mapeo fino de dos qtls asociados a la maduraciÓn

Trabajo de final de grado

Ingeniería de Sistemas Biológicos

MAPEO FINO DE DOS QTLS ASOCIADOS

A LA MADURACIÓN CLIMATÉRICA DEL

FRUTO DEL MELÓN

Autora Tutor académico Tutora externa

Nathalia Gómez Jiménez Joan Simó Cruanyes Marta Pujol Abajo

2020

Mapeo fino de dos QTLs asociados a la maduración climatérica del fruto del melón 1

Escola d’Enginyeria Agroalimentària i de Biosistemes de Barcelona

UPC - BarcelonaTech

2 Nathalia Gómez Jiménez

RESUMEN

El melón (Cucumis melo L.) es una planta de la familia de las cucurbitáceas de alto interés económico

y agrícola a nivel mundial. Su amplia diversidad fenotípica ha hecho del melón objeto de gran

cantidad de estudios a nivel genético, bioquímico y molecular, lo cual la sugiere como posible

organismo modelo.

El objetivo principal de este trabajo fue realizar el mapeo fino de dos Quantitative Trait Loci o QTL

del melón con el fin de entender el mecanismo de maduración climatérica de los frutos, a partir de

dos líneas no climatéricas, Piel de Sapo (PS) y Makuwa (Mak), introgresadas en Védrantais (Ved),

un melón climatérico. Para este propósito, se trabajó con dos Introgression Line (IL), una con el QTL

ETHQV8.1 de PS en fondo Ved y con el QTL MAK_10-1 de Mak en fondo Ved. Para ETHQV8.1 se

trabajó con una F3 mientras que para MAK_10-1 se trabajó con una F2.

El mapeo fino se llevó a acabo a través de varios pasos: el genotipado del ADN de las plantas F2 y

F3 con marcadores moleculares tipo SNP flanqueantes de los QLTs para la identificación de plantas

que hayan sufrido una recombinación en el intervalo del QTL; el fenotipado de todos los

recombinantes para caracteres como el aroma, capa de abscisión, cambio de color, firmeza de la

pulpa y la fecha de cosecha; y el análisis estadístico mediante un T-test para determinar diferencias

fenotípicas significativas entre diferentes genotipos.

Para el proyecto ETHQV8.1 se germinaron 48 plantas de cada una de las 9 familias a estudiar y 8 de

cada una de las líneas parentales de la población (PS8.2 y Ved), utilizadas como controles. Para el

proyecto MAK_10-1, se germinaron 384 semillas F2, provenientes del cruce MAK_10-1 x Ved y se

obtuvieron 116 plantas recombinantes de las cuales 80 se evaluaron en invernadero.

Se logró acotar el QTL ETHQV8.1 hasta encontrar un gen candidato más plausible para ser el

responsable del QTL, el gen MELO3C024520.2.1 (ERF024). También se logró acotar la región del QTL

MAK_10-1 a 0,47 Mb donde hay 70 genes anotados, mas no se pudo detectar un único gen

candidato para el QTL, puesto que el QTL con el que se trabajó era de gran tamaño.

Palabras clave: IL, Piel de Sapo, QTL, maduración, mapeo fino, Makuwa, recombinación, RIL, test

de progenie, Védrantais.



UPC - BarcelonaTech

RESUM

El meló (Cucumis melo L.) és una planta de la família de les cucurbitàcies d'alt interès econòmic i

agrícola a nivell mundial. La seva àmplia diversitat fenotípica ha fet el meló objecte de gran

quantitat d'estudis a nivell genètic, bioquímic i molecular, la qual cosa la suggereix com a possible

organisme model.

L'objectiu principal d'aquest treball va ser realitzar el mapeig fi de dues Quantitative Trait Loci o QTL

del meló per tal d'entendre el mecanisme de maduració climatèrica dels fruits, a partir de dues

línies no climatèriques, Pell de Gripau (PS) i Makuwa (Mak), introgresades en Védrantais (Ved), un

meló climatèric. Per a aquest propòsit, es va treballar amb dos Introgression Line (IL), una amb el

QTL ETHQV8.1 de PS en fons Ved i amb el QTL MAK_10-1 de Mak en fons Ved. Per ETHQV8.1 es va

treballar amb una F3 mentre que per MAK_10-1 es va treballar amb una F2.

El mapatge fi es va dur a terme a través de diversos passos: el genotipat de l'ADN de les plantes F2

i F3 amb marcadors moleculars tipus SNP flanquejants dels QLTs per a la identificació de plantes

que hagin patit una recombinació en l'interval de l'QTL; el fenotipat de tots els recombinants per a

caràcters com l'aroma, capa d'abscisió, canvi de color, fermesa de la polpa i la data de collita; i

l’anàlisi estadística mitjançant un T-test per determinar diferències fenotípiques significatives entre

diferents genotips.

Per al projecte ETHQV8.1 es van germinar 48 plantes de cadascuna de les 9 famílies a estudiar, i 8

de cadascuna de les línies parentals de la població (PS8.2 i Ved), utilitzades com a controls. Per al

projecte MAK_10-1, es van germinar 384 llavors F2, provinents de l'encreuament MAK_10-1 x Ved

i es van obtenir 116 plantes recombinats de les quals 80 es van avaluar en hivernacle.

Es va aconseguir delimitar el QTL ETHQV8.1 fins a trobar un gen candidat més plausible per ser el

responsable de l'QTL, el gen MELO3C024520.2.1 (ERF024). També es va aconseguir acotar la regió

de l'QTL MAK_10-1, mes no es va poder detectar un únic gen candidat per al QTL, ja que encara no

s'havien fixat els al·lels homozigots i el QTL amb el qual es va treballar era de grans dimensions.

Paraules clau: IL, Pell de Gripau, QTL, maduració, mapatge fi, Makuwa, recombinació, RIL, test de

progènie, Védrantais.


ABSTRACT

The melon (Cucumis melo L.) is a plant of the cucurbit family of high economic and agricultural

interest worldwide. Its wide phenotypic diversity has made the melon the subject of a large number

of studies at the genetic, biochemical and molecular level, which suggests it as a possible model

organism.

The main objective of this work was to carry out the fine mapping of two Quantitative Trait Loci or

QTL of the melon in order to understand the climacteric ripening mechanism of the fruits, from two

non-climacteric lines, Piel de Sapo (PS) and Makuwa (Mak), introgressed into Védrantais (Ved), a

climacteric melon. For this purpose, we worked with two Introgression Line (IL), one with the QTL

ETHQV8.1 of PS in the Ved background and with the QTL MAK_10-1 of Mak in the Ved background.

For ETHQV8.1 we worked with an F3 while for MAK_10-1 we worked with an F2.

The fine mapping was carried out through several steps: the genotyping of the DNA of the F2 and

F3 plants with molecular markers type SNP flanking the QLTs for the identification of plants that

have undergone a recombination in the QTL interval; the phenotyping of all recombinants for

characteristics such as aroma, abscission layer, colour change, pulp firmness, and harvest date; and

the statistical analysis using a T-test to determine significant phenotypic differences between

different genotypes.

For the ETHQV8.1 project, 48 plants were germinated from each of the 9 families to be studied, and

8 from each of the parental lines of the population (PS8.2 and Ved), used as controls. For the

MAK_10-1 project, 384 F2 seeds were germinated, coming from the MAK_10-1 x Ved and 116

plants were obtained, of which 80 were evaluated in the greenhouse.

The QTL ETHQV8.1 was narrowed down until a more plausible candidate gene was found to be

responsible for the QTL, the MELO3C024520.2.1 gene (ERF024). It was also possible to limit the

region of the QTL MAK_10-1, but a single candidate gene for the QTL could not be detected, since

the homozygous alleles had not yet been fixed and the QTL with which we worked was large.

Key words: IL, Piel de Sapo, QTL, ripening, fine mapping, Makuwa, recombination, RIL, progeny test,

Védrantais.



UPC - BarcelonaTech


SUMARIO

Índice de figuras ................................................................................................................ 8

Índice de tablas ................................................................................................................11

Agradecimientos ..............................................................................................................13

1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................16

1.1. El melón, características genéticas, fisiológicas e importancia económica .................. 16

1.2. Maduración del melón: frutos climatéricos y no climatéricos ..................................... 18

1.3. Mapeo de genes ........................................................................................................... 20

1.4. Avances previos y contexto .......................................................................................... 23

2. OBJETIVOS ..............................................................................................................26

3. MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................................28

3.1. Material vegetal ........................................................................................................... 28

3.2. Extracción de ADN ........................................................................................................ 31

3.2.1. Extracción de ADN rápida .............................................................................................................. 31

3.2.2. Extracción de ADN tipo Doyle ....................................................................................................... 32

3.3. Genotipado................................................................................................................... 32

3.4. Fenotipado ................................................................................................................... 34

3.5. Mapeo fino de los QTLs ................................................................................................ 35

3.6. Análisis de datos ........................................................................................................... 37

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.....................................................................................39

4.1. Proyecto ETHQV8.1 ...................................................................................................... 39

4.1.1. Genotipado de los recombinantes ............................................................................................... 39

4.1.2. Fenotipado de los recombinantes ................................................................................................ 42

4.1.3. Mapeo fino por asociación fenotipo-genotipo ........................................................................... 44

4.1.4. Genes candidatos ........................................................................................................................... 47

4.2. Proyecto MAK_10-1 ..................................................................................................... 48

4.2.1. Genotipado de los recombinantes ............................................................................................... 48



UPC - BarcelonaTech

4.2.2. Fenotipado de los recombinantes ................................................................................................ 50

4.2.3. Mapeo fino por asociación fenotipo-genotipo ........................................................................... 54

4.2.4. Genes candidatos ........................................................................................................................... 57

5. CONLCUSIONES ......................................................................................................59

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................................62

7. ANEXOS ..................................................................................................................68

Índice de figuras ...............................................................................................................70

Índice de tablas ................................................................................................................72

ANEXO A. LISTA DE GENES DE MAK_10-1. .......................................................................73

ANEXO B. FIGURAS DE ETHQV8.1 Y MAK_10-1 ...............................................................74

ANEXO C. TABLAS DE ETHQV8.1 Y MAK_10-1 .................................................................82

ANEXO D. RESULTADOS DE LOS CÁLCULOS DE CHI CUADRADA Y DISTANCIA GÉNICA ...90


Índice de figuras

Figura 1.1.1. Cantidad media de producción de melones, incluidos cantalupos, por

países del año 1994 a 2018 (FAOSTAT, 2018). ........................................................17

Figura 1.3.1. Representación gráfica de un marcador molecular tipo SNP. ....................21

Figura 1.3.2. Representación gráfica del funcionamiento de las sondas de KASPar™ para

el genotipado de SNP con fluorescencia (Yuan et al. 2014). ..................................22

Figura 3.1.1. Plántulas de los parentales PS y Ved en el invernadero del CRAG..............29

Figura 3.1.2. Disposición vertical de las plantas del melón en Torre Marimón, Caldas de

Montbui, a principios de julio. ................................................................................29

Figura 3.1.3. Fotografía del procedimiento de autopolinización manual con espátula. A:

Flor masculina de la planta. B: Flor femenina de la planta. ...................................30

Figura 3.2.1.1. Representación del proceso de extracción de ADN a partir de una hoja de

melón (Areco, 2019). ..............................................................................................31

Figura 3.3.1. Interficie del programa LightCycler donde aparecen en los dos ejes

información sobre los alelos presentes en las muestras de ADN: alelo X (azul), el

alelo Y (verde) o ambos (híbrido, rojo). ..................................................................33

Figura 3.4.1. Crecimiento del melón en Torre Marimón. ................................................35

Figura 4.1.2.1. Gráfica boxplot de la aparición de capa de absición (EALF) de las líneas

recombinantes y los parentales. .............................................................................43

Figura 4.1.3.1. Representación en gráfica de los marcadores y sus posiciones (eje X) y el

-log10 de los valores de las P-value correspondientes a los T-test realizados para

cada fenotipo (EARO, ECD, EALF y ABS) (eje Y) del QTL ETHQV8.1. ........................45

Figura 4.1.3.2. Mapa físico la región de marcadores moleculares tipo SNP en el

cromosoma 8 con las distancias respectivas entre sí. La región marcada en rojo, y

destacada en naranja, corresponde a los marcadores los cuales se vinculan más



UPC - BarcelonaTech

estrechamente como los responsables de delimitar el locus relacionado con

ETHQV8.1................................................................................................................46

Figura 4.1.4.1. Representación gráfica de los 2 genes candidatos que se encuentran en

la región del QTL analizado durante el proyecto, extraída de la web Melonomics,

con la región correspondiente entre los marcadores más ligados a los genes

potencialmente responsables de la maduración, chr8_9628485 y chr8_9630609. 47

Figura 4.2.2.1. Representación gráfica de los valores de EARO en días para los

recombinantes. *Los números en el eje X representan los recombinantes en el

orden que aparece en la Tabla 4.2.2.3. ..................................................................52

Figura 4.2.2.2. Representación gráfica de los valores de FIR en días para los

recombinantes. *Los números en el eje X representan los recombinantes en el

orden que aparece en la Tabla 4.2.2.4. ..................................................................53

Figura 4.2.3.1. Mapa físico de la región del QTL de maduración de MAK_10-1, en el

cromosoma 10 con marcadores tipo SNP utilizados para el mapeo fino. Cada línea

representa un marcador utilizado, a excepción de los marcadores de los extremos

del cromosoma, el cual fue utilizado para crear el cromosoma con el programa

MapChart. A la izquierda se muestra la posición física del marcador en el

cromosoma y a la derecha el nombre del marcador utilizado. ..............................55


-log10 de los valores de las P-value correspondientes a cada fenotipo (EARO, ECD,

EALF y ABS) (eje Y) del QTL MAK_10-1. ..................................................................56

Figura 4.2.4.1. Representación gráfica de los genes que se encuentran en la región del

QTL analizado durante el proyecto, extraída de la web Melonomics, con la región

correspondiente entre los marcadores más ligados a los genes potencialmente

responsables de la maduración, S10_423142 y S10_896478. ................................57

Tabla-C4. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo EARO. ...............................84


Tabla-C9. Log10 (tabla superior) de los P-value de todos los fenotipos y -Log10 (tabla

inferior) de los mismos valores. ..............................................................................86

Tabla-C10. Secuencias de los primers coincidentes con los marcadores moleculares

utilizados para el mapeo fino del QTL MAK_10-1. A1 y A2 corresponden a cada

alelo, C1 el encebador común. ................................................................................87



UPC - BarcelonaTech

Índice de tablas

Tabla 3.3.1. Especificación de parámetros utilizados para el genotipado en placa de 96

pocillos. ...................................................................................................................33

Tabla 3.3.2. Tabla de parámetros para el genotipado PACE2.0™. *Además de estos

parámetros, hay que ajustar Sec Target (°C) = 57 y Step Size (°C) = 0,8. ................34

Tabla 3.5.1. Diseño y posición de los marcadores moleculares tipo SNP utilizados en el

proyecto ETHQV8.1. PS: Piel de Sapo; Ved: Védrantais. ........................................36


proyecto MAK_10-1. Mak: Makuwa; Ved: Védrantais. .........................................36

Tabla 4.1.1.1. Número de plantas seleccionadas del total de plantas genotipadas de las

9 familias F3 del proyecto ETHQV8.1......................................................................40

Tabla 4.1.1.2. Test de progenie. Genotipado de los recombinantes y marcadores

utilizados para cada sección. B corresponde a genotipo PS para ese marcador, V

corresponde a Ved para ese marcador...................................................................41

Tabla 4.1.2.1. Resultado del fenotipado del aroma (EARO), cambio de color (ECD),

aparición de la capa de abscisión (EALF), día de recolecta (HAR) y firmeza (FIR).

