikacija je glikolizacija hidroksilnih grupa (nastajanje O-glikozida) ili flavonoidnog jezgra

(nastajanje C-glikozida).

Slika 13. Osnovni skelet flavonoida

Flavonoidi su široko rasprostranjeni u biljnim organizmima odakle je izolovano preko 4.000

flavonoida. Kao biljni pigmenti, odgovorni za boju cvetova, listova i plodova biljaka. Nijanse boje se

kreću od bele do žute, osim kod antocijanidina koji su odgovorni za skoro sve ružičaste i ljubičaste

nijanse

Osim što predstavljaju biljne pigmente, flavonoidi takođe doprinose ukusu, najčešće gorčini i

oporosti biljaka u kojima se nalaze. Ova klasa jedinjenja nesumnjivo učestvuje i u odbrambenom

sistemu jer su oporost i gorčina koju daju biljkama neprijatni biljojedima, među koje spada i čovek,

a takođe štite biljku i od štetnog dejstva UV zračenja

Klase flavonoida međusobno se razlikuju prema oksidacionom statusu heterocikličnog

prstena C i poziciji vezivanja B prstena. Flavonoidi se na osnovu oksidacionog stanja prstena C mogu

podeliti u  dvanaest klasa: flavoni, izoflavoni, flavanoni, flavonoli, flavanoli, flavani, katehini,

antocijanidini, leukoantocijanidini, halkoni, dihidrohalkoni i auroni (slika 13). Najrasprostranjeniji

flavonoidi su flavonoli i flavoni.

19 

Slika 14. Podela flavonoida na osnovu oksidacionog stanja prstena

Flavonoidi se ponašaju kao: antioksidansi, inhibitori enzima, fotosenzibilizatori i prenosioci

energije, a takođe imaju i antikancerogene osobine.

Flavonoidi se javljaju u slobodnom ili u polimernom obliku. Estri flavonoida sa šećerima i

neflavonoidima, prevashodno taninskim kiselinama, nazivaju se glikozidima. Najčešće se nalaze u

obliku monoglikozida, a ređe u obliku di i tri glikozida. Glikozide najčešće grade sa D-glukozom, D-

galaktozom i L-ramnozom. Ostali monosaharidi su manje zastupljeni.

Zbog svoje specifične strukture flavonoidi su potencijalni prirodni antioksidansi. Prisustvo

flavonoida dovodi do prekidanja slobodno-radikalskih reakcija, pri čemu oni predaju atom vodonika

radikalima i sami postaju slobodni radikali. Ovako nastali slobodni radikali rezonantno su

stabilizovani i nemaju dovoljno energije da pokrenu lančanu reakciju sa supstratom.

Biološka i farmakološka svojstva flavonoida u vezi su sa inhibicijom određenih enzima i

njihovom antioksidativnom aktivnošću. Brojna istraživanja ukazuju da je antioksidativna aktivnost

flavonoida znatno veća od aktivnosti vitamina C i E, kao i od mnogih komercijalnih sintetičkih

20 

preparata (Michalak A., (2006); Dragović-Uzelac V. i sar., (2009)). Antioksidativna svojstva

flavonoida mogu ispoljiti na nekoliko načina:

uklanjanjem hidroksil radikala, peroksi radikala, „hvatači“ su superoksid anjon radikala

uklanjanjem singletnog kiseonika

aktiviranjem antioksidantnih enzima indukujući enzime II faze detoksikacije (NAD(P)H

oksidoreduktazu, glutation S-transferazu i UDP-glukuronozil transferazu) koji

predstavljaju glavne sisteme odbrane od elektrofilnih toksikanata i oksidativnog stresa (

Malbert Y., (2014))

redukući α-tokoferol radikal koji je potencijalni prooksidans (Aziza A. i sar., (2010))

sprečavanjem Fentonove reakcije, što je uslovljeno rasporedom hidroksilnih grupa u

molekulu i omogućavanjem građenja stabilnih helatnih kompleksa sa jonima gvožđa i

bakra (Ferrali M. i sar., (1997)).

Glikozilacija jedne ili više -OH grupa flavonoida znatno smanjuje antioksidativnu aktivnost.

Pored antioksidativne aktivnosti, flavonoidi pokazuju i prooksidantnu aktivnost koja je direktno

proporcionalna ukupnom broju hidroksilnih grupa u molekulu flavonoida (Hanasaki Y. i sar., (1994)).

Takođe, flavonoidi pokazuju antiinflamatornu, antialergijsku, antimikrobnu, hepatoprotektivnu,

antiviralnu, kardioprotektivnu, antidijabetsku, antikancerogenu i mnoge druge aktivnosti.

21 

2.6. Dinja i lubenica

Dinja (Cucumis melo) je jednogodišnja biljka koja se ubraja u porodicu Cucurbitaceae. Zbog

toga se može smatrati povrćem, ali je ipak većina koristi kao voće. Uzgaja se uglavnom u Aziji, SAD-

u, Meksiku, ali i u mnogim mediteranskim zemljama. Naziva se još dina, melon, pekun, pipun i

pepun. Daje žute, mesnate, sočne i slatke plodove. U ishrani može da se koristi plod i seme. Dinja

sadrži karotenoide, folnu kiselinu i vitamin C, manje količine vitamina B: B2, B3, B4, B5, B6 i vitamin

E, fosfate i vitamin C. Od minerala sadrži: kalcijum, magnezijum, fosfor, kalijum, natrijum, sumpor,

cink, gvožđe i bakar. Od plodova se često pravi kompot, džem, marmelada, a najčešće se koristi u

svežem stanju. Dinja ima pozitivne učinke na zdravlje organizma. Štiti organizam od

kardiovaskularnih bolesti i starenja, podstiče rad bubrega, i pomaže u smanjenju telesne težine. Oblog

od soka dinje se koristi za ublažavanje bolova.

Slika 15. Dinja

22 

Lubenica (Citrullus lanatus) je jednogodišnja zeljasta biljka iz porodice bundeva

(Cucurbitaceae). Poreklom je iz tropskih oblasti Afrike, dok se u Evropi najviše uzgaja u Grčkoj i

Makedoniji.

Lubenice mogu biti duguljastog ili okruglog oblika. Imaju gustu i zelenu koru koja može biti

pegava ili prugasta. Lubenica nije samo ukusno, nego i zdravo voće (premda pripada porodici

bundeva). Svaki deo lubenice je jestiv, čak i njegova kora. Lubenica sadrži fitohemikaliju citrulin

koja ima svojstvo opuštanja vena i arterija, čime utiče na libido. U 120 grama lubenice nalazi se čak

150 miligrama citrulina. Citrulin je neesencijalna aminokiselina, prvo identifikovana iz soka lubenica,

koja predstavlja efikasno sredstvo za uklanjanje hidroksilnih radikala (Akashi K. i sar., 2001).

Stimuliše rad bubrega i izbacivanje toksina iz organizma. Takođe, lubenica je bogat izvor nutrijenata

važnih za zdravlje srca kao što su vitamini A, C i B6. Sadrži kalaj i magnezijum, dva minerala koji su

poznati po tome što pomažu regulisanju krvnog pritiska. Lubenica je odličan izvor vitamina B1 –

vitamina koji učestvuje u proizvodnji energije. Semenke su bogat izvor magnezijuma, fosfora, kalaja

i drugih minerala. U azijskoj medicini semenke lubenice se koriste za čišćenje bubrega i u druge

medicinske svrhe.

Slika 16. Lubenica

23 

2.7. UV/VIS spektrofotometrija

UV/VIS spektrofotometrija spada u grupu apsorpcionih metoda i zasniva se na proučavanju

zavisnosti apsorpcije svetlosti od talasne dužine zračenja koje je prošlo kroz analiziranu supstancu.

Apsorpcija se može pratiti kako u ultraljubičastoj (UV) i vidljivoj (VIS) oblasti tako i u infracrvenoj

(IC), mikrotalasnoj (MT) i radiofrekventnoj (RF) oblasti. U analitičkoj praksi od interesa je oblast od

200 do 1000 nm.

Slika 17. Oblasti elektromagnetnog zračenja

Kako veliki broj jedinjenja ne apsorbuje u ovom delu spektra, to UV/VIS spektrofotometrija,

u poređenju sa drugim strukturnim metodama (IC, NMR, MS), ima daleko manju primenu za

strukturna određivanja i uglavnom se koristi kao komplementarna metoda za identifikaciju delova

molekula koji apsorbuju u navedenoj oblasti, takozvanih hromofora. U tim slučajevima dobijeni

UV/Vis spektri mogu da pruže veoma korisne informacije o strukturi ispitivanog jedinjenja i ona je

često nezamenljiva pomoćna (a često i glavna) metoda za identifikaciju prirodnih polikonjugovanih

jedinjenja, kao što su: biljni pigmenti (karotenoidi), poliacetileni, porfirini, flavonoidi itd.

Po načinu nastanka spektri mogu biti emisioni i apsorpcioni, a prema nosiocu zračenja spektri

se dele na atomske i molekulske. Molekulski spektri najčešće se posmatraju kao apsorpcioni spektri.

