master rad - pmf.ni.ac.rs · rasta bmk i fermentacije u hrani utiču na teksturu i ukus hrane....
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
MASTER RAD
Tehnološka karakterizacija bakterija mlečne kiseline izolovanih
iz peglane kobasice
Mentor: Kandidat:
Prof. dr Nataša Joković Jelena Vujić, 231
Niš, 2018.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
MASTER RAD
Tehnološka karakterizacija bakterija mlečne kiseline
izolovanih iz peglane kobasice
Mentor: Kandidat:
Prof. dr Nataša Joković Jelena Vujić, 231
Niš, 2018.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Technological characterization of lactic acid bacteria
isolated from “peglana” sausage
Master thesis
Mentor: Candidate:
PhD Nataša Joković Jelena Vujić, 231
Niš, 2018.
Zahvalnica
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Nataši Joković na velikoj profesionalnosti,
angažovanosti i pomoći oko izrade master rada.
Posebno se zahvaljujem asistentu Stanković Nikoli koji mi je pomogao da uspešno i na vreme
obavim laboratorijski deo ovog rada.
Biografija
Jelena Vujić je rođena 11. maja 1994. godine u Nišu. Osnovnu školu “Đura Jakšić” u Jelašnici
završava 2009. god. sa odličnim uspehom. Nakon toga upisuje srednju Ugostiteljsko-turističku
školu u Nišu, smer Turistički tehničar, koju završava 2013. sa odličnim uspehom. Iste godine
upisuje Osnovne akademske studije na Departmanu za biologiju i ekologiju Prirodno-
matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu i završava 2016. godine sa prosečnom ocenom 8,79.
Master akademske studije, smer Biologija upisuje iste godine i završava 2018. sa prosečnom
ocenom 9.44.
Sažetak
Bakterije mlečne kiseline (BMK) su Gram-pozitivne bakterije koje žive na obogaćenim
podlogama. Koriste se kao starter kulture pri porizvodnji fermentisanih proizvoda, među kojima
su kobasice. U ovom radu rađena je tehnološka karakterizacija bakterija mlečne kiseline izolovanih
iz peglane kobasice. Korišćeni su izolati identifikovani kao Lactobacillus sakei (31 soj),
Lactobacillus curvatus (5 sojeva), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (1 soj),
Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (4 soja), Weissella viridescens (10 soja),
Carnobacterium maltaromaticum (2 soja), Carnobacterium divergens (1 soj), kao i
Staphylococcus hominis (1 soj), Staphylococcus capitis (1 soj) i Staphylococcus sp. (2 soja) koji
ne pripadaju grupi BMK. Ispitan je rast izolata na: niskim temperaturama, podlogama sa različitim
koncentracijama NaCl, začina i aw vrednostima. Rađeno je ispitivanje produkcije određenih
enzima (lipaze, proteinaze, nitrat reduktaze, ureaze, citrate liaze), sinteze egzopolisaharida i
antimikrobnih supstanci. Utvrđeno je da BMK rastu na niskim temperaturama, na podlogama sa
različitim koncentracijama NaCl i začina i na podlogama sa visokim aw vrednostima. Neki izolati
BMK produkuju citrat liaze, sintetišu egzopolisaharide i antimikrobne supstance. Rezultati su
pokazali da BMK mogu da se koriste kao starter kulture pri proizvodnji kobasica, ali uz dodatak
drugih bakterija koje imaju sve one osobine koje su značajne za dobijanje kvalitetnog proizvoda.
Ključne reči: peglana kobasica, bakterije mlečne kiseline, tehnološke karakteristike
Abstract
Lactic acid bacteria (LAB) are Gram-positive bacteria that live in enriched supstrate. They are
used as starter cultures in production of fermented products, among which are sausages. In this
paper, the technological caracterization of lactic acid bacteria isolated from “peglana” sausage was
done. The isolates were identified as Lactobacillus sakei (31 strains), Lactobacillus curvatus (5
strains), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (1 strain), Leuconostoc mesenteroides ssp.
dextranicum (4 strains), Weissella viridescens (10 strains), Carnobacterium maltaromaticum (2
strains), Carnobacterium divergens (1 strain), as well as Staphylococcus hominis (1 strain),
Staphylococcus capitis (1 strain) and Staphylococcus sp. (2 strains) which don’t belong to the LAB
group. The isolates growth was tested on: low temperature, substrates with different concentration
of NaCl, spices and aw value. Testing of various enzymes production was also performed (lipase,
proteinase, nitrate reductase, urease, citrate lyase), as well as synthesis of egzopolysaccharides and
antimicrobial substances. It was established that LAB growth in low temperature, on substrates
with different concentration of NaCl and spices and on substrates with high aw value. Some LAB
isolates produced citrate lyase, synthesized egzopolysaccharides and antimicrobial substances.
Results showed that characterized LAB isolated could be used as starter cultures in sausages
production, but with the addition of other bacteria that have all the features that are significant for
getting quality product.
Key words: “peglana” sausage, lactic acid bacteria, technological characteristics
Sadržaj
1. UVOD -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
1.1. Bakterije mlečne kiseline ------------------------------------------------------------------------------- 1
1.2. Bakterije mlečne kiseline u kobasicama -------------------------------------------------------------- 4
1.3. Tehnološka svojstva bakterija mlečne kiseline značajna za starter kulture u kobasicama ---- 5
1.3.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija ------------------------------------------------------ 5
1.3.2. Enzimska aktivnost bakterija mlečne kiseline -------------------------------------------------- 6
1.3.3. Katabolizam citrata --------------------------------------------------------------------------------- 8
1.3.4. Sinteza egzopolisaharida --------------------------------------------------------------------------- 9
1.3.5. Sinteza antimikrobnih supstanci ------------------------------------------------------------------ 9
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ------------------------------------------------------------------------------ 11
3. MATERIJAL I METODE ------------------------------------------------------------------------------- 12
3.1. Bakterijski sojevi ---------------------------------------------------------------------------------------- 12
3.2. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija ---------------------------------------------------------- 12
3.3. Sinteza enzima ------------------------------------------------------------------------------------------- 13
3.4. Razgradnja citrata --------------------------------------------------------------------------------------- 15
3.5. Sinteza egzopolisaharida ------------------------------------------------------------------------------- 15
3.6. Sinteza antimikrobnih supstanci ---------------------------------------------------------------------- 15
3.7. Kriva rasta ------------------------------------------------------------------------------------------------ 16
4. REZULTATI I DISKUSIJA ----------------------------------------------------------------------------- 16
4.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija ---------------------------------------------------------- 17
4.2. Sinteza enzima ------------------------------------------------------------------------------------------- 23
4.3. Razgradnja citrata --------------------------------------------------------------------------------------- 27
4.4. Sinteza egzopolisaharida ------------------------------------------------------------------------------- 28
4.5. Antimikrobna aktivnost -------------------------------------------------------------------------------- 28
4.6. Kriva rasta ------------------------------------------------------------------------------------------------ 31
5. ZAKLJUČAK --------------------------------------------------------------------------------------------- 33
LITERATURA ----------------------------------------------------------------------------------------------- 35
1
1.UVOD
1.1. Bakterije mlečne kiseline
Bakterije mlečne kiseline (BMK) spadaju u jednu od najstarijih grupa organizama na
Zemlji. Smatra se da su nastale pre 2,75 milijardi godina o čemu nam svedoče fosilni ostaci
pronađeni u sedimentima. Ovde spadaju Gram-pozitivne koke i bacili, koje imaju mali broj guanin-
citozin parova u genomu. Ne produkuju enzim katalazu, pa zbog toga ne mogu da razgrađuju
vodonik peroksid. Ne poseduju citohrome tako da spadaju u grupu mikroaerofilnih ili anaerobnih
mikroorganizama. Istraživanje je pokazalo da ukoliko se u supstrat stavi hem, bakterije počinju da
sntetišu katalaze i citohrome (Hutkins, 2006). Ne produkuju spore.
BMK se gaje na podlogama koje su bogate šećerima, vitaminima, amino kiselinama,
purinima i pirimidinima. Kao glavni izvor energije iz podloge koriste glukozu. Katabolizmom
glukoze nastaje piruvat, koji ulazi u proces mlečne fermentacije zbog nedostatka citohroma i
elektronskog transportnog lanca. Sinteza mlečne kiseline je osnovna karakteristika ovih bakterija.
BMK se dele na homofermentativne i heterofermentativne bakterije. Kod
homofermentativnih bakterija krajnji produkti fermentacije glukoze su 2 mola ATP i 2 mola
mlečne kiseline (laktat). Krajnji produkti heterofementativnih bakterija su 1 mol ATP, 1 mol
laktata, 1 mol etanola i 1 mol CO2. Mlečna kiselina može da ima dva optički aktivna oblika, D(+)
i D(-). Prisustvo D(-) oblika u fermentisanim proizvodima nije poželjno jer humane ćelije ne mogu
da ga metabolišu, što može da izazove acidozu.
BMK nemaju štetan efekat na ljudsko zdravlje osim nekih pripadnika roda Streptococcus
koje izazivaju bolesti poput upale pluća, miokarditisa, meningitisa itd. Veliki broj vrsta pripada
normalnoj flori usne duplje, gastrointestinalnog trakta i vagine kod sisara. Mogu da se nađu u
mleku i mlečnim proizvodima, mesu i piću.
Poslednjih godina BMK imaju veliku primenu u industriji fermentisane hrane. FDA (Food
and Drug Administration) je ovim mikroorganizmima dodelio GRAS (Generaly Recognized As
2
Safe) status, što omogućava njihovu bezbednu upotrebu u industriji hrane. Produkti nastali tokom
rasta BMK i fermentacije u hrani utiču na teksturu i ukus hrane.
Produkcija mlečne kiseline snižava pH vrednost supstrata pri čemu se inhibira rast drugih
mikroorganizama. BMK se dodaju kao starter kulture pri proizvodnji jogurta, kefira, kiselog
mleka, pavlake, sireva i drugih proizvoda.
Red Lactobacialles poseduje nekoliko rodova koji pripadaju grupi bakterija mlečne
kiseline. Najznačajniji rodovi BMK čiji su predstavnici značajni u mikrobiologiji hrane su:
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenococcus, Enterococcus,
Streptococcus i Weissella.
Rod Lactobacillus
Laktobacili predstavljaju jednu vrlo heterogenu grupu bakterija. Mogu da budu različitog
oblika, od kratkih do veoma dugih štapića povezanih u lance. Takođe mogu da imaju i kokoidni
oblik (kokobacili). Nalaze se u usnoj duplji, gastrointestinalnom i urogenitalnom traktu sisara.
Mogu izazvati kvarenje mlečnih i mesnih proizvoda, piva, vina i voća. Dele se na:
1. obligatno homofermentativne koji katabolišu samo heksoze. Lactobacillus delbrueckii
subsp. bulgaricus dodaje se kao starter kultura pri proizvodnji jogurta, a Lactobacillus helveticus za
proizvodnju sireva. Lactobacillus acidophilus je izolovan iz gastrointestinalnog trakta ljudi a koristi
se kao probiotska bakterija za proizvodnju mlečnih napitaka i probiotskih preparata;
2. fakultativno heterofermentativne koji fermentišu heksoze i pentoze, a iz glukonata
produkuju gas. Ovde spadaju Lactobacillus paracasei, Lactobacillus casei, Lactobacillus
rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus i Lactobacillus sakei. Lb. paracasei, Lb.
casei i Lb. rhamnosus dodaju se kao starter kulture pri proizvodnji sireva. Lb. plantarum se dodaje
kao starter kultura pri proizvodnji kobasica i kiselog kupusa. Lb. curvatus i Lb. sakei se dodaju kao
starter kultura pri proizvodnji proizvoda od mesa;
3. obligatno heterofermentativne koji fermentišu heksoze do laktata, sirćetne kiseline, CO2 i
etanola. Lactobacillus sanfranciscensis se koristi za proizvodnju kiselog testa, Lactobacillus kefiri i
Lactobacillus kefiranofaciens za proizvodnju kefira dok je Lactobacillus reuteri probiotska bakterija
izolovana iz gastrointestinalnog trakta čoveka.