Valores medios de las medidas tomadas en el invernadero para parentales y

recombinantes, a excepción de FIR (firmeza) que fue tomada en el laboratorio

correspondientes al proyecto ETHQV8.1. *NC corresponde al fenotipo no

climatérico de PS8.2 para ese carácter, C corresponde al fenotipo climatérico de

Ved para ese carácter e I corresponde al fenotipo intermedio. .............................42

Tabla 4.2.1.1. Tipos de recombinaciones en los alelos encontradas entre el marcador

S10_423142 y S10_2206450. * V corresponde a homocigoto Ved para el alelo, M

homocigoto Mak para el alelo, H heterocigoto para el alelo y ND corresponde a

No data. No fueron añadidos los parentales, dobles recombinantes ni la F1. .......49


Tabla 4.2.2.1. Medias de los fenotipos de los parentales (Ved y Mak) y los rangos de los

fenotipos para los recombinantes. .........................................................................51

Tabla 4.2.2.2. Resultados del T-test para los fenotipos de Ved vs Mak. .........................51

Tabla 4.2.2.3. Resultados del fenotipo EARO de los recombinantes y su genotipo. *Los

valores de líneas ordenadas corresponden a su respectivo recombinante. ...........52

Tabla 4.2.2.4. Resultados del fenotipo FIR de los recombinantes y su genotipo. *Los

valores de líneas ordenadas corresponden a su respectivo recombinante. ...........53



UPC - BarcelonaTech

Agradecimientos

En este Trabajo de Final de Grado he contado con la ayuda de varias personas, sin las cuales no

hubiera podido conseguirlo y quiero agradecerles su gran aportación.

Quiero dar las gracias al centro de investigación CRAG por haberme brindado la oportunidad de

hacer mi estadía en su laboratorio y por ende este proyecto. A mis compañeros investigadores de

ese centro, los cuales me ayudaron en todo lo que necesité y especialmente a mi tutora Marta Pujol

por haberme guiado y aconsejado tan sabiamente durante todo este proceso.

Agradecer también a mi tutor Joan Simó por haberme iniciado en el mundo de la genética y

haberme transmitido la pasión por esta ciencia, la cual me ha traído hasta donde estoy ahora.

A la profesora Marta Ginovart por haber estado al pie del cañón durante todo el análisis estadístico

de este proyecto, por su supervisión y su amabilidad, por la cual siempre la recordaré.

Especialmente quiero agradecer a mis padres, sin los cuales jamás hubiera llegado hasta aquí.

Siempre he tenido su apoyo incondicional que es mi fuerza para conseguirlo todo.

Por último, a mi compañero de vida, por haber estado a mi lado en todo momento alentándome a

perseguir mis sueños. Thank you, for the countless nights of patience and support and for offering

me encouragement when I needed it the most.



UPC - BarcelonaTech

INTRODUCCIÓN


1. INTRODUCCIÓN

1.1. El melón, características genéticas, fisiológicas e importancia económica

El melón (Cucumis melo L.) es una planta que forma parte de la familia de las cucurbitáceas, la cual

consta de unos 120 géneros y más de 800 especies de plantas, como por ejemplo especies tan

conocidas como la calabaza (Cucurbita spp.), el pepino (Cucumis sativus L.) o la sandía (Citrullus

lanatus) (Nuñez-Palenius et al. 2008).

Este cultivo, domesticado hace unos 4.000 años, presente en zonas tropicales y subtropicales, tiene

un genoma diploide, dotado de 12 cromosomas (2n = 24) y se estima que tiene 29.980 genes

codificadores de proteínas (García-Mas et al. 2012; Ruggieri et al 2018). Estudios recientes

apuntan a que su origen es en Asia y Australia, no en África como tradicionalmente se ha creído

(Sebastian et al. 2010). La domesticación de esta planta aparentemente fue de manera

independiente en las distintas regiones como China, Asia Central, India y África, dando paso a la

gran diversidad genética que se conoce actualmente en esta especie (Sebastian et al. 2010).

Su amplia diversidad fenotípica en cuanto al tamaño, forma, color, contenido en azúcares, nivel de

acidez y demás caracteres, ha hecho del melón objeto de gran cantidad de estudios a nivel genético,

bioquímico y molecular para mejorar la apariencia y calidad de este (Burger et al. 2006).

La pluralidad de esta planta la ha llevado a tener clasificaciones divergentes. No obstante, una de

las clasificaciones que puede utilizarse para abarcar este diverso cultivo es la división entre dos

subespecies, melo y agretis, y estos a su vez en 15 grupos o variedades: acidulous, chinensis,

conomon, makuwa and momordica (ssp. agrestis), and adana, ameri, cantalupensis, chandalak,

chate, dudaim, flexuosus, inodorus, reticulatus and tibish (ssp. melo) (Pavan et al. 2017).

En cuanto a características fisiológicas, a pesar de las distintas clasificaciones, tienen unos rasgos

comunes; es una planta anual, herbácea, dicotiledónea, de fecundación entomófila, su tallo va de

1 a 12 metros de longitud recubierto de vellosidades y con ramificaciones, con un sistema radicular

ramificado y extenso (hasta 1,2 m de profundidad, a pesar de que la mayor parte de la raíz se

encuentra a unos 30-40 cm de profundidad). Es trepadora o rastrera, para lo cual ha desarrollado

unos pelos afilados que le permiten buena sujeción. Las hojas son de aspecto áspero debido a las

vellosidades que les permiten la regulación de pérdida de agua, de unos 7 a 15 cm de diámetro.



UPC - BarcelonaTech

Consta de flores femeninas, de las cuales se puede distinguir el ovario y masculinas de color

amarillo, aunque tiene también flores hermafroditas de unos 2 o 3 cm de diámetro. Sus semillas

son de color blanco o incluso amarillento, ovaladas, alargadas y relativamente planas de unos 1 o 2

cm de largo (Kirkbride, 1993).

El melón es un cultivo de gran valor económico alrededor de todo el mundo, con una producción

en el año 2018 de casi 32 millones de toneladas en total (31.936.936,67 toneladas), donde los

mayores productores fueron China (8.994.611,88 toneladas) y China continental (8.883.766,76

toneladas), Turquía (8.883.766,76 toneladas), Irán (1.760.016,92 toneladas), Estados Unidos

(1.066.633,24 toneladas) y en sexta posición España (936.019,92 toneladas) (FAOSTAT, 2018)

(Figura 1.1.1).

Figura 1.1.1. Cantidad media de producción de melones, incluidos cantalupos, por países

del año 1994 a 2018 (FAOSTAT, 2018).


Las estadísticas muestran un aumento del área destinada al cultivo de esta especie y la producción

a nivel mundial desde el año 1994 hasta el 2018 (Figura 1.1.2). En hectáreas, el aumento ha sido de

963.468 a 1.047.283 hectáreas en 24 años. Por otro lado, las toneladas han aumentado aún más:

han pasado en el mismo periodo de tiempo de 15.952.659 toneladas a 27.349.214 toneladas, en

total 11.396.555 toneladas más que la producción anual de China y Turquía juntas.

1.2. Maduración del melón: frutos climatéricos y no climatéricos

La maduración de los frutos es un proceso fisiológico altamente complejo y de gran relevancia para

la planta, en el cual cambios bioquímicos dan lugar a cambios de color, aroma, estructura, etc.,

hasta desembocar en el completo desarrollo del fruto maduro. Es por ello por lo que requiere un

gran gasto de energía y recursos que tendrán como desenlace la perpetuación de la especie, con el

paso de estos genes a las siguientes generaciones (Vegas, 2014).

Los frutos en general se pueden clasificar a grandes rasgos en dos grupos: frutos climatéricos y no

climatéricos. El fundamento de esta clasificación se basa en su conducta de respiración y la

presencia de producción autocatalítica de etileno, o ausencia de esta, durante el proceso de

Figura 1.1.2. Cantidad media de producción de melones, incluidos cantalupos, por países

del año 1994 a 2018, con datos específicos de 2018 (FAOSTAT, 2018).



UPC - BarcelonaTech

maduración. Posibles ejemplos de frutos climatéricos serían el tomate (Solanum lycopersicum),

melocotón (Prunus persica), aguacate (Persea americana), manzana (Malus x domestica), etc., los

cuales se caracterizan de un pico de respiración y una producción de etileno al comienzo de la

maduración. Por otro lado, algunos ejemplos de frutos no climatéricos, los cuales no demuestran

un incremento en la producción de etileno o respiración mientras maduran, podrían ser el pimiento

(Capsicum annuum), fresas (Fragaria x ananassa), uvas (Vitis vinifera), etc. (Nuñez-Palenius et al.,

2008; Pereira, 2018). En el caso del melón, ambos tipos de maduración coexisten en su especie,

teniendo como ejemplo de frutos climatéricos los de la tipología Cantalupensis y como ejemplo de

no climatéricos los de la tipología Inodorus.

La ruta biosintética del etileno está causada por dos enzimas. Primero se produce la conversión de

s-adenosil-L-medionina (SAM) en ácido aminociclopropano-1-carbocílico (ACC) mediante la encima

ACC sintasa (ACS) y luego se produce la segunda conversión de ACC en etileno por ACC oxidasa

(ACO) (Pereira, 2018; Vegas, 2014).

En el caso se los frutos no climatéricos no se aprecia un pico de producción de etileno o de

respiración durante la maduración, si no al contrario, la maduración se produce de manera

paulatina. En los frutos no climatéricos la hormona que juega un papel muy importante en la

maduración es el ácido abscísico o ABA. La fresa se ha considerado un modelo de comportamiento

no climatérico en frutos. (Pereira, 2018).

Durante la maduración, el fruto padece numerosos cambios fisiológicos y bioquímicos y estos

cambios son comunes en múltiples especies. El mesocarpio se ablanda por la degradación de la

pared celular, el almidón se transforma en azúcares, degradación de clorofila, se comienzan a

acumular azúcares solubles, carotenoides y pigmentos, ácidos orgánicos, volátiles y metabolitos

secundarios. El mayor componente de los azúcares solubles de los melones maduros son sacarosa,

fructosa y glucosa, aunque la diferente proporción de estos azúcares hace que el sabor cambie

entre melones. Muchos de los cambios que sufren los frutos están relacionados con las

características organolépticas de cada variedad, ya que algunos presentan una proporción

diferente, y estas características también varían dependiendo de la especie (Burger et al. 2006,

Vegas, 2014).


El sabor y aroma son consecuencia del equilibrio en la acumulación de muchos compuestos,

directamente relacionados con la acumulación de azúcares durante el proceso de maduración del

fruto, lo cual significa un sabor más dulce, así como la acumulación de carotenoides, lo cual conlleva

al color de la pulpa. Estos son puntos muy relevantes en la mejora genética del fruto del melón

(García-Mas et al. 2012).

1.3. Mapeo de genes

El objetivo del mapeo de genes es identificar el locus de un gen, posicionándolo en el genoma y

conocer la distancia entre distintos genes mediante el uso de marcadores moleculares. Los QTLs o

quantitative trait locus, son loci que están asociados a la expresión de fenotipos de carácter

cuantitativo y se pueden mapear en el genoma gracias al uso de marcadores moleculares que se

relacionan con los caracteres observados.

Los marcadores moleculares son herramientas biotecnológicas muy útiles a la hora de crear un

mapa de genes. Son fragmentos específicos de ADN los cuales pueden ser identificados en el

genoma ya que se encuentran en loci concretos. Hay diversos tipos de marcadores moleculares y

diferentes clasificaciones. Si se mira desde el punto de vista de la variación genética que detectan,

hay marcadores de SNPs (polimorfismos de nucleótido único o single nucleotide polymorphism), de

Indels (deleciones o inserciones de pares de bases, de 1 a cientos de pares) o de VNTR (número de

repeticiones en tándem o variations in the number of tandem repeats). Por otro lado, otra

clasificación de los marcadores moleculares sería por la técnica molecular usada; RAPDs

(amplificación aleatoria de ADN polimórfico o random amplification of polymorphic DNA), AFLPs

(polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados o Amplified fragment length

polymorphism), RFLPs (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción o restriction

fragment length polymorphism) o SSCPs (polimorfismos de conformación de cadena simple o Single

stranded conformation polymorphism) entre otros (Vignal et al., 2002).

El tipo de marcador molecular que fue utilizado para llevar a cabo este proyecto son los SNPs (Figura

1.3.1). Los SNPs son cambios de un sólo nucleótido en la secuencia de ADN en la misma posición

entre individuos de la misma especie, y por tanto son bialélicos. Para que esa variación se considere

un SNP, el alelo menos frecuente debe tener una recurrencia de aparición mayor o igual al 1%

(Ahmadian et al., 2000; Marth et al. 1999).



UPC - BarcelonaTech

Las poblaciones con las que se puede trabajar para hacer mapas genéticos, dependiendo del

objetivo a esclarecer, son poblaciones segregantes F2, líneas puras recombinantes o RILs

(Recombinant inbred lines), líneas doble haploides o los retrocuzamientos o backcrossing entre

otras. Gracias a estas poblaciones se han estudiado resistencias a plagas, calidad del fruto… y se ha

comprendido el papel de estas en la planta (Pereira et. al, 2018; Luan et. al, 2010; Boissot et. al,

2010; Eduardo et. al, 2005; Castro et. al, 2019; Shaid et. al, 2018; Vegas, 2014).

En este proyecto, el mapeo genético ha servido para comprender el funcionamiento y regulación

de la maduración del fruto del melón. Se logra obtener esta información trabajando con diferentes

poblaciones de mapeo y el estudio de sus genotipos y fenotipos. Para el genotipado de SNP existen

varios métodos y por tanto varias herramientas tecnológicas al abasto.

Durante este proyecto la tecnología elegida para genotipar los SNP fue la PCR alelo específica

mediante la química PACE2.0™. La química PACE2.0™ consta de un Assay Mix, que tiene dos

cebadores, o forward primers, de alelos específicos y un cebador común, o reverse primer común,

y un Master Mix, el cual contiene los elementos necesarios para llevar a cabo la PCR y generar la

fluorescencia específica. Durante el proceso de hibridación y elongación de la PCR se produce la

fluorescencia. Cuando se trata de un SNP homocigoto, solo será visible un color de las dos señales

Figura 1.3.1. Representación gráfica de un marcador molecular tipo SNP.


fluorescentes y, por el contrario, si es un alelo heterocigoto, se generarán ambas fluorescencias.

Con esta herramienta se consiguió un gráfico en el que se distinguía los tres posibles resultados:

alelo X (azul), el alelo Y (verde) o ambos (híbrido, rojo). Funciona de una manera muy similar a

herramientas de las marcas KASP™ (Integrated DNA Technologies, 2020).

Figura 1.3.2. Representación gráfica del funcionamiento de las sondas de KASPar™ para

el genotipado de SNP con fluorescencia (Yuan et al. 2014).



