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MassenspektrometrieMassenspektrometrie in komplexen Matrices: in komplexen Matrices: was können ESI, APCI und MALDI ?was können ESI, APCI und MALDI ?

Jahrestagung Regensburg 2004Gemeinsame FachgruppentagungFachgruppen Arzneimittelkontrolle/Pharmazeutische Analytik und Klinische Pharmazie"Analytik aus komplexen Matrices: Proteine, Biotechnik, Pharmakokinetik"

Dr. Klaus RaithDr. Klaus RaithMartinMartin--LutherLuther--Universität HalleUniversität Halle

Institut für Pharmazeutische Technologie und BiopharmazieInstitut für Pharmazeutische Technologie und BiopharmazieWolfgangWolfgang--LangenbeckLangenbeck--StrStr. 4. 4

DD--06120 Halle06120 Halle

IonisationsmethodenIonisationsmethodenIonisation in der Gasphase: EI, CIIonisation in der Gasphase: EI, CIVerdampfung der Probe notwendigVerdampfung der Probe notwendiggeeignet für GC/MSgeeignet für GC/MS--KopplungKopplungIonisation aus flüssiger Phase: ESI, APCI, APPIIonisation aus flüssiger Phase: ESI, APCI, APPIVerdampfung des Lösungsmittels erforderlichVerdampfung des Lösungsmittels erforderlichIonisation unter Atmosphärendruck (API)Ionisation unter Atmosphärendruck (API)geeignet für LC/MS und CE/MSgeeignet für LC/MS und CE/MS--Kopplung (Online)Kopplung (Online)Ionisation aus fester Phase Ionisation aus fester Phase MALDI (Matrix MALDI (Matrix AssistedAssisted Laser Laser DesorptionDesorption Ionisation)Ionisation)Präparation der Probe zusammen mit spezieller MatrixPräparation der Probe zusammen mit spezieller Matrixgeeignet für qualitative und halbquantitative geeignet für qualitative und halbquantitative Untersuchung von Biomolekülen, bes. Proteinen und Untersuchung von Biomolekülen, bes. Proteinen und KohlenhydratenKohlenhydrateni.d.Ri.d.R. nur Offline. nur Offline--Kopplung möglichKopplung möglich

ESI: Probleme in komplexen MatricesESI: Probleme in komplexen Matrices

Signalunterdrückung (z.B. Signalunterdrückung (z.B. TensideTenside))Nichtflüchtige Salze (Phosphat, Borat, Sulfat) verstopfen Nichtflüchtige Salze (Phosphat, Borat, Sulfat) verstopfen ProbeneinlaßProbeneinlaß, verschlechtern Empfindlichkeit (auch , verschlechtern Empfindlichkeit (auch durch Bildung neutraler Komplexe)durch Bildung neutraler Komplexe)Wechselwirkung mit Ionen gleicher Ladung (Common Wechselwirkung mit Ionen gleicher Ladung (Common Ion Ion InterferencesInterferences), z.B. ), z.B. AdduktbildungAdduktbildung, schlechtere , schlechtere EvaporationEvaporationPolarität oder Flüchtigkeit des Lösungsmittels nicht Polarität oder Flüchtigkeit des Lösungsmittels nicht optimaloptimalEvtl. ungünstiger Evtl. ungünstiger pHpHProbleme beheben oder umgehen durch Probleme beheben oder umgehen durch Probenvorbereitung, Chromatographie (LC/MS)Probenvorbereitung, Chromatographie (LC/MS)

MALDI: BesonderheitenMALDI: Besonderheiten

Generell weniger anfällig als ESIGenerell weniger anfällig als ESIPräparation: Präparation: DriedDried DropletDroplet, , ThinThin--LayerLayer, , Lsm.Lsm.--freifreiGgf. Entsalzung notwendigGgf. Entsalzung notwendigPolymere: ggf. SEC bei zu hoher Polymere: ggf. SEC bei zu hoher PolydispersitätPolydispersitätStörungen im unteren Massenbereich (<500) durch Störungen im unteren Massenbereich (<500) durch PeaksPeaks der der MALDIMALDI--MatrixMatrixPSD: Relativ ungenaue Isolation durch Timed Ion PSD: Relativ ungenaue Isolation durch Timed Ion SelectorSelector (10(10--20 Da)20 Da)LC/LC/MALDIMALDI--KopplungKopplung über Probenroboter vorteilhaftüber Probenroboter vorteilhaftQuantitative und semiquantitative AnsätzeQuantitative und semiquantitative Ansätze

ProbenvorbereitungProbenvorbereitung

Notwendigkeit: störende Salze, Matrixkomponenten (z.B. Notwendigkeit: störende Salze, Matrixkomponenten (z.B. PlasmaproteinePlasmaproteine), zu geringe Konzentration), zu geringe KonzentrationAPIAPI--TechnikenTechniken besonders empfindlich (besonders empfindlich (v.av.a. ESI), MALDI . ESI), MALDI robusterrobusterMethoden:Methoden:FlüssigFlüssig--FlüssigFlüssig--ExtraktionExtraktionFestphasenextraktion (SPE)Festphasenextraktion (SPE)ZipTipsZipTips, , NutipsNutips und Ähnliches (vereinfachte SPE)und Ähnliches (vereinfachte SPE)IonenaustauschIonenaustauschAffinitätsmedienAffinitätsmedienEntfernung von Entfernung von PlasmaproteinenPlasmaproteinen: Ultrafiltration, : Ultrafiltration, ACNACN--FällungFällungSäulenschaltung, LC/LCSäulenschaltung, LC/LC

Wie löst man QuantifizierungsWie löst man Quantifizierungs--problemeprobleme mittels LC/MS ?mittels LC/MS ?

Quantitative Aussagen nur durch Vergleich mit Standards möglich Quantitative Aussagen nur durch Vergleich mit Standards möglich !!Quantifizierung anhand der Quantifizierung anhand der PeakflächenPeakflächen in einem in einem ChromatogrammChromatogramm(FIA oder LC/MS), (FIA oder LC/MS), i.d.Ri.d.R. nicht anhand der . nicht anhand der PeakhöhePeakhöhe im im Massenspektrum !Massenspektrum !Optimal: Linearer ZusammenhangOptimal: Linearer ZusammenhangResponse: Response: PeakflächePeakfläche = RF x Konzentration= RF x KonzentrationRF = ResponseRF = Response--FaktorFaktor

Responsefaktor Responsefaktor mußmuß für Standard und Probe gleich sein !für Standard und Probe gleich sein !In Praxis häufig nicht linear über gesamten Bereich In Praxis häufig nicht linear über gesamten Bereich →→andere andere adäquate adäquate FktFkt. verwenden, z.B. Polynom 2. Grades. verwenden, z.B. Polynom 2. Grades

Wie löst man QuantifizierungsWie löst man Quantifizierungs--problemeprobleme mittels LC/MS ?mittels LC/MS ?

Welcher Typ von Analytliegt vor ?

Standards vorhanden ?

Normalisierung

verwenden

Interne oder Externe Standardisierung

verwenden

JaNein

Überprüfung der MethodeAnalytische Parameter

Unbekannt Bekannt

VermutetnormalerweiseStd. vorhanden

Welche Standardisierung ?

Muß mit Matrixeffekten

gerechnet werden ?

Muß die Proben-vorbereitung und

Wiederfindung berück-sichtigt werden ?

Ja

Ja

Nein

Genug Zeitum Int.-Std.-Methode

zu entwickeln ?Nein

Nein

Ja

InterneStandardisierung

ExterneStandardisierung

3 Arten von internen Standards:

Standardzugabe(Analyt selbst)

Chemische Analogsubstanz

Isotopen-markierter

Analyt

• schnell und einfach

• geringe Probenanzahl

• komplexe Probe

• linearer Response

• Spurenidentifizierung (Spiking)

• Probenvorbereitung berücksichtigt

• hohe Genauigkeit

• genug Zeit und Geld vorhanden

• passender Standard verfügbar (!)

• Probenvorbereitung berücksichtigt

• hohe Genauigkeit• hohe Meßrate

erforderlich• genug Geld vorhanden• berücksichtigt auch

Zufallsabweichungen und Nichtlinearität

• passender Standard (stabiles Isotop) verfügbar (!)

Beispiele Beispiele

Analytik von Analytik von StratumStratum--corneumcorneum--CeramidenCeramidenAnalytik von Analytik von CholesteroloxidationsproduktenCholesteroloxidationsprodukten in in NahrungsmittelnNahrungsmittelnAnalytik von Analytik von ElastinElastinPeptide in Peptide in NahrungsproteinhydrolysatenNahrungsproteinhydrolysaten

Analytik von Analytik von StratumStratum--corneumcorneum--CeramidenCeramiden

Matrix: Lösungsmittelextrakte aus Hornhaut Matrix: Lösungsmittelextrakte aus Hornhaut in vivoin vivo oder oder ex vivoex vivoVortrennung der Vortrennung der CeramidklassenCeramidklassen an Normalphasenmaterial:an Normalphasenmaterial:Trennung nach Anzahl und Stellung der Trennung nach Anzahl und Stellung der HydroxygruppenHydroxygruppen, rel. , rel. unabhängig von der Kettenlängeunabhängig von der KettenlängeAnalytik der Analytik der CeramidklassenCeramidklassen mittels mittels MassenspektrometrieMassenspektrometrie zur zur Untersuchung der molekularen Zusammensetzung inkl. Untersuchung der molekularen Zusammensetzung inkl. KettenlängenKettenlängenMöglichkeiten: TLCMöglichkeiten: TLC--RPLCRPLC--ESIESI--MS oder (SPE)MS oder (SPE)--NPLCNPLC--APCIAPCI--MSMSMS/MS zur StrukturidentifizierungMS/MS zur Strukturidentifizierung

O

OO

NH OH

OH

O

NHOH

OH

O

NHOH

OHOH

O

OO

NH OH

OHOH

O

NHOH

OH

OHO

NHOH

OHOH

OH

O

NHOH

OH

OH

OH

Ceramide 1 [EOS]

Ceramide 2 [NS] Ceramide 3 [NP]

Ceramide 4 [EOH]

Ceramide 5 [AS] Ceramide 6 [AP]

Ceramide 7 [AH]


LipidExtraction

AMD-HPTLC

DensitometricQuantification of Lipid Classes

LC/MS

Preparation of BandsReextraction(MeOH/Chloroform 1:1)

1 2 3 4 5 6 7Time (min)

0

50

1000

50

1000

50

1000

50

1000

50

100 m/z= 580.5

m/z= 608.5

m/z= 636.5

m/z= 664.5

m/z= 692.5

Rel

ativ

e In

tens

ity

0

20

40

60

80

100

540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760

m/z

Rel

ativ

e A

bund

ance

in %

200 250 300 350 400 450 500 550 600m/z

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

308.4

534.5

548.4

324.3300.3518.6283.5

567.5265.4

239.4

Negative ESI-MS/MS

N

O

OH

OH

Ceramide II [M-H]N-Stearoylsphinganine

-

m/z=567

RO

N

R

RO

N

OH

m/z=518

m/z=324

NH2

OR

OH

m/z=300

-H2O

-CH2OH,-2H

m/z=548

m/z=534

Stearic acidm/z=283

RO

N

m/z=308R

O

m/z=265

R Om/z=239

H3N

OHOH

OH

Phytosphingosine [M+H]

+

+

m/z=318

-H2O

m/z=300

-H2O

m/z=282

-H2O

m/z=264

-H2 NH+

NH

O

OH

OH

OHOH

H+

Ceramide 6 (Cer[AP]) m/z= 601 ([M+H]+)

MS/MS

MS3

MS4

MS5

MS6

N-2-Hydroxystearoyl-phytosphinganine

Positive ESI-MSn

m/z=262


The densitometric chromatogram of the standardlipids. 1: start, 2: cholesterol-3-sulfate, 3: first peakof synthetic ceramide AP, 4: double peak of bothceramide AS and the second peak of ceramideAP, 5: ceramide NP, 6: ceramide NS, 7: cholesterol, 8: palmitic acid, 9: triolein, 10: cholesteryl oleate, 11: squalene.

The densitometric chromatogram of the standard lipids. 1: start, 2: cholesterol-3-sulfate, 3: first peak of syntheticceramide AP, 4: double peak of both ceramide AS and thesecond peak of ceramide AP, 5: ceramide NP, 6: ceramideNS, 7: cholesterol, 8: palmitic acid, 9: triolein, 10: cholesteryloleate, 11: squalene.


LC chromatogram of the skin ceramides. 1: Cer [EOS], 2: Cer [NS], 3: Cer [NP], 4: Cer[EOH], 5: Cer [AS], 6: Cer [AP], 7: Cer [AH].

APCI-MS spectrum of ceramide [NP].

Analytik von Analytik von CholesteroloxidationsproduktenCholesteroloxidationsprodukten in in NahrungsmittelnNahrungsmitteln

OH OH O

OH

OH

OH

OH

OH

OHO

OH OH

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Time in min

0

20

40

60

80

100

Relative Abundancein%

6

5

3

2

1

4

Separation of COP standards with LC/APCI-MS. 1: 25-hydroxycholesterol, 2: cholestane-3β-5α-6β-triol, 3: 7β -hydroxycholesterol, 4: 7-ketocholesterol, 5: 5,6 α-epoxycholesterol, 6: cholesterol.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Time in min

050

1000

50100

050

1000

50100

050

1000

50100 m/z= 400.7-401.7

m/z= 366.7-367.7

m/z= 368.7-369.7

m/z= 384.7-385.7

m/z= 400.7-401.7

m/z= 504.5-505.5

4

RelativeAbundancein %

3

6

25

4

1

0

Quantification of COP's in egg extract with LC/APCI-MS. 0: internal standard betamethasone-17,19-dipropionate, 1: 25-hydroxycholesterol, 2: cholestane-3β-5α-6β-triol, 3: 7β-hydroxycholesterol, 4: 7-ketocholesterol, 5: 5,6α-epoxycholesterol, 6: cholesterol.

Analytik von Analytik von ElastinElastin

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000M/z0

100

%

bovine elastin, pepsin digest, 1:10bel-p-040910_1012 MaxEnt 3 300 [Ev-178354,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,1,Cmp) 1: TOF MSMS 1012.40ES+

GL G G V G G L G V G G L bMax L G G V G L G G V G G L G yMax

1012.42(M+H) +

749.32593.25

384.16b5

356.17a5

341.25311.12285.11b4

271.10155.06

86.09L

72.08V 119.08

228.10b3214.09

583.27a8

480.18441.17

b6413.18

a6

470.20a7

515.23y6 572.25

y7

552.23

629.27y8 650.26

739.34a10

668.27b9

722.31670.20

767.33b10

994.44806.35

785.35y10

842.35y11

863.35 881.36b12

974.40923.33

1013.50

1014.34

Peptid aus Pepsinverdau von bovinem Elastin (Q-TOF 2)

Analytik von Analytik von ElastinElastin

nanospray

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z0

100

%

0

100

%

belast2 547 (10.748) Cm (143:565) TOF MS ES+ 7.88e3415.204

391.279216.202114.109

130.176 359.322331.277

528.293

416.211

507.329

724.457595.395 639.420 794.582

833.492 877.534

921.557965.605

1009.630 1053.6421180.713

belast0 112 (2.266) Cm (87:121) TOF MS ES+ 4.05e3122.105104.089

56.077 415.229

400.269

243.181

122.357

123.117

173.123

386.257

343.248303.212

244.194

442.325

499.343527.393

570.383

648.474620.436

830.560766.562708.363

709.406831.595

887.673 1076.770

Verdau von bovinem Elastin mit Thermitase (oben: nach ZipTip C18)

Analytik von Peptiden in Analytik von Peptiden in NahrungsproteinhydrolysatenNahrungsproteinhydrolysaten

LC/MS: Kompromiss zwischen optimaler chromatographischer LC/MS: Kompromiss zwischen optimaler chromatographischer Trennung und optimaler ElektrosprayTrennung und optimaler Elektrospray--IonisationIonisationbinärer Gradient 5binärer Gradient 5--50% ACN in 60 min,50% ACN in 60 min,0,1% Ameisensäure, alternativ 0,01% TFA0,1% Ameisensäure, alternativ 0,01% TFA

Chromatogramm/Spektrum einer β-Casein-Fraktion


TANDEM-MS

de-novoDatenbank

- Sequenzierung direkt aus den Tandem-MS-Spektren

- besondere technische Anforderungen an die MS (hohe Massengenauigkeit und Auflösung …)

Zuordnung einer Peptid-sequenz durch Vergleich von experimentell erhaltenen Tandem-MS-Daten mit errechneten anhand einer Protein- oder Peptid-datenbank.


Peak No.a Sequence identifiedb

calc. [M+H]+

β-Casein residuesc MCd

MALDI-PSD

ESI-MS/MS MSDB Expected?

1 <SL>e 219.13 0 ● ●

2 A<FL>Le 279.17 205-206 1 ● ●

3 S<LTL>T 346.23 140-142 - ● ● ○

4 <QSL>e 347.19 - ● ○

5 Q<AFL>L 350.21 204-206 2 ● ● ●

6 A<FLL>Y 392.25 205-207 2 ● ● ●

7 L<QSW>M 420.19 156-158 1 ● ●

8 S<LTLT>D 447.28 140-143 - ● ○

9 Q<AFLL>Y 463.29 204-207 3 ● ● ●

10 L<LYQE>P 552.27 207-210 3 ● ●

11 A<FLLY>Q 555.32 205-208 3 ● ● ●

12 S<QSLTL>T 561.32 138-142 - ● ● ○

13 S<LTLTD>V 562.31 140-144 - ● ● ○

14 F<PPQSVL>S 640.37 173-178 1 ● ● ●

15 I<PPLTQT>P 656.36 90-95 - ● ● ○

16 F<LLYQE>P 665.35 206-210 4 ● ● ●

17 RELEE>L 675.33 16-20 3 ● ● ●

18 L<YQEPVL>G 748.39 208-213 3 ● ● ●

19 M<FPPQSVL>S 787.43 172-178 2 ● ● ●

20 V<PPFLQPEVM>G 1057.54 100-108 - ● ● ● ○

21 G<PVRGPFPIIV 1094.67 215-224 - ● ● ● ○

22 E<PFTESQSLTL>T 1122.57 133-142 4 ● ● ●

23 L<GPVRGPFPIIV 1151.69 214-224 1 ● ● ● ●

24 T<PVVVPPFLQPEVM>G 1451.80 96-108 - ● ● ● ○

25 E<PVLGPVRGPFPIIV 1460.90 211-224 2 ● ● ●

26 L<TDVENLHLPLPLL>Q 1473.83 143-155 5 ● ● ● ●

27 L<TDVENLHLPLPLLQS>W 1688.92 143-157 - ● ● ● ○

28 S<WMHQPHQPLPPTVM>F 1698.82 158-171 - ● ● ● ○

29 L<YQEPVLGPVRGPFPIIV 1881.06 208-224 5 ● ● ● ●

30 L<LYQEPVLGPVRGPFPIIV 1994.15 207-224 6 ● ● ● ●

31 F<LLYQEPVLGPVRGPFPIIV 2107.23 206-224 7 ● ● ●

32 S<WMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL>S 2467.24 158-178 - ● ● ○

33 L<QSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL>S 2682.33 156-178 7 ● ● ●

34 L<SLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQ>A 2806.53 179-203 7 ● ● ●

35 L<SLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQA>F 2877.57 179-204 8 ● ● ●

36 L<SLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAF>L 3024.63 179-205 9 ● ●

37 H<LPLPLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVLSLSQS>K 3831.01 150-183 - ● ○

38 L<VYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVM>G 3863.06 74-108 10 ● ● ●

SQSKVLPVPQ KAVPYPQRDM PIQAFLLYQE PVLGPVRGPF PIIV

| | | |

190 200 210 220

HKEMPFPKYP VEPFTESQSL TLTDVENLHL PLPLLQSWMH QPHQPLPPTV MFPPQSVLSL

| | | | | |

130 140 150 160 170 180

QDKIHPFAQT QSLVYPFPGP IPNSLPQNIP PLTQTPVVVP PFLQPEVMGV SKVKEAMAPK

| | | | | |

70 80 90 100 110 120

MKVLILACLV ALALARELEE LNVPGEIVES LSSSEESITR INKKIEKFQS EEQQQTEDEL

| | | | | |

10 20 30 40 50 60


| | | |

190 200 210 220


| | | | | |

130 140 150 160 170 180


| | | | | |

70 80 90 100 110 120


| | | | | |

10 20 30 40 50 60


| | | |

190 200 210 220


| | | | | |

130 140 150 160 170 180


| | | | | |

70 80 90 100 110 120


| | | | | |

10 20 30 40 50 60

Sequenzierte Peptide des peptischen Verdaus β-Caseins

DatenbanksucheDatenbanksuche

Datenbanksuchprogramm

Sequenz-Datenbanken

Taxonomie

Modifikationen

Miss. Cleavagesetc.

Protease

MSMS--DatenDaten

MS und/oder MS/MS

Sequenzen(Peptide Proteine)

(Mascot Server)

(MSDB, SwissProt, NCBI)

ProzessierungProzessierungProbleme bei der Peakerkennung:

-Erkennung von Peaks geringer Intensität-Auswahl von Peaks die dem Grundrauschen entstammen-Auswahl der/des falschen Peaks oder aller Peaks auseinem Isotopen-Cluster

Segment aus MALDI-PSD-Spektrum

12

Zusätzliche Probleme inMALDI-PSD-Spektren:

(1) Baseline-“Sprünge“(2) S/N klein

Signalpeaks schwer vomRauschen unterscheidbar

ProzessierungProzessierung

Mascot Distiller

iterativ arbeitende Software, die bei der Detektion von Signalpeaks die durchschnittliche Isotopenverteilung von Peptiden zu Grunde legt und während der Suche einmal als Signal erkannte Peaks vom verbleibenden Spektrum subtrahiertauch manuell nicht zu detektierende Peaks in der Größenordnung des Signalrauschens lassen sich noch sicher erkenneneignet sich auch sehr gut für Peptide Mass Fingerprinting

Verbesserte Identifizierungsquote

ZusammenfassungZusammenfassungΣVerschiedene Ionisationsmethoden Verschiedene Ionisationsmethoden komplementärkomplementär

ESI (MS/MS) ESI (MS/MS) vs.vs. MALDI (PSD) MALDI (PSD) bei Strukturaufklärungbei Strukturaufklärung

ESI ESI vs.vs. APCI bei LC/MSAPCI bei LC/MS

Bei komplexen Proben ProbenvorbereitungBei komplexen Proben Probenvorbereitungmeist meist unerläßlichunerläßlich, viele Möglichkeiten, viele Möglichkeiten

Bei Quantifizierung interne Standardisierung Bei Quantifizierung interne Standardisierung wichtig

45 95 60ESI MALDI

Detektion von 200 Proteinen:Schnittmenge und Exklusivbereiche

Pol

aritä

t

1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 1e+5Molmasse

ESI

APCI

wichtig

DankDank

Christian SchmelzerChristian SchmelzerHanyHany FarwanahFarwanahChristian BrennerChristian BrennerMelkamuMelkamu GetieGetieProf. Reinhard NeubertProf. Reinhard NeubertBMBF, DFG, KM SachsenBMBF, DFG, KM Sachsen--AnhaltAnhalt

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