Rod Lactococcus
Laktokoke su okrugle nepokretne bakterije u okviru kojih postoji pet vrsta: Lactococcus
garvieae, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis i Lactococcus
3
lactis sa tri podvrste Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis i Lc. lactis subsp. hordniae. Lc.
plantarum se nalazi na površini biljaka. Lc. garvieae izaziva mastitis kod krava. Meso lososa sadrži
vrstu Lc. piscium. Na površini kože i u sirovom mleku domaćih životinja nalazi se vrsta Lc.
raffinolactis. U mlečnim proizvodima su najčešće prisutne Lc. lactis subsp. lactis i Lc. lactis subsp.
cremoris. Podvrsta Lc. lactis subsp. lactis ima varijetet Lc. lactis subsp. lactis biovarijetet diacetylactis
koja ima sposobnost da metaboliše citrat i da proizvodi aromatična jedinjenja (acetaldehid, acetoin,
2-3 butandiol i diacetil). Sposobnost da metaboliše citrat je kodirana genima na plazmidima, pa je to
veoma varijabilna osobina. Spadaju u grupu mezofilnih homofermentativnih bakterija koje sintetišu
L(+) laktat.
Osnovna uloga laktokoka je snižavanje pH vrednosti supstrata, proteoliza i sinteza jedinjenja
koja utiču na organoleptička svojstva hrane.
Rod Leuconostoc
U okviru ovog roda postoji veoma značajna vrsta Leuconostoc mesenteroides sa nekoliko
podvrsta: mesenteroides, dextranicum i cremoris. Mogu da se nađu na površini svežih biljaka, a
učestvuju u fermentaciji kobasica, žitarica, povrća i mlečnih proizvoda. Kokoidnog su oblika.
Pripadaju mezofilnim heterofermentativnim bakterijama, koje produkuju CO2, etanol i D(-) laktat.
Izoluju se iz sireva i kefira, a sintezom acetaldehida, etanola, diacetila i egzopolisaharida poboljšavaju
organoleptička svojstva hrane.
Rod Pediococcus
Vrste u okviru ovog roda su okruglog oblika i nakon ćelijske deobe formiraju tetrade.
Pediococcus acidilactici i Pediococcus pentosaceus se koriste kao starter kulture pri proizvodnji
kobasica i fermentisanog povrća. Mezofilne su i homofermentativne bakterije koje produkuju L(+)
oblik mlečne kiseline. Šećer laktozu slabo katabolišu. Podnose nisku pH vrednost sredine i
halotolerantne su, što znaci da podnose visoku koncentraciju soli u podlozi.
Rod Enterococcus
Enterokoke su specifične po tome što imaju okrugle i malo izdužene ćelije, udružene u parove
ili lance. Termofilne su i heterofermentativne bakterije koje produkuju L(+) oblik mlečne kiseline.
Mogu da se nađu u vodi, zemljištu, na površini biljaka, u hrani i mogu da preživljavaju različite uslove
sredine. U gastrointestinalnom traktu čoveka, kao pripadnici normalne flore javljaju se vrste
Enetrococcus faecalis i Enterococcus faecium. Ove dve vrste kao i vrsta E. durans izolovane su iz
mlečnih proizvoda, kao posledica loših higijenskih uslova proizvodnje. Podstiču zrenje sireva kao što
4
su čedar sir, mocarela, feta, zahvaljujući svojoj proteolitičkoj aktivnosti i sintezi različitih jedinjenja
koja daju aromu proizvodu. Usled pada imuniteta mogu da izazovu različite bolesti, pa se nazivaju
opurtunističkim patogenima. U svom genomu poseduju gene za rezistenciju na antibiotike.
Rod Weissella
Pripadnici roda Weissella su mezofilne heterofermentativne bakterije koje produkuju D(-)
mlečnu kiselinu katabolizmom ugljenih hidrata. Po svojoj morfologiji spadaju u veoma kratke i
napravilne štapiće ili kokoidne bakterije. Njihovo prirodno stanište je biljni materijal ali su izolovani
iz mleka, mlečnih proizvoda i kobasica. Najznačajniji su u fermentaciji kiselog povrća.
1.2. Bakterije mlečne kiseline u kobasicama
Svaki deo sveta je prepoznatljiv po tradicionalnoj proizvodnji fermentisanih kobasica. U
različitim fazama zrenja kobasica, sastav mikrobnih populacija se menja. Tokom svake faze se
izoluju mikroorganizmi i vrši se njihova identifikacija do nivoa vrste i soja zahvaljujući
savremenim molekularnim metodama. BMK su najdominantnije vrste bakterija u ovim
proizvodima. Pored BMK, nalaze se i druge vrste bakterija, kao što su enterokoke, mikrokoke,
zatim kvasci i plesni. Svaka grupa mikroorganizama obavlja određenu funkciju, što se odražava
na kvalitet i organoleptička svojstva proizvoda.
BMK produkuju bakteriocine i mlečnu kiselinu inhibirajući rast patogenih
mikroorganizama. Na taj način proizvod ostaje stabilan i dugotrajan. Enterokoke se dodaju zbog
svoje lipolitičke aktivnosti, proteolitičke aktivnosti, redukcije nitrata i stabilizacije boje proizvoda.
Tradicionalna proizvodnja kobasica ne zahteva dodavanje starter kultura, što se odražava na ukus
i kvalitet proizvoda. U prehrambenoj industriji se prilikom proizvodnje kobasica dodaju starter
kulture koje vrše proces fermentacije pod kontrolisanim uslovima. Smatra se da su kobasice
dobijene na tradicionalan način boljeg kvaliteta od onih koje se proizvode u industriji. Veoma
često se dodaje starter kultura čiji sastav mikroorganizma nije prilagođen uslovima koji vladaju u
mesu. Slaba aktivnost ili nedostatak aktivnosti tih mikroorganizama se direktno odražava na ukus
i kvalitet proizvoda. Zato se u novije vreme vrši selekcija autohtonih starter kultura koje potiču iz
tradicionalnih mesnih proizvoda i koje će se lakše prilagoditi uslovima koji vladaju u mesu.
5
1.3. Tehnološka svojstva bakterija mlečne kiseline značajna za starter kulture
u kobasicama
U tehnološke karakteristike bakterija koje su značajne za proizvodnju kobasica svrstavaju se
sve one osobine starter kultura koje su pogodne za dobijanje kvalitetnog proizvoda. Neke od tih
osobina su određene genetičkim metaboličkim potencijalom vrste bakterija, kao što su produkcija
određenih enzima (lipaze, proteinaze, citrat liaze, ureaze, nitratne reduktaze i dr.), sinteza
anitmikrobnih jedinjenja i egzopolisaharida. Određene osobine zavise od spoljašnjih uslova sredine u
kojoj se nalaze bakterije pri fermentaciji kobasica poput temperature mesa (nadeva), aktivnosti vode,
količine NaCl kao i pH vrednosti koja se menja tokom zrenja kobasica, zbog sineteze mlečne kiseline
u procesu fementacije.
1.3.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija
U odnosu na temperaturni opseg sve mikroorganizme možemo da podelimo na: psihrofilne
(6-10oC), mezofilne (20-40oC) i termofilne (45-65oC). Bakterije mlečne kiseline su najčešće
mezofilne i termofilne. Optimalna temperatura na kojoj rastu bakterije mlečne kiseline je 30oC. BMK
imaju duže generacijsko vreme u odnosu na patogene bakterije. Neke vrste mogu da rastu na 4oC u
frižideru, pa se na taj način ponašaju kao psihrofili. U zavisnosti od načina sušenja kobasica, različite
vrste će preživljavati rezličite temperature. Lb. curvatus i Lb. sakei se koriste kao starter kulture za
proizvodnju sirovih fermentisanih kobasica i drugih proizvoda od mesa. Takvi proizvodi se pakuju
u vakuum ambalaži i čuvaju na temperaturi ispod 5oC. Vrste u okviru roda Pediococcus vrše
fermentaciju na visokim temperaturama i dodaju se kao stareter kulture pri proizvodnji kobasica.Vrste
u okviru roda Leuconostoc se takođe mogu koristiti kao starter kulture pri proizvodnji kobasica, a
fermentaciju vrše na niskoj temperaturi (Kegalj et al., 2012).
Povećana količina vode, odnosno vlage u kobasicama omogućava patogenima brži razvoj pri
fermentaciji kobasica. Dodavanjem NaCl smanjuje se količina vode u kobasici i sprečava se razvoj
svih mikroorganizama koji bi izazvali njeno kvarenje. Često se kao zamena za NaCl dodaje nitritna
so koja daje mesu crvenu boju.
Tehnološka funkcija NaCl je da iz komadića mesa ekstrahuje proteine koji povezuju
komadiće mesa sa komadićima masnog tkiva, što doprinosi razvoju čvrste teksture tokom sušenja i
zrenja kobasica (Lilić et al., 2013). Uobičajena količina NaCl koja se dodaje nadevu za proizvodnju
kobasica je 26-30 g/kg nadeva. Različita koncentracija soli deluje inhibitorno na različite vrste
6
patogena. Vrstu Clostridium botulinum tip E inhibira 5% soli, vrstu Clostridium botulinum tip B 10%,
vrstu Staphylococcus aureus 18% a vrstu Halobacterium halobium inhibira 26% soli u nadevu.
Povišena koncentracija NaCl u mesu smanjuje aktivnost BMK, ali čini proizvod
kompaktijim i čvršćim. Da bi se podstakla aktivnost BMK i da bi proizvod bio kompaktniji dodaju
se manja koncentracija NaCl i određene koncentracije hloridnih soli kalijuma, kalcijuma i
magnezijuma.
Voda predstavlja važan faktor za opstanak svih mikroorganizama. U različitim sredinama
voda je zastupljena u različitim količinama. Neke vrste mikroorganizama mogu da opstanu u jako
sušnim uslovima sredine. Za mikroorganizme nije bitna količina vode u okruženju, već njena
dostupnost. Voda može biti slobodna i vezana. Slobodna voda je ona koju koriste mikroorganizmi.
Ukoliko su za vodu vezani šećeri, soli ili neka druga jedinjenja za takvu vodu kažemo da je vezana i
mikroorganizmi ne mogu da je koriste. Količina slobodne vode u određenoj sredini se označava kao
aktivnost vode (aw). To je ona količina vode koja je neophodna za odvijanje brojnih reakcija.
Optimalna količina vode u svežem mesu je veća od 0,97, a optimalna aw za većinu bakterija je od 0,93
do 0,99. Ukoliko je aw u mesu manje od 0,90 onda se tu razvijaju gljivice (Kegalj et al., 2012).
pH vrednost predstavlja količinu slobodnih vodonikovih protona (H+ ) u rastvoru, odnosno
supstratu. Poznato je da se pH vrednost fermentisanih proizvoda menja zbog aktivnosti BMK. BMK
vrše fermentaciju i u tom slučaju se oslobađaju kiseline koje menjaju pH vrednost proizvoda. Ove
kiseline mogu da inhibiraju rast patogenih ali i nepatogenih mikroorganizama. Sirćetna kiselina ima
jači efekat na kvasce i plesni nego mlečna kiselina. Mlečna kiselina koju sintetišu bakterije može da
deluje inhibitorno na njih, ukoliko se njena količina poveća, tj. ukoliko je pH vrednost niža u odnosu
na onu koje bakterije tolerišu.
Optimalna pH vrednost za većinu bakterija je 6,5-7,0. Neke vrste mikroorganizama mogu da
rastu u širokom rasponu pH vrednosti 4,0-9,5. Acidofilne bakterije mogu da prežive kada je pH manja
od 4,0 (Kegalj et al., 2012).
1.3.2. Enzimska aktivnost bakterija mlečne kiseline
Lipolitička aktivnost
Lipaze su enzimi koji vrše hidrolizu, odnosno razgradnju lipida na masne kiseline i glicerol,
a daljom razgradnjom ovih jedinjenja nastaju aldehidi, ketoni i estri. Ova karbonilna jedinjenja daju
ukus kobasicama. Lipaze su senzitivne kada je pH vrednost niska, a najaktivnije su kada je sredina
7
neutralna ili alkalna. Aktivnost lipaza zavisi i od temperature. Najmanja aktivnost je na temperaturi
od od 1oC, a najveća je na 40oC (Kenneally et al., 2013).
Da bi se ispitala lipolitička aktivnost bakterija u kobasicama, vrsta Staphylococcus xylosus je
korišćena kao model jer ulazi u sastav starter kultura pri proizvodnji fermentisanih mesnih proizvoda
koji sazrevaju na temperaturi od 10-30oC. Ispitano je koji spoljašnji faktor najviše utiče na aktivnost
lipaza. Rezultati su pokazali da visoke koncentracije soli u nadevu i niska pH vrednost inhibiraju
lipaze, dok promena temperature ne utiče negativno na aktivnost lipaza (Kenneally et al., 2013).
BMK ne produkuju lipaze. Zbog toga se prilikom proizvodnje fermentisanih kobasica dodaju
neke vrste bakterija koje imaju tu sposobnost. Takve vrste pripadaju rodu Micrococcus.
Proteolitička aktivnost
Proteinaze su enzimi koji razlažu proteine na oligopeptide, dok peptidaze razlažu peptide na
amino kiseline. Oslobođene amino kiseline se koriste za kataboličke ili anaboličke procese.
Dekarboksilacijom amino kiselina nastaju biogeni amini koji su toksični za čoveka i izazivaju
kvarenje hrane. Usled delovanja intracelularnih enzima od amino kiselina nastaju alkoholi, aldehidi,
kiseline i sumporna jedinjenja koja utiču na organoleptička svojstva hrane, ali i NH3 i H2S koji
dovode do kvarenja hrane. BMK su specifične po tome što imaju sposobnost degradacije proteina
što se odražava na organoleptička svojstva fermentisane hrane. Proteolitički sistem BMK čine
ekstracelularne proteinaze (prtP, prtB, prtH i prtR), specifičan transportni sistem za di, tri i
oligopeptide, intracelularne peptidaze i enzimi koji katabolišu aminokiseline do jedinjenja koja su
značajna za formiranje ukusa i mirisa krajnjeg proizvoda. Sve proteinaze koje produkuju BMK
pripadaju grupi subtilizinskih serinskih proteinaza koje u aktivnom centru sadrže katalitičku trijadu
Asp, His i Ser.
Sinteza nitrat reduktaza
U anaerobnom disanju vrši se oksidacija organskih jedinjenja, pri čemu se redukuje koenzim
NAD+, koji se oksiduje na respiratornom lancu. Zbog nedostatka kiseonika akceptor elektrona je
vezani kiseonik organskih jedinjenja. To su najčešće soli azotne, sumporne ili ugljene kiseline.
Nitrati su krajnji akceptori elektrona u takozvanom nitratnom disanju. Vodonik se odvaja od
supstrata procesom dehidrogenacije i prenosi na respiratorni lanac gde se krajnji akceptor elektrona
oksidiše enzimom nitratnom reduktazom. Ovaj enzim se sintetiše u anaerobnim uslovima i u prisustvu
nitrata i vrši redukciju nitrata do nitrita.
NO3 + 2e- + H+ NO2 + H2O
8
Redukcija nitrata se vrši sve dok se ne dobiju neredukujući oblici azot - N2 i amonijak - NH3.
Nitritna so se dodaje prilikom proizvodnje kobasica jer daje crvenu boju kobasicama, a sa
druge strane inhibira nepoželjne mikroorganizme. Ako se proizvode kobasice koje imaju dug period
zrenja onda se dodaju nitrati koji se redukuju do nitrita zahvaljujući bakterijama koje produkuju
nitratne reduktaze (Staphylococcus i Micrococcus) (Lilić et al., 2013). BMK su poznate po tome što
ne vrše redukciju nitrata, pa se iz tog razloga dodaju one bakterije koje imaju takvu sposobnost.
Sinteza ureaza
Ureaze su enzimi koji vrše hidrolizu uree na amonijak i ugljen dioksid. Hidroliza predstavlja
neku vrstu fermentacije urina. Ove enzime produkuju različite vrste bakterija. Među tim bakterijama
mogu da se nađu uzorčnici infekcija urinarnog trakta. Ureaze se koriste za dobijanje fermentisanih i
alkoholnih napitaka, kao što su crveno i belo vino, kinesko vino, sake itd. U tom slučaju koriste se
ureaze izolovane iz bakterija koje pripadaju rodovima Lactobacillus (Lb. fermentum, Lb. reuteri, Lb.
animalis, Lb. salivarius, Lb. ruminis, Lb. delbrueckii), Streptococcus (Streptococcus mitior, S.
salivarius, S. thermophylus), Weissella (Weissella cibaria, W. confusa, W. wiridescens),
Enterococcus (Enterococcus faecalis, E. faecium, E. pseudoavium) i Enterobacter, kao i vrstama
Arthrobacter mobilis i Providencia rettgeri (Phang et al., 2018).
1.3.3. Katabolizam citrata
Važan izvor energije za bakterije mlečne kiseline, pored ugljenih hidrata jeste citrat. Citrat se
nalazi u mleku, voću, povrću i u živim ćelijama. Bakterije ga katabolišu istovremeno sa ugljenim
hidratima, pri čemu nastaju C4 jedinjenja ili aromatogena jedinjenja, koja daju aromu fermentisanoj
hrani. U C4 jedinjenja spadaju acetaldehid, acetoin, 2-3 butandiol i diacetil. Količina ovih jedinjenja
je veća kada se istovremeno sa citratom kataboliše glukoza ili laktoza, a na kraju prve faze
katabolizma nastaje piruvat. Višak piruvata se oksidativnom dekarboksilacijom pretvara u diacetil.
Neke BMK, naročito one iz roda Lactococcus, Leuconostoc i Lactobacillus, mogu da razlažu citrat
do CO2, acetata, diacetila, acetoina i nekada 2,3 butandiola.
Za ćelijsku membranu je vezan enzim citrat permeaza zahvaljujući kome citrat ulazi u ćeliju,
a za unutrašnju stranu enzima vezuje se mlečna kiselina koja se razmenjuje za anjonski oblik citrata.
Citrat ulazi u ćelije samo kada se vrši katabolizam ugljenih hidrata.
Zahvaljujući citrat liazi, citrat se kataboliše do acetata i oksalacetata. Oksalacetat se razgrađuje
do piruvata i CO2, a od piruvata nastaju C4 jedinjenja.
9
1.3.4. Sinteza egzopolisaharida
Polisaharidi su ugljeni hidrati građeni od velikog broja monosaharidnih jedinica. Dele se na
intracelularne (unutar ćelije), strukturne (izgrađuju ćelijsku membranu) i ekstracelularne ili
egzopolisaharide (izlučuju se van ćelije). Egzopolisaharidi (EPS) se izlučuju u vidu kapsule i imaju
veliku molekulsku masu. Sprečavaju gubitak svih materija koje su neophodne bakterijama. Takođe
omogućavaju formiranje biofilma (Ivanković, 2016).
Bakterije iz rodova Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc i Lactococcus mogu da
produkuju EPS koji su različiti po svom hemijskom sastavu, strukturi i veličini. Na osnovu
strukture, mehanizma biosinteze i potrebnih prekursora, EPS se dele na homopolisaharide i
heteropolisaharide. Homopolisaharidi su polimeri koji se sastoje od jedne vrste monosaharida.
Tako dekstran koji produkuju Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides i Ln. mesenteroides ssp.
dextranicum kao i neki laktobacili i veisele sastoji se od monomera glukoze. Heteropolisaharide
proizvodi veliki broj laktokoka, laktobacila i streptokoka. Oni se sastoje od ponavljajućih
oligomernih jedinica monosaharida koji često sadrže kombinaciju D-glukoze, D-galaktoze i D-
ramnoze, a u nekim slučajevima N-acetilglukozoamin, N-acetilgalaktozoamin ili glukuronsku
kiselinu.
1.3.5. Sinteza antimikrobnih supstanci
Razgradnjom ugljenih hidrata, BMK produkuju jedinjenja koja imaju antimikrobnu aktivnost.
Tu spadaju primarni i sekundarni metaboliti.
Organske kiseline imaju antimikrobnu aktivnost. BMK produkuju mlečnu, sirćetnu i
limunsku kiselinu. Ugljen dioksid (CO2) nastaje usled metabolizma heterofementativnih BMK.
Stvara anaerobne uslove što ne pogoduje mnogim bakterijama. Narušava potencijal ćelijske
membrane. Vodonik peroksid (H2O2) svoju antimikrobnu aktivnost ispoljava na taj način što se
vezuje za membranu ćelijskih organela i vrši njenu destrukciju. Diacetil daje aromu fermentisanim
proizvodima i ima antimikrobnu aktivnost. Etanol nastaje kao krajnji produkt katabolizma ugljenih
hidrata. Vrši denaturaciju ćelijskih membrana.
Bakteriocini su molekuli proteinske prirode koji imaju inhibitorni efekat na Gram pozitivne
bakterije iz rodova Listeria, Staphylococcus, Clostridium i Bacillus. Sintetišu se u stacionarnoj
fazi rasta kao sekundarni metaboliti.
Bakteriocini su podeljeni u nekoliko grupa. Prvu grupu čine lantibiotici, stabilni peptidi
koji se sastoje od neuobičajenih amino kiselina lantionina, β-metillantionina, dehidroalanina i
10
dehidrobutirina. Najpoznatiji lantibiotik je nizin koga sintetišu laktokoke. Narušava membranski
potencijal i sprečava reparaciju ćelijskog zida.
Drugu grupu čine termostabilni peptidi bez modifikovanih amino kiselina ili mogu da budu
izgrađeni od jednog ili dva polipeptidna lanca. Ovde spada pediocin koga sintetišu pediokoke. U
hrani se često razvija vrsta Lysteria monocytogenes koju inhibira pediocin.
Treću grupu čine bakteriolizini. Oni vrše hidrolizu ćelijskog zida, što dovodi do lize ćelije.
Najpoznatiji je helveticin koga sintetiše Lb. helveticus.
Često se kao aditivi prehrambenim proizvodima dodaju bakteriocini. Jedan od njih je već
pomenuti nizin. U farmaceutskoj industriji mogu se koristiti kao zamena za antibiotik, ali se po svojim
karakteristikama dosta razlikuju od antibiotika. Zato bi trebalo da se koriste istovremeno, jer imaju
sinergistički efekat.
11
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
Bakterije mlečne kiseline svojim rastom i metabolizmom usmeravaju proces zrenja
fermentisanih kobasica. Koriste se i kao starter kulture za proizvodnju kobasica standardnog
kvaliteta. Izbor sojeva BMK izolovanih iz autohtonih proizvoda za starter kulture u proizvodnji
kobasica zavisi od tehnoloških svojstava izolata. Zato su ciljevi istraživanja bili sledeći:
1. ispitivanje uticaja temperature, različitih koncentracija NaCl, začina i aktivnosti vode
na rast BMK izolovanih iz peglanih kobasica,
2. ispitivnje produkcije određenih enzima (proteinaze, lipaze, ureaze, nitratne reduktaze,
citrate liaze),
3. ispitivanje produkcije egzopolisaharida i antimikrobnih supstanci.
12
3. MATERIJAL I METODE
3.1. Bakterijski sojevi
Bakterijski sojevi korišćeni u ovom radu su izolovani iz mesa od kojeg su pravljene peglane
kobasice (oznaka M), kao iz dva uzorka peglanih kobasica (PK i PF). Identifikovani su na Institut
za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo (IMGGI) u Beogradu do nivoa vrste. Izolovane
su sledeće vrste: Lactobacillus sakei (31 soj), Lactobacillus curvatus (5 sojeva), Leuconostoc
mesenteroides ssp. mesenteroides (1 soj), Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (4 soja),
Weissella viridescens (10 soja), Carnobacterium maltaromaticum (2 soja), Carnobacterium
divergens (1 soj), Staphylococcus hominis (1 soj), Staphylococcus capitis (1 soj) i Staphylococcus
sp. (2 soja). Čuvani su u stokovima na temperaturi od -20oC. Za aktivaciju kultura, sojevi su vađeni
iz stoka, zasejavani na MRS agar i inkubirani na 30oC. Radna kultura dobijena je nakon inokulacije
MRS bujona (Torlak, Srbija) određenim aktiviranim sojem i inkubacije zasejanih podloga na 30oC.
3.2. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija
Da bi se ispitao uticaj niskih temperatura na rast sojeva bakterija mlečne kiseline, MRS
bujoni su inokulisani prekonoćnim kulturama i čuvani u frižideru na +4oC. Rast je praćen na
osnovu zamućenja narednih deset dana. Za određene sojeve je merena pH vrednost bujona i
optička gustina na OD640 nm, posle 6, 24, 48,72 i 96 h.
Da bi se ispitao uticaj NaCl na rast sojeva BMK, zasejavan je MRS agar sa različitom
koncentracijom NaCl od 4%, 8% i 10%. MRS agar je inkubiran na 30oC, a rast se pratio na osnovu
formiranja kolonija. Uticaj koncentracije NaCl na rast sojeva ispitivan je i u tečnim podlogama.
MRS bujon (4%, 6% i 8% NaCl) je inokulisan određenim sojevima i inkubiran na 30oC. Za
određena sojeve je merena pH vrednost bujona i optička gustina na OD640 nm, posle 6, 24 i 48h.
Kako bi se ispitao uticaj začina na rast sojeva, pravljen je MRS agar sa začinom. MRS agar
je sa 2% NaCl prokuvan i sterilisan. Nakon toga je dodato 1,5% aleve paprike i 1% belog luka.
Takva podloga je opet prokuvana do ključanja i razlivena u Petrijeve šolje. Eksperiment je
ponovljen, s tim što je u MRS agar dodata duplo veća koncentracija NaCl, aleve paprika i belog
luka. Rast je praćen na osnovu formiranja kolonija. Za praćenje rasta sojeva u tečnoj podlozi, MRS
13
bujonu je dodato 4% NaCl, 3% aleve i 2% belog luka. Bujon je inokulisan određenim sojevima i
inkubiran na 30oC. Merena je pH vrednost bujona i optička gustina na OD640 nm, posle 6, 24 i 48h.
Da bi se odredila minimalna aw vrednost koja omogućava rast bakterijskim sojevima,
korišćen je Mlečni agar sa različitom koncentracijom saharoze, odnosno kuhinjskog šećera. Mlečni
agar sadrži 1 g obranog mleka u prahu, 5 g peptona, 3 g ekstrakta kvasca, 15 g Agar-agar, 1 l
destilovana voda, 5 g natrijum citrat, saharoza i glicerol. U tabeli 1 su date koncentracije saharoze
i glicerola za različite aw vrednosti.
Tabela 1. Različite koncentracije saharoze i glicerola za različite aw vrednosti
aw0.99 aw0.95 aw0.91
saharoza 18.3 g/100 ml 18.3 g/100 ml 87.7 g/100 ml
glicerol 2.0 g/100 ml 21.5 g/100ml 40.5 g/100 ml
Podloga je zagrejana na 50oC, a zatim sterilisana na 100oC, bez pritiska 10 minuta. Za sve
tri vrednosti aw je korišćena saharoza u prvom ponavljanju, a u drugom je korišćen kuhinjski šećer
za aw 0,99.
3.3. Sinteza enzima
Lipolitička aktivnost
Tributirin agar (TBA) i Spirit Blue Agar (SBA) su korišćeni za određivanje produkcije
lipaza, enzima koji razgrađuju lipide.
TBA je pravljen dodavanjem 2% Tributyrin Agar Base w/o Triibutyrin (Himedia, India) u
1 l destilovane vode.
SBA je pravljen dodavanjem 2% Agar-agar, 1% tripton i 0,5% ekstrakta kvasca u 1 l
destilovane vode. Lipoidalna emulzija je pravljena mešanjem 0,2% TWEEN-80 i 20% svinjske
masti. U SBA je prvi put dodato 3%, a drugi put 1% lipoidalne emulzije.
TBA i SBA su sterilisane u autoklavu na 121oC pod pritiskom. Praćen je rast kolonija i
pojava svetlih zona (halo) oko kolonija.
Proteolitička aktivnost
Za određivanje proteolitičke aktivnosti pravljena je podloga u koju su dodati
sarkoplazmatski proteini. Podloga se sastoji od 0,5% triptona, 0,25% ekstrakta kvasca, 0,1%
glukoze i 1,5% Agar-agar. Sarkoplazmatski proteini su izolovani tako što je izblendirano 10 g
14
mesa u 100 ml NaH2PO4 pufera, čija je pH vrednost 7,4. Po 1 ml je sipano u epndorfice i
centrifugirano na 8000 g na 4oC 15 minuta. Nakon centrifugiranja dobijeni supernatant je sterilisan
filtracijom (prečnik pora je 0,45 μm) i ubačen u podlogu. Za dobijanje miofibrilarnih proteina
prethodno dobijeni pelet je prebačen u 100 ml pufera KJ, čija je pH vrednost 7,4 i centrifugiran na
8000 g na 4oC 15 minuta. Dobijeni pelet je izmeren i u odnosu na tu količinu dodato je 10x više
KJ pufera. Prebačen je po 1 ml u ependorfice i centrifugiran na 10 000 g na 4oC 20 minuta. U
dobijeni natant je sipano 10x više pufera KJ. Dobijeni miofibrilarni proteini su profiltrirani i
prebačeni u podlogu.
Proteolitička aktivnost se utvrđuje na osnovu pojave svetle zone oko bunarčića u koji su
zasejani sojevi čija se proteolitička aktivnost ispituje.
Sinteza nitrat reduktaze
Kako bi se odredila redukcija nitrata, pravljen je YT agar čiji su sastojci sledeći: 1 l
destilovna voda, 1% tripton, 0,5% ekstrakt kvasca, 1,5% Agar-agar i 0,1% KNO3. Bakterijski
sojevi su zasejani na dati agar. Praćen je rast kao i redukcija nitrata. Pozitivan rezultat redukcije je
promena boje podloge. Rađeno je i spektrofotometrijsko ispitivnje redukcije nitrata u nitrite tako
što je 100 μl prekonoćnih kultura ispitivanih sojeva inokulisano u 10 ml YT bujona kome je dodato
250 ppm KNO3 i inkubirano na 20 i 30oC 24 h i na 15 oC 72 h. Deo kulture je korišćen za
određivanje suve mase, dok je 100 μl dodato u 250 μl Griess I (0,5 g sulfanilne kiseline u 150 ml
5 N sirćetne kiseline), 250 μl Griess II (0,5 g naftilamina u 50 ml destilovane vode i 100 ml 5 N
sirćetne kiseline) i 2 ml destilovane vode. Sve ovo je vorteksirano 1 minut i inkubirano na sobnoj
temperaturi 15 minuta. Masa je merena analitičkom vagom, tako što je nastavkom za automatsku
pipetu vađeno 1 ml YT bujona i stavljeno u čašu. Suva masa je dobijena tako što je od mase bujona
sa izolatima oduzeta masa kontrole. Masa kontrole je merena za sve tri temperature. Suva masa je
izražena kao mg/ml bujona. Produkcija nitrita iz nitrata je određena merenjem optičke gustine na
OD540 nm.
Ureazna aktivnost
Za određivanje ureazne aktivnosti korišćen je Urea Agar Base (Filter sterilizable) (w/o
Agar) (Himedia, India). Podloga je sterilisana filtracijom i stavljena je u inkubator na 37oC. Agar-
agar je prokuvan sa destilovanom vodom i sjedinjen sa Urea agarom. Dobijena podloga je
razlivena u Petrijeve šolje i zasejana. Praćeno je da li bakterije rastu na ovoj podlozi i da li razlažu
ureu, što se vidi na osnovu promene boje podloge.
15
3.4. Razgradnja citrata
Da bi se utvrdilo da li sojevi razlažu citrate, pravljena je podloga Mlečni citratni agar. Za
ovu podlogu je potrebno 10 g obranog mleka u prahu, hidrolizat kazeinat 2,5 g, glukoza 5 g, Agar-
agar 18 g, destilovana voda 1 l. Dobijena podloga je sterilisana u autoklavu na 100oC bez pritiska
10 minuta. Napravljeni rastvori A (10% K-fericijanid) i B (0,025% feri citrate i 0,025% natrijum
citrate), sterilisani su odvojeno i dodati u zapremini od 1 ml u sterilnu podlogu. Podloga je
razlivena u Petri šolje i nakon toga je vršeno zasejavanje. Sposobnost razlaganja citrata se vidi na
osnovu promene boje kolonija na podlozi u plavo.
3.5. Sinteza egzopolisaharida
Za ispitivanje sinteze egzopolisaharida pravljen je rekonstruisani MRS agar koji sadrži
sledeće sastojke: 10 g/l pepton, 5 g/l ekstrakt kvasca, 10 g/l mesni ekstrakt, 20 g/l saharoza, 2 g/l
K2HPO4, 5 g/l natrijum acetat, 0.2 g/l MgSO4, 0.05 g/l MnSO4 x H2O, 1.08 g/l TWEEN-80, 2 g/l
amonijum citrat, 15 g/l Agar-agar i 1 l destilovana voda.
Podloga je sterilisana i razlivena u Petrijeve šolje i na njoj su zasejane bakterije. Praćena
je pojava egzopolisaharida u vidu sluzave mase preko površine kolonija.
3.6. Sinteza antimikrobnih supstanci
Za antimikrobnu aktivnost je napravljen MRS agar i razliven u Petrijeve šolje. Plastični
sterilni prstenčići su naređani preko MRS agara. Pripremljene su dve vrste bujona, Sabouraud
Dextrose (Himedia, India) sa prekonoćnom kulturom kvasca Candida albicans i Mueller Hinton
bujon (Himedia, India) sa prekonoćnim kulturama bakterija Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Lysteria monocytogenes, Bacillus cereus i Sallmonela enteritidis. Takođe su pripremljene
epruvete sa dve vrste top agara, Sabouraud Dextrose i Mueller Hinton, tako što je bujonima dodato
0,7% Agar-agar. Epruvete sa top agarima su zasejane sa 80 μl prekonoćne kulture indikator soja i
sipane u Petrijeve šolje sa MRS agarom i sterilnim prstenčićima. Nakon nekoliko minuta prstenčići
su izvađeni, tako da su na taj način dobijeni bunarčići. U bunarčiće je sipano po 50 μl prekonoćne
kulture različitih sojeva bakterija mlečne kiseline. Pripremljene ploče su inkubirane na 30oC i
praćena je pojava zona inhibicije oko bunarčića.
16
Kada su korišćeni indikator sojevi Lysteria monocytogenes, Bacillus cereus, Sallmonella
enteritidis i Yersinia enterocolitica korišćene su tečna i čvrsta podloga Brain Heart Infusion Agar
sledećeg sastava: ekstrakt mesa 13 g, pepton 10 g, glukoza 2 g, NaCl 5 g, disodijum fosfat 2,5 g,
destilovana voda 1 l.
3.7. Kriva rasta
Za određivanje krive rasta pimenjena je tehnika razblaživanja i merena je optička gustina
spektrofotometrom OD600 nm u toku 24 h. Kriva rasta je određena za sojeve u okviru vrste Lc.
mesenteroides ssp. dextranicum (PK15), Lb. curvatus (PK4) i Lb. sakei (PF18).
U tri erlenmajera je napravljeno po 50 ml MRS bujona. Napravljen je i 0,9% fiziološki
rastvor NaCl. Na MRS agaru su zasejane prekonoćne kulture datih sojeva i inkubirane na 30oC.
Sutradan su napravljene suspenzije, tako što su prekonoćne kulture ubačene u fiziološki rastvor, a
na densitometru je podešeno 0,5 McF. U MRS bujon je prebačeno 500 μl suspenzije sa određenim
sojem tako da je dobijeno razblaženje 10-1. U mikrotitar ploču je sipano po 90 μl fiziološkog
rastvora u 6 bunarčića. Iz MRS bujona je u prvi bunarčić sipano 10 μl, iz prvog u drugi takođe 10
μl i tako sve do poslednjeg bunarčića, u kome je razblaženje bilo 10 -7. Razblaženja su pravljena
na svaka tri sata i po 10 μl svakog razblaženja je prenšeno na MRS agar. Praćen je rast kolonija i
određen je broj ćelija. Na svaka tri sata je merena optička gustina spektrofotometrom OD600 nm.
4. REZULTATI I DISKUSIJA
17
4.1. Uticaj spoljašnjih faktora na rast bakterija
Nakon što su MRS bujoni inokulisani prekonoćnim kulturama bakterijskih sojeva, čuvani
su u frižideru na +4oC. Svakodnevno je praćen rast, odnosno zamućenje bujona. Nakon deset dana
je utvrđeno koji izolati rastu na datoj temperaturi (Tabela 2). Izolati koji nisu rasli na datoj
temperaturi su: Lb. sakei M11, M14, M16, Lb. sakei PK17 i W. viridescens M4 (Tabela 2).
Tabela 2. Uticaj različitih spoljašnjih faktora na rast bakterija mlečne kiseline
Rast
na
Izolati 4⁰C 4%
NaCl
8%
NaCl
10%
NaCl Zacin
Zacin
(2X)
Aw
0.91
Aw
0.95
Aw
0.99
s.
Aw
0.99
š.
Lb. sakei
M16 0 0 0 0 + + 0 0 + +
M19 + + 0 0 + + 0 0 + +
M11 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
M12 + 0 0 0 + + 0 0 + +
M15 + 0 0 0 + 0 0 0 + +
M14 0 0 0 0 + 0 0 0 + +
M13 + + 0 0 + + 0 0 + 0
PK1 + + 0 0 + + 0 0 + +
PK7 + + 0 0 + + 0 0 0 +
PK6 + 0 0 0 0 0 0 0 0 +
PK17 0 + 0 0 + + 0 0 0 +
PK18 + + 0 0 + + 0 0 + +
PK19 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF1 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF2 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF3 + 0 0 0 + + 0 0 + +
PF6 + 0 0 0 + + 0 0 0 +
PF8 + + 0 0 + + 0 0 0 0
PF11 + + 0 0 + + 0 0 0 +
PF12 + + 0 0 + + 0 0 + 0
PF13 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF4 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF9 + + 0 0 + + 0 0 0 +
PF14 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF15 + 0 0 0 + + 0 0 + +
PF18 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF19 + + 0 0 + + 0 0 + +
PF20 + 0 0 0 + + 0 0 + +
Lb. curvatus
PK5 + + 0 0 + 0 0 0 0 +
PK14 + + 0 0 + + 0 0 0 +
PK20 + + 0 0 + + 0 0 0 +
18
PK4 + 0 0 0 + + 0 0 0 0
PF17 + 0 0 0 + + 0 0 + +
Ln. meseneroides
ssp. mesenteroides
PK21 + + 0 0 + + 0 0 0 +
Ln. meseneroides
ssp. dextranicum
PK6A + + 0 0 + 0 0 0 0 0
PK15 + 0 0 0 + + 0 0 0 +
PK16 + + 0 0 + + 0 0 0 0
PK16A + + 0 0 + + 0 0 0 +
W. viridescens
M10 + + 0 0 + + 0 0 0 +
M18 + + 0 0 + + 0 0 + +
M20 + 0 0 0 + + 0 0 + +
M1 + + 0 0 + + 0 0 + +
M7 + + 0 0 + + 0 0 + 0
M8 + 0 0 0 + + 0 0 0 +
M9 + + 0 0 + + 0 0 + +
M4 0 + 0 0 + + 0 0 + +
M1 + + 0 0 + + 0 0 + +
M8 + 0 0 0 + + 0 0 + +
C. maltaromaticum
M2 + + 0 0 + 0 0 0 + +
M3 + 0 0 0 + + 0 0 0 +
C. divergens
PK3 + 0 0 0 + 0 0 0 + +
St. hominis
M17 + 0 0 0 + 0 0 0 + +
St. capitis
PK8 + + 0 0 + 0 0 0 0 0
Staphylococcus
sp.
PK11 + + + + + + 0 0 + +
PK12 + + + + + + 0 0 + +
+ postoji rast; 0 nema rasta
Da bi se ispitao broj ćelija u bujonu i količina sintetisane mlečne kiseline, za određene
sojeve koji su rasli na 4oC, vršeno je merenje optičke gustine bakterijskih ćelija spektrofotometrom
(OD640 nm) i merena je pH vrednost bujona u kome je gajen određeni izolat. U tabeli 3 prikazani
su dobijeni rezultati. U većini slučajeva apsorbanca je imala veće vrednosti nakon nego nakon 24
h, dok je nakon 48 h bila opet veća nego nakon 24 h. pH vrednost se takođe nije značajno menjala.
Uglavnom su najniže vrednosti zabeležene nakon 96 h.
Tabela 3. Merenje optičke gustine i pH vrednosti MRS bujona koji je čuvan u frižideru na 4oC
19
OD640
pH
Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h 72 h 96 h
kontrola 0.565 0.503 0.503
Lb. sakei
M14 0.484 0.448 0.448 6.59 6.63 6.67 6.66 5.42
PK17 0.385 0.470 0.470 6.56 6.54 6.72 6.58 5.40
PF18 0.590 0.583 0.583 6.55 6.39 6.58 6.45 6.17
PF19 0.531 0.491 0.491 6.64 6.39 6.60 6.31 5.57
Lb. curvatus
PK4 0.506 0.492 0.492 6.56 6.52 6.61 6.31 5.37
PK5 0.525 0.496 0.496 6.54 6.48 6.33 6.57 6.57
PF17 0.492 0.393 0.393 6.56 6.63 6.64 6.41 5.71
Ln.
mesenteroides
ssp.
dextranicum
PK15 0.558 0.477 0.477 6.57 6.60 6.38 6.27 5.57
W. viridescens
M18 0.512 0.520 0.520 6.55 6.49 6.63 6.54 6.53
C.
maltaromaticum
M2 0.503 0.434 0.434 6.52 6.52 6.60 6.71 6.46
Kako bi se ispitao uticaj povećane koncentracije NaCl na rast bakterijskih sojeva, svaki od
izolovanih sojeva je zasejan na MRS agaru sa 4%, 8% i 10% NaCl. Na MRS agaru sa 4% NaCl
zabeležen je rast kod skoro polovine ispitivanih sojeva (Tabela 2). Rast izolata je zabeležen kod
vrsta Lb.sakei (19), Lb. curvatus (3), Ln. mesenteroides ssp. dextranicum (3), Ln. mesenteroides
ssp. mesenteroides (1), W. viridescen (7), C. maltaromaticum (1), St. capitis (1), Staphylococcus
sp. (2). Na MRS agaru sa 8 i 10% NaCl rasli su samo izolati Staphylococcus sp PK11. i PK12. To
su stafilokoke koje imaju sposobnost da rastu na slanim agarima. Zato su pokazale i najefikasniji
rast (Tabela 2).
Prema ispitivanjima Kurćubić et al. (2011), sadržaj NaCl u kobasicama je 3,45 g/100 g
nadeva. Ova količina NaCl je nešto manja u odnosu na koncentraciju koja je stavljena u podlogu
(4%). Prilikom ispitivnja viršli sa novosadskog tržišta dokazano je da se NaCl dodaje u mnogo
manjoj koncentraciji koja se kreće od 1,2 do 2,55% (Prica et al., 2013) nego što je to slučaj sa
fermentisanim kobasicama. Svi oni izolati koji su porasli na podlozi sa 4% NaCl mogu da se
koriste kao starter kulture prilikom proizvodnje kobasica u kojima se dodaje 4% soli.
20
Određeni izolati su gajeni u bujonima sa 4%, 6% i 8% NaCl. Merena je optička gustina
(OD640 nm) (Tabela 4) i pH vrednost posle 6 h, 24 h i 48 h (Tabela 5).
U bujonima sa 4% NaCl apsorbanca je bila manja nakon svakog merenja, dok se pH
vrednost takođe znatno smanjila nakon 24 h. U bujonima sa 6% NaCl apsorbanca je varirala dok
se pH nije drastično promenila osim za izolat Lb. sakei PF19. Takođe je apsorbanca varirala u
bujonima sa 8% NaCl. pH vrednost se nije znatno promenila nakon 48 h.
Tabela 4. Merenje optičke gustine (OD640 nm) u bujonu sa različitim koncentracijama NaCl
OD640
4%
NaCl
6%
NaCl
8%
NaCl
Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h
kontrola 0.209 0.185 0.201 0.192 0.191 0.193 0.197 0.187 0.190
Lb. sakei
PK17 0.204 0.204 0.178 0.188 0.210 0.177 0.179 0.152 0.174
PF18 0.177 0.239 0.184 0.161 0.197 0.182 0.187 0.182 0.178
PF19 0.197 0.361 0.101 0.182 0.185 0.101 0.111 0.180 0.177
Lb. curvatus
PK4 0.170 0.408 0.167 0.190 0.202 0.167 0.166 0.171 0.172
PK5 0.206 0.187 0.144 0.169 0.193 0.144 0.145 0.180 0.173
PF17 0.193 0.186 0.175 0.189 0.170 0.175 0.175 0.156 0.159
Ln.
mesenteroides
ssp.
dextranicum
PK15 0.156 0.441 0.171 0.199 0.199 0.171 0.172 0.177 0.179
W.viridescens
M18 0.171 0.231 0.198 0.191 0.199 0.198 0.197 0.193 0.189
C.
maltaromaticum
M2 0.188 0.205 0.190 0.191 0.192 0.190 0.190 0.180 0.186
U tabeli 5 je prikazana promena pH vrednosti bujona sa 4%, 6% i 8% NaCl. U bujonima
sa 4% i 6% NaCl pH vrednost je tokom vremena opadala, pri čemu je nešto veći pad u bujonima
21
sa 4% NaCl. Nakon 24 h, u bujonima sa 8% NaCl, pH vrednost se polako povećava ili je ostaje
ista kao i prilikom merenja nakon 24 h.
Tabela 5. Merenje pH vrednosti bujona sa različitom koncentracijom NaCl
pH 4% pH 6% pH 8%
Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h
Lb. sakei
M14 6.74 6.66 4.13 6.53 6.53 6.46 6.53 6.46 6.51
PK17 6.77 6.09 3.75 6.62 6.55 5.45 6.62 6.31 6.48
PF18 6.68 5.06 3.83 6.64 6.56 5.89 6.52 6.60 6.52
PF19 6.69 4.62 3.76 6.61 6.65 3.99 6.51 6.45 6.42
Lb. curvatus
PK4 6.73 5.05 3.91 6.65 6.48 6.31 6.56 6.29 6.41
PK5 6.58 6.72 4.31 6.40 6.67 6.46 6.54 6.04 5.66
PF17 6.70 6.73 6.00 6.66 6.73 6.46 6.56 6.47 6.53
Ln.
mesenteroides
ssp.
dextranicum
PK15 6.63 4.77 3.96 6.54 6.51 6.34 6.63 6.25 6.25
W.viridescens
M18 6.68 6.28 3.94 6.69 6.54 6.17 6.59 6.42 6.42
C.
maltaromaticum
M2 6.66 6.53 4.25 6.56 6.56 6.51 6.60 6.45 6.45
MRS agar sa začinom imitira uslove koji vladaju u kobasici. Od začina je korišćen NaCl,
aleva paprika i beli luk. Eksperiment je ponovljen dva puta, pri čemu je prvi put stavljeno u
podlogu 2% NaCl, 1,5% aleve paprike i 1% belog luka. U tom slučaju je većina izolata formirala
kolonije (Tabela 2). Izolati koji nisu rasli su: Lb. sakei M11 i PK6. Drugi put je stavljena duplo
veća koncentracija začina. U tom slučaju, pored ova dva izolata Lb. sakei M11 i PK6, kolonije
nisu formirali ni Lb. sakei M11, M14, M15 i PK6, Lb. curvatus PK5, Ln. mesenteroides ssp.
dextranicum PK6A, C. maltaromaticum M2, C. divergens PK3, S. capitis PK8 i St. hominis M17.
Stafilokoke PK11 i PK12 su pokazale izvanredan rast.
Od začina, za pravljenje kobasica, se najčešće koristi aleva paprika, čiji je plod prethodno
osušen i smleven. Ona utiče na boju i ukus kobasica (Petrović, 2012), pa tako različita jedinjenja
iz začina deluju inhibitorno na bakterije u kobasici. Beli luk se dodaje zbog svog antimikrobnog i
antioksidativnog dejstva.
22
Bakterijski sojevi određenih vrsta su gajeni u MRS bujonu sa začinom. Kao i u prethodnim
slučajevima, apsorbanca je uglavnom bila veća nakon 6 h nego nakon 24 h, pa se onda opet
povećavala nakon 48 h. pH vrednost se takođe smanjivala tokom vremena (Tabela 6).
Tabela 6. Merenje optičke gustine i pH vrednosti MRS bujona sa začinom
OD640
pH
Izolati 6 h 24 h 48 h 6 h 24 h 48 h
kontrola 1.241 1.172 1.216
Lb. sakei
M14 1.174 1.108 1.145 6.10 5.45 3.96
PK17 1.126 0.894 1.107 6.14 4.20 3.84
PF18 1.155 0.854 1.032 6.07 4.17 3.77
PF19 1.132 0.873 1.037 6.06 4.01 3.77
Lb. curvatus
PK4 1.118 0.874 1.099 6.14 4.34 4.04
PK5 1.073 1.206 1.228 6.19 5.99 3.99
PF17 1.169 1.039 1.128 6.03 5.69 3.96
Ln. mesenteroides
ssp. dextranicum
PK15 1.156 0.880 1.103 6.14 4.42 4.01
W. viridescens
M18 1.131 0.878 1.090 5.98 4.26 4.15
C. maltaromaticum
M2 1.067 1.000 1.134 6.13 4.95 3.87
Da bi se odredila minimalna količina vode u podlozi koja bi omogućila rast izolatima,
korišćena je podloga Mlečni agar sa različitim aw vrednostima: 0,91; 0,95 i 0,99. Na podlogama
sa aw 0,91 i 0,95 ni jedan izolat nije formirao kolonije (Tabela 2). Na podlozi gde je aw 0,99
određeni izolati su formirali kolonije.
Drugi put je eksperiment ponovljen tako što je u podlogu stavljen običan kuhinjski šećer
ali samo za aw 0,99. Na ovoj podlozi su izolati rasli u mnogo većem broju nego kada je za istu aw
vrednost korišćena saharoza.
Ako aw iznosi manje od 0,95, u tom slučaju patogene vrste ne mogu da rastu. Ukoliko se
aw spusti na vrednosti ispod 0,90, prestaje rast svih bakterija (Vuković et al., 2012). Ovim
istraživanjem je to na neki način potvrđeno. Velika količina šećera u podlozi vezuje vodu pa na taj
način voda postaje nedostupna mikroorganizmima.
23
4.2. Sinteza enzima
Tributyrin Agar je korišćen da bi se ispitala lipolitička aktivnost datih sojeva. Ni jedan soj
nije pokazao sposobnost vršenja lipolize, već samo sposobnost rasta na datoj podlozi. Jedini soj
koji nije porastao na ovoj podlozi je Lb. sakei M11 (Tabela 7).
Tabela 7. Sposobnost sinteze lipaza, proteinaza, nitrat reduktaza, ureaza, citrata i egzopolisaharida
Izolati TBA SBA 1%
emulzija
SBA 3%
emulzija
Miof.
proteini
Sarkopl.
proteini Nitrati
Urea
Mlecni
citratni
agar
EPS
Lb. sakei
M16 + + + + + + 0 0 +
M19 + + + + + + + + +
M11 0 0 0 0 0 0 0 + 0
M12 + + + + + + + 0 +
M15 + 0 + + + + + + +
M14 + + + + + + + + +
M13 + + + 0 0 + 0 + ++
PK1 + + + + + + + 0 +
PK7 + + + + + + + + +
PK6 + 0 0 + + 0 0 + +
PK17 + + + + + + + + +
PK18 + + + 0 + + + + +
PK19 + + + + + + + + +
PF1 + 0 + + + + 0 + +
PF2 + + + + + + 0 + +
PF3 + + +
+ + +
+ + plave
kolonije +
PF6 + + + + + + + 0 +
PF8 + + + 0 0 + + + +
PF11 + 0 + 0 0 + 0 + +
PF12 + 0 + 0 0 + 0 + +
PF13 + + + 0 0 + + 0 +
PF4 + + + + + + + + +
PF9 + + + 0 + + + + +
PF14 + + + + + + 0 + +
PF15 + + + + + + 0 0 +
PF18 + + + + + + + + +
PF19 + + + + + + + + ++
PF20 + + + 0 + + + 0 +
Lb. curvatus
PK5 + 0 0 + + + + + +
PK14 + + + + + + 0 + ++
PK20 + + + + + + 0 + ++
PK4 + + + + + + + 0 ++
24
PF17 + + + + + + + 0 +
Ln.
meseneroides
ssp.
mesenteroides
PK21 + + + + + + + + +
Ln.
meseneroides
ssp.
dextranicum
PK6A + 0 0 + + + 0 0 +
PK15 + + + + + + + 0 ++
PK16 + + + + + + 0 + ++
PK16A + + + + + + 0 + ++
W. viridescens
M10 + + + + + + + + ++
M18 + + + + + + + + +
M20 + + + + + + + 0 +
M1 + + + + + + + + +
M7 + + + 0 0 + 0 + +
M8 + + + + + + + 0 ++
M9 + + + + + + 0 + +
M4 + + + + + 0 + 0 +
M1 + + + + + + + + +
M8 + 0 + + + 0 0 + +
C.
maltaromaticu
m
M2 + + + + + + + + +
M3 + + + + + + + 0 +
C. divergens
PK3 + + + 0 0 + + + +
St. hominis
M17 + + + + + + 0 + 0
St. capitis
PK8 + 0 0 + + + 0 + +
Staphylococcu
s sp.
PK11 + halo halo + + + + 0 +
PK12 + halo halo 0 0 + + + +
+ postoji rast; 0 nema rasta; ++ rast i sinteza EPS
Spirit Blue Agar je takođe korišćen u iste svrhe. Pošto je ovde korišćena različita
koncentracija emulzije (1% i 3%) dobijeni su različiti rezultati rasta (Tabela 7). Na podlogama
kojima je dodato 1% ili 3% emulzije nisu rasle sledeće vrste: Lb. sakei M11 i PK6, Lb. curvatus
PK5, Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides PK6A i St. capitis PK8. Na agaru sa 1% emulzije nisu
25
rasli sojevi: Lb. sakei M15, PF1, PF8 i PF11 i W. viridescens M8. Ti isti sojevi su rasli na agaru sa
3% emulzije. Ostali sojevi su rasli na agaru i sa jednom i sa drugom koncentracijom emulzije.
Stafilokoke PK11 i PK12 su rasle prilikom dodatka jedne i druge koncentracije emulzije, a takođe
su pokazale da imaju lipolitičku aktivnost, jer su se oko kolonija stvarale svetle zone (halo). To je
znak da poseduju lipaze, enzime koji vrše hidrolizu lipida. Lipoliza utiče na organoleptička
svojstva kobasica. Hugas i Monfort (1997) su dokazali da stafilokoke imaju najveću sposobnost
razlaganja lipida. Takođe su Kenneally et al. (1997) dokazali da laktobacili nemaju sposobnost
razgradnje lipida.
Pod proteolizom se podrazumeva razgradnja proteina na polipeptide. U ovom slučaju je
ispitana proteoliza miofibrilarnih i sarkoplazmatskih proteina. Pravljena je podloga kojoj su dodati
miofibrilarni proteini i dokazano je da na njoj uglavnom rastu izolati, ali da ne vrše proteolizu. Ni
jedan izolat nije formirao svetlu zonu oko kolonije (Tabela 7). Isti rezultat je zabeležen i kod
sarkoplazmatskih proteina.
Prilikom vršenja proteolize dolazi do promene pH vrednosti mesa (Aymerich et al., 2003).
Ta pH raste do te mere da dostiže onu vrednost koju meso ima odmah nakon klanja životinje.
Za dokazivanje nitratnih reduktaza pravljen je YT agar. Na ovom agaru ni jedan izolat nije
pokazao sposobnost redukcije nitrata u nitrite, odnosno nije doslo do promene boje podloge. Izolati
kod kojih nije uočen rast su: Lb. sakei M11 i PK6 i W. viridescens M8 (Tabela 7).
Takođe je pravljen i YT bujon sa KNO3 koji je inokulisan izolatima: Lb. sakei M14, PK17,
PF18 i PF19, Lb. curvatus PK4, PK5, PF17, Ln. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, W.
viridescens M18, C. maltaromaticum M2. Inkubacija na 15oC je trajala 72 h, dok je na 20oC i 30
oC trajala 24 h. Deo bujona je korišćen za merenje optičke gustine OD540, a deo za merenje suve
mase. Prilikom mernja optičke gustine kod nekih izolata je apsorbanca za sve tri temperature imala
približnu vrednost, dok su se u nekim slučajevima vrednosti znatno razlikovale (Tabela 8).
U svakom bujonu sa određenim izolatom stavljeno je po 0,5 ml rastvora alfa-naftilamina i
1 ml rastvora sulfanilne kiseline da bi se utvrdila redukcija nitrata. Međutim, ni jedan izolat nije
pokazao sposobnost redukcije nitrata do nitrita, odnosno nije doslo do pormene boje iz žućkaste u
crvenkastu.
Da bi se uporedio rast bakterija na različitim temperaturama u YT bujonu, pre merenja
suve mase, merena je masa kontrole. Za 15oC je 995,0 mg, za 20oC i 30 oC je 1002,0 mg. Kontrole
26
su takođe inkubirane na datim temperaturama U tabeli 8 je prikazana masa bujona sa određenim
izolatima, dok je u tabeli 9 prikazana suva masa.
Tabela 8. Merenje optičke gustine (OD540 nm) i mase (mg) YT bujona sa izolatima
Inkubacija na 15oC 72 h Inkubacija na 20oC 24 h Inkubacija na 30oC 24 h
Izolati OD540 nm mg OD540 nm mg OD540 nm mg
Lb. sakei
M14 0,058 1019.4 0.064 1011.4 0.047 981.1
PK17 0.062 1027.4 0.074 1001.8 0.135 982.7
PF18 0.066 1007.4 0.072 995.5 0.070 987.4
PF19 0.076 1015.1 0.071 1001.8 0.102 988.8
Lb. curvatus
PK4 0.061 1032.6 0.063 989.7 0.037 984.5
PK5 0.053 1004.0 0.056 995.3 0.058 1011.1
PF17 0.088 1005.2 0.056 994.3 0.045 982.9
Ln.
mesenteroides
ssp.
dextranicum
PK15 0.142 1002.3 0.057 1014.4 0.034 1003.9
W. viridescens
M18 0.065 1029.2 0.136 1007.1 0.056 1009.9
C.
maltaromaticum
M2 0,060 1011.3 0.068 1029.3 0.083 988.1
U nekim slučajevima je suva masa imala negativnu vrednost. Takve vrednosti se javljaju
kod onih YT bujona koji su inkubirani na 20oC i 30 oC. Pretpostavlja se da je doslo do isparenja
bujona prilikom merenja.
Tabela 9. Merenje optičke gustine (OD540 nm) i suve mase (mg/ml)
Inkubacija na 15oC 72 h Inkubacija na 20oC 24 h Inkubacija na 30oC 24 h
Izolati OD540 nm mg/ml OD540 nm mg/ml OD540 nm mg/ml
Lb. sakei
M14 0,058 24.4 0.064 9.4 0.047 -20.9
27
PK17 0.062 32.4 0.074 -0.2 0.135 -19.3
PF18 0.066 12.4 0.072 -6.5 0.070 -14.6
PF19 0.076 20.1 0.071 -0.2 0.102 -13.2
Lb. curvatus
PK4 0.061 37.6 0.063 -12.3 0.037 -17.5
PK5 0.053 9 0.056 -6.7 0.058 9.1
PF17 0.088 10.2 0.056 -7.7 0.045 -19.1
Ln
mesenteroides
ssp.
dextranicum
PK15 0.142 7.3 0.057 12.4 0.034 1.9
W. viridescens
M18 0.065 34.2 0.136 5.1 0.056 7.9
C.
maltaromaticum
M2 0,060 16.3 0.068 27.3 0.083 -13.9
Urea agar je korišćen da bi se ispitalo da li bakterije razlažu ureu. Ukoliko bakterije
poseduju ureaze, razlaganjem uree dolazi do promene boje podloge iz žućkaste u ružičastu. U
ovom slučaju ni jedan izolat nije razlagao ureu, odnosno podloga nije promenila boju. Mnogi
izolati nisu formirali kolonije na ovoj podlozi (Tabela 7).
Poznato je da bakterije iz familije Enterobacteriaceae, gde spadaju stafilokoke, ne razlažu
ureu. BMK ne poseduju ureaze pa zbog toga ne mogu da razlažu ureu.
4.3. Razgradnja citrata
Mlečni citratni agar je korišćen da bi se ispitao rast BMK i produkcija citrat liaze, enzima
koji razgrađuje citrat. Na ovoj podlozi nisu rasli određeni izolati . Izuzetan rast kao i sposobnost
da razlaže citrat pokazao je soj Lb. sakei PF3, što se vidi na osnovu plave boje (Tabela 7). To je
dokaz da ovaj soj poseduje citrat liazu.
Prema istraživanju koje sprovodi Kršev (1976), dokazano je da samo neki sojevi u okviru
vrste Streptococcus lactis razlažu citrate. Uloga citrata u podlozi je povećanje pH vrednosti, što
ubrzava proces fermentacije (Mazić, Božanić, 2008). U istraživanju Mazić i Božanić (2008)
korišćene su vrste Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris, Lc. lactis ssp. lactis biovar.
28
diacetylactis i Ln. mesenteroides ssp. cremoris. Ovim istraživanjem je dokazano da samo jedan
izolat razlaže citrat, a to je Lb. sakei PF3.
4.4. Sinteza egzopolisaharida
Egzopolisaharidi se javljaju u vidu providne kapsule iznad formiranih kolonija. BMK ih
sintetišu kada se u MRS podlogu stavi saharoza umesto glukoze. Svi izolati osim Lb. sakei M11 i
S. hominis M17 su rasli na ovoj podlozi, a samo su neki sintetisali egzopolisaharide (Tabela 7). To
su izolati: Lb. sakei M13 i PF19, Lb. curvatus PK4, PK14, PK20, Ln. mesenteroides ssp.
dextranicum PK15, PK16, PK16A, W. viridescens M8 i M10. To su sojevi u okviru rodova
Lactobacillus i Leuconostoc za koje se zna da produkuju egzopolisaharide, koji utiču povoljno na
organoleptička svojstva fermentisanog proizvoda (Samardžija et al., 2001).
4.5. Antimikrobna aktivnost
Kod izolata je ispitano da li produkuju neku od antimikrobnih supstanci koje deluju
inhibitorno na patogene vrste mikroorganizama. U eksperimentu, gde su na Mueller Hinton agaru
i Sabouraud Dextrose agaru gajene patogene vrste, neki od izolata su pokazali antimikrobnu
aktivnost, a to se videlo na osnovu svetle zone oko bunarčića. Antimikrobne supstance nisu
delovale na vrstu Cn. albicans jer je pokazala izuzetan rast na datoj podlozi. Ostale vrste (E. coli,
S. aureus, L. monocytogenes, B. cereus i S. enteritidis) su normalno rasle na određenoj polozi a
izolati su inhibirali njihov rast zahvaljujući antimikrobnim supstancama. Oko bunarčića u kojima
su bili izolati stvarale su se zone inhibicije. Što je veća zona inhibicije jači je efekat antimikrobne
supstance. U tabeli 10 su prikazane zone inhibicije izražene u milimetrima. Prazna polja u tabeli
pokazuju da određeni izolat nije delovao inhibitorno na određenu patogenu vrstu.
Tabela 10. Antimikrobna aktivnost izolata iz peglane kobasice (zona inhibicije izražena u mm)
Izolat E.coli
St. aureus
L.
monocytogenes
B. cereus
S. enteritidis
Lb. sakei
M16 17 17 17 15 15
PK6 13 16 17 18 18
29
Prema istraživanju Vesković-Moračanin et al. (2010), dokazano je da Lb. sakei produkuje
bakteriocine i inhibira vrste L. monocitogenes i St. aureus. Vrsta Ln. mesenteroides ssp.
mesenteroides produkuje posebnu vrstu bakteriocina koji se naziva Mesenterocin 52. Ovaj
bakteriocin deluje inhibitorno na vrste iz rodova Lysteria i Staphylococcus, a na laktobacile i
leukonostoke ne deluje inhibirorno (Mathieu et al., 1993). Tabela pokazuje da je sposobnost
inhibicije rasta korišćenih indikator sojeva različita. Ukoliko je prečnik zone inhibicije veći od 15
mm, bakterija ima veliku antimikrobnu aktivnost.
Na slikama su prikazane zone inhibicije čiji je prečnik prikazan u tabeli 10.
Slika 1. Antimikrobna aktivnost sojeva na vrste E. coli i B. cereus
PF1 16 16 14 12 17
PF2 16 19 17 14 16
PF3 19 18 17 18
PF6 15 20 20 16
PF14 15 17 20 17 16
PF15 18 20 20 16
PF18 13 18 17 16 16
PF19 15 16 18 17 17
PF20 17 17 12 15
Lb. curvatus
PK4 14 19 18
PK20 17 18 18 18 20
Ln. mesenteroides
ssp. mesenteroides
PK21 15 12 20 13 16
Ln. mesenteroides
ssp. dextranicum
PK15 9 15 14 8
PK16 15 15 14 15
PK16A 17 16 18 13 17
30
Slika 2. Antimikrobna aktivnost sojeva na vrste St. aureus i S. enteritidis
Slika 3. Antimikrobna aktivnost sojeva na vrstu L. monocytogenes
Antimikrobna aktivnost izolata iz peglane kobasice je takođe ispitana tako što su patogene
vrste gajene na improvizovanom Brain Heart Infusion agaru. Od patogenih vrsta su korišćene L.
monocytogenes, S. enteritidis, B. cereus i Yersinia enterocolitica. U ovom slučaju su zone
inhibicije bile mnogo veće u odnosu na one iz prethodnog eksperimenta. Tabela 12 prikazuje
prečnik zone inhibicije izražene u milimetrima (mm). Zone inhibicije nisu postojale kod vrste Y.
enterocolitis i B. cereus. Sojevi vrste Lb. sakei PF3 i PF6 imali su najveći inhibitorni efekat na
vrstu L. monocytogenes. Prečnik zona inhibicije je 23 mm. Soj Lb. sakei M19 takođe ima jak
inhibitorni efekat na vrstu S. enteritidis (zona inhibicije 23 mm).
31
Tabela 11. Antimikrobna aktivnost izolata iz peglane kobasice na L. monocytogenes i
S. enteritidis (zona inhibicije izražena u mm)
Izolati S. enteritidis Izolati L. monocytogenes
Lb. sakei Lb. sakei
M19 23 PF2 22
PK19 17 PF3 23
PF2 17 PF6 23
PF14 18 PF14 17
Lb. curvatus PF15 23
PK20 15 PF18 18
PK4 17 PF19 21
Ln. mesenteroides ssp.
dextranicum
PF20 22
PK15 15
PK16A 14
W. viridescens
M4 15
M18 17
M20 17
C. maltaromaticum
M3 14
4.6. Kriva rasta
Različite vrste mirkoorganizama imaju različito generacijsko vreme, tj. vreme koje je
potrebno da se broj ćelija u populaciji udvostruči. Da bi se utvrdilo generacijsko vreme izolata Lb.
sakei PF18, Lb. curvatus PK4 i Ln. mesenteroides ssp. dextranicum PK15, izolati su zasejavani u
MRS bujon i inkubirani na 30o C pri čemu je optička gustina merena na svaka 3 h. Napravljena je
kriva rasta za sva tri izolata koja ima lag, log, stacionarnu i fazu odumiranja.
32
Od 9 pa do 21 h je log faza u kojoj se znatno povećao broj ćelija, pa je zbog toga apsorbanca
bila veća. Od 21 h je stacionarna faza u kojoj se broj ćelija nije znatno povećao, kao što je to bio
slučaj u prethodnoj fazi.
Tabela 12. Praćenje rasta sojeva merenjem optičke gustine (OD600 nm)
Vreme
Izolati 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 15 h 18 h 21 h 24 h 27 h
Lb. sakei PF18 0.021 0.016 0.012 0.027 0.540 0.093 0.410 1.587 1.940 2.128
Lb. curvatus
PK4 0.006 0.006 0.014 0.056 0.660 0.662 1.490 1.989 2.107 2.142
Ln.
mesenteroides
ssp. dextranicum
PK 15
0.007 0.006 0.021 0.035 0.428 0.046 0.572 1.427 1.585 1.673
Prilikom prvog merenja (0 h) najveću apsorbancu je imao bujon zasejan sojem Lb. sakei
PF18 (Tabela 12). Posle 9 h najveća apsorbanca je zabeležena u bujonu sa sojem Lb. curvatus
PK4. Do kraja praćenog perioda ovaj soj je pokazao najveći rast. Velika promena apsorbance kod
sva tri soja je zabeležena u periodu između 9 i 12 h. U periodu od 21 pa do 27 h apsorbanca se nije
začajno povećavala jer su izolati ušli u stacionarnu fazu.
Slika 4. Kriva rasta za izolate Lb. sakei PF18, Lb. curvatus PK4 i Ln. mesenteroides ssp. mesenteroides
PK15
0
1
2
3
4
5
6
7
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27
Ap
sorb
anca
(O
D600
nm
)
Vreme (h)
PF18
PK4
PK15
33
Pored optičke gustine, za svaki izolat je određen i broj ćelija u bujonima u period inkubacije
od 24 h (Tabela 13). Početni broj ćelija bio je najveći u bujonu sa izolatom Ln. mesenteroides ssp.
mesenteroides PK15 (2,4 x103), dok je na kraju praćenog perioda inkubacije, najveći broj ćelija
(1,8 x 105) detektovan za izolat Lb. sakei PF18. Izolat Lb. curvatus PK4 je najsporije rastao u MRS
bujonu.
Tabela 13. Praćenje rasta sojeva određivanjem broja ćelija (CFU/ml)
Izolati 0 h 3 h 6 h 9 h 12 h 15 h 18 h 21 h 24 h
Lb. sakei
PF18
1x102 2.4x103 1.4x104 1.4x105 1.5x105 1.6x105 2.0x105 2.2x105 1.7x105
Lb. curvatus
PK4
0 8x102 1.7x104 1.2x105 1.2x105 9.2x104 1.1x104 3.2x105 6.7x103
Ln.
mesenteroides
ssp.
mesenteroides
PK15
2.4x103 9.5x102 1.7x104 1.2x105 7.5x106 7.7x105 1.3x105 6.5x105 1.2x105
5. ZAKLJUČAK
Na osnovu ovog istraživanja utvrđeno je da:
• izolati iz peglane kobasice mogu da rastu na temperaturi od +4oC,
• snižavaju pH podloge, zbog produkcije laktata,
• velika koncentracija NaCl deluje inhibitorno na izolate,
• skoro svi izolati rastu na podlogama sa začinom,
• ne mogu da rastu na podlozi čija je aw manja od 0,95,
• ispitivani izolati ne produkuju lipaze, osim stafilokoka,
• izolati ne produkuju proteinaze,
• ni jedan soj ne produkuju nitratne reduktaze,
• ne produkuju ureaze, ali mogu da rastu na agaru sa ureom,
34
• sojevi u okviru vrste Leuconostoc razlažu citrat,
• sojevi u okviru vrste Leuconostoc produkuju egzopolisaharide,
• određeni izolati produkuju antimirkobne supstance kojima inhibiraju patogene.
35
LITERATURA
Aymerich, T. et al., 2003. Microbial quality and direct PCR identifi cation of lactic acid bacteria
and nonpathogenic Staphylococci from artisanal low-acid sausages. Applied Environmental
Microbiology, 69: 4583–4594.
Breidt, F. et al., 2013. Fermented vegetables. In M. P. Doyle & R. L. Buchanan, eds. Food
Microbiology. American Society of Microbiology, 841–855.
Vesković-Moračanin S. et al., 2010. Antimicrobial properties of indigenous Lactobacillus sakei
strain. Acta Veterinaria, 1(60): 59-66.
Vuković, I. et al., 2012. Ispitivanje važnih promena u toku zrenja tradicionalne fermentisane
kobasice lemeški kulen. Tehnologija mesa, 53(2): 140-147.
Ivanković L., 2016. Mikrobni egzopolisaharidi. Zavrsni rad, 1-6.
Kegalj, A. et al., 2012. Raznolikost mikroflore u mesu i mesnim proizvodima. Znanstveno-stručni
skup „Hrana kao temelj zdravlja i dugovječnosti“, 3(12): 239-246.
Kenneally, P. et al., 1997. Evaluation of the lipolytic activity of starter cultures for meat
fermentation purposes. Jorunal of Applied Microbiology, 84: 839-846.
Kurćubić, V. et al., 2011. Sadržaj natrijum-hlorida i natrijuma u proizvodima od mesa različitih
grupa. Tehnologija mesa, 52(2): 225-233.
Lilić, S. et al., 2013. Uticaj smanjenog sadržaja natrijum-hlorida na process fermentacije I kvalitet
suvih fermentisanih kobasica. Tehnologija mesa, 54(2): 150-159.
Mathieu, F. et al., 1993. Mesenterocin 52, a bacteriocin produced by Leuconostoc mesenteroides
ssp. mesenteroides FR52. Applied Microbiology, 4(74): 372-379.
Petrović, Lj., Tasić, T. (2012). Organska i tradicionalna proizvodnja i prerada mesa. Organska
prerada, Urednici Carić, M., Babović, J. (st. 91-114). Fakultet za ekonomiju i inženjerski
menadžment, Novi Sad, Srbija.
Prica, N. et al., 2013. Sadržaj natrijumhlorida u proizvodima od mesa. Arhiv veterinarske
medicine, 1(6): 71-79.
Phang, I. R. K. et al., 2018. Isolation and characterization of urease producing bacteria from
tropical peat. Biocatalysis and Agricultural Biotehnology, 13: 168-175.
Samardžija, D. et al., 2001. Karakteristika i uloga mezofilne culture bakterija mlečne kiseline.
Agriculturae Conspectus Scientificus, 2(66): 113-120.
36
Hugas M. and Monfort J., 1997. Bacterial starter cultures for meat fermentation. Food Chem., 59:
547–554.
Hutkins R. W., 2006. Microbiology and technology of fermented foods, Blackwell Publishing,
First edition, IFT Press.
file:///C:/Users/Admin/Downloads/djurdjevic_ivana_ptfos_2014_zavrs_sveuc.pdf
https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:641212
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Јелена Вујић
Ментор, МН: Наташа Јоковић
Наслов рада, НР: Технолошка карактеризација бактеријa млечне киселине изолованих из пеглане кобасице
Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2018.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)
36 стр. ; 4 слике, 13 табела
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: Микробиологија хране
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: пеглана кобасица, бактерије млечне киселине, технолошке карактеристике УДК 673.05 + 547.472.3 ] : 637.524
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН:
Извод, ИЗ: Бактерије млечне киселине (БМК) су Грам – позитивне бактерије
које живе на обогаћеним подлогама. Користе се као стартер културе
при производњи ферментисаних производа, међу којима су
кобасице. У овом раду рађена је технолошка карактеризација
бактерија млечне киселине изолованих из пеглане кобасице.
Коришћени су изолати идентификовани као Lactobacillus sakei (31
сој), Lactobacillus curvatus (5 сојева), Leuconosstoc mesenteroides ssp.
Mesenteroides (1 сој), Leuconostoc mesenteroides ssp. Dextranicum (4
соја), Weisella viridescens (10 соја), Carnobacterium maltaromaticum
(2 соја), Carnobacterium divergens (1 сој), Staphzlococcus hominis (1
сој), Staphylococcus capitis (1 сој), I Staphylococcus sp. (2 соја) који не
припадају групи БМК. Испитан је раст изолата на: ниским
температурама, подлогама са различитим концентрацијама NaCl,
зачина и аw вредностима. Датум прихватања теме, ДП: 05.09.2018.
Датум одбране, ДО: 01.10.2018.
Чланови
комисије,
КО:
Председник: дp Татјана Михаjилов-Крстев
Члан: дp Зорица Стојановић-Радић
Члан, ментор: дp Наташа Јоковић
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: university degree thesis
Author, AU: Jelena Vujić
Mentor, MN: Nataša Joković
Title, TI: Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from “peglana” sausage
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2018
Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.
Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
36 p. ; 4 pictures, 13 tables
Scientific field, SF: biology Scientific discipline, SD: food microbiology
Subject/Key words, S/KW: “peglana” sausage, lactic acid bacteria, technological characteristics
UC 673.05 + 547.472.3 ] : 637.524
Holding data, HD: library Note, N:
Abstract, AB: Lactic acid bacteria (LAB) are Gram-positive bacteria that live in enriched supstrate. They are used as starter cultures in production of fermented products, among which are sausages. In this paper, the technological caracterization of lactic acid bacteria isolated from “peglana” sausage was done. The isolates were identified as Lactobacillus sakei (31 strains), Lactobacillus curvatus (5 strains), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (1 strain), Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum (4 strains), Weissella viridescens (10 strains), Carnobacterium maltaromaticum (2 strains), Carnobacterium divergens (1 strain), as well as Staphylococcus hominis (1 strain), Staphylococcus capitis (1 strain) and Staphylococcus sp. (2 strains) which don’t belong to the LAB group. The isolates growth was tested on: low temperature, substrates with different concentration of NaCl, spices and aw value.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 05.09.2018.
Defended on, DE: 01.10.2018.
Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihaliov-Krstev
Member: PhD Zorica Stojanović-Radić
Member, Mentor: PhD Nataša Joković