Apsorbovano zračenje dovodi do energetskih promena u atomima, molekulima i jonima

ispitivane supstance. Apsorpcija vidljivog i ultraljubičastog zračenja dovodi do elektronskih prelaza,

koji su u molekulima i njihovim jonima kombinovani sa nizom vibracionih i rotacionih prelaza.

Vibracije i rotacije takođe imaju određene energijske nivoe. Apsorpcija vidljivog i ultraljubičastog

zračenja dovodi do elektronskih prelaza, koji su u molekulima i njihovim jonima kombinovani sa

nizom vibracionih i rotacionih prelaza. Pri merenju UV-VIS spektara poželjno je da svi procesi osim

24 

apsorpcije budu zanemarljivi. Svetlost je jedan od oblika energije i apsorpcija svetlosti od strane

materije dovodi do povećanja energetskog sadržaja atoma ili molekula. Ukupna potencijalna energija

molekula može se predstaviti kao suma elektronske (Ee) vibracione (Ev) i rotacione (Er) energije:

E = Ee + Ev +Er

Energija koja je potrebna za prelazak elektrona sa nižeg na viši energetski nivo jednaka je

energiji kvanta apsorbovane svetlosti. Apsorbovana energija zavisi od razlike energija osnovnog i

pobuđenog stanja. Što je razlika u energiji manja, to je talasna dužina apsorpcije veća. Vibracioni i

rotacioni energetski nivoi se superponiraju sa elektronskim i zbog toga postoji mnogo mogućih

elektronskih prelaza u apsorpcionom spektru, što za posledicu ima pojavu traka.

Slika 18. Vibracioni i rotacioni energijski nivoi

Prolaskom svetlosti kroz kivetu u kojoj se nalazi uzorak za analizu, količina apsorbovane

svetlosti predstavlja razliku između intenziteta upadne svetlosti (Io) i propuštene svetlosti (Ip) i

izražava se transparencom ili apsorbancom. Transparenca predstavlja odnos inteziteta propuštene i

upadne svetlosti:

T = Ip / Io

gde je:

T - transparenca

I0 - intenzitet upadnog zraka

I p- intezitet zraka po prolasku kroz uzorak

Apsorbanca se definiše kao:

A = - log T = - log (Ip / Io) = εꞏlꞏc

gde je:

A - apsorbanca

I0 - intenzitet upadnog zraka

I p- intezitet zraka po prolasku kroz uzorak

25 

e - molarna apsorptivnost

l - debljina sloja [cm]

c - koncentracija apsorbujuće supstance [mol/l].

Slika 19. Prolazak svetlosti kroz kivetu sa rastvorom

Lambert-Beer-ov zakon je osnova kvantitativne spektrofotometrijske analize: apsorbanca

rastvora direktno je proporcionalna koncentraciji apsorbujuće vrste i debljini sloja kroz koje zračenje

prolazi.

A = ε l c

gde je:

ε - molarna apsorptivnost

l - debljina sloja [cm]

c - koncentracija apsorbujuće supstance [mol/L].

Za kvantitativnu analizu je bitno da se merenja apsorbance vrše sa najvećom mogućom

tačnošću i osetljivošću. Da bi se postigla moguća tačnost i osetljivost apsorbance bitan je izbor talasne

dužine merenja. Ona mora da ispuni nekoliko uslova:

da se merenjem postiže maksimalna osetljivost,

da mala promena talasne dužine ne utiče na reproduktivnost i

da važi Lambert-Beer-ov zakon.

Na osnovu ovih zahteva merenje apsorbance se izvodi na:

na talasnoj dužini gde je apsorbanca maksimalna λmax

na talasnoj dužini optimalne apsorbance, λ opt i

na talasnoj dužini izobestičke tačke, λ izob

Molarna apsorptivnost ε predstavlja konstantnu vrednost za konstantne uslove snimanja

(talasna dužina, temperatura i rastvarač). Vrednost molarne apsorptivnosti zavisi i od karakteristika

upotrebljenog aparata. Zbog toga se u kvantitativnoj analizi najčešće ne koristi određena tablična

vrednost, nego se svaki put snima kalibraciona prava koristeći standardni rastvor ispitivane supstance.

26 

Boja je važno svojstvo svake supstance i usko je povezana sa apsorpcijom i refleksijom svetlosti.

Ljudsko oko vidi komplementarnu boju onoj koja je apsorbovana. U praksi, nastajanje i opažanje

boja su veoma kompleksni procesi koji zavise takođe i od spektra upadne svetlosti i od površinske

strukture posmatranog predmeta.

Slika 20. Apsorpcija svetlosti i doživljaj boje

2.7.1. UV-VIS spektrofotometar

Spektrofotometar je uređaj za analizu spektra elektromagnetnog zračenja. Sastoji se od izvora

elektromagnetnog zračenja, disperzionog elementa koji izdvaja usku oblast talasnih dužina, uzorka

za analizu, detektora koji meri intenzitet propuštenog zračenja i optičkih delova- (prizme, sočiva i

ogledala) koji služe da usmere svetlosni snop.

Snimanjem intenziteta zračenja apsorbovanog, propuštenog ili reflektovanog od strane uzorka

u zavisnosti od talasne dužine, generiše se spektar.

Slika 21. Delovi UV-VIS spektrofotometra

Spektrofotometri su podeljeni na jednozračne i dvozračne spektrofotometre.

Jednozračni spektrofotometri su predviđeni samo za prolaz jednog zraka i mogu snimati samo

jedan uzorak (I). Referentni uzorak, npr. rastvarač, (I0) se meri nakon što se uzorak izvadi iz držača,

a dobijeni spektar naknadno obradi.

27 

Dvozračni spektrofotometri imaju prednost jer se kod njih kompenzuje promena u intezitetu

primarnog zračenja, a svetlost se pomoću ogledala deli na dva zraka, jedan prolazi kroz uzorak a

drugi je referentni i prolazi pored. Ova dva zraka se propuštaju naizmenično kroz monohromator i

šalju dalje na detektor. Dakle, upadni snop zračenja se deli na dva pre prolaska kroz uzorak pri čemu

jedan služi kao referentni snop (I0), a drugi prolazi kroz uzorak (Ip). Detektor detektuje odnos

inteziteta ova dva zraka.

Izvor zračenja koji se primenjuje u spektrofotometriji treba da bude konstantnog intenziteta i

da obuhvata širok opseg talasnih duzina. Najčešće se upotrebljavaju obična volframova lampa (300 -

2500 nm), i deuterijumska lampa (190 - 400 nm). Moguća je primena ksenonske lampe (160 - 2000

nm), ali ona nije pogodna za kvantitativno određivanje.

Disperzioni element ima funkciju da snop polihromatskog zračenja razloži na uske oblasti

talasnih dužina. Koristi se prizma i difrakciona rešetka.

Detektori pretvaraju svetlosni signal u električni signal. Idealni detektor poseduje linearnu

osetljivost u širokom opsegu talasnih dužina i intenziteta svetlosti. Moderni spektrofotometri sadrže

fotomultiplikator ili fotodiodni niz. Fotomultiplikator ima dobru osetljivost u celom UV-VIS

području pri malom intenzitetu svetlosti. To omogućava detektovanje male razlike između slepe

probe i uzorka za analizu, što znači da se mogu određivati male količine supstance. Fotodiodni niz

kao detektor ima široki opseg detekcije talasnih dužina, što ga čini idealnim za snimanje celog UV-

VIS spektra u kratkom vremenskom intervalu.

Kiveta u kojoj se nalazi uzorak mora da bude transparentna za UV-VIS zračenje. Kivete su

obično pravougaonog oblika, najčešće unutrašnje širine 1cm. Neki instrumenti umesto kiveta koriste

epruvete. Kivete su izrađene od visoko kvalitetnih jedinjenja silicijuma ili kvarca, materijala koji su

dobro transparentni za UV-VIS i blisku infracrvenu oblast.

28 

2.8. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti

Svi eksperimenti u vezi antioksidativne aktivnosti koji se vrše u in vitro uslovima prevode se

na in vivo uslove antioksidativnog delovanja na ljude i druge životinje, što zahteva dobru

metodologiju (Halliwell B., 2012).

Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti se mogu podeliti na više načina:

prema sistemu ispitivanja (in vivo i in vitro),

prema metodi detekcije (hemiluminiscentne, spektrofotometrijske, fluorometrijske,

spektroskopske-ESR),

prema direktnosti određivanja (direktne i indirektne).

Prisustvo lipida u sistemu i mehanizam reakcije koja se odigrava između antioksidativnih

jedinjenja i slobodnih radikala na koje se antioksidativna aktivnost određuje, takođe mogu biti osnove

za podelu metoda određivanja antioksidativne aktivnosti (Sanchez-Moreno, 2002; Aruoma, 1996).

Prema prisustvu lipida u sistemu, metode se dele na:

metode koje se zasnivaju na merenju "skevindžer" sposobnosti slobodnih radikala, a koje se

izvode u sistemima koji ne sadrže lipide i

metode koje se izvode u biološkim modelnim sistemima koji sadrže lipide, a koje se zasnivaju

na merenju stepena inhibicije oksidacije lipidnog ili lipoproteinskog supstrata.