UPC - BarcelonaTech

1.4. Avances previos y contexto

Los antecedentes del proyecto de mapeo fino de ETHQV8.1 están basados en los estudios

realizados en el centro de investigación Centre for Research in Agrigultural Genomics (CRAG) e

Institute of Agrifood Research and Technology (IRTA) realizados por Jordi García Mas y su grupo de

investigación. Por otro lado, los antecedentes del proyecto de mapeo de MAK_10-1 están basados

en los estudios realizados en el Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP) junto

con la Universitat Politèctica de València (UPV) y el CSIC, realizados por Antonio J. Monforte y su

grupo de investigación.

Respecto al primer proyecto, con el objetivo de identificar los QTLs relacionados con la calidad del

fruto, se desarrolló una población de RILs entre dos líneas parentales de melón Piel de Sapo (PS) y

Védrantais (Ved). Se utilizó un mapa genético basado en GBS (genotyping-by-sequencing) con el

cual se detectaron varios QTLs relacionados con la producción de etileno, la maduración temprana,

el aroma y la capa de abscisión entre otros. Uno de los QTLs importantes que fueron hallados para

maduración, fue el QTL mayor ETHQV8.1 relacionado con casi todos los rasgos estudiados, que

contenía 14 genes en un intervalo de 154 kb. También se encontraron otros QTLs que contribuyen

en menor medida a la maduración. Esta población fue cultivada en el invernadero de Torre

Marimón (Caldas de Montbui, Barcelona).

Los melones obtenidos presentaban segregación para las características climatéricas, como

formación de capa de abscisión, cambio de color, producción temprana de etileno y aroma,

degradación de clorofila.

Una vez obtenidas las RILs y comprobando que los caracteres de maduración climatérica tenían una

alta relación con el QTL ETHQV8.1 en el cromosoma 8, se prosiguió con el mapeo fino, creando ILs

con introgresiones de PS en fondo Ved. Posteriormente se obtuvo una F2 con la que poder

proseguir la investigación y clonar los genes responsables (Pereira, 2018).

Respecto al segundo proyecto, con el objetivo de mejorar la calidad del fruto y su longevidad útil,

se trabajó con una línea proveniente de una colección de ILs con el parental recurrente Ved y

parental donante Makuwa (Mak), una variedad asiática con características de maduración menos

climatéricas. La IL MAK_10-1 cuenta con características muy similares a Ved, a excepción de la falta


de capa de abscisión (Abscission layer o AL) y aroma en el momento de la maduración, lo cual hace

que tenga una ventaja comercial debido a que el fruto se mantiene en planta.

La IL MAK_10-1 tiene una introgresión de Mak en el cromosoma 10 en fondo Ved, la cual altera el

proceso de maduración del fruto, el QTL MAK_10-1. Esta línea se seleccionó de la generación BC3S1

mediante marcadores tipo SNP muy distribuidos a lo largo del genoma. Las líneas fueron

autopolinizadas y fenotipadas. Esas semillas fueron enviadas al CRAG para continuar con la

investigación sobre la maduración del fruto del melón (Perpiñá et al., 2017).



UPC - BarcelonaTech

OBJETIVOS


2. OBJETIVOS

El objetivo general de este trabajo de final de grado fue realizar el mapeo fino de dos Quantitative

Trait Loci (QTL) de melón (Cucumis Melo L.) con el fin de entender el funcionamiento y regulación

de la maduración climatérica de los frutos. Ambos QLTs fueron detectados a partir del cruce de

variedades con distintos tipos de maduración: Piel de Sapo (no climatérico) x Védrantais (altamente

climatérico) (QTL ETHQV8.1) y Makuwa (levemente climatérico) x Védrantais (QTL MAK_10-1).

Con el fin de alcanzar el objetivo general, se establecieron objetivos específicos para cada QTL, los

cuales fueron:

• Mapeo fino de ETHQV8.1:

o Obtención de plantas homocigotas recombinantes en el QTL ETHQV8.1 en la

población F3 de PS8.2 x VED.

o Determinar y acotar la región del QTL ETHQV8.1 asociada al fenotipo estudiado la

maduración climatérica del fruto.

o Identificar los genes candidatos causantes del fenotipo observado.

• Mapeo fino de MAK_10-1:

o Buscar recombinantes en el QTL MAK10-1 en la población F2 de Mak10-1 x VED

o Determinar y acotar la región del QTL MAK10-1 asociada al fenotipo estudiado la

maduración climatérica del fruto.

o Identificar los genes candidatos causantes del fenotipo observado.



UPC - BarcelonaTech

MATERIALES Y MÉTODOS


3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Material vegetal

El material vegetal del que se partió al principio del estudio vino de una población F3 proveniente

del cruce de la línea de introgresión PS8.2 x Ved para el proyecto de mapeo fino de ETHQV8.1; y de

una población F2 proveniente del cruce de la línea de introgresión MAK_10-1 x Ved para el proyecto

de mapeo fino de MAK_10-1.

Para el primer proyecto, se germinaron semillas F3, provenientes de una selección de 9 plantas F2

recombinantes en el intervalo del QTL ETHQV8.1. En total se germinaron 48 plantas de cada una de

las 9 familias a estudiar y 8 de cada una de las líneas parentales de la población (PS8.2 y Ved),

utilizadas como controles. Para el segundo proyecto, QTL MAK_10-1, se germinaron 384 semillas

F2, provenientes del cruce MAK_10-1 x Ved. El procedimiento para la germinación, genotipado y

trasplante de ambos proyectos se realizó siguiendo las mismas pautas.

Primero se trataron las semillas con Merpan, un antifúngico para evitar colonización de hongos en

las mismas, durante aproximadamente 2 minutos en una placa de Petri, agitándola ligeramente

para asegurar que todas semillas quedaran impregnadas. A continuación, se aclararon con agua, se

colocaron en una placa de Petri con papel de filtro humedecido y se cerró la placa con parafilm. Se

pusieron en una cámara de germinación cuyas condiciones son de 28 °C con un fotoperiodo de 12

horas de luz y 12 horas de oscuridad, durante 3 días.

Una vez germinadas, se seleccionaron las más desarrolladas para trasladarlas al invernadero del

centro, en unos tiestos biodegradables (Fertipots) con una proporción de 1:3:1 de perlita, sustrato

B y vermiculita, respectivamente. El crecimiento de las plántulas se monitorizó durante dos

semanas (Figura 3.1.1), tras las cuales se extrajo el DNA de hojas jóvenes y se genotiparon para

poder elegir qué plantas se trasladarían al invernadero de Torre Marimón unas semanas después.

En el caso del proyecto ETHQV8.1, tras el genotipado, se seleccionaron las plantas homocigotas

recombinantes, con una región del QTL fijada para el alelo Ved y la otra región fijada para el alelo

Piel de Sapo (PS). En el caso del proyecto MAK_10-1 se seleccionaron las plantas recombinantes

entre los marcadores flanqueantes del QTL, tanto en homocigosis como en heterocigosis. Como



UPC - BarcelonaTech

controles se seleccionaron plantas homocigotas o heterocigotas para los alelos Ved y Mak en toda

la región.

En el invernadero de Torre Marimón, la disposición de las plantaciones se hizo de manera vertical

para que las plantas pudieran trepar por la malla de sujeción y así tener una distribución más

eficiente del espacio. Se crecieron en condiciones de invernadero en Caldas de Montbui desde la

semana del 11 de mayo hasta su cosecha en verano.

Figura 3.1.1. Plántulas de los parentales PS y Ved en el invernadero del CRAG.

Figura 3.1.2. Disposición vertical de las plantas del melón en Torre Marimón, Caldas de

Montbui, a principios de julio.


De 3 a 4 semanas después de su plantación en el invernadero, las plantas ya empezaron a producir

flores femeninas y a mediados de junio se empezó la autopolinización de manera manual. La

polinización se realizó a diario, polinizando una flor femenina al día y dejando, como mucho, 3 flores

femeninas polinizadas en cada planta, para de esta forma favorecer el cuajado de frutos (Figura

3.1.3). Todas las plantas del experimento fueron autopolinizadas y, para evitar que hubiese

cruzamiento con otras plantas cercanas, las flores polinizadas se taparon con bolsas de papel

durante los primeros días después de la fecundación y se etiquetaron con la fecha y el cruce

realizado (en este caso autopolinización). Cuando se veía que la flor había cuajado, se retiraba la

bolsa. Por otro lado, cuando la flor era abortada, se cortaba y se volvía a proceder a la polinización.

Se fueron podando semanalmente para evitar que las plantas se enredaran entre ellas y para

potenciar el crecimiento óptimo de la cosecha. Al final de esta, cuando los melones habían crecido

significativamente, se fue reduciendo el riego para evitar el cracking, el cual afecta al fenotipado de

los frutos.

Figura 3.1.3. Fotografía del procedimiento de autopolinización manual con espátula. A:

Flor masculina de la planta. B: Flor femenina de la planta.



UPC - BarcelonaTech

3.2. Extracción de ADN

Se realizaron dos tipos diferentes de extracción de ADN, dependiendo del momento del

experimento y del objetivo. Tanto para el proyecto ETHQV8.1 como para el proyecto MAK_10-1 se

realizó primero una extracción rápida de ADN, de esta manera se pudieron genotipar y llevar las

plantas de interés al invernadero en el menor tiempo posible. Una vez plantadas allí se realizó la

extracción de ADN tipo Doyle para genotipar con todos los marcadores dentro del QTL.

En el primer caso (proyecto ETHQV8.1) se utilizaron todos los marcadores involucrados

(flanqueantes de las recombinaciones y internos) en el QTL con la extracción rápida. En el segundo

caso (proyecto MAK_10-1) se utilizó dicha extracción rápida sólo con los marcadores flanqueantes

del QTL para la búsqueda de recombinantes. En este caso, la extracción Doyle se realizó a posteriori

sobre las plantas de invernadero con todos los marcadores intermedios, lo que permitió localizar

los puntos de recombinación.

3.2.1. Extracción de ADN rápida

Se recolectó material vegetal de hoja joven de todas las plantas. Se colocó una bola de tungsteno

dentro de cada tubo con muestras, 96 tubos en total. Se agregaron 57 μl de NaOH 0,3 M a cada

muestra. Se molieron las muestras con el Mixer Mill durante 30 segundos a 30 Hz. Se incubaron los

tubos de muestras a 96 °C durante 1 minuto. A continuación, se agregaron 200 μl de Tris-HCl 0,75M

(pH= 7,5-7,8), se centrifugó a 3.000 g durante 1 minuto y se transfirió el sobrenadante a otra placa

y se guardaron a 4 °C (Lu et al. 2020).

Figura 3.2.1.1. Representación del proceso de extracción de ADN a partir de una hoja de

melón (Areco, 2019).


3.2.2. Extracción de ADN tipo Doyle

Se recolectó material vegetal de hoja joven de todas las plantas. Se colocó una bola de tungsteno

dentro de cada tubo con muestras, 96 tubos en total. Se agregaron 340 μl de CTAB en cada tubo

para la trituración de las muestras con el Mixer Mill y a continuación se hizo un spin de todas las

muestras, para precipitar el contenido, las cuales fueron posteriormente incubadas a 65 °C durante

30-45 minutos. Se añadieron 340 μl de cloroformo: ácido isoamilico 24:1 y se mezcló por inversión,

con una posterior centrifugación durante 10 minutos a 3.000 rpm. Se recuperaron 200 μl del

sobrenadante, se agregaron 200 μl de isopropanol a temperatura ambiente y se mezcló por

inversión varias veces, seguido de una centrífuga durante 30 minutos a 3.000 rpm. Se desechó el

sobrenadante y se agregó 200 μl de etanol 70% a 20 °C, seguido de otra centrifugación durante 10

minutos a 3.000 rpm. El sobrenadante se desechó y se secaron las muestras precipitadas a

temperatura ambiente. Se añadieron 50 μl de agua ultra pura antes de poner las muestras durante

toda la noche en la nevera. Posteriormente fueron guardadas en un congelador a -20 °C.

3.3. Genotipado

En el caso de ambos proyectos, ETHQV8.1 y MAK_10-1, se llevaron a cabo los mismos pasos para

el genotipado. Para el diseño de los primers fue necesario tener la secuencia flanqueante de SNP,

más o menos 100 pb. Se diseñaron y encargaron los primers. Se realizó la extracción de ADN en

placa, la muestra se diluyó 1:5 o 1:15, dependiendo del método de extracción. La Master Mix se

puso en un Eppendorf protegida de la luz y en hielo. Se repartieron en cada pocillo de la placa óptica

5 μl de la mezcla (5 μl de MasterMix de PACE2.0™, con fluorescencia específica en los óligos para

los diferentes alelos y 0,138 5 μl de PACE2.0™ Assay). Se añadió en cada pocillo 5 μl de ADN

correspondiente y se selló la placa con un film autoadhesivo, en total 96 pocillos, y llevarla al

termociclador (Tabla 3.3.1).



UPC - BarcelonaTech

Se ajustaron los parámetros adecuados en el programa (Tabla 3.3.2) y el resultado se analizó

mediante el programa LightCycler de Roche (Figura 3.3.1).

Componentes para placa de 96 pocillos Volúmenes (μl)

MasterMix de PACE2.0™ 2x (stock concentration) 5 μl PACE2.0™ Assay (primers) 0,138 μl

ADN genómico 5 μl

TOTAL 10 μl/pocillo

Tabla 3.3.1. Especificación de parámetros utilizados para el genotipado en placa de 96

pocillos.

Figura 3.3.1. Interfaz del programa LightCycler donde aparecen en los dos ejes

información sobre los alelos presentes en las muestras de ADN: alelo X (azul), el

alelo Y (verde) o ambos (híbrido, rojo).


Nombre de la fase

Ciclos Temperatura

(°C) Tiempo

(minutos) Ramp rate Cuantificación

Hot-start 1 94 00:15:00 4,4 Ninguna

Touch-down

10 94 00:00:20 4,4 Ninguna

65 00:01:00 2,2* Ninguna

PCR 35 94 00:00:20 2,2 Ninguna

57 00:01:00 2,2 Ninguna

Read plate 1 37 00:01:00 2,2 Ninguna

37 00:00:01 4,4 Una

Nombre de la fase

Ciclos Temperatura

(°C) Tiempo

(minutos) Ramp rate Cuantificación

Acquisition 1 57 00:00:01 2,2 Una

3.4. Fenotipado

En el caso de ambos proyectos, ETHQV8.1 y MAK_10-1, se llevaron a cabo los mismos pasos para

fenotipado, el cual se realizó de dos maneras: en planta en el invernadero durante la cosecha y en

el laboratorio, una vez recogido el fruto.

El fenotipado en planta consistió en medir a diario cuantitativamente el aroma (EARO), después de

la polinización (days after pollination, DAP) cuando aparecía este carácter. El cambio de color (ECD),

aparición de la capa de abscisión (EALF), nivel de capa de abscisión en el momento de la recolecta

(ABS), la cual se media en una escala del 0 al 3 dependiendo de si caía de la planta el fruto (3) o se

tenia que cortar (1 o 2) teniendo en cuenta la profundidad de la capa y día de recolecta (HAR).

En el fenotipado de laboratorio se pesó cada fruto, se fotografió por delante, detrás y arriba cada

melón, se escaneó una de las mitades del fruto y se anotó la resolución utilizada en el escáner. Se

analizó cada mitad de melón con el programa Tomato Analyzer (Darrigues et al. 2008 ) para obtener

medidas del contorno y del color de la pulpa. Se midió también la concentración de azúcares en la

Tabla 3.3.2. Tabla de parámetros para el genotipado PACE2.0™. *Además de estos

parámetros, hay que ajustar Sec Target (°C) = 57 y Step Size (°C) = 0,8.



UPC - BarcelonaTech

pulpa de cada fruto. Para ello se tomó un poco de pulpa, se exprimió encima del refractómetro y

se anotó cada medida como grados Brix (°Bx). Se midió la firmeza de la pulpa (en kg/cm2) mediante

un penetrómetro tomando 4 puntos diferentes y equidistantes del melón. Por último, se tomó

muestra de pulpa y corteza y se congelaron en nitrógeno líquido.

3.5. Mapeo fino de los QTLs

Para el mapeo fino de los QTLs de ambos proyectos, se utilizaron marcadores moleculares de tipo

SNP para genotipar la zona en ambos cromosomas y que sirvieron para hacer el test de progenie

(proyecto ETHQV8.1) y el análisis de recombinantes (proyecto MAK_10-1) (Pereira, 2018; Vegas,

2014).

Para el QTL ETHQV8.1 se utilizaron 15 marcadores SNP mientras que para el QTL MAK_10-1 se

utilizaron 12.

Figura 3.4.1. Crecimiento del melón en Torre Marimón.



proyecto ETHQV8.1. PS: Piel de Sapo; Ved: Védrantais.

Marcador Cromosoma SNP

PS/Ved Posición bp

V3.6.1

Chr8_9603217

8

G/A 9.603.217

Chr8_9628485 C/T 9.628.485

Chr8_9630609 C/T 9.630.609

Chr8_9632267 G/A 9.632.267

Chr8_9634968 T/C 9.634.968

Chr8_9638241 G/A 9.638.241

Chr8_9643649 T/C 9.643.649

Chr8_9651404 G/A 9.651.404

Chr8_9663583 G/A 9.663.583

Chr8_9676828 C/T 9.676.828

Chr8_9681370 G/C 9.681.370

Chr8_9683615 A/G 9.683.615

Chr8_9688516 T/C 9.688.516

Chr8_9693668 G/A 9.693.668

Chr8_9717281 A/C 9.717.281


proyecto MAK_10-1. Mak: Makuwa; Ved: Védrantais.

Marcador Cromosoma SNP

Ved/Mak Posición bp v3.6.1

S10_423142

10

G/A 424.008

S10_895810 C/T 896.478

S10_899379 T/A 900.046

S10_1010796 T/C 1.011.682

S10_1398632 A/G 1.398.814

S10_1415860 T/A 1.416.361

S10_1499219 A/G 1.499.662

S10_1806176 A/G 1.806.548

S10_1879648 A/T 1.880.060

S10_2044171 C/T 2.044.564

S10_2124809 C/T 2.125.186

S10_2206450 C/A 2.206.788



UPC - BarcelonaTech

3.6. Análisis de datos

Para el análisis de datos se realizaron múltiples T-test de dos muestras asumiendo que las varianzas

son iguales (T-test: two-Sample Assuming Equal Variances). El análisis se realizó para diversos

fenotipos asociados con la maduración, tanto para el proyecto de ETHQV8.1 como para MAK_10-

1. Además, para el análisis del proyecto ETHQV8.1, al comparar más de dos grupos, se realizó la

corrección de Bonferroni para múltiples comparaciones. El análisis se realizó mediante dos

programes informáticos R Studio, Excel y Minitab.


RESULTADOS Y DISCUSIÓN



UPC - BarcelonaTech

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. Proyecto ETHQV8.1

4.1.1. Genotipado de los recombinantes

Para la realización del genotipado de las plantas del proyecto ETHQV8.1, se llevó a cabo la

extracción rápida de DNA, la cual ha sido descrita en el apartado 3.2.1. La utilización de los

marcadores tipo SNP, tanto los flanqueantes del QTL como internos en la región del QTL (Tabla

3.5.1), fue esencial para poder obtener el genotipado completo de todas las líneas utilizadas en el

proyecto y seleccionar las plantas necesarias para el ensayo.

La segregación de marcadores en la F3 se evaluó a través del genotipado (Tabla 4.1.1.1). Se

esperaba una segregación mendeliana 1:2:1 para cada marcador al genotipar la progenie de las 9

plantas F2 recombinantes seleccionadas el año 2019. De 48 plantas genotipadas de cada una de las

9 familias F3, en total 432 plantas, se seleccionaron las plantas con genotipo homocigoto PS o Ved,

según interese para obtener plantas con una región del QTL homocigota para un alelo y el resto

homocigoto para el alelo contrario. Finalmente se obtuvieron un total de 82 plantas para el test de

progenie (Tabla 4.1.1.1).

Se llevaron entre 10 y 6 plantas por línea, hasta un total de 72 plantas al invernadero en Torre

Marimón. Se comprobó que la segregación se ajustaba a lo esperado mediante una prueba Chi

cuadrado y que sí seguía las leyes mendelianas. Para todas las pruebas Chi cuadrado realizadas, una

para cada una de las líneas, se obtuvieron valores-P superiores a 0,05 a excepción de la prueba

correspondiente a la línea R79 (el valor crítico de Chi cuadrado con dos grados de libertad y nivel

de significación del 5% es igual a 5,9915). Para la línea R79 se obtuvo un valor-P igual a 0,006. No

obstante, tomando en consideración la corrección de Bonferroni para ampliar el rango de

aceptación del conjunto de pruebas realizadas, el nuevo valor de significación individual de una

prueba calculado aplicando esta corrección es 0,05/9=0,0055, por lo cual el valor-P de 0,006 de la

R79 tampoco sería significativo (el valor crítico de Chi cuadrado con dos grados de libertad y nivel

de significación del 0,05% es 10,5966 y el valor calculado para esta prueba del R79 es 10,3636).


Con todo ello se puede mantener la hipótesis de que la segregación se ajustaba a lo esperado por

las leyes mendelianas (1:2:1), con proporciones poblacionales de 25%-50%-25% (Anexo A).

Tabla 4.1.1.1. Número de plantas seleccionadas del total de plantas genotipadas de las 9

familias F3 del proyecto ETHQV8.1.

Línea Número de plantas recombinantes seleccionadas

R5 10

R14 6

R15 9

R17 10

R24 7

R42 11

R57 4

R68 9

R79 16

Total: 82 plantas recombinantes seleccionadas

Los resultados de genotipado de las plantas recombinantes se muestran en la Tabla 4.1.1.2.



UPC - BarcelonaTech

Líneas Replicas

Marcadores

9603

217

9628

485

9630

609

9632

267

9634

968

9638

241

9643

649

9651

404

9663

583

9676

828

9681

370

9683

615

9688

516

9693

668

9717

281

R68 8 V B B B B B B B B B B B B B B

R57 7 V V V V V V V V V V V V V B B

R24 6 V V V V V V V V V V V V V V B

R5 9 B V V V V V V V V V V V V V V

R14 6 B B B V V V V V V V V V V V V

R17 9 B B B B V V V V V V V V V V V

R79 10 B B B B B V V V V V V V V V V

R42 9 B B B B B B B B B B B B B V V

R15 8 B B B B B B B B B B B B B B V

VED 9 V V V V V V V V V V V V V V V

PS8.2 9 B B B B B B B B B B B B B B B

En el año anterior se realizó el primer fenotipado de esta colección, con los recombinantes en el

QTL ETHQV8.1, es decir, con zonas heterocigotas. Esos resultados preliminares eran principalmente

de la diferencia en los fenotipos de Ved y PS8.2 (parentales). A partir de estos datos se hizo un

Power Test, el cual indica el número de réplicas mínimas que debe tener el experimento para que

este salga significativo, suponiendo que las diferencias van a ser las mismas que las del año anterior

(de F2 a F3). Por este motivo, de cada grupo se eligieron 10 plantas por cada línea recombinante

para obtener 7 frutos. De los grupos de los cuales no se obtuvieron el número mínimo de

recombinantes se llevaron el máximo obtenido, en algunos casos fueron 6, 7 etc. (Tabla 4.1.1.2). En

el caso de los parentales, Ved y PS8.2, se llevaron a invernadero 9 de cada, ya que con esa cantidad

era suficiente para obtener resultados significativos y también porque, al ser líneas importantes

que también era parte de otros proyectos, ya había más réplicas en el invernadero.

Tabla 4.1.1.2. Test de progenie. Genotipado de los recombinantes y marcadores

utilizados para cada sección. B corresponde a genotipo PS para ese marcador, V

corresponde a Ved para ese marcador.


4.1.2. Fenotipado de los recombinantes

Para la realización del fenotipado de los frutos del proyecto ETHQV8.1, se elaboraron observaciones

tanto de los parentales como de las líneas, in situ en el invernadero cuando aún estaban en planta

los melones y en el laboratorio.

En el invernadero, una vez se polinizaron las plantas y los frutos cuajaron, se tomaron datos a diario

para verificar la aparición de caracteres como el aroma, capa de abscisión y cambio de color. Se

esperaba que los frutos presentaran una disminución del carácter típico de melones climatéricos;

aparición de capa de abscisión más tardía o sin esta, aparición del aroma más tardío, etc. Esto se

debe a que al tener introgresiones de Piel de Sapo (melones no climatéricos) en fondo Védrantais

(melón climatérico) se notarán cambios en el comportamiento climatérico.

Las medias de las observaciones de los melones del proyecto ETHQV8.1 están presentes en la Tabla

4.1.2.1.

EARO (DAP) (Días)

EARO* (Tipo de

maduración

ECD (DAP) (Días)

ECD* (Tipo de

maduración)

EALF (DAP) (Días)

EALF* (Tipo de

maduración)

HAR (Días)

HAR* (Tipo de

maduración)

FIR (kg/cm2)

FIR* (Tipo de

maduración)

R68 38.25 NC 34.75 I 37.75 NC 41.50 NC 3.68 NC

R57 31.57 C 31.71 C 31.71 C 36.14 C 1.52 C

R24 32.67 C 33.00 I 32.50 C 35.83 C 2.75 I

R5 32.22 C 32.67 C 32.56 C 35.22 C 2.23 I

R14 37.00 NC 37.60 NC 37.20 I 40.80 NC 4.05 NC

R17 35.56 NC 36.11 I 36.00 NC 38.44 NC 2.69 I

R79 34.20 C 34.40 I 34.40 C 39.30 NC 2.94 I

R42 35.56 NC 35.11 I 35.00 NC 39.11 NC 3.11 NC

R15 32.88 C 33.25 I 33.25 C 37.88 C 3.65 NC

VED 32.44 C 32.67 C 32.56 C 35.67 C 1.91 C

PS8.2 37.22 NC 36.89 NC 36.56 NC 41.00 NC 3.24 NC

Tabla 4.1.2.1. Resultado del fenotipado del aroma (EARO), cambio de color (ECD), aparición de la capa

de abscisión (EALF), día de recolecta (HAR) y firmeza (FIR). Valores medios de las medidas tomadas

en el invernadero para parentales y recombinantes, a excepción de FIR (firmeza) que fue tomada en

el laboratorio correspondientes al proyecto ETHQV8.1. *NC corresponde al fenotipo no climatérico

de PS8.2 para ese carácter, C corresponde al fenotipo climatérico de Ved para ese carácter e I

corresponde al fenotipo intermedio.



UPC - BarcelonaTech

Se observó que, en todas las líneas de introgresión, el genotipo en los marcadores Chr8_9628485

y Chr8_9630609 (Tabla 4.1.1.2), recuadrados en rojo, concordaban con el comportamiento más o

menos climatérico de los melones. Es decir, cuando en estos dos marcadores tenían genotipo PS

(Tabla 4.1.1.1), mayoritariamente las características fenotípicas de esa línea coincidían con PS8.2,

como es el caso de la R68, que para ambos marcadores el genotipo marcaba PS y para casi todos

los fenotipos observados (EARO, ECD, EALF, HARD y FIR) el comportamiento de dicha línea es PS8.2

(Tabla 4.1.2.1), correspondiente al código NC, color verde.

Esto ocurrió en todas las líneas, a excepción de los R15 y R79 que, siguiendo este orden de ideas,

deberían haber presentado comportamiento parecido a PS8.2 y en cambio presentaron un

comportamiento más propio de Ved, el resto de los recombinantes se comportaron más o menos

de la manera esperada (Tabla 4.1.2.1).

La figura presentada a continuación ilustra la información del fenotipo EALF, su distribución por

línea y similitudes con los parentales, las cuales coinciden mayoritariamente con el análisis

estadístico (Tabla 4.1.2.1). El resto de los fenotipos se encuentran en el Anexo B, de la Figura-B1 a

la Figura-B4.

Pudo verse la tendencia hacia el fenotipo de tipo Ved (izquierda de la línea roja) de las líneas R57,

R5, R24 y R15, mientras que las líneas R68, R42, R17 y R14 tuvieron tendencia hacia el fenotipo

Figura 4.1.2.1. Gráfica boxplot de la aparición de capa de abscisión (EALF) de las líneas

recombinantes y los parentales.


PS8.2 (derecha de la línea roja). La línea 79, como pasó en la evaluación estadística con las medias,

presenta un comportamiento casi intermedio entre ambos parentales. Estos resultados coinciden

con lo discutido anteriormente. Esta misma interpretación se hizo del resto de figuras presentes en

el Anexo B.

Teniendo en cuenta los valores medios de los fenotipos tomados, en el conjunto de cada línea se

pudo decir si de forma general (observando todos los fenotipos) estos caracteres (EARO, ECD, etc.)

se correspondieron o no con el fenotipo no climatérico de PS8.2 o climatérico de Ved.

Globalmente, los fenotipos observados en cada línea son: R68 no climatérica, R57 climatérica, R24

climatérica, R5 climatérica, R14 no climatérica, R17 no climatérica, R79 presenta un fenotipo

variable difícil de clasificar, R42 no climatérica y R15 climatérica. Los parentales Ved y PS8.2

correspondieron al fenotipo climatérico y no climatérico respectivamente, como cabía esperar.

Las imágenes correspondientes a las fotografías tomadas en el laboratorio de algunos de los

melones (parentales y recombinantes) están recogidas en el Anexo B, Figura-B5 y Figura-B6. No se

han incluido fotografías de todos los recombinantes porque, al tener características físicas visibles

muy similares, no se consideraron relevantes todas las imágenes para este trabajo.

4.1.3. Mapeo fino por asociación fenotipo-genotipo

Tras la selección de las plantas recombinantes con los caracteres fijados, comparamos el fenotipo

con el genotipo obtenidos a lo largo del proyecto. Por una parte, analizando estadísticamente cada

línea (Tabla 4.1.2.1) y por otra mapeando mediante marcadores moleculares tipo SNP. Los

marcadores SNP elegidos fueron los flanqueantes de las regiones recombinantes dentro de la

región de interés, en total 15 marcadores (Figura 4.1.3.2).

La región del QTL se encuentra a finales del primer tercio del cromosoma, que es donde se

diseñaron los marcadores.

Para el mapeo fino, por cada uno de los marcadores se agruparon todas las plantas con alelo B y

todas las plantas con alelo V (Anexo C, Tabla-C2) y se llevó a cabo la comparación de los dos grupos

a través de una prueba T o T-test, test estadístico t de Student para la comparación de dos medias

suponiendo varianzas iguales. A los valores P-value obtenidos para cada una de las pruebas

estadísticas aplicadas a cada fenotipo se les aplicó una transformación no lineal, el logaritmo

negativo en base 10 (-log10) con el fin de magnificar las diferencias entre estos valores P (todos ellos



UPC - BarcelonaTech

positivos e inferiores a 1). Aquellos valores P obtenidos en las pruebas T muy significativas, y que

eran los valores muy pequeños y próximos a cero se “engrandecieron” o aumentaron de forma

notable con la transformación -log10, convirtiéndose en los mayores valores, evidenciando la

distancia que consiguieron frente a valores más pequeños correspondientes a valores P mayores y

más cercanos a 1 (Anexo C, Tabla-C9). Con esta metodología de transformación de los valores P de

los T-test realizados se obtuvo una representación gráfica que permite transmitir los resultados del

análisis de los marcadores de forma visual e inmediata (Figura 4.1.3.1).

El QTL ETHQV8.1 se encuentra entre los marcadores Chr8_9603217 y Chr8_9717282 el cual se

acotó de 114 kb a 2,12 kb, dejando entre el segundo y tercer marcador los genes candidatos. Pudo

0

2

4

6

8

10

12

9580000 9600000 9620000 9640000 9660000 9680000 9700000 9720000 9740000

-lo

g10

de

P-v

alu

e

Posición de los marcadores

EARO

ECD

EALF

ABS

HAR

FIR

Figura 4.1.3.1. Representación en gráfica de los marcadores y sus posiciones (eje X) y el -log10

de los valores de las P-value correspondientes a los T-test realizados para cada fenotipo

(EARO, ECD, EALF y ABS) (eje Y) del QTL ETHQV8.1.


observarse que la capa de abscisión (EALF), el día de cosecha (HAR) y el aroma (EARO) son los

caracteres que están más estrechamente ligados con la maduración, los cuales fueron los tres

valores menores del log10 de los valores de P-value (los cuales en la Figura 4.1.3.1 corresponden a

los valores mayores, ya que se aplicó el cambio de signo -log10 de los valores de P-value). Los valores

máximos conseguidos, situado entre los marcadores Chr8_9628485 y Chr8_9630609, ilustraron

que la parte izquierda del QTL está asociada al fenotipo, mientras que la parte derecha no lo está.

Como entre el primer marcador, Chr8_9603217, y el marcador Chr8_9628485 hay una región muy

amplia, se podría añadirse un marcador más intermedio para acotarla, para verificar la relación de

ese sector del QTL con la maduración y ver con más claridad este “pico” de relación entre fenotipo-

genotipo del QTL ETHQV8.1.

Figura 4.1.3.2. Mapa físico la región de marcadores moleculares tipo SNP en el cromosoma 8

con las distancias respectivas entre sí. La región marcada en rojo, y destacada en

naranja, corresponde a los marcadores los cuales se vinculan más estrechamente

como los responsables de delimitar el locus relacionado con ETHQV8.1.



UPC - BarcelonaTech

4.1.4. Genes candidatos

Tras el análisis de marcadores moleculares tipo SNP, se llegó a acotar la zona del gen responsable

del QTL ETHQV8.1 relacionado con la maduración climatérica del melón. Se partió de 11 genes, 114

kb y se logró acotar la región a un total de 2 genes, 2,12 kb. A partir del análisis estadística, en el

que se evaluó la relación del genotipo con el fenotipo, se logró acotar aún más la cantidad de genes

que podrían ser responsables de la maduración climatérica en el QTL gracias al pico visible en la

Figura 4.1.3.1.

Los genes que se hallaron entre los marcadores con más relación estadística fueron el gen

MELO3C024521.2.1 (Histone-lysine N-methyltransferase SETD1B-like protein) y el gen

MELO3C024520.2.1 (ethylene-responsive transcription factor ERF024) (Figura 4.1.4.1).

El primero es un gen relacionado ampliamente con genes de diferentes organismos (Husmann et

al. 2019) y a veces relacionado con distintos tipos de cáncer, como los carcinomas (Chen et al.

2019), aunque también hubo un estudio en 2017 que lo relacionó con la determinación del sexo de

unos tipos de tortugas (Literman et al. 2017). El segundo gen, está relacionado con el etileno, la

hormona de plantas, el cual está asociado con la maduración de los frutos (Pereira et al. 2020).

Figura 4.1.4.1. Representación gráfica de los 2 genes candidatos que se encuentran en la

región del QTL analizado durante el proyecto, extraída de la web Melonomics, con la

región correspondiente entre los marcadores más ligados a los genes potencialmente

responsables de la maduración, Chr8_9628485 y Chr8_9630609.


Con la información encontrada de ambos genes de la región del QTL entre los marcadores

previamente nombrados, se encuentra una relación más probable entre la maduración climatérica

con el gen MELO3C024520, o ERF024, ya que es un factor de transcripción dependiente de etileno,

hormona involucrada en la maduración de muchos frutos, entre ellos el tomate (Zuo et al. 2020).

Por tanto, el gen candidato relacionado con la maduración climatérica en el proyecto del QTL

ETHQV8.1 sería el MELO3C024520 o ERF024.

4.2. Proyecto MAK_10-1

4.2.1. Genotipado de los recombinantes

Para la realización del genotipado de los frutos del proyecto MAK_10-1 se llevaron a cabo dos tipos

de extracción de ADN, las cuales están descritas en el apartado 3.2.

Al estar este proyecto una generación por detrás respecto al proyecto ETHQV8.1, las introgresiones

debían ser seleccionadas y comprobadas, ya que la homocigosidad de los alelos no estaba fijada

aún en este punto. De las plantas híbridas MAK_10-1 x Ved (cuyos antecedentes se explican en el

apartado Avances previos y contexto, 1.4) se obtuvo la F2 de este proyecto. Al trabajar con una

población F2, se esperaba obtener un número suficiente de plantas recombinantes para poder

realizar el mapeo fino.

La utilización de los marcadores tipo SNP flanqueantes del QTL en la región del cromosoma en la

que se esperaban ver recombinaciones de marcadores no fijados (Tabla 3.5.2), fue esencial para

poder obtener el genotipado completo de todos los recombinantes del proyecto.

Se germinaron 450 semillas, de las cuales se sembraron 384. De estas semillas se evaluó el genotipo

para elegir las recombinantes, 116 plantas en total. Se eligieron aquellas plantas en las cuales hubo

regiones recombinantes entre los marcadores flanqueantes correspondientes a V (homocigoto Ved

para el alelo), M (homocigoto Mak para el alelo) o H (heterocigoto) (Tabla 4.2.1.1).

Las plantas recombinantes que se llevaron a Torre Marimón fueron un total de 80, más los

parentales, un total de 102 plantas. La segregación de marcadores en la F2 se evaluó a través del

genotipado (Anexo C, Tabla-C11), puesto que es muy extensa, al contener recombinantes y los

parentales, Mak_10-1, Ved y el híbrido (H). Se obtuvieron recombinantes de Mak_10-1 e



UPC - BarcelonaTech

introgresiones heterocigotas, Ved e introgresiones heterocigotas, Ved e introgresiones Mak_10-1 y

una combinación de todo, dobles recombinantes.

Tabla 4.2.1.1. Tipos de recombinaciones en los alelos encontradas entre el marcador

S10_423142 y S10_2206450. * V corresponde a homocigoto Ved para el alelo, M

homocigoto Mak para el alelo, H heterocigoto para el alelo y ND corresponde a No

data. No fueron añadidos los parentales, dobles recombinantes ni la F1.

Con el número de recombinantes, en este caso 116, se pudo deducir la distancia genética en

centimorgans del QTL, entre los dos marcadores flanqueantes S10_423142 y S10_2206450 (Tabla

3.5.2). Se obtuvo un valor de 15 cM (los datos de cálculo se pueden ver en el Anexo D, cálculo de la

Líne

a

S10

_42

314

2

S10

_22

064

50

Líne

a

S10

_42

314

2

S10

_22

064

50

R1 V H R56 H V

R9 V H R57 H V

R4 ND H R58 H V

R19 V H R2 H H

R18 V H R59 M H

R17 V H R60 M H

R15 V H R62 M H

R21 V H R72 M H

R20 V H R65 H H

R7 V H R66 M H

R5 ND H R68 M H

R22 V H R70 M H

R25 V H R64 M H

R24 V H R67 M H

R28 V H R69 M H

R26 V H R71 M H

R29 V ND R75 ND H

R30 V H R76 M H

R34 V V R73 M H

R32 H V R74 M H

R33 ND V R77 M H

R35 H V R78 ND H

R36 H V R84 M M

R37 H V R87 M M

R39 H V R79 H M

R40 M V R80 H M

R105 H V R82 H M

R54 H V R88 H M

R42 H ND R89 H M

R46 H V R92 H M

R48 H V R99 H M

R41 H V R100 H M

R44 H V R90 H M

R49 H V R94 H M

R50 H V R98 H M

R51 H V R102 H M

R23 H H R103 ND M

R52 H V R111 H M

R53 H V


distancia genética del QTL MAK_10-1) para una distancia física de 1.782.780 pb (1,78 Mb). Se

calculó una recombinación total de 8,47 cM/Mb, lo cual concuerda con la bibliografía (Pereira,

2018) ya que la tasa de recombinación tiene el mismo orden de magnitud, sus resultados fueron

4,4 cM/Mb de recombinación media en el cromosoma 10.

Estas plantas recombinantes fueron trasladadas a Caldas de Montbui para continuar con el

experimento.

4.2.2. Fenotipado de los recombinantes

Para la realización del fenotipado de los frutos del proyecto MAK_10-1, como en el proyecto

ETHQV8.1, se realizaron observaciones tanto de los parentales como los recombinantes, in situ en

el invernadero, cuando aún estaban en planta los melones, y después en el laboratorio.

En el invernadero, una vez se polinizaron las plantas y los frutos cuajaron, se tomaron datos a diario

para verificar la aparición de caracteres como el aroma, capa de abscisión y cambio de color. Se

esperaba que los frutos presentaran una disminución del carácter típico de melones climatéricos;

como una aparición más tardía de la capa de abscisión o el aroma. Esto se debe a que al tener

introgresiones de Makuwa (melones poco climatéricos) en fondo Védrantais (melón climatérico) se

notaran cambios en el comportamiento climatérico.

Las imágenes correspondientes a los fenotipos están recogidas en el Anexo B, de la Figura-B7 a la

Figura-B10. No se han incluido fotografías de todos los recombinantes porque, al tener

características físicas visibles muy similares, no se consideraron relevantes todas las imágenes para

este trabajo.

Los fenotipos observados fueron en su gran mayoría intermedios, puesto que todos los

recombinantes eran heterocigotos, sin alelos fijados y con el hecho de Makuwa ser un melón con

características levemente climatéricas, fue difícil distinguir claramente comportamiento climatérico

y no climatérico.

Se realizó la media de los fenotipos de los parentales para tener una guía de tendencia de los

fenotipos en los recombinantes y un T-test para evaluar si existían diferencias significativas entre

los parentales Ved y Mak. Estos valores están recogidos en las Tabla 4.2.2.1 y Tabla 4.2.2.2.



UPC - BarcelonaTech

Tabla 4.2.2.1. Medias de los fenotipos de los parentales (Ved y Mak) y los rangos de los

fenotipos para los recombinantes.

Tabla 4.2.2.2. Resultados del T-test para los fenotipos de Ved vs Mak.

Estas dos tablas sirvieron para conocer los fenotipos de los parentales, los cuales eran los únicos

con todos los alelos homocigotos, y para visibilizar el rango de valores de cada fenotipo de los

recombinantes con los que se trabajó. Algunos recombinantes tuvieron valores de cada fenotipo

más cercanos a Ved o Mak_10-1, mientras que otros tuvieron valores intermedios, los cuales fueron

más difíciles de categorizar entre los dos parentales.

Los T-test comparando los fenotipos de ambos parentales para ver diferencias significativas dio

como resultado que, como se observa en la Tabla 4.2.2.2, todos los valores del test dan por debajo

del valor de alfa elegido (𝛼 = 0,05) por lo tanto, se deduce que son entre ellos significativamente

diferentes, a excepción de el fenotipo SSC, el cual tiene un valor superior a alfa (0,832>0,05).

También se seleccionaron los individuos recombinantes que para el primer marcador flanqueante

tenían alelo homocigoto V o M. De esta manera se pudo hacer una división entre individuos con

fenotipo no climatérico e individuos con fenotipo climatérico para correlacionar el alelo V o M con

estos.

Se obtuvo un gráfico para los fenotipos EARO (aroma) y FIR (firmeza) ya que fueron los dos fenotipos

más relacionado con el comportamiento de los frutos.

Medias de parentales EARO ECD EALF ABS HAR SSC FIR

Ved 33.80 34.20 33.80 2.60 37.00 7.22 2.66

Mak 41.11 39.00 38.89 1.00 43.78 6.97 4.44

Rango mínimo de los

recombinantes30 31 30 1 31 3 1.5

Rango máximo de los

recombinantes46 44 41 3 46 10.6 5.75

T-test entre parentales EARO ECD EALF ABS HAR SSC FIR

Ved vs Mak 4.61E-05 1.27E-03 2.96E-05 1.02E-06 3.67E-06 8.32E-01 3.39E-03


Figura 4.2.2.1. Representación gráfica de los valores de EARO en días para los

recombinantes. *Los números en el eje X representan los recombinantes en el orden

que aparece en la Tabla 4.2.2.3.

Tabla 4.2.2.3. Resultados del fenotipo EARO de los recombinantes y su genotipo. *Los

valores de líneas ordenadas corresponden a su respectivo recombinante.

30

32

34

36

38

40

42

44

46

48

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

EAR

O (

día

s)

Individuos recombinantes

Líneas

ordenadasLíneas EARO S10_423142

1 R28 30 V

2 R94 30 M

3 R23 31 V

4 R29 31 V

5 R3 32 V

6 R30 32 V

7 R79 32 V

8 R21 33 V

9 R9 33 M

10 R7 33 M

11 R22 34 V

12 R17 35 V

13 R32 35 M

14 R89 35 M

15 R54 36 V

16 R41 37 M

17 R2 38 M

18 R82 38 M

19 R58 39 V

20 R98 39 V

21 R51 39 M

22 R72 39 M

23 R70 39 M

24 R99 40 V

25 R76 40 V

26 R20 40 M

27 R62 41 M

28 R106 42 M

29 R66 42 M

30 R46 43 M

31 R73 43 M

32 R69 44 M

33 R114 45 M

34 R113 46 V



UPC - BarcelonaTech

Figura 4.2.2.2. Representación gráfica de los valores de FIR en días para los

recombinantes. *Los números en el eje X representan los recombinantes en el orden

que aparece en la Tabla 4.2.2.4.

Tabla 4.2.2.4. Resultados del fenotipo FIR de los recombinantes y su genotipo. *Los

valores de líneas ordenadas corresponden a su respectivo recombinante.

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 91

01

11

21

31

41

51

61

71

81

92

02

12

22

32

42

52

62

72

82

93

03

13

23

33

43

5

FIR

(día

s)

Individuos recombinantes

Línas

ordenadasLíneas FIR S10_423142

1 R22 2.25 V

2 R18 2.4125 V

3 R3 2.5 V

4 R30 2.525 V

5 R79 2.85 V

6 R54 3.0625 V

7 R58 3.125 V

8 R28 3.1875 V

9 R21 3.25 V

10 R29 3.3125 V

11 R17 3.375 V

12 R98 3.875 V

13 R99 3.875 V

14 R62 4.375 M

15 R69 4.375 M

16 R46 4.625 M

17 R106 4.675 M

18 R51 4.6875 M

19 R114 4.6875 M

20 R113 4.9375 V

21 R32 5 M

22 R89 5 M

23 R41 5 M

24 R2 5 M

25 R82 5 M

26 R76 5 V

27 R20 5 M

28 R66 5 M

29 R73 5 M

30 R72 5.55 M

31 R70 5.75 M

32 R94 M

33 R9 M

34 R7 M


Las gráficas previas ilustran la variabilidad progresiva de EARO y FIR de los diferentes

recombinantes. Los valores más pequeños de EARO coincidieron con el genotipo Ved, lo que

significa que esos recombinantes tuvieron la aparición del aroma más temprana que aquellos con

valores mucho más parecido a la media de Mak_10-1. Se vio una tendencia en la Tabla 4.2.2.3 que

la parte superior fuera de genotipado Ved y la inferior Mak_10-1, aunque siguió habiendo en medio

los genotipos mezclados.

En el caso de la FIR, se pudo ver con más claridad esa tendencia a genotipo Ved en la parte superior

de la tabla y genotipo Mak_10-1 en la inferior (Tabla 4.2.2.4). Aquellos recombinantes cuyos frutos

tuvieron una firmeza más alta coincidieron con el genotipo Mak-10_1.

En las gráficas se trazó una línea divisoria en el recombinante que hace de frontera entre los

genotipos-fenotipos Ved y Mak_10-1. Por debajo de la línea en ambos gráficos, abunda más la

relación genotipo-fenotipo Ved, mientras que por encima de la división abundan más la relación

genotipo-fenotipo Mak_10-1.

No se han representado el resto de los caracteres, ya que se obtuvieron resultados demasiado

intermedios como para apreciar una diferencia entre la relación genotipo-fenotipo.

4.2.3. Mapeo fino por asociación fenotipo-genotipo

Tras la selección y el fenotipado de las plantas recombinantes, comparamos el fenotipo con el

genotipo obtenidos. Se analizó cada planta mediante marcadores moleculares tipo SNP. Los

marcadores SNP elegidos fueron los flanqueantes del QTL y varios marcadores dentro de la región

de interés, en total 12 marcadores (Figura 4.2.3.1).



UPC - BarcelonaTech

De igual manera que en el proyecto ETHQV8.1, para mapear se comparó el genotipo con el fenotipo

entre los marcadores S10_423142 y S10_2206450. Una vez se pasaron todos los marcadores en

las diferentes plantas recombinantes, se realizó el análisis, en el que se vio la relación entre los

caracteres estudiados (fenotipo) y la genética (genotipo) de los recombinantes.

Otra vez, como se hizo para el QTL ETHQV8.1, para mapear se comparó el genotipo con el fenotipo

obtenido y se comparó la región que está asociada (en el QTL entre el primer marcador S10_423142

y el segundo S10_895810). Se pasaron todos los marcadores por cada línea y se analizaron. Se

obtuvo una relación entre los fenotipos y el genotipo, aunque no fue un resultado tan claro como

en el QTL ETHQV8.1. Se realizando de nuevo el logaritmo negativo en base 10 (log10) de cada P-

value. De esta manera se realizó un gráfico para tener una respuesta más visual de los resultados.

Figura 4.2.3.1. Mapa físico de la región del QTL de maduración de MAK_10-1, en el cromosoma

10 con marcadores tipo SNP utilizados para el mapeo fino. Cada línea representa un marcador

utilizado, a excepción de los marcadores de los extremos del cromosoma, el cual fue utilizado

para crear el cromosoma con el programa MapChart. A la izquierda se muestra la posición

física del marcador en el cromosoma y a la derecha el nombre del marcador utilizado.


Después de analizar los datos se vio una clara asociación entre los primeros marcadores del

intervalo con el QTL Mak_10-1 (Figura 4.2.3.1). Por lo tanto, se pudo deducir que el gen responsable

del QTL debe estar en esa zona, entre los marcadores S10_423142 y S10_895810.

Se pudo observar una relación con los fenotipos EARO (Figura 4.2.3.2), que pareció que es el

carácter más relacionado en este caso, FIR y ABS. Para el resto de los fenotipos no hubo una relación

tan evidente.

El tamaño del QTL pasó de 1,78 Mb con 263 genes a 0,47 Mb con 70 genes, gracias al mapeo fino.

Los recombinantes de MAK_10-1 son heterocigotos para una parte del QTL, este hecho dificultó la

expresión del fenotipado, el cual es intermedio. El siguiente paso para continuar con el proyecto,

sería hacer un test de progenie y seleccionar las plantas F3 homocigotas para cada región del QTL

para evaluar con más seguridad el fenotipo, como se realizó en ETHQV8.1.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

400,000 600,000 800,000 1,000,000 1,200,000 1,400,000 1,600,000 1,800,000 2,000,000 2,200,000 2,400,000

-lo

g10

de

P-v

alu

e

Posición de los marcadores

EARO

ECD

EALF

ABS

HAR

SSC

FIR


-log10 de los valores de las P-value correspondientes a cada fenotipo (EARO, ECD,

EALF y ABS) (eje Y) del QTL MAK_10-1.



UPC - BarcelonaTech

4.2.4. Genes candidatos

Con el mapeo fino se pudo acotar la región del QTL más plausible a estar relacionada con la

maduración. Se pasó de 1,78 Mb (263 genes) a un loci de 0,47 Mb en el cual se encuentran unos 70

genes que podrían ser candidatos. Estos 70 genes están recogidos en la Figura 4.2.4.1 en la cual

pueden verse enmarcados en rojo.

Fue un gran avance pasar de tantos genes presentes en el QTL a acotar la región a tan sólo 70. Sin

embargo, todavía es un número muy elevado de genes y por lo tanto podría continuarse el proyecto

delimitando más la región y así acotando los genes candidatos a un número menor, pero se llevó

acabo en el QTL ETHQV8.1.

La tabla con los genes de esta zona del QTL se encuentra en el Anexo D.

Figura 4.2.4.1. Representación gráfica de los genes que se encuentran en la región del QTL

analizado durante el proyecto, extraída de la web Melonomics, con la región

correspondiente entre los marcadores más ligados a los genes potencialmente

responsables de la maduración, S10_423142 y S10_896478.


CONCLUSIONES



UPC - BarcelonaTech

5. CONLCUSIONES

A partir de los resultados obtenidos del trabajo realizado, se establecen las siguientes conclusiones:

Relativo al mapeo fino de ETHQV8.1:

A partir de la obtención de plantas homocigotas recombinantes en el QTL estudiado y viendo los

genotipos relacionados con la maduración climatérica, se puede concluir que las líneas R68, R14,

R17 y R42 tuvieron un comportamiento no climatérico (PS8.2), mientras que las líneas R57, R24,

R5, R79 y R15 tuvieron un comportamiento climatérico (VED). Las diferencias y similitudes entre

estas líneas fueron esenciales para determinar y acotar la región del QTL, que pasó de 114 kb a 2,12

kb. Con estas evidencias, se concluye que el gen involucrado en la maduración climatérica del QTL

ETHQV8.1 se encuentran la zona del genoma entre los marcadores Chr8_9628485 y Chr8_9630609.

Puesto que, de los únicos dos genes anotados en este intervalo, uno de los genes está relacionado

con la maduración climatérica, se propone el gen MELO3C024520 (ERF024) como responsable del

QTL ETHQV8.1.

Como posible continuación de este proyecto se podría mirar la expresión del gen mediante una

qPCR o RNA-seq, por ejemplo, y si sigue apuntando al posible responsable, sería realizar un knock

out, podría ser mediante CRISPR, en el gen candidato para asegurar que realmente es el

responsable de la maduración del QTL ETHQV8.1. Este gen, al expresarse en Ved y no en PS,

creemos que favorece la maduración del fruto. La hipótesis es que con CRISPR en una línea pura de

VED sobre el gen candidato, se vería una maduración más tardía, lo cual confirmaría que este gen

es el responsable de dicho QTL.

Relativo al mapeo fino de MAK10-1:

El QTL de MAK10-1 estaba descrito al principio del cromosoma 10, en una región de unas 2 Mb. A

partir de la obtención de recombinantes F2 en el QTL y viendo los genotipos relacionados con la

maduración climatérica, se ha podido determinar y acotar la región del QTL a un intervalo de 0,47

Mb que contiene 70 genes. A pesar de la gran reducción del intervalo, el gran número de genes

complica la selección de genes candidatos y se deberá esperar a la evaluación de la siguiente

generación (F3), de la que se ha obtenido semilla durante este trabajo.


La continuación de este proyecto sería plantar las semillas F3 en primavera 2021, genotipar para

seleccionar los recombinantes en homocigosis, para fijar caracteres y fenotipar las plantas para

analizar los QTLs y poder subdividir esa zona y acotar a un QTL de menor tamaño que permita

identificar el gen candidato para posteriores validaciones funcionales mediante CRISPR.



UPC - BarcelonaTech

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS


6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Ahmadian, A., Gharizadeh, B., Gustafsson, A. C., Sterky, F., Nyrén, P., Uhlén, M., & Lundeberg, J.

(2000). Single-Nucleotide Polymorphism Analysis by Pyrosequencing. Analytical

Biochemistry, 280(1), 103–110. doi:10.1006/abio.2000.4493

Amanullah, S., Liu, S., Gao, P., Zhu, Z., Zhu, Q., Fan, C., & Luan, F. (2018). QTL mapping for melon

(Cucumis melo L.) fruit traits by assembling and utilization of novel SNPs based CAPS markers.

Scientia Horticulturae, 236, 18–29.

Areco Ayala, L. B. (2019). Pyramiding three QTLS involved in climacteric fruit ripening in melon

(Cucumis melo L.) and finishing a new introgression line (IL) population (Tesis de maestría).

Universidad Autónoma de Barcelona, Centre of Research in Agricultural Genomics,

Barcelona.

Boissot, N., Thomas, S., Sauvion, N., Marchal, C., Pavis, C., & Dogimont, C. (2010). Mapping and

validation of QTLs for resistance to aphids and whiteflies in melon. Theoretical and Applied

Genetics, 121(1), 9–20. doi:10.1007/s00122-010-1287-8

Broekema, R. V., Bakker, O. B., & Jonkers, I. H. (2020). A practical view of fine-mapping and gene

prioritization in the post-genome-wide association era. Open Biology, 10(1),

190221. doi:10.1098/rsob.190221

Burger, Y., Sa’ar, U., Paris, H., Lewinsohn, E., Katzir, N., Tadmor, Y., & Schaffer, A. (2006). Genetic

variability for valuable fruit quality traits in Cucumis melo . Israel Journal of Plant Sciences,

54(3), 233-242. doi:10.1560/ijps_54_3_233

Castro, G., Perpiñá, G., Monforte, A. J., Picó, B., & Esteras, C. (2019). New melon introgression lines

in a Piel de Sapo genetic background with desirable agronomical traits from dudaim melons.

Euphytica, 215(10). doi:10.1007/s10681-019-2479-1

Chen, D., Li, T., Wang, C., Lei, G., Wang, R., Wang, Z., & Yang, P. (2019). High-level SETD1B gene

expression is associated with unfavorable prognosis in hepatocellular carcinoma. Molecular

Medicine Reports. doi:10.3892/mmr.2019.9832



UPC - BarcelonaTech

Doyle, J. (1991). DNA Protocols for Plants. In G. M. Hewitt, A. W. B. Johnston, & J. P. W. Young (Eds.),

Molecular Techniques in Taxonomy (pp. 283-293). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin

Heidelberg.

Eduardo, I., Arús, P., & Monforte, A. J. (2005). Development of a genomic library of near isogenic

lines (NILs) in melon (Cucumis melo L.) from the exotic accession PI161375. Theoretical and

Applied Genetics, 112(1), 139–148.

Ezura, H., & Owino, W. O. (2008). Melon, an alternative model plant for elucidating fruit ripening.

Plant Science, 175(1-2), 121–129. doi:10.1016/j.plantsci.2008.02.004

Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAOSTAT. (2018). Retrieved from

http://www.fao.org/faostat/es/#data/QC

Garcia-Mas, J., Benjak, A., Sanseverino, W., Bourgeois, M., Mir, G., Gonzalez, V. M., Hénaff, E.,

Câmara, F., Cozzuto, L., Lowy, E., Alioto, T., Capella-Gutiérrez, S., Blanca, J., Cañizares, J.,

Ziarsolo, P., Gonzalez-Ibeas, D., Rodríguez-Moreno, L., Droege, M., Du, L.,… Puigdomenech,

P. (2012). The genome of melon (Cucumis melo L.). Proceedings of the National Academy of

Sciences, 109(29), 11872–11877. doi:10.1073/pnas.1205415109

Garrigues, A., Hall, J., Van Der Knaap, E., Francis, D. M., Dujmovic, N., & Gray, S. Tomato analyzer-

color test: a new tool for efficient digital phenotyping. J Am Soc Hortic Sci. 2008; 133:579–

86.

Husmann, D., & Gozani, O. (2019). Histone lysine methyltransferases in biology and disease. Nature

Structural & Molecular Biology, 26(10), 880–889. doi:10.1038/s41594-019-0298-7

Kirkbride, J., (1993). Biosystematic Monograph of the Genus Cucumis Cucurbitaceae: Botanical

Identification of Cucumbers and Melons. Boone, North Carolina, USA: Parkway Publishers.

Lister, C., & Dean, C. (1993). Recombinant inbred lines for mapping RFLP and phenotypic markers

in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 4(4), 745–750. doi:10.1046/j.1365-

313x.1993.04040745.x

Literman, R., Radhakrishnan, S., Tamplin, J., Burke, R., Dresser, C., & Valenzuela, N.

(2017). Development of sexing primers in Glyptemys insculpta and Apalone spinifera turtles


uncovers an XX/XY sex-determining system in the critically-endangered bog turtle Glyptemys

muhlenbergii. Conservation Genetics Resources, 9(4), 651-658. doi:10.1007/s12686-017-

0711-7

Liu, L., Kakihara, F., & Kato, M. (2004). Characterization of six varieties of Cucumis melo L. based on

morphological and physiological characters, including shelf-life of fruit. Euphytica, 135(3),

305–313.

Luan, F., Sheng, Y., Wang, Y., & Staub, J. E. (2010). Performance of melon hybrids derived from

parents of diverse geographic Origins. Euphytica, 173(1), 1–16. doi:10.1007/s10681-009-

0110-6

Marth, G. T., Korf, I., Yandell, M. D., Yeh, R. T., Gu, Z., Zakeri, H., Stitziel, N. O., Hillier, L., Kwok, P.-Y,

& Gish, W. R. (1999). A general approach to single-nucleotide polymorphism discovery.

Nature Genetics, 23(4), 452–456. doi:10.1038/70570

McCreight, J. D., Nerson, H., & Grumet, R. (1993). Melon. Genetic Improvement of Vegetable Crops,

267–294. doi:10.1016/b978-0-08-040826-2.50024-2

Nuñez-Palenius, H. G., Gomez-Lim, M., Ochoa-Alejo, N., Grumet, R., Lester, G., & Cantliffe, D. J.

(2008). Melon Fruits: Genetic Diversity, Physiology, and Biotechnology Features. Critical

Reviews in Biotechnology, 28(1), 13–55. doi:10.1080/07388550801891111

Pavan, S., Marcotrigiano, A. R., Ciani, E., Mazzeo, R., Zonno, V., Ruggieri, V., Lotti, C., & Ricciardi, L.

(2017). Genotyping-by-sequencing of a melon (Cucumis melo L.) germplasm collection from

a secondary center of diversity highlights patterns of genetic variation and genomic features

of different gene pools. BMC Genomics, 18(1).

Pereira, L. (2018). Genetic dissection of fruit quality and ripening traits in melon (Tesis doctoral).

Universidad Autónoma de Barcelona, Barcelona.

Pereira, L., Ruggieri, V., Pérez, S., Alexiou, K. G., Fernández, M., Jahrmann, T., Pujol, M., & Garcia-

Mas, J. (2018). QTL mapping of melon fruit quality traits using a high-density GBS-based

genetic map. BMC Plant Biology, 18(1). doi:10.1186/s12870-018-1537-5

Pereira, L., Santo Domingo, M., Ruggieri, V., Argyris, J., Phillips, M. A., Zhao, G., Lian, Q., Xu, Y., He,

Y., Huang, S., Pujol, M., & Garcia-Mas, J. Genetic dissection of climacteric fruit ripening in a



UPC - BarcelonaTech

melon population segregating for ripening behavior. Hortic Res 7, 187 (2020).

doi:10.1038/s41438-020-00411-z

Perpiñá, G., Cebolla-Cornejo, J., Esteras, C., Monforte, A. J., & Picó, B. (2017). “MAK-10”: A Long

Shelf-life Charentais Breeding Line Developed by Introgression of a Genomic Region from

Makuwa Melon. HortScience, 52(11), 1633–1638. doi:10.21273/hortsci12068-17

Rose, J. K. C., Lee, H. H., & Bennett, A. B. (1997). Expression of a divergent expansin gene is fruit-

specific and ripening-regulated. Proceedings of the National Academy of Sciences, 94(11),

5955–5960. doi:10.1073/pnas.94.11.5955

Ruggieri, V., Alexiou, K. G., Morata, J., Argyris, J., Pujol, M., Yano, R., Nonaka, S., Ezura, H., Latrasse,

D., Boulem, A., Bendahmane, A., Cigliano, R. A., Sanseverino, W., Puigdomènech, P.,

Casacuberta, J. M., & Garcia-Mas, J. (2018). An improved assembly and annotation of the

melon (Cucumis melo L.) reference genome. Scientific Reports, 8(1). doi:10.1038/s41598-

018-26416-2

Schaid, D. J., Chen, W., & Larson, N. B. (2018). From genome-wide associations to candidate causal

variants by statistical fine-mapping. Nature Reviews Genetics, 19(8), 491–

504. doi:10.1038/s41576-018-0016-z

Sebastian, P., Schaefer, H., Telford, I. R. H., & Renner, S. S. (2010). Cucumber (Cucumis sativus) and

melon (C. melo) have numerous wild relatives in Asia and Australia, and the sister species of

melon is from Australia. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(32), 14269–

14273. doi:10.1073/pnas.1005338107

Stepansky, A., Kovalski, I., & Perl-Treves, R. (1999). Intraspecific classification of melons (Cucumis

melo L.) in view of their phenotypic and molecular variation. Plant Systematics and Evolution,

217(3-4), 313–333

Tsuchihashi, Z., & Dracopoli, N. C. (2002). Progress in high throughput SNP genotyping methods.

The Pharmacogenomics Journal, 2(2), 103–110. doi:10.1038/sj.tpj.6500094

Vegas, J., Garcia-Mas, J., & Monforte, A. J. Estudio genetico de la maduración del fruto en melón en

la línea isogenica SC3-5-1. Universidad Autónoma de Barcelona. (2014)

https://doi.org/10.1038/s41438-020-00411-z


Vegas Renedo, J., 2014. Estudio genetico de la maduración del fruto en melón en la línea isogenica

SC3-5-1. Tesis Doctoral, Universidad Autónoma de Barcelona.

Vignal, A., Milan, D., SanCristobal, M., & Eggen, A. (2002). A review on SNP and other types of

molecular markers and their use in animal genetics. Genetics Selection Evolution, 34(3), 275–

305. doi:10.1051/gse:2002009

Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., & Wang, D. (2014). Introduction of High Throughput and Cost Effective SNP

Genotyping Platforms in Soybean. Plant Genetics, Genomics, and Biotechnology. 2. 90-94.

doi:10.5147/pggb.2014.0144.

Zuo, J., Grierson, D., Courtney, L. T., Wang, Y., Gao, L., Zhao, X., & Giovannoni, J. J.

(2020). Relationships between genome methylation, levels of noncoding RNAs, mRNAs and

metabolites in ripening tomato fruit. The Plant Journal. doi:10.1111/tpj.14778



UPC - BarcelonaTech

ANEXOS


7. ANEXOS



UPC - BarcelonaTech

SUMARIO

ANEXO A. LISTA DE GENES DE MAK_10-1. .......................................................................73

ANEXO B. FIGURAS DE ETHQV8.1 Y MAK_10-1 ...............................................................74

ANEXO C. TABLAS DE ETHQV8.1 Y MAK_10-1 .................................................................82

ANEXO D. RESULTADOS DE LOS CÁLCULOS DE CHI CUADRADA Y DISTANCIA GÉNICA ...90


Índice de figuras

Figura-A1. Lista de genes encontrados en en el QTL MAK_10-1 entre los marcadores

S10_423142 y S10_896478. ....................................................................................73

Figura-B1. Gráfica boxplot del fenotipo EARO de las líneas de introgresión y los

parentales...............................................................................................................74

Figura-B2. Gráfica boxplot del fenotipo ECD de las líneas de introgresión y los

parentales...............................................................................................................74

Figura-B3. Gráfica boxplot del fenotipo HAR de las líneas de introgresión y los

parentales...............................................................................................................75

Figura-B4 . Gráfica boxplot del fenotipo EALF de las líneas de introgresión y los

parentales...............................................................................................................75

Figura -B5. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal

tomadas en el laboratorio; en orden, recombinante R5, recombinante R68 y

recombinante R24. .................................................................................................76


tomadas en el laboratorio; en orden, parental Ved 46, parental PS8.2-9 y

recombinante R15. .................................................................................................77

Figura-B7. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal

tomadas en el laboratorio; en orden, recombinante R7, recombinante R22,

recombinante R32 y recombinante 44. ..................................................................78



recombinante 76. ...................................................................................................79



recombinante 102. .................................................................................................80



UPC - BarcelonaTech


tomadas en el laboratorio; en orden, parental Mak10.1, recombinante R2 y

recombinante R4. ...................................................................................................81


Índice de tablas

Tabla -C1. Secuencias de los primers coincidentes con los marcadores moleculares

utilizados para el mapeo fino del QTL ETHQV8.1. A1 y A2 corresponden a cada

alelo, C1 el encebador común. ................................................................................82

Tabla -C2. Análisis de QTL ETHQV8.1 y genotipado de este mismo. ................................83

Tabla-C3. Tipos de fenotipado analizados. ......................................................................84

Tabla-C5. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo ECD. ..................................84

Tabla-C6. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo EALF. .................................84

Tabla-C7. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo HAR. .................................85

Tabla-C8. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo FIR. ...................................86

Tabla-C11. Análisis de QTL MAK_10-1 y genotipo de este mismo. ..................................88

Tabla- C12. Log10 (tabla superior) de los P-value de todos los fenotipos y -Log10 (tabla

inferior) de los mismos. valores ..............................................................................89

Tabla-D1. Chi cuadrado calculado para R5. .....................................................................90

Tabla-D2. Chi cuadrado calculado para R14. ...................................................................90







Tabla -D9. Chi cuadrado calculado para R79. ..................................................................93



UPC - BarcelonaTech

ANEXO A. LISTA DE GENES DE MAK_10-1.

1. MELO3C012444.2.1 36. MELO3C012409.2.1

2. MELO3C012443.2.1 37. MELO3C012408.2.1

3. MELO3C012442.2.1 38. MELO3C012407.2.1

4. MELO3C012441.2.1 39. MELO3C012406.2.1

5. MELO3C012440.2.1 40. MELO3C012405.2.1

6. MELO3C012439.2.1 41. MELO3C012404.2.1

7. MELO3C012438.2.1 42. MELO3C012403.2.1

8. MELO3C012437.2.1 43. MELO3C012402.2.1

9. MELO3C012436.2.1 44. MELO3C034024.2.1

10. MELO3C034029.2.1 45. MELO3C012401.2.1

11. MELO3C012434.2.1 46. MELO3C012400.2.1

12. MELO3C012433.2.1 47. MELO3C012399.2.1

13. MELO3C012432.2.1 48. MELO3C034032.2.1

14. MELO3C034030.2.1 49. MELO3C012397.2.1

15. MELO3C012431.2.1 50. MELO3C012396.2.1

16. MELO3C012430.2.1 51. MELO3C012395.2.1

17. MELO3C012429.2.1 52. MELO3C012394.2.1

18. MELO3C012428.2.1 53. MELO3C034031.2.1

19. MELO3C012427.2.1 54. MELO3C012393.2.1

20. MELO3C012426.2.1 55. MELO3C012392.2.1

21. MELO3C012425.2.1 56. MELO3C012391.2.1

22. MELO3C012424.2.1 57. MELO3C012390.2.1

23. MELO3C012422.2.1 58. MELO3C012389.2.1

24. MELO3C012421.2.1 59. MELO3C012388.2.1

25. MELO3C034023.2.1 60. MELO3C012387.2.1

26. MELO3C012419.2.1 61. MELO3C012386.2.1

27. MELO3C012418.2.1 62. MELO3C012385.2.1

28. MELO3C012417.2.1 63. MELO3C012384.2.1

29. MELO3C012416.2.1 64. MELO3C012383.2.1

30. MELO3C012415.2.1 65. MELO3C012382.2.1

31. MELO3C012414.2.1 66. MELO3C012381.2.1

32. MELO3C012413.2.1 67. MELO3C012379.2.1

33. MELO3C012412.2.1 68. MELO3C012378.2.1

34. MELO3C012411.2.1 69. MELO3C012377.2.1

35. MELO3C012410.2.1 70. MELO3C012376.2.1

Figura-A1. Lista de genes encontrados en en el QTL MAK_10-1 entre los marcadores S10_423142 y S10_896478.


ANEXO B. FIGURAS DE ETHQV8.1 Y MAK_10-1

• Figuras del proyecto ETHQV8.1

Figura-B1. Gráfica boxplot del fenotipo EARO de las líneas de introgresión y los parentales.

Figura-B2. Gráfica boxplot del fenotipo ECD de las líneas de introgresión y los parentales.



UPC - BarcelonaTech

Figura-B3. Gráfica boxplot del fenotipo HAR de las líneas de introgresión y los parentales.

Figura-B4 . Gráfica boxplot del fenotipo EALF de las líneas de introgresión y los parentales.


Figura -B5. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal tomadas en el laboratorio; en orden, recombinante R5,

recombinante R68 y recombinante R24.



UPC - BarcelonaTech

Figura -B6. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal tomadas en el laboratorio; en orden, parental Ved 46,

parental PS8.2-9 y recombinante R15.


• Figuras del proyecto MAK_10-1.

Figura-B7. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal tomadas en el laboratorio; en orden, recombinante R7, recombinante

R22, recombinante R32 y recombinante 44.



UPC - BarcelonaTech

Figura -B8. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal tomadas en el laboratorio; en orden, recombinante R52,

recombinante R66 y recombinante 76.


Figura-B9. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal tomadas en el laboratorio; en orden, recombinante

R88, recombinante R92 y recombinante 102.



UPC - BarcelonaTech

Figura-B10. Fotografías de los frutos por delante, detrás, arriba y corte transversal tomadas en el laboratorio; en orden, parental Mak10.1, recombinante R2 y

recombinante R4.


ANEXO C. TABLAS DE ETHQV8.1 Y MAK_10-1

• Tablas del proyecto ETHQV8.1

Order Name Sequence

Chr8_9603217.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATTTTCTCCCTCTCATTTTAATCCCTT

Chr8_9603217.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCTCCCTCTCATTTTAATCCCTC

Chr8_9603217.C1 GAAGACAATTGTTTTAGTATTAGAAGTTAA

chr08.9628485.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATCCTAGAGAAACCATCCGCATG

chr08.9628485.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATCCTAGAGAAACCATCCGCATA

chr08.9628485.C1 GTTTCTAATGTCTTGGATTATTCCAATGGT

chr08.9630609.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGACGTAGCAGCCCTAGCC

chr08.9630609.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACGACGTAGCAGCCCTAGCT

chr08.9630609.C1 GGTCCGCGTTGGGGCCCTT

chr08.96322671.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCGTGATAATTAGAAATCTATTTACATTCGAAA

chr08.96322671.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCGTGATAATTAGAAATCTATTTACATTCGAAG

chr08.96322671.C1 AAGCAAGACTGAGTAGCTTTAGGATGTTT

chr08.9634968.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACGTGGTGGTCATTTAGAGCC

chr08.9634968.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGAACGTGGTGGTCATTTAGAGCT

chr08.9634968.C1 GTGCTGACGTAACTGAACGTGTTCTT

chr08.9638241.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTGAGGTATGTTATTCTGAGCATGATTA

chr08.9638241.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGGTATGTTATTCTGAGCATGATTG

chr08.9638241.C1 GTGCATGATGTATGTTCTTCTCTCTCTTA

chr08.9643649.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATACTCATGTCTGCCGGGAG

chr08.9643649.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCATACTCATGTCTGCCGGGAA

chr08.9643649.C1 ATGCACATCAAATAAAATGACAATTACTAA

chr08.9651404.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAACAACAAATTCAAATTACAGGCTTGCT

chr08.9651404.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAACAAATTCAAATTACAGGCTTGCC

chr08.9651404.C1 GGCTGAGGTGGTCGGGGGTA

chr08:9663583.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTAAACAAAGTTGCACGACCATTTGT

chr08:9663583.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTAAACAAAGTTGCACGACCATTTGC

chr08:9663583.C1 CTGAAGAATCACTGCTGGTCAGAAAATTT

chr08.9676828.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATTAAATAATAATTACATTGAAAGTTGTTTC

chr08.9676828.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTAAATAATAATTACATTGAAAGTTGTTTT

chr08.9676828.C1 AAAGCTCCCCAGTCATCCATGTCAA

chr08.9681370.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTTGTTTGTGTGAAGTGGGTTC

chr08.9681370.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTTTGTTTGTGTGAAGTGGGTTG

chr08.9681370.C1 CCTTGCTCCAAGTAACTTAAAAAAAGAAAA

chr08.9683615.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTGGGGTTCTCTAATTCTATCCTT

chr08.9683615.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTTGGGGTTCTCTAATTCTATCCTC

chr08.9683615.C1 CTCAATTCTATTAGCCACTAAAACTCATAA

chr08.9688516.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTTCTCCGTTGGCTCAACAAAAG

chr08.9688516.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACTTCTCCGTTGGCTCAACAAAAA

chr08.9688516.C1 GATGTGAGAGTTGGTGACTTTTTAAATCTA

chr08.9693668.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATTACAACAATTTTCATACATTATAATCCACT

chr08.9693668.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAATTACAACAATTTTCATACATTATAATCCACC

chr08.9693668.C1 TGTTGTTATTAAAATTTTCAAAAAGAAAAA

chr08.9717281.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACATATTTATAGTTCGGTTTGGGTCAA

chr08.9717281.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACATATTTATAGTTCGGTTTGGGTCAC

chr08.9717281.C1 GGTTAAAAATCAAAACCAGACCAACTGGTT

14

13

15

Primers

1

2

3

4

5

12

9

10

11

6

7

8

Tabla -C1. Secuencias de los primers coincidentes con los marcadores moleculares utilizados para el mapeo fino del QTL ETHQV8.1. A1 y A2

corresponden a cada alelo, C1 el encebador común.



UPC - BarcelonaTech

Tabla -C2. Análisis de QTL ETHQV8.1 y genotipado de este mismo.

Line Rep Plant EARO ECD EALF ABS HAR FIR 96

03

21

7

96

28

48

5

96

30

60

9

96

32

26

7

96

34

96

8

96

38

24

1

96

43

64

9

96

51

40

4

96

63

58

3

96

76

82

8

96

81

37

0

96

83

61

5

96

88

51

6

96

93

66

8

97

17

28

1

PS8.2 1 PS8.2-1 39 37 39 1 43 2.8125 B B B B B B B B B B B B B B B









R17 45 R17-45 37 39 38 3 39 3.3375 B B B B B B B B B B B B B B V








R42 1 R42-1 39 32 33 1 38 3.0625 B B B B B B B B B B B B B V V




R42 14 R42-14 36 36 36 2 42 B B B B B B B B B B B B B V V


R42 30 R42-30 36 36 36 3 39 3 B B B B B B B B B B B B B V V



R5 10 R5-10 30 31 31 1 36 1.625 B B B B B V V V V V V V V V V









R57 2 R57-2 32 33 33 2 38 B B B B B V V V V V V V V V V

R57 13 R57-13 29 29 29 2 34 2 B B B B V V V V V V V V V V V

R57 8 R57-8 30 30 30 2 35 2.1875 B B B B V V V V V V V V V V V




R57 47 R57-47 34 34 34 2 39 1 B B B B V V V V V V V V V V V




R68 16 R68-16 40 11 39 3 41 5 B B B V V V V V V V V V V V V

R68 19 R68-19 40 40 39 3 42 3.9375 B B B V V V V V V V V V V V V





R79 5 R79-5 32 32 32 1 36 3.975 B V V V V V V V V V V V V V V





R79 21 R79-21 35 36 35 37 2.6375 B V V V V V V V V V V V V V V




R14 23 R14-23 37 37 37 3 37 5 V B B B B B B B B B B B B B B

R14 3 R14-3 36 39 36 1 42 4.125 V B B B B B B B B B B B B B B

R14 30 R14-30 36 36 38 1 43 5 V B B B B B B B B B B B B B B



R14 42 R14-42 V B B B B B B B B B B B B B B



R15 21 R15-21 33 33 34 1 35 4.0625 V V V V V V V V V V V V V B B







R17 13 R17-13 33 34 34 3 35 2.8 V V V V V V V V V V V V V V B


R17 17 R17-17 36 37 36 37 1.9875 V V V V V V V V V V V V V V B




Ved 41 Ved-41 34 34 34 39 V V V V V V V V V V V V V V V

Ved 42 Ved-42 31 31 31 3 35 1.625 V V V V V V V V V V V V V V V









Tabla-C3. Tipos de fenotipado analizados.

Tabla-C1. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo.

EARO.

Tabla-C5. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo ECD.

Tabla-C6. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo EALF.

EARO

PS8.2 R14 R15 R17 R24 R42 R5 R57 R68 R79

R14 1.00000 - - - - - - - - -

R15 9.40E-05 0.00403 - - - - - - - -

R17 1.00000 1.00000 0.11165 - - - - - - -

R24 0.00019 0.00475 1.00000 0.11883 - - - - -

R42 1.00000 1.00000 0.11165 1.00000 0.11883 - - - - -

R5 1.80E-06 0.00022 1.00000 0.00567 1.00000 0.00567 - - - -

R57 4.00E-07 4.40E-05 1.00000 0.00097 1.00000 0.00097 1.00000 - - -

R68 1.00000 1.00000 1.30E-06 0.10613 3.40E-06 0.10613 2.00E-08 5.50E-09 - -

R79 0.0153 0.22464 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.81616 0.15374 0.00024 -

Ved 5.60E-06 0.00054 1.00000 0.01465 1.00000 0.01465 1.00000 1.00000 6.30E-08 1.00000

PS8.2 VED

R14 1.00000 0.00054 A

R15 9.40E-05 1.00000 B

R17 1.00000 1.47E-02 A

R24 0.00019 1.00000 B

R42 1.00000 0.01465 A

R5 1.80E-06 1.00000 B

R57 4.00E-07 1.00000 B

R68 1.00000 6.30E-08 A

R79 0.0153 1.00000 B

VED 5.60E-06 - B

PS8.2 - 5.60E-06 A

Code Phenotype Units

EARO Earliness of aroma DAP

ECD Earliness of chlorophyll degradation DAP

EALF Earliness of abscission layer formation DAP

ABS Abscission Level of abscission

HAR Harvest day DAP

FIR Firmness kg cm-2

ECD

PS8.2 R14 R15 R17 R24 R42 R5 R57 R68 R79

R14 1.00 - - - - - - - - -

R15 1.00 1.00 - - - - - - - -

R17 1.00 1.00 1.00 - - - - - - -

R24 1.00 1.00 1.00 1.00 - - - - - -

R42 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 - - - - -

R5 0.49 0.54 1.00 1.00 1.00 1.00 - - - -

R57 0.16 0.19 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 - - -

R68 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 - -

R79 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 -

Ved 0.49 0.54 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

PS8.2 VED

R14 1.00 0.54 A

R15 1.00 1.00 AB

R17 1.00 1.00 AB

R24 1.00 1.00 AB

R42 1.00 1.00 AB

R5 0.49 1.00 B

R57 0.16 1.00 B

R68 1.00 1.00 AB

R79 1.00 1.00 AB

VED 0.49 - B

PS8.2 - 0.49 A



UPC - BarcelonaTech

Tabla-C7. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo HAR.

HAR

PS8.2 R14 R15 R17 R24 R42 R5 R57 R68 R79

R14 1.00000 - - - - - - - - -

R15 0.31045 1.00000 - - - - - - - -

R17 1.00000 1.00000 1.00000 - - - - - - -

R24 0.00233 0.02771 1.00000 1.00000 - - - - - -

R42 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.40414 - - - - -

R5 3.50E-05 0.00169 0.99054 0.18486 1.00000 0.02585 - - - -

R57 0.00305 0.03976 1.00000 1.00000 1.00000 0.60162 1.00000 - - -

R68 1.00000 1.00000 0.10636 0.37108 0.00075 1.00000 1.00E-05 0.00095 - -

R79 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.21669 1.00000 0.0101 0.32024 1.00000 -

Ved 0.00018 0.00607 1.00000 0.59976 1.00000 0.09845 1.00000 1.00000 5.40E-05 0.04246

PS8.2 VED

R14 1.00000 0.00607 A

R15 0.31045 1.00000 B

R17 1.00000 0.59976 A

R24 0.00233 1.00000 B

R42 1.00000 0.09845 A

R5 3.50E-05 1.00000 B

R57 0.00305 1.00000 B

R68 1.00000 5.40E-05 A

R79 1.00000 0.04246 A

VED 0.00018 - B

PS8.2 - 0.00018 A

EALF

PS8.2 R14 R15 R17 R24 R42 R5 R57 R68 R79

R14 1.00000 - - - - - - - - -

R15 0.00375 0.00283 - - - - - - - -

R17 1.00000 1.00000 0.04231 - - - - - - -

R24 0.00048 0.00041 1.00000 0.00537 - - - - - -

R42 1.00000 0.93226 1.00000 1.00000 0.24121 - - - - -

R5 7.00E-05 0.0001 1.00000 0.00119 1.00000 0.10669 - - - -

R57 4.10E-06 7.50E-06 1.00000 6.70E-05 1.00000 0.00699 1.00000 - - -

R68 1.00000 1.00000 1.90E-05 1.00000 3.00E-06 0.04231 2.30E-07 1.70E-08 - -

R79 0.26469 0.12255 1.00000 1.00000 1.00000 1.00000 0.83357 0.06408 0.00209 -

Ved 7.00E-05 1.00000 1.00000 0.00119 1.00000 0.10669 1.00000 1.00000 2.30E-07 0.83357

PS8.2 VED

R14 1.00000 1.00000 AB

R15 0.00375 1.00000 B

R17 1.00000 0.00119 A

R24 0.00048 1.00000 B

R42 1.00000 0.10669 A

R5 7.00E-05 1.00000 B

R57 4.10E-06 1.00000 B

R68 1.00000 2.30E-07 A

R79 0.26469 0.83357 B

VED 7.00E-05 - B

PS8.2 - 7.00E-05 A


Tabla-C2. Log10 (tabla superior) de los P-value de todos los fenotipos y -

Log10 (tabla inferior) de los mismos valores.

Tabla-C3. T-test y corrección de Bonferroni para el fenotipo FIR.

FIR

PS8.2 R14 R15 R17 R24 R42 R5 R57 R68 R79

R14 1.0000 - - - - - - - - - 1.0000 - - - - - - - - -

R15 1.0000 1.0000 - - - - - - - - 1.0000 1.0000 - - - - - - - -

R17 1.0000 0.5091 1.0000 - - - - - - -

R24 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 - - - - - -

R42 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 - - - - -

R5 1.0000 0.0336 0.1092 1.0000 1.0000 1.0000 - - - -

R57 0.0346 0.001 0.0026 0.9665 1.0000 0.1064 1.0000 - - -

R68 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.0879 0.0021 - -

R79 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.1924 1.0000 -

Ved 0.2010 0.0054 0.0152 1.0000 1.0000 0.5766 1.0000 1.0000 0.0120 1.0000

PS8.2 VED

R14 1.0000 0.0054 A

R15 1.0000 0.0152 A

R17 1.0000 1.0000 AB

R24 1.0000 1.0000 AB

R42 1.0000 0.5766 A

R5 1.0000 1.0000 AB

R57 0.0346 1.0000 B

R68 1.0000 0.0120 A

R79 1.0000 1.0000 AB

VED 0.2010 - B

PS8.2 - 0.2010 A

96

03

21

7

96

28

48

5

96

30

60

9

96

32

26

7

96

34

96

8

96

38

24

1

96

43

64

9

96

51

40

4

96

63

58

3

96

76

82

8

96

81

37

0

96

83

61

5

96

88

51

6

96

93

66

8

97

17

28

1

EARO 0.102155 0.000000 0.000000 0.000001 0.000098 0.000018 0.000018 0.000018 0.000018 0.000018 0.000018 0.000018 0.000018 0.085246 0.055492

ECD 0.015455 0.000291 0.000291 0.013877 0.146080 0.143068 0.143068 0.143068 0.143068 0.143068 0.143068 0.143068 0.143068 0.944262 0.977796

EALF 0.041840 0.000000 0.000000 0.000001 0.000715 0.000358 0.000358 0.000358 0.000358 0.000358 0.000358 0.000358 0.000358 0.168828 0.225312

ABS 0.433026 0.031009 0.031009 0.077470 0.005148 0.033583 0.033583 0.033583 0.033583 0.033583 0.033583 0.033583 0.033583 0.012414 0.433026

HAR 0.047544 0.000000 0.000000 0.000000 0.000001 0.000036 0.000036 0.000036 0.000036 0.000036 0.000036 0.000036 0.000036 0.016368 0.117111

FIR 0.032108 0.000001 0.000001 0.000650 0.000220 0.000252 0.000252 0.000252 0.000252 0.000252 0.000252 0.000252 0.000252 0.117106 0.874506

(-log10)

96

03

21

7

96

28

48

5

96

30

60

9

96

32

26

7

96

34

96

8

96

38

24

1

96

43

64

9

96

51

40

4

96

63

58

3

96

76

82

8

96

81

37

0

96

83

61

5

96

88

51

6

96

93

66

8

97

17

28

1

EARO 0.990740 9.788953 9.788953 5.948770 4.009301 4.752115 4.752115 4.752115 4.752115 4.752115 4.752115 4.752115 4.752115 1.069324 1.255773

ECD 1.810924 3.535970 3.535970 1.857695 0.835408 0.844458 0.844458 0.844458 0.844458 0.844458 0.844458 0.844458 0.844458 0.024908 0.009752

EALF 1.378409 10.397614 10.397614 5.837139 3.145540 3.446514 3.446514 3.446514 3.446514 3.446514 3.446514 3.446514 3.446514 0.772555 0.647215

ABS 0.363486 1.508515 1.508515 1.110866 2.288354 1.473883 1.473883 1.473883 1.473883 1.473883 1.473883 1.473883 1.473883 1.906098 0.363486

HAR 1.322908 10.232367 10.232367 6.491491 5.924931 4.439021 4.439021 4.439021 4.439021 4.439021 4.439021 4.439021 4.439021 1.785995 0.931404

FIR 1.493392 6.127288 6.127288 3.187253 3.657184 3.598404 3.598404 3.598404 3.598404 3.598404 3.598404 3.598404 3.598404 0.931420 0.058237



UPC - BarcelonaTech

• Tablas del proyecto MAK_10-1.

Order Name Sequence

S10_423142.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGAAATTCTCTGTAAAAGTTAAAATGGAAGA

S10_423142.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAATTCTCTGTAAAAGTTAAAATGGAAGG

S10_423142.C1 GAAGACTACCGATTTAATTAACCGTTTCTT

S10_895810.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCAAATGCAGCATCAGGTTCATATC

S10_895810.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCAAATGCAGCATCAGGTTCATATT

S10_895810.C1 GTCAAAATGTGCTTGAACAAGATTCAATTT

S10_899379.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGCTTATTAGAGGTCATTTATCTGCTA

S10_899379.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGCTTATTAGAGGTCATTTATCTGCTT

S10_899379.C2 TTCAGAAACTCATCCATTCTGAGCAGTT

S10_1010796.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTCGCTATGACGTTTACCACAAC

S10_1010796.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTCGCTATGACGTTTACCACAAT

S10_1010796.C1 TATTGATGCACTCACCCCTGTCCAA

S10_1398632.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGAGGACCTTCATCGCCGGT

S10_1398632.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGGACCTTCATCGCCGGC

S10_1398632.C1 CAGTGCTCCAAGATGCCACAGCA

S10_1415860.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGACTTCGGTGAGAGGAGCTTGA

S10_1415860.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACTTCGGTGAGAGGAGCTTGT

S10_1415860.C1 CTGCCGCTGCCGTACGCCAA

S10_1499219.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGACTCACTTTGAACTