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Estudios de macro- y microevolución
con secuenciación masiva dirigida
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SEBOT 2020Lisa Pokorny1 & Juan Viruel2
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas 2Royal Botanic Gardens, Kew (RBGK)
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Hyb-Seq1. Introducción: secuenciación masiva2. Secuenciación mixta 3. Diseño de paneles de captura4. Análisis bioinformáticos5. Ejemplos6. El futuro es ahora
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1.Introducción:
Secuenciación Masiva
● Cronología● Limitaciones● Técnicas
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Cronología y comparación de instrumentos de secuenciación masiva
Fig. 1. Reuter et al. 2015. Mol. Cell 58: 586–597
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Costes de secuenciación por genoma (para humanos en dólares)
2ª generación (fragmentos cortos)
3ª generación (fragmentos largos)
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Tamaños del genoma en plantas embriofitas
Fig. 1. Pellicer et al. 2018. Genes 9 (2), 88
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Técnicas de muestreo genómico
Aleatorio
▣ A perdigones (shotgun seq)
▣ Genotipado por secuenciación (GbS, RAD-seq)
Estratificado
▣ Trascriptómica (RNA-seq)
▣ Enriquecimiento y captura (microfluídica, en fase sólida, en solución)
Mixto
▣ Combinando a perdigones con captura en solución (Hyb-Seq)
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Estratificado
▣ Trascriptómica (RNA-seq)
▣ Enriquecimiento y captura (microfluídica, en fase sólida, en solución)
Técnicas de muestreo genómico
Aleatorio Mixto
Hyb-Seq
Fig. 1. Davey et al. 2011. Nat. Rev. Genet. 12: 499–510 Fig. 5. Metzker. 2010. Nat. Rev. Genet. 11: 31–46
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Secuenciación Sanger vs. masiva dirigida
Secuenciación de terminación de cadena (Sanger sequencing)
Secuenciación masiva dirigida (target capture sequencing)
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Hyb-Seq
Secuenciación mixta
Fig. 1. Dodsworth*, Pokorny*, Johnson* et al. 2019. Trends Plant Sci. 24 (10), 887–891
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2.Secuenciación
mixta (Hyb-Seq)● Definición● Materiales● Métodos
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‘’
Secuenciación aleatoria a perdigones(genome skimming)
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‘’
Secuenciación masiva dirigida
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‘’80% 20%
Hyb-Seq = shotgun + targeted sequencing
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‘’
Hyb-Seq: flujo de trabajo molecularHale et al. 2020. Strategies for reducing per-sample costs in target capture sequencing for phylogenomics and population genomics in plants. APPS, in press.
200 ng
1000 ng>5ng/µl
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‘’
Optimización de protocolos molecularesFig. 3. Brewer et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 1102Fig. 3. Bakker et al. 2015. Biol. J. Linn. Soc. 117: 33–43
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3.Diseño de
paneles de captura
● Específicos● Universales● Comparativa
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Recursos genómicosTranscriptomas, ESTs, genomas...
Recursos económicosProducción y optimización
Recursos computacionalesDiseño con MarkerMiner, BaitFisher, DOMINO...
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Fig. 9. Cheng et al. 2018. GigaScience 7: 1–9.
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‘’2,840 genes de
angiospermas en copia
baja o única
(2,663 baja + 177 única)
Fig. 3. De Smet et al. 2013. PNAS 110: 2898–2903
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Transcriptomas▣ Preexistentes o material vivo ▣ Ensamblaje de novo
Genoma(s) de referencia▣ 16 disponibles en ▣ Posible añadir más
Panel de enriquecimiento y captura comercial▣ Co-diseño del panel
Diseño de panel específico
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Fig. 1. Chamala et al. 2015. Apps. Plant Sci. 3(4): 1400115
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A partir de▣ Cuatro transcriptomas
□ 3x grupo de estudio (Dioscorea) □ 1x género hermano (Tacca).