Podela metoda za određivanje antioksidacione aktivnosti bazirana na mehanizmu reakcije

koja se odigrava između antioksidativnih jedinjenja i slobodnih radikala na koje se antioksidativna

aktivnost određuje prikazana je u tabeli 3 (Magalhaes J. i sar., (2007)).

29 

Tabela 3. Metode za određivanje antioksidativne aktivnosti.

Metode in vitro određivanja antioksidativne aktivnosti

Metode koje uključuju H-transfer reakcije (HAT)

ROO• + AH → ROOH + A• ROO• +LH → ROOH + L•

ORAC metoda (Oxygen radicalabsorbance capacity)

LPIC metoda (Lipid peroxidationinhibition capacity)

TRAP metoda (Total radicaltrapping antioxidant parameter)

IOC metoda (Inhibited oxygenuptake)

SASA metoda (Scavenging ofsuper oxide radical formation byalkaline)

Elektron transfer metode (ET) M(n) + e- (iz AH) → AH• + M(n-1)

TEAC metoda (Trolox equivalentantioxidant capacity)

FRAP metoda (Ferric IonReducing Antioxidant PowerAssay)

DPPH metoda (Scavengig of2,2difenil-1-pikrilhidrazil RadicalAssay)

CUPRAC metoda (Copper (II)reduction capacity)

FCR metoda (Folin-CiocalteuReducing Capacity Assay)

Ostale metode

TOSC metoda (Total oxidantscavenging capacity)

ECL metoda (Enhancedchemiluminescence)

TLC bioautography

CAA metoda (Cellular antioxidantactivity assay)

30 

2.8.1. Metoda za određivanje ukupnih fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC)

Folin-Ciocalteauovom metodom se određuje sadržaj ukupnih fenolnih jedinjenja u uzorcima

(Singleton VR. isar., (1965)). Metoda se zasniva na oksidaciji prisutnih fenola Folin-Ciocalteauovim

reagensom. Sam reagens predstavlja smešu fosfomolibdenske i fosfovolframove kiseline i može se

predstaviti formulama:

3H2O × P2O5 × 13WO3 × 5MoO3 × 10H2O i

3H2O × P2O5 × 14WO3 × 4MoO3 × 10H2O

Reagens (Mo4+ (žuto obojen) se redukuje, intenzitet nastale plave boje (Mo5+ (plavo obojen))

direktno je proporcionalan količini fenolnih jedinjenja u rastvoru:

Mo4+ (žuto obojen) + e– → Mo5+ (plavo obojen)

U alkalnoj sredini, nakon dodatka reagensa u analizirani uzorak, dolazi do prenosa elektrona

sa fenolne komponente i drugih redukcionih vrsta na molibden (Mo) pri čemu se formira plavi

kompleks koji se detektuje spektrofotometrijski na 𝜆 750-765 nm. Kao standard najčešće se koristi

galna kiselina, a rezultati se prikazuju kao ekvivalenti galne kiseline. Korišćeni reagens je

nespecifičan za fenolna jedinjenja, jer može biti redukovan od strane mnogih nefenolnih jedinjenja

kao što su aromatični amini, sumpor dioksid, vitamin C, Cu+, Fe2+. Ometajuće supstance treba

ukloniti i podesiti pH rastvora (pH ≈ 10).

2.8.2. Određivanje ukupnog sadržaja flavonoida (Total Phlavonoids Content TFC)

Ukupni sadržaj flavonoida u analiziranim uzorcima određen je spektrofotometrijskom

metodom (Yang J. i sar., (2004); Zhishen J. i sar., (1999)). Ova metoda zasniva se na reakciji

aluminijum-hlorida sa flavonima i flavonolima, pri čemu se formiraju kompleksna jedinjenja. Pored

toga, AlCl3 formira kisele labilne komplekse sa ortodihidroksilnim grupama u A- ili B-prstenu

flavonoida.

Slika 22. Reakcija Al3+ sa izokvercetinom (molekuli vode u kompleksu sa Al3+ su izostavljeni)

31 

2.8.3. DPPH metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radical assay)

DPPH je skraćenica za organsko jedinjenje 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil. DPPH test je

najrasprostranjenija metoda za ispitivanje antioksidativne aktivnosti mnogih ekstrakata, odnosno za

istraživanje prirodnih antioksidanasa. Prvi put je ova metoda opisana 1958. godine (Blois M.S.,

(1958)), a kasnije je modifikovana od strane brojnih istraživača (Krishnaiah D. i sar., (2011)).

PubMed baza podataka pokazuje da je DPPH test od 1969. godine bio uključen u više od 850

istraživanja (Tirzitis & Bartosz, (2010)). Ova metoda se bazira na redukciji rastvora DPPH radikala

(DPPH•) nekim redukcionim sredstvom (Shivprasad HN. i sar., (2005)). Rastvor DPPH• ima

maksimum apsorpcije na 517 nm (ljubičasta boja). Kada antioksidans reaguje sa DPPH•, prihvatita

elektron da postane stabilan dijamagnetičan molekulu prisustvu vodonika kao donora elektrona, ovaj

radikal se redukuje u DPPH i posledica toga je apsorpcija na manjim talasnim dužinama od one na

kojoj apsorbuje DPPH radikal. Pritom dolazi do obezbojavanja rastvora (žuta boja) - veći stepen

obezbojavanja označava veću redukcionu sposobnost, odnosno veća antioksidativna aktivnost.

Slika 23. Promena apsorbancije u toku redukcije DPPH•

32 

2.8.4. ABTS metoda (Scavengig of 2,2’-azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) Radical Assay)

ABTS je hemijsko jedinjenje, 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina), koje

se koristi za praćenje kinetike reakcija specifičnih enzima. Obično se upotrebljava u enzimskom

imunosorbentnom testu (ELISA) da detekciju vezivanja molekula jedan za drugi.

U ovom testu, ABTS se konvertuje u svoj radikalski katjon (ABTS•+) dodavanjem natrijum

persulfata. Nastali radikalski katjon je plave boje i maksimum na kojem apsorbuje svetlost je na 734

nm. ABTS radikalski katjon (ABTS•+) je reaktivan prema većini antioksidanasa, uključujući fenole,

tiole i vitamin C. Tokom ove reakcije, plavi ABTS•+ prelazi u svoju bezbojnu, neutralnu formu.

Reakcija se može pratiti spektrofotometrijski. Svako jedinjenje koje ima niži redoks potencijal od

ABTS• može reagovati sa radikalom (Re R. i sar., 1999).

Slika 24. Redukcija ABTS radkalom

33 

2.8.5. FRAP metoda (Ferric Reducing Antioxidant Power Assay)

FRAP metodu razvili su Benzie I.F. i sar., (1996) i Benzie i Strain (1996). Metoda se bazira

na reakciji redukcije žuto obojenog kompleksa gvožđa-2,4,6-tripiridil-s-triazina [Fe3+-(TPTZ)2]3+ pri

čemu nastaje plavo obojeni kompleks [Fe2+TPTZ)2]2+. Reakcija se odvija u kiseloj sredini, pri

pH=3,6. Pri nižim pH vrednostima smanjuje se jonizacioni potencijal koji omogućuje prenos

elektrona.

Slika 25. Redukcija kompleksa [Fe 3+-(TPTZ)2]3+ do kompleksa [Fe 2+-(TPTZ)2]2+

Svako jedinjenje sa redoks potencijalom nižim od redoks potencijala para Fe3+/Fe2+, teorijski

može redukovati Fe3+ do Fe2+ i omogućiti visoke FRAP vrednosti. Mnogi antioksidansi ne mogu

dovoljno brzo redukovati Fe 3+ kako bi se brzina reakcije mogla meriti u posmatranom vremenskom

intervalu (obično 4 minuta). U zavisnosti od vremena analize red njihove reaktivnosti se menja.

Polifenoli sa takvim ponašanjem su: kvercetin, feruminska kiselina, kofeinska kiselina, taninska

kiselina.

Niska vrednost pH, koja je neophodna za metodu, može da dovede do precipitacije nekih

proteina, kao što je kazein iz mleka (Kranl K. i sar., 2005). Antioksidansi koji deluju kao "gasioci"

radikala (transferi H-atoma) ne mogu se određivati ovom metodom.

34 

2.8.6. Ukupna redukciona moć TRP (Total reducing power)

Za određivanje ukupne redukcione moći koristi se metoda koju je opsiao Oyaizu M. (1986).

Ova metoda se zasniva na građenju obojenog kompleksa KFeFeCN6 poznatog kao "berlinsko

plavo". Ovaj proizvod nastaje u reakciji Fe3+ ili Fe(CN)6 3- jona sa antioksidansima:

Fe(CN)63- + antioksidans Fe(CN)64- + antioksidans

Fe(CN)64- + Fe 3 FeFe(CN)6-

Reakcija nastajanja obojenog proizvoda se prati merenjem apsorbance rastvora na 700 nm u

rastvoru fosfatnog pufera (pH=6,6).

2.8.7. CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity)

CUPRAC metoda se temelji na redukciji Cu (II) u Cu(I) u reakciji antioksidansa sa

kompleksom bis(neokuproin)bakar (II) katjonom. Pri pH=7 gradi se bezbojan bis(neokuproin) bakar

(I) helatni komleks. U prisustvu redukcionog sredstva nastaje Cu(I)-Nc, kompleksno jedinjenje

narandžasto-crvene boje koje pokazuje maksimum apsorbancije na 450 nm (Ak T. i sar., (2008)).

U poređenju sa drugim metodama za određivanje antioksidativne aktivnosti zasnovanih na

redoks reakcijama, u CUPRAC metodi ne utiču parametri kao što su prisustvo vazduha, sunčeva

svetlost i vlažnost jer je Cu2+ - Nc reagens stabilniji od DPPH-a i ABTS-a. Redoks reakcija u

CUPRAC metodi se odvija pri pH 7 (približno fiziološki uslovi) za razliku od kisele sredine koja se

mora obezbediti u FRAP metodi (pH 3,6) gde redukciona moć može biti suprimirana zbog reakcije

hidroksilne grupe ispitivanog jedinjenja sa H+ jonom (Apak i sar ., 2008).

Slika 26. Redukcija Cu 2+ u Cu+

Eksperimentalni deo

36 

3. Eksperimentalni deo

3.1. Aparatura i pribor

UV/Vis spektrofotometar, Perkin Elmer Lambda 15

Vaga, Shimadzu AX20

Ultrazvučno kupatilo, Maget Bela Palanka

Vodeno kupatilo, Baths HH-S114

Aparat za dejonizovanu vodu, TKA MICROMED

3.2. Korišćeni reagensi

Destilovana voda

1%-tni rastvor K3[Fe (CN)6] (Merck, Nemačka)

10%-tna trihlorsirćetna kiselina (Merck, Nemačka)

0,1% FeCl3 (Merck, Nemačka)

Askorbinska kiselina (vitamin C) (Seharlau, Nemačka)

Pufer NaH2PO4-Na2HPO4 (0,2 mol/L, pH=6,6) (Zorka, Srbija)

Rastvor CuCl2; 0,01M

Pufer NH4OAc (pH=7)

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) (La Chema, Nemačka)

Kalijum persulfat (K2S2O8) (Merck, Nemačka)

Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina) (Sigma Aldrich,

Nemačka)

Metanol (VWR International S.A.S, Francuska)

2,2-azinobis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS)

2,9-dimetill-1,10-fenantrolin (neokuproin) (Merck, Nemačka)

Dimetil sulfoksid (DMSO) (Sigma Aldrich, Nemačka)

2%-AlO3 (Zorka, Srbija)

5%-NaNO3 (Zorka, Srbija)

NaOH – 1M (Zorka, Srbija)

37 

3.3 Priprema ekstrakta lubenice i dinje

Uzorci lubenica

Narandžasta lubenica-Sandia Naranja;

Slika 27. Narandžasta lubenica-Sandia Naranja

Lubenica koja je veoma retka i skupa, ima veoma i dobar sladak ukus, Sama lubenica sadrži

malo semena, zbog toga se seme ne prodaje već se čuva za sadnju sledeće godine. Pored toga što je

jako ukusna i slatka privlačna je zbog svoje narandžaste boje kojom mami poglede.

Lubenica-Crimson Suite

Slika 28. Lubenica- Crimson Suite

Lubenica "Crimson suite" odnosi se na voće koje rano sazreva u razmaku od - 65-82 dana.

Sama lubenica je okrugla i velika, kora glatka, sjajna i prugasta, meso lubenice sočno i slatko.

Prosečna težina lubenice - 7 kg.

38 

Besemena lubenica -Gipsy F1

Slika 29. Besemena lubenica- Gipsi F1

Besemena lubenica- Gipsi F1 je okrugla sorta lubenice, kora je zelene boje sa svetlim

prugama, prosečna težina iznosi od 6-8kg. Dobija se ukrštanjem diploidne (2n broj hromozoma) i

tetraploidne (4n broj hromozoma-praktično dupli broj, a takvo dupliranje se često javlja i spontano),

tako da je krajnji proizvod triploidna (3n) lubenica koja je sterilna, a umesto semenki ima samo po

koju ljuspicu.

Mini lubenica-Baby

Slika 30. Mini lubenica Baby

Mala lubenica "Sugar Baby" je rana sorta lubenice. Voće koje sazreva u razmaku od 70-80

dana. Okruglog oblika, tamno zelene boje, meso lubenice je crveno, sočno i slatko. Semenke su

krupne i smeđe. Prosečna težina ploda - 4 kg. Sorta je pogodna za kiseljenje.

39 

Žuta Lubenica- Sandia Amarila Dulce

Slika 31. Žuta Lubenica -Sandia Amarila Dulce

Stara, zaboravna sorta, koje su se uzgajale na našim prostorima a najviše na prostoru Mediterana,

izuzetno slatka sa tankom korom, sadrži malo semena i nije mnogo skuplja od klasične lubenice.

Uzorci dinja

Dinja žuta -Honey Draw 

Slika 32. Dinja-žuta Honey Daw

Dinja-žuta spada u vrstu najslađih sorti dinje. Kora dinje je žuta, okruglog oblika. Unutrašnjost

dinje ima zeleno meso koje je jeko ukusno, srednje rana sorta koja sazreva od 105 do110 dana.

Prosečna težina ploda je 1,6-1,8 kg

40 

Dinja-Supra F1

Slika 33. Dinja -Supra F1

Supra F1 je rani hibrid dinje u galia tipu. Prosečna težina plodova je 1,5-3 kg. Spada u ranu

sortu sazrevanja. Plodovi su okruglo-ovalnog oblika sa narandžastom bojom mesa. Meso je vrlo

sočno i izuzetno slatko.

Ananas dinja

Slika 34. Ananas dinja

Legendarna dinja koja je veoma poznata medu baštovanima. Ima jako dobar ukus i veoma je

slatka, odnosno ima visok procenat šecera. Druga stvar što je odlikuje jeste, bobar rod. Inače spada u

srednje ranu sortu. Ubraja se među najbolje dinje.

Nakon čišćenja od ostataka semenki, meso lubenica i dinja je usitnjeno, a zatim je odmerena

masa (5g) uzoraka prelivena smešom rastvarača metanol-voda (80:20) i ekstrahovana na

ultrazvučnom kupatilu. Uzorak je ekstrahovan dva puta po 15 minuta. Nakon ekstrakcije, izvršena je

filtracija i ekstrakt dopunjen u normalnom sudu do 25 ml.

41 

3.4. Metoda odredjivanja antioksidativne aktivnosti

3.4.1. Odredjivanje ukupnih fenola (TPC)

Određivanje sadržaja fenolnih jedinjenja vršeno je po metodi Singleton (Singleton VL. i sar.,

1999) korišćenjem Folin–Ciocalteu reagensa. 0,05 mL ekstrakta pomešano je sa 0,5 mL Folin–

Ciocalteu reagensa, 2 mL Na2CO3 i dopunjeno vodom do zapremine od 7,55 mL. Dobijena smeša je

ostavljena da stoji 30 minuta u mraku, na sobnoj temperaturi nakon čega je merena apsorbanca na

talasnoj dužini od 750 nm. Rezultati su izraženi kao miligram ekvivalenata galne kiseline na 100 gr

svežeg uzorka (mg GAE/100g FW).

3.4.2. Odredjivanje ukupnih flavonoida (TFC)

Ukupni sadržaj flavonoida je određen prema metodi po Zišenu (Zhishen J. i sar., 1999). U

ekstrakte zapremine 50 μL, su dodati rastvori sledećim redom H2O (2 mL) i NaNO2 (150 μL, 5 %

rastvor), posle stajanja na sobnoj temperaturi, dodat je AlCl3 (0,75 mL; 2 % rastvor) i nakon 5 minuta

je dodat NaOH (1 mL, 1 M). Smeša je dopunjena dejenizovanom vodom do ukupne zapremine 5 mL.

Snimljena je i standardna serija rutina merenjem apsorbancije rastvora (prema vodi) na talasnoj dužini

od 520 nm. Alikvot ekstrakta (1 mL) je pomešan sa 0,15 mL rastvora NaNO2. Nakon 5 minuta, dodato

je 0,75 mL rastvora AlCl3, i rastvor je ostavljen da stoji 5 min na sobnoj temperaturi. Zatim je 1 mL

NaOH rastvora dodato u smešu a dodatkom dejonizovane vode i postignuta je konačna zapremina od

5 mL. Rezultati su izraženi kao miligram ekvivalenata rutina na 100g svežeg uzorka (mg RE/100g

FW). 

3.4.3. DPPH metoda

Scavening" radikalski kapacitet uzoraka određen je primenom DPPH metode. Za izvođenje

ovog testa rastvor DPPH reagensa (1ꞏ10-4 mol/L) je pripremljen u metanolu. 1,5 mL rastvora DPPH

i 1 ml ekstrakta koncentracije 200 mg/mL je pomešano sa 1,5 mL metanola. Reakciona smeša je

ostavljena da stoji u mraku 1 sat. Apsorbanca rastvora je merena na talasnoj dužini od 515 nm.

Rezultati su izraženi kao miligram trolox ekvivalenta na 100 g svežeg uzorka (mg TE/100g FW).

3.4.4. ABTS metoda

ABTS je rastvoren u metanolu i na taj način je pripremljen rastvor koncentracije 7٠10-3

mol/L). ABTS˙ radikal katjon (ABTS˙+) nastaje kao proizvod reakcije između rastvora ABTS-a i

K2S2O8. Radni rastvor se priprema mešanjem rastvora ABTS-a i K2S2O8 u odnosu 1:1 i ostavlja se

42 

da stoji u mraku na sobnoj temperaturi 12 sati pre upotrebe. Zatim je 14,8 mL ovog rastvora (ABTS˙+)

razblaženo dodatkom metanola, sa ciljem da vrednost očitane apsorbance bude 0,7 ± 0,02 na talasnoj

dužini od 734 nm. Potom je 1 mL ekstrakta pomešano sa 1,8 mL rastvora ABTS˙+ i sa 1,2 mL

metanola. Nakon 6 minuta odvijanja reakcije na sobnoj temperaturi, meri se smanjenje apsorbance

na talasnoj dužini od 734 nm. Rezultati su izraženi kao miligram trolox ekvivalenta na 100 g svežeg

uzorka (mg TE/100g FW).

3.4.5. FRAP metoda

FRAP reagens je pripremljen mešanjem acetatnog pufera (300 mM, pH 3.6), 10 mM rastvora

TPTZ i 20 mM rastvora gvožđa FeCL3 u zapreminskom odnosu 10:1: 1. Zatim je 100 µL uzorka

dodato u 1 mL FRAP reagensa, a reakciona smeša je razblažena vodom do ukupne zapremine od 4

mL. Apsorbanca smeše merena je na 595 nm nakon 30 min inkubacije. Kalibraciona prava je

pripremljena korišćenjem rastvora FeSO4 x7H20. Rezultati su izraženi kao miligram ekvivalenata Fe

na 100 g svežeg uzorka (mg Fe/100g FW).

3.4.6. TRP metoda

Reakcione smeše su pripremljene mešanjem 10 μL ekstrakta sa 1 mL 1 % rastvora K3[Fe

(CN)6] i 1 mL pufera NaH2PO4-Na2HPO4 (pH 6,6). Smeše su inkubirane na 50 °C 30 minuta i nakon

čega se dodaje 1 mL, 10 % CCl3COOH i 0,3 mL 0,1 % rastvora FeCl3. Apsorbanca tako dobijenih

smeša merene su na talasnoj dužini od 700 nm. Veće apsorbancije reakcionih smeša ukazuju na veću

redukcionu moć. Kalibraciona prava pripremljena je korišćenjem askorbinske kiseline kao standarda

i rezultati su izraženi kao miligram ekvivalenta askorbinske kiseline na 100 g svežeg uzorka (mg

AAE/100g FW).

3.4.7. CUPRAC metoda

Smeši koja sadrži 0,5 mL uzorka i 1.05 mL vode, 1 mL amonijum-acetatnog pufera (pH=7) i

1 mL rastvora neokuproina dodato je 1 mL rastvora Cu (II)-hlorida. Dobijena smeša je ostavljena da

stoji 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, merena je apsorbanca na talasnoj dužini od 450

nm. Kalibraciona prava konstruisana je merenjem serije rastvora askorbinske kiseline troloksa.

Rezultati su izraženi kao miligram ekvivalenta troloksa na 100 g svežeg uzorka (mg TE/100g FW).

Rezultati i diskusija

44 

4. Rezultati i diskusija

4.1 Određivanje sadržaja fenolnih jedinjenja (Total Phenolic Content-TPC) u

uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja

Fenolna jedinjenja kao sekundarni metaboliti biljaka generišu se tokom metaboličkog puta

šikiminske kiseline. Određivanje sadržaja fenolnih jedinjenja (TPC) u odabranim vrstama lubenice i

dinje vršeno je korišćenjem Folin-Ciocalteu reagensa. Standardna serija galne kiseline kao i

metanolni ekstrakti svih analiziranih vrsta lubenice i dinje snimljeni su spektrofotometrom na talasnoj

dužini od 750 nm. Na slici 35. prikazana je kalibraciona prava galne kiseline.

Slika 35. Kalibraciona prava galne kiseline korišćena kao standard za određivanje sadržaja ukupnih

fenola

y = 52,005x - 0,0199R² = 0,9901

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006

A

C galne kiseline (mg/mL)

TPC

45 

Slika 36. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata uzoraka lubenica i dinja određena

primenom TPC metode

Ono što se sa Slike 36. može uočiti je da metanolni ekstrakt Žute Lubenice- Sandia Amarila

Dulce-  ima najveći sadržaj ukupnih fenolnih jedinjenja (44,51mg GAE/100g FW). Za ostale

analizirane uzorke nešto veći sadržaj ukupnih fenolnih jedinjenja zabeležen je za Mini lubenicu- Baby

(29,50mg GAE/100g FW) i Lubenicu - Crimson Suite (19,75 mg GAE/100g FW). Uzorci dinja imaju

niži sadržaj fenolnih jedinjenja u poređenju sa lubenicama. Najveći sadržaj fenolnih jedinjenja u

uzorcima dinje zabeležen je za uzorak Dinja - Supra F1 (17,29 mg GAE/100g FW). Jyotsana i sar.

(2016) su određivali sadržaj fenolnih jedinjenja u uzorcima lubenice i dinje. Rezultat dobijen u

njihovom radu za lubenica Citrullus lanatus-iznosio je 35,54mg GAE/100g FW, što je u rangu sa

rezultatima dobijenim za uzorak Žute Lubenice - Sandia Amarila Dulce u ovom istraživanju. Što se

uzoraka dinje tiče, sadržaj ukupnih fenolnih jedinjenja prikazan u radu Singh J. i sar. (2016) bio je

(54,29 mg GAE/100g FW) za uzorak dinje - (Cucumis melo), što je nešto više u odnosu na rezultate

dobijene za uzorke dinje u ovom radu. Razlog tome mogu biti različite sorte dinja i različiti

agroekološki uslovi u kojima su gajene analizirane vrste.

0,005,00

10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,0045,0050,00

mg

GA

E/ 1

00g

FW

TPC

46 

4.2. Određivanje sadržaja flavonoida (Total Flavonoid Content TFC) u

uzorcima metanolnih ekstrakata lubenica i dinja

Voće je jedan od najdragocenijih izvora prirodnih flavonoida za koje se zna da imaju

blagotvorna dejstva na zdravlje. Antioksidativna aktivnost flavonoida zavisi od strukture i supstitucije

hidroksilnih grupa (Sharififar F.i sar., (2008)).  Flavonoidi su prisutni u skoro svim biljkama i

zahvaljujući svojoj hemijskoj strukturi poseduju antikancerogena, antiinflamatorna i antialergijska

svojstva. Rezultati spektrofotometrijskog određivanja sadržaja ukupnih flavonoida u metanolnom

ekstraktu odabranih vrsta lubenica i dinja prikazani su na slici 37. Kalibraciona prava konstruisana je

upotrebom rutina kao standarda, merenjem apsorbancije reakcionih smeša na talasnoj dužini od 520

nm.

Slika 37. Kalibraciona prava rutina korišćena kao standard za određivanje sadržaja flavonoida

y = 3,6274x - 0,0056R² = 0,9948

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09

A

C rutina (mg/mL)

TFC

47 

Slika 38. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata uzoraka lubenica i dinja određena

primenom TFC metode

Lubenica besemena - Gipsi F1 je uzorak sa najvećim sadržajem flavonoida (785,98 mg

RE/100g FW). Ukupan sadržaj flavonoida u ostalim uzorcima je vrlo sličan i kreće se u rasponu od

(410 - 550 mg RE/100g FW). Najniži sadržaj flavonoida je registrovan u Lubenici - Crmson Suite

(413,97 mg RE/100g FW). Poređenjem dobijenih vrednosti može se videti da su najsličniji po

sadržaju flavonoida uzorci Narandžaste lubenice – Sandia Naranja (466,94 mg RE/100g FW) i Žute

lubenice – Sandia Amarila Dulce (484,85 mg RE/100g FW). Tadmor Y. i saradnici (2010) određivali

su sadržaj pigmenata u razičitim sortama dinje i zaključili da najzastupljeniji flavonoid, odgovoran

za boju plodova dinje je naringenin halkon.

0,00

100,00

200,00

300,00

400,00

500,00

600,00

700,00

800,00

900,00

mg

RE

/100

g FW

TFC

48 

4.3. Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih ekstrakata

lubenica i dinja primenom DPPH metode

Sposobnost “hvatanja” slobodnih radikala ispitivanih uzoraka određivan je merenjem njihove

sposobnosti da redukuju DPPH radikale (Brand-Williams W. i sar., (1995)). 1,1difenil-2-

pikrilhidrazil radikal (DPPH˙) je stabilan radikal čiji je maksimum apsorpcije na 515 nm.

Antioksidansi reaguju sa stabilnim DPPH˙ radikalom i transformišu ga pri čemu dolazi do

smanjenja ljubičaste boje rastvora radikala. Što je veće obezbojavanje rastvora DPPH˙, to je

koncentracija antioksidanasa u uzorku veća. Nivo obezbojavanja rastvora DPPH˙ radikala ukazuje na

"skevindžer" potencijal antioksidanasa. Na slici 39 prikazana je kalibraciona prava konstruisana

upotrebom troloksa kao standarda.

Slika 39. Kalibraciona prava troloksa korišćena kao standard za određivanje antioksidativne

aktivnosti DPPHꞏ radikalom

Rezultati ispitivanja antioksidativne aktivnosti dobijeni DPPH metodom prikazani su na slici 40.

y = 70.21x - 0.010R² = 0.997

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005

A

C troloksa (mg/mL)

DPPH

49 

Slika 40. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata uzoraka lubenica i dinja određena

primenom DPPH metode

Iz dobijenih rezultata može se uočiti da tri uzorka Mini lubenica - Baby (5,18 mg TE/100g

FW), Dinja žuta - Honey Daw (5,23 mg TE/100g FW), Dinja- Supra F1 (5,22 mg TE/100g FW)

pokazuju veću antioksidativnu aktivnost u odnosu na ostale analizirane uzorke. Antioksidativna

aktivnost lubenica povezana je sa visokim sadržajem vitamina A, likopena i β-karotena (R.U. Hamzah

i sar., (2013)). Najniža vrednost prema DPPH metodi zabeležena je za Lubenicu - Crimson Suite

(1,59 mg TE/100g FW). Lubenica besemena - Gipsy F1 odlikuje se visokim sadržajem flavonoida

(785,98 mg RE/100g FW), te je visoka antioksidativne aktivnosti (3,95 mg TE/100g FW) za ovaj

uzorak prema DPPH metodi očekivana. Ovaj rezultat potvrđuje činjenicu da su flavonoidi u velikoj

meri odgovorni za antioksidativnu aktivnost biljaka.

Narandžasta lubenica - Sandia Naranja (2,04 mg TE/100g FW) i Ananas dinja (2,40 mg

TE/100g FW) pokazale su sličnu antioksidativnu aktivnost prema DPPH metodi, što je i očekivano

ako se u obzir uzme njihov sličan sadržaj fenolnih jedinjenja i flavonoida.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

mg

TE

/ 100

g FW

DPPH

50 

4.4. Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih ekstrakata

lubenica i dinja primenom ABTS metode

ABTS metoda se koristi za određivanje antioksidativne aktivnosti uzoraka različitog porekla

i kao tehnika je veoma brza i jednostavna (Ozgen i sar., (2006)). Kako je metanolni rastvor ABTS˙+

plave boje sa maksimumom apsorpcije na 734 nm, usled redukcije ovog radikala antioksidansima

prisutnim u uzorku dolazi do smanjenja intenziteta boje. Kao standard za konstrukciju kalibracione

prave korišćen je troloks (Slika 41.).

Slika 41. Kalibraciona prava troloksa korišćena kao standard za određivanje antioksidativne

aktivnosti ABTS radikalkatjonom

y = 73,411x + 0,0036R² = 0,9968

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,0000 0,0010 0,0020 0,0030

A

C troloksa (mg/mL)

ABTS

51 

Slika 42. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata uzoraka lubenica i dinja određena

primenom ABTS metode

Uzorci Mini lubenice - Baby (5,25 mg TE/100g FW), Dinje - Supra F1 (4,74 mg TE/100g

FW), Dinje žute - Honey Daw (4,45 mg TE/100g FW), pokazuju veću aktivnost u odnosu na ostale

analizirane uzorke. Najniža aktivnost upotrebom ABTS metode uočena je za uzorak Lubenice-

Crimson Suite (1,60 mg TE/100g FW)

Lubenica besemena - Gipsy F1 (3,55mg TE/100g FW) i Žuta lubenica (3,53mg TE/100g FW)

imaju približno iste vrednosti antioksidativne aktivnosti određene primenom ove metode jer im je i

sadržaj ukupnih fenolnih jedinjenja takođe sličan. Takođe, pored toga Dinja - Supra F1 (4,74 mg

TE/100g FW) i Dinja žuta - Honey Daw (4,45 mg TE/100g FW) pokazuju sličme vrednosti

antioksidativne aktivnosti određene ABTS metodom zbog sličnog sadržaja fenolnih jedinjenja i

flavonoida u ovim uzorcima.

Singh J. i saradnici, (2016) su određivali antioksidativnu aktivnost ekstrakata uzoraka

lubenice i dinje primenom ABTS metode. Rezultati dobijeni za lubenicu - Citrullus lanatus (1.19

μmol TE/100g FW) ili (29,78 mg TE/100g FW) i dinju- Cucumis melo (2.13 μmol TE/100g FW) ili

(53,31mg TE/100g FW) nešto su veći u odnosu na rezultate dobijene u ovom istraživanju.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

mg

TE

/ 100

g F

W

ABTS

52 

4.5. Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih

ekstrakata lubenica i dinja primenom FRAP metode

FRAP je kvantitativni test za merenje antioksidativne aktivnosti u različitim uzorcima.

Redukcija jona gvožđa pri niskom pH uzrokuje stvaranje obojenog kompleksa gvožđe-

tripiridiltriazina. FRAP vrednosti su dobijene merenjem apsorbance reakcionih smeša i njihovim

poređenjem sa standardom FeSO4 na 595 nm (Benzie i sar., (1996)). FRAP test je jednostavan i jeftin,

ali ne meri antioksidanse koji sadrže SH-grupu (Cao G i sar., (1998)).

Slika 43. Kalibraciona prava rastvora FeSO4 korišćena kao standard za određivanje antioksidativne

aktivnosti prema FRAP metodi

y = 80,808x + 0,0078R² = 0,9998

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 0,007 0,008

A

C Fe (mg/mL)

FRAP

53 

Slika 44. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata uzoraka lubenica i dinja određena

primenom FRAP metode

Primenom ove metode zapaženo je da najveću antioksidativnu aktivnost pokazuje Mini

lubenica - Baby (2,20 mg Fe/100g FW). Ovakav rezultat se može dovesti u vezu sa činjenicom da se

uzorak Mini lubenice - Baby karakteriše i velikim saržajem fenolnih jedinjenja i flavonoida. U

poređenju sa Dinjom - Supra F1 (1,57 mg Fe/100g FW), antioksidativna aktivnost Mini lubenice je

skoro dva puta veća. Ostali analizirani uzorci pokazali su nižu antioksidativnu aktivnost prema FRAP

metodi. Žuta Lubenica - Sandia Amarila Dulce (0,39 mg Fe/100g FW) pokazala je nisku

antioksidativnu aktivnost prema FRAP metodi, što nije očekivano s obzirom na visoki sadržaj

fenolnih jedinjenja u ovom uzorku.

Približno iste FRAP vrednosti dobijene su za uzorke Lubenice - Crimson Suite (0,25 mg

Fe/100g FW) i Lubenice besemena - Gipsy F1 (0,24mg Fe/100g FW), kao i za Žutu Lubenicu- Sandia

Amarila Dulce (0,39 mg Fe/100g FW) i Ananas dinju (0,37 mg Fe/100g FW).

Singh J. i saradnici (2016) korišćenjem FRAP metode analizirali su antioksidativnu aktivnost

u uzorcima lubenice i dinje. Za uzorke lubenice - Citrullus lanatus dobili su rezultat 2.73μM Fe/100g

FW ili ti 15,25mg Fe/100g FW, dok su za uzorke dinje - Cucumis melo dobili rezultat 4.20μM

Fe/100g FW kada se prevede 23,45 mg Fe/100g FW. Dobijene vrednosti su nešto više u poređenju

sa vrednostima ovog master rada. Sa druge strane, Guo C. i sar., (2003) ispitivali su antioksidativnu

aktivnost na uzorku lubenice Jingxin #1 i dobili vrednost koja je u skladu sa rezultatima dobijenim u

master radu (0,16mmol/L Fe/100g FW) ili (8,94 mg TE/100g FW).

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

mg

Fe/

100

g F

W

FRAP

54 

4.6. Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih

ekstrakata lubenica i dinja primenom TRP metode

Određivanje ukupne redukcione moći ekstrakata zasniva se na redukciji Fe3+ u Fe2+, koja se

prati merenjem promene apsorbance na 700 nm, odnosno određivanju koncentracije berlinskog

plavog. Kalibraciona prava konstruisana je upotrebom askorbinske kiseline kao standara i prikazana

je na slici 45.

Slika 45. Kalibraciona prava rastvora askorbinske kiseline korišćena kao standard za određivanje

antioksidativne aktivnosti prema TRP metodi

y = 0.1056x + 0.0452R² = 0.99

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

A

C askorbinske kiseline (mg/mL)

TRP

55 

Slika 46. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata uzoraka lubenica i dinja određena

primenom TRP metode

Na osnovu dobijenih rezultata uočljivo je da se Žuta Lubenica - Sandia Amarila Dulce (44,51

mg AAE/100g FW) ističe sa najvećom aktivnošću, dok je posle nje po aktivnosti Mini lubenica -

Baby (29,50 mg AAE/100g FW). Žuta Lubenica - Sandia Amarila Dulce, koja ispoljava najveću

ukupnu redukcionu moć poseduje i najveći sadržaj ukupnih fenola što je u skladu sa pretpostavkom

da fenolna jedinjenja imaju značajnu ulogu u antioksidativnoj aktivnosti uzoraka lubenice.

Uzorci koji se odlikuju sličnim sadržajem flavonoida Dinja žuta - Honey Draw i Dinja- Supra

F1 odlikuju se i sličnim TRP vrednostima (16,03 i 17,29 mg AAE/100g FW, respektivno). Za uzorke

Lubenice - Crmson Suite (19,75 mg AAE/100g FW) i Lubenice besemena - Gipsy F1 (18,26 mg

AAE/100g FW) dobijene su slične TRP vrednosti. Ova dva uzorka odlikuju se sličnim sadržajem

fenolnih jedinjenja, te se može zaključiti da je redukciona moć ekstrakata posledica prisustva fenolnih

jedinjenja u uzorcima lubenica i dinja.

0,005,00

10,0015,0020,00

25,0030,00

35,0040,00

45,0050,00

mg

AA

E/1

00g

FW

TRP

56 

4.7. Određivanje antioksidativne aktivnosti u uzorcima metanolnih

ekstrakata lubenica i dinja primenom CUPRAC metode

CUPRAC metoda je vrlo jednostavna metoda za određivanje hidrofilnih i lipofilnih

antioksidanasa u hrani. Promena boje rastvora ispitivanog rastvora iz plave u žuto-narandžastu

posledica je redukcije Cu2+ jona antioksidansima do Cu+ pri čemu se gradi stabilan kompleks čiji je

maksimum apsorpcije na 450 nm. Kalibraciona prava konstruisana je upotrebom troloksa kao

standarda i prikazana je na slici 47.

Slici 47. Kalibraciona prava rastvora troloksa korišćena kao standard za određivanje

antioksidativne aktivnosti prema CUPRAC metodi

y = 57,73x + 0,2317R² = 0,9988

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

0,0000 0,0100 0,0200 0,0300

A

C troloks (mg/mL)

CUPRAC

57 

Slika 48. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata uzoraka lubenica i dinja određena

primenom CUPRAC metode

Na osnovu dobijenih rezultata može se uočiti da uzorak Mini lubenice - Baby (3,24 mg

TE/100g FW), ima veću antioksidativnu aktivnost određenu CUPRAC metodom u odnosu na ostale

analizirane uzorke. Antioksidativna aktivnost preostalih uzoraka opada sledećim redosledom: Dinja

- Supra F1 (2,69 mg TE/100g FW) > Dinja žuta - Honey Daw (2,37 mg TE/100g FW) > Lubenica

besemena (2,21 mg TE/100g FW) > Žuta Lubenica - Sandia Amarila Dulce (1,68 mg TE/100g FW)

> Ananas dinja (1,56 mg TE/100g FW) > Lubenica - Crimson Suite (1,56 mg TE/100g FW) >

Narandžasta lubenica-Sandia Naranja (1,48 mg TE/100g FW).

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

mg

TE

/ 100

g FW

CUPRAC

Zaključak

59 

5. Zaključak

Konzumacija lubenica i dinja ima pozitivan uticaj na ljudsko zdravlje. Jedan od važnih aspekata

njihovog delovanja je i antioksidativna aktivnost. U ovom radu prikazani su rezultati ispitivanja

antioksidativne aktivnosti, sadržaja ukupnih fenola i flavonoida metanolnih ekstrakta sledećih vrsta

lubenica i dinja: Narandžasta lubenica - Sandia Naranja; Lubenica - Crimson Suite; Lubenica

besemena - Gipsy F1; Mini lubenica - Baby; Žuta Lubenica - Sandia Amarila Dulce; Dinja žuta -

Honey Draw; Dinja - Supra F1; Ananas dinja.

Antioksidativna aktivnost ekstrakata određivana je primenom pet različitih metoda i to : DPPH

metoda (Scavengig of 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radical assay), ABTS metoda (Scavengig of 2,2’-

azobis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfat) Radical Assay), FRAP metoda (Ferric Reducing Antioxidant

Power Assay) CUPRAC metoda (Copper (II) reduction capacity)- Ukupna redukciona moć TRP

(Total reducing power). Pored toga određen je i sadržaj ukupnih fenola i sadržaj ukupnih flavonoida.

Najveći sadržaj fenolnih jedinjenja zabeležen je za uzorke Žute Lubenice - Sandia Amarila Dulce

(44,51 mg GAE/100g FW), Mini lubenice - Baby (29.50 mg GAE/100g FW), Dinje - Supra F1 (17.29

mg GAE/100g FW), a uzorak Ananas dinje (12,76 mg GAE/100g FW) ima najmanji sadržaj fenolnih

jedinjenja.

Najveći sadržaj ukupnih flavonoida ima Lubenica besemena - Gipsi F1 (785,98 mg RE/100g

FW), dok je najniži sadržaj flavonoida određen u uzorku Lubenice - Crimson Suite (413,97 mg

RE/100g FW).

Najveću redukcionu moć pokazala je Žuta Lubenica - Sandia Amarila Dulce (44,51 mg

AAE/100g FW), koja se odlikuje i najvećim sadržajem ukupnih fenolnih jedinjenja, te se može

zaključiti da fenolna jedinjenja imaju veliku ulogu u antioksidativnoj aktivnosti lubenica i dinja.

Neočekivano najmanju antioksidativnu aktivnost prema FRAP metodi pokazala je Lubenica

besemena - Gipsy F1 (0,24mg Fe/100g FW), s obzirom na to da je ovaj uzorak uzorak sa najvećim

sadržajem flavonoida.

Uzorak Mini lubenice - Baby pokazuje najbolje antioksidativne karakteristike upotrebom DPPH

(51,83 mg TE/100g FW), ABTS (5,25 mg TE/100g FW) FRAP (2,20 mg Fe/100g FW) i CUPRAC

(3,24 mg TE/100g FW) metode, te se ona može izdvojiti kao uzorak sa najboljim antioksidativnim

karakteristikama.

Literatura

61 

6. Literatura

Ak T, Gulcin I, (2008). Antioxidant and radical scavenging properties of curcumin. Chemico-

Biological Interactions 174(1): 27-37

Akashi K, Miyake C, Yokota A, (2001). Citrulline, a novel compatible solute in drought-tolerant wild

watermelon leaves, is an efficient hydroxyl radical scavenger. FEBS Letters 508(3):438-442

Apak R, Guclu K, Ozyurek M, Celik SE, (2008). Mechanism of antioxidant capacity assays and the

CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity) assay. Microchimica Acta 160(4):413-419

Arai S, Mori T, Miki W, Yamaguchi K, Konosu S, Satake M, Fujita T, (1987). Pigmentation of

juvenile coho salmon with carotenoid oil extracted from Antarctic krill. Aquaculture 66(3-4):255-264

Aruoma OI, (1996). Assessment of potencial prooxidant and antioxidant actions. Journal of the

American Oil Chemists' Society 12(73):1617-1625

Akashi K, Miyake C, Yokota A, (2001). Citrulline, a novel compatible solute in drought-tolerant wild

watermelon leaves, is an efficient hydroxyl radical scavenger. FEBS Letters 508(3):438-442

Aziza AE, Quezada N, Cherian G, (2010). Antioxidative effect of dietary Camelina meal in fresh,

stored, or cooked broiler chicken meat. Poulti Scince 89(12):2711-2718

Božin B, Mimica-Đukić N, Samojlik I, Anackov G, Igić R, (2008). Phenolics as antioxidants in garlic

(Allium sativum L., Alliaceae). Food Chemistry, 115(1):371-374

Božin B, (2009) Biohemijska i farmakološka ispitivanja vrsta roda Allium L. (Sect. Allium).

Doktorska disertacija. Univerzitet u Novom Sadu, Prirodno-matematički fakultet, Novi Sad.

Bieri E, (1974). γ-Tocopherol: metabolism, biological activity and significance in human vitamin E

nutrition. American Journal of Clinical Nutrition 27(9):980—986

Beecher GR, (2003). Overview of Dietary Flavonoids: Nomenclature, Occurrence and Intake. The

Journal of Nutrition 133(10):3248–3254

Benzie IF, Strain JJ, Anal Biochem, (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a

measure of "antioxidant power": the FRAP assay. Analitical Biohemistry 15:239(1):70-76

62 

Blois MS, (1958). Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181:1199-

1200

Brigelius-F B, Traber MG, (1999). Vitamin E: function and metabolism. The FASEB Journal

(13):1145—1155

Brand-Williams W, Cuvelier M E, and Berset C, (1994). Use of a Free Radical Method to Evaluate

Antioxidant Activity. Semantic Scholar: 28:25-30

Cadenas E, Davies KJ, (2000). Mitochondrial free radical generation, oxidative stress and aging. Free

Radical Biology & Medicine 29(3-4):222-230

Guo C, Yang J, Wei J, Li Y, Xu J, Jiang Y, (2003). Antioxidant activities of peel, pulp and seed

fractions of common fruits as determined by FRAP assay. Nutrition Research 23(12):1719-1726

Gutteridge JM, Winyard PG, Blake DR, Lunec J, Brailsford S, Halliwell B, (1985). The behaviour of

caeruloplasmin in stored human extracellular fluids in relation to ferroxidase II activity, lipid

peroxidation and phenanthroline-detectable copper. Biochemical Journal 230(2):517-523

Guzik TJ, West NE, Pillai R, Taggart DP, Channon KM, (2002). Nitric oxide modulates superoxide

release and peroxynitrite formation in human blood vessels. Hypertension 39(6):1088–1094

Dragovic-Uzelac V, Pospišil J, Levaj B, Delonga K, (2005). The study of phenolic profiles of raw

apricots and apples and their purees by HPLC for the evaluation of apricot nectars and jams

authenticity. Food Chemistry 91(2):373-383

Dröge W, (2002). Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological Reviews

82(1):47–95

Ferreira AR, Bonatto F, Pasquali MA, Polydor M, et al (2006). Oxidative stress effects on the central

nervous system of rats after acute exposure to ultra-high frequency electromagnetic fields.

Bioelectromagnetics 27:487-493

Ferrali M, Signorini C, Caciotti B, Sugherini L, Ciccoli L, Giachetti D, Comporti M, (1997). 

Protection against oxidative damage of erythrocyte membrane by the flavonoid quercetin and its

relation to iron chelating activity. FEBS Letters 416(2):123-129

63 

Halliwell B, Gutteridge JM, Aruoma OI, (1987). The deoxyribose method: a simple "test-tube" assay

for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals. Analytical Biochemistry

165(1):215-219

Halliwell B, (2012). Free radicals and antioxidants: updating a personal view. Nutritional-Revolution

70(5):257-265

Halliwell B, Gutteridge J, M, C, (1985). Free radicals in biology and medicine. Clarendon, Oxford

University Press.

Halliwell B, Gutteridge C, (2006). Free Radicals in Biology and Medicine, Ed 4. Clarendon press

Oxford 1-25

Halliwel B, Whiteman M, (2004). Measuring reactive species and oxidative damage invivo in cell

culture: how should you do it and what do the results mean?. British Journal of Pharmacology 

142(2):231-255

Hanasaki Y, Ogawa S, Fukui S, (1994). The correlation between active oxygens scavenging and

antioxidative effects of flavonoids. Free Radical Biology & Medicine 16(6):845-850

Hamzah RU, Jigam AA, Makun HA, Egwim EC, (2013). Antioxidant Properties of Selected African

Vegetables, Fruits and Mushrooms: A Review In: Mycotoxin and Food Safety in Developing

Countries, Edited by Hussaini Anthony Makun

Herrera B, (2001). Vitamin E: action, metabolism and perspectives. Journal of Physiology and

Biochemistry 57(2):43-56

Huda-Faujan N, Noriham A, Norrakiah, A.S., Babji, A.S. (2009). Antioxidant activity of plants

methanolic extracts containing phenolic compounds. African Journal of Biotechnology 8(3):484-489

Hoyt A, Luukkonen J, Juutilainen J, Naarala J. (2008). Title Proliferation, Oxidative Stress and Cell

Death in Cells Exposed to 872 MHz Radiofrequency Radiation and Oxidants. Radiation Research

170(2):235-243

Janićijević-Hudomal, S, Kenić J, Arsić-Komljenović G, (2008). Antioksidantni potencijal biljke

matočina (Mellitis Melisophyllum). Praxis Medica 36:83–87

64 

Kojic D, (2009). Otpornost na niske temperature i dehidrataciju kukuruznog plamenca (Ostrinia

nubilalis Hb- celijski i molekularni odgovor. Doktorska disertacija. Univerzitet u Novom Sadu,

Prirodno-matematicki fakultet, Novi Sad.

Kranl K, Schlesier K, Bitsch R, Hermann H, Rohe M, Bohm V, (2005). Comparingantioxidative food

additives and secondary plant products - use of different assays. Food Chemistry 93(1):171-175

Krishnaiah D, Rosalam S, Rajesh N, (2011). A review of the antioxidant potential of medicinal plant

species. Food and Bioproducts Processing 89(3):217-233

Iovine NM, Pursnani S, Voldman A, Wasserman G, Blaser MJ, Weinrauch Y, (2008). Reactive

nitrogen species contribute to innate host defense against Campylobacter jejuni. Infection and

Immunity 76 (3):986–993

O'Donnell VB, Eiserich JP, Chumley PH, Jablonsky MJ, Krishna NR, Kirk M, Barnes S, Darley-

Usmar VM, Freeman BA (1999). Nitration of unsaturated fatty acids by nitric oxide-derived reactive

nitrogen species peroxynitrite, nitrous acid, nitrogen dioxide, and nitronium ion. Chemical Research.

Toxicology 12(1):83–92

Oyaizu M, (1986). Studies on Products of Browning Reactions: Antioxidative Activities of Product

of Browning Reaction Prepared from Glucosamine. Japan Journal of Nutrition 44:307-315

Ozgen M, Reese RN, Tulio AZ Jr, Scheerens JC, Miller AR, (2006): Modified 2,2-azino-bis-3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (abts) method to measure antioxidant capacity of Selected small

fruits and comparison to ferric reducing antioxidant power (FRAP) and 2,2'-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH) methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54(4):115-171

Pacher P, Beckman JS, Liaudet L, (2007). Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. 

Physiological Reviews 87(1):315–424

Re R, Pellegrin N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rice-Evans C, (1999). Antioxidant activity

appl ying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine

26(9-10):123-131

Magalhaes J, Ferreira R, Marques F, Olivera E, Soares J, Ascensao A, (2007). Indoor climbing elicits

plasma oxidative stress. Medicine & Science in Sports & Exercise 39(6):955-963

65 

Malbert Y, (2014). Flavonoid lucodiversification with engineered sucrose-active enzymes

Biotechnology. INSA de Toulouse, Doktorska disertacija

Michalak A, (2006). Phenolic compounds and their antioxidant activity in plants growing under heavy

Metal stress. Polish. Journal of Environmental Studies 15(4):523–530

Mimica-Dukić N, (1997). In vivo i in vitro ispitivanja antioksidantnih svojstava biljnih ekstrakata.

Arhiva za farmaciju 47(5):475-493

Oyaiz M. (1986). Studies on product of browning reaction prepared from glucose amine. Japan

Journal of Nutrition 44:307-315

Sharififar F, Nudeh-Dehghn G, Mirtajaldini M, (2008). Major flavonoids withantioxidant activity

from Teucrium polium L. Food Chemistry 112(4):885-888

Sanchez-Moreno C, (2002). Methods used to evaluate the free radical scavenging activity in foods

and biological systems, review. Free Radical Scavenging Activity in Foods 8(3):121-137

Sandhar HK, Kumar B, Prasher S, Tiwari P, Salhan M, Sharma P, (2011). A Review of

Phytochemistry and Pharmacology of Flavonoids. Internationale Pharmaceutical Sciencia 23(4):239-

244

Sayre ML, Perry G, Smith MA, (1999). Redox metals and neurodegenerative disease. Current

Opinion in Chemical Biology 3(2):220-225

Singh J, Singh V, Shukla S, Rai A K, (2016). Phenolic Content and Antioxidant Capacity of Selected

Cucurbit Fruits Extracted with Different Solvents. Nutr Food Science 6:6

Singleton VL, Rossi J, (1965). Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-

Phosphotungstic Acid Reagents. American Journal of Enology and Viticulture 16:144-158

Shi H, Noguchi N, Niki E,  Pokorny J, Yanishlieva N, Gordon M, (2001). Introducing natural

antioxidants antioxidants in food. Practical Applications Scientific Reasrch 22-70

Squadrito GL, Pryor WA, (1998). Oxidative chemistry of nitric oxide: the roles of superoxide,

peroxynitrite, and carbon dioxide. Free Radical Biology and Medicine 25(4–5):392–40

Shivprasad HN, Mohan S, Kharya MD, Shiradkar MR, (2005). Lakshman K. In-vitro models for

antioxidant aactivity evaluation. American Pharmaceutical Review 3:1-11

66 

Tadmor Y, Burger J, Yaakov I, Feder A, Libhaber SE, Portnoy V, Meir A, Tzuri G, Sa'ar U, Rogachev

I, Aharoni A, Abeliovich H, Schaffer AA, Lewinsohn E, Katzir N, (2010). Genetics of flavonoid,

carotenoid, and chlorophyll pigments in melon fruit rinds. Journal of Agricultural and Food

Chemistry 58(19):10722-10728

Tirzitis G, Bartosz G, (2010). Determination of antiradical and antioxidant activity: basic principles

and new insights. Acta Biochimica Polonica 57(1): 139-142

Yang J, Meyers KJ, Van der Heide J, Liu RH, (2004). Varietal differences in phenol content and

antioxidant and antiproliferative activities of onions. Journal of Agricultural and Food Chemistry

52:6787-6793

Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W, (1999). The determination of flavonoid contents in mulberry

and their scavenging effects on superoxide radicals. Food Chemistry 64:555-559

Živković M, (1998). Hiperbarična i podvodna medicina. Beograd: HBO medical center; Nauka.

str.251