▣ Dos genomas de referencia□ Oryza sativa (Poales)□ Xerophyta viscosa (Pandanales)
Resultados▣ 260 genes de copia baja o única
□ (+43 genes de interés)□ >60% enriquecimiento
▣ Excelente resolución filogenética
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Figs. 1, S5 & S6. Liu et al. 2019. Nat. Commun. 10: 1485
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http://mossmatters.net/blog/SequenceClusters.html
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http://mossmatters.net/blog/SequenceClusters.html
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¿Panel universal o específico?
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¿Panel universal o específico?
▣ ¿Cuál es tu hipótesis?
▣ ¿Qué recursos genómicos, computacionales y económicos tienes?
▣ ¿Y por qué no ambos?
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¿Panel universal o específico?
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¿Panel universal o específico?
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¿Panel universal o específico?
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4.Análisis
bioinformáticos
● Calidad● Procesado● Filogenómica● Ploidía
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Calidad
Recorta
Pega
Colorea
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Calidad
Recorta
Pega
Colorea
Datos en bruto
Secuencias
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Calidad
FastQC|Trimmomatic
BLASTx|BWA
SPAdes|exon(intron)erate
HybPiper
Datos en bruto
Secuencias
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HybPiper
https://github.com/mossmatters/HybPiper/wiki
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PHYLUCE HybPhyloMaker
https://phyluce.readthedocs.io/en/latest/ Fig. 1. Fér & Schmickl. 2018. Evol. Bioinfo. 14: 1–9
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Procesado
Alinea
Poda y enmascara
Refina
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Procesado
Alinea
Poda y enmascara
Refina
Secuencias
Alineamientos
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Procesado
MAFFT|PASTA|UPP
AMAS|trimAl
FastTree|TreeShrink
Secuencias
Alineamientos
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PASTA
Fig. 1. Mirarab et al. 2015. J. Comput. Biol. 22 (5): 377–386
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Fig. 2. Nguyen et al. 2015. Genome Biol. 16: 123
UPP
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TreeShrink
Fig. 1. Mai & Mirarab. 2015. BMC Genomics 19: 272
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Genes
Filogenómica
Especies
Evolución
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Genes
Filogenómica
Especies
Evolución
Alineamientos
Filogenias
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Árboles de genes vs. árboles de especies
Fig. 1. Liu et al. 2015. Ann. N. Y. Acad. Sci 1360: 36–53
Concatenación Coalescencia en 1 paso Coalescencia en 2 pasos
especie Aespecie Bespecie Cespecie Despecie E
gen 1 gen 2 gen 3 gen 4
árboles de genessúper-matriz
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Árboles de genes vs. árboles de especies
Fig. 1. Liu et al. 2015. Ann. N. Y. Acad. Sci 1360: 36–53
Concatenación Coalescencia en 1 paso Coalescencia en 2 pasos
especie Aespecie Bespecie Cespecie Despecie E
gen 1 gen 2 gen 3 gen 4
árboles de genessupermatriz
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Filogenómica
RAxML-NG|IQ-tree|PhyML
ASTRAL III
Alineamientos
Filogenias
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Árboles de genes vs. árboles de especies
Fig. 1. Liu et al. 2015. Ann. N. Y. Acad. Sci 1360: 36–53
Concatenación Coalescencia en 1 paso Coalescencia en 2 pasos
especie Aespecie Bespecie Cespecie Despecie E
gen 1 gen 2 gen 3 gen 4
árboles de genessupermatriz
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Filogenómica
ML|PoMo|SVDquartets
Alineamientos
Filogenias
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Genes
Filogenómica
Especies
Evolución
Alineamientos
Filogenias
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Filogenómica
BEAST 1.x y 2.x|RevBayes
Alineamientos
Filogenias
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RevBayes
https://revbayes.github.io/tutorials/
Métodos comparativos (Ornstein-Uhlenbeck)
Tiempos de divergencia (Birth-Death)
Tasas de diversificación (HiSSE)
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RAxML-NG|IQ-tree|PhyML
Filogenómica
PAML|HyPhy
Alineamientos
Filogenias
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▣ GARD (Genetic Algorithm for Recombination Detection)
▣ FEL (Fixed Effects Likelihood)
▣ SLAC (Single-Likelihood Ancestor Counting)
▣ FUBAR (Fast, Unconstrained Bayesian AppRoximation)
▣ MEME (Mixed Effects Model of Evolution)
▣ aBSREL (adaptive Branch-Site Random Effects Likelihood)
▣ BUSTED (Branch-Site Unrestricted Statistical Test for Episodic Diversification)
▣ RELAX
http://www.hyphy.org/getting-started/#characterizing-selective-pressures
HyPhy
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‘’
Fig. 1. Wendel. 2015. Am. J. Bot. 102(11): 1753–1756
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‘’
Visualización del nivel de ploidía ploidyNGS
Fig. 1. Corrêa dos Santos et al. 2017. Bioinformatics 33(16): 2575–2576
Haploide Diploide
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‘’
Visualización del nivel de ploidía ploidyNGS
Fig. 1. Corrêa dos Santos et al. 2017. Bioinformatics 33(16): 2575–2576
Haploide Diploide
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‘’
Histogramas obtenidos con simulaciones
https://github.com/diriano/ploidyNGS
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‘’
Estimación del nivel de ploidía nQuire
Fig. 2. Weiß et al. 2018. BMC Bioinformatics 19: 122. Disponible en https://github.com/clwgg/nQuire
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‘’
Secuencias producidas con Hyb-Seq
Fig. 2. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937
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‘’
Ploidía estimada con datos de Hyb-Seq de material de herbario
Fig. 3. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937
1 / 1 = 1
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‘’
Ploidía estimada con datos de Hyb-Seq de material de herbario
Fig. 3. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937
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‘’ FastQC+Trimmomatic
BWA+ploidyNGS
nQuire+R
Datos en bruto
Ploidía
Fig. S5b. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937
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‘’
Ploidía estimada con datos de Hyb-Seq de material de herbario
Fig. 3. Viruel et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 937
![Page 73: masiva dirigida con secuenciación y microevolución Estudios ......Estratificado Trascriptómica (RNA-seq) Enriquecimiento y captura (microfluídica, en fase sólida, en solución)](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070107/6022e2118708555a08237c92/html5/thumbnails/73.jpg)
5.Ejemplos:
● Flores● Tabaibas● Juncias● Chefleras
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Órdenes y familias APG IV
▣ Transcriptomas 1KP
▣ Captura con angiosperms-353
▣ SRAs (RNA-seq) de NCBI
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Órdenes y familias APG IV
▣ Transcriptomas 1KP
▣ Captura con angiosperms-353
▣ SRAs (RNA-seq) de NCBI
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Captura y minado
Fig. 4. Brewer et al. 2019. Front. Plant Sci. 10: 1102
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Análisis filogenómicos
trimmomatic
HybPiper
UPP+TS+trimAl
Datos en bruto
Alineamientos
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Resultados preliminares
IQ-tree+UFboot
ASTRAL+LPP
SortaDate+BEAST
Alineamientos
Filogenias
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Euphorbia balsamifera s.l.
Figs. 1, 3 & 4. Villaverde*, Pokorny* et al. 2018. New Phytol. 220: 636–650
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C4 Cyperus Clade
Figs. 1, 2 & 4. Larridon*, Villaverde* et al. 2020. Front. Plant Sci.
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Shee et al. 2020. Front. Plant Sci., in press
Schefflera
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6.el futuro es
ahora
● Fragmentos largos
● Depauperacióncon CRISPR
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‘’
https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/posters/pdf/P17013%20SeqCap%20v7.0%20A4%20_compressed.pdf
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‘’
![Page 85: masiva dirigida con secuenciación y microevolución Estudios ......Estratificado Trascriptómica (RNA-seq) Enriquecimiento y captura (microfluídica, en fase sólida, en solución)](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022070107/6022e2118708555a08237c92/html5/thumbnails/85.jpg)
‘’
https://arborbiosci.com/wp-content/uploads/2019/01/PAGXXVII-Poster-CRISPR-Cas-Targeted-Sequencing.pdf
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¡Gracias!¿Preguntas?
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Lisa Pokorny [ @Calyptrochaeta]
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Foto: WJ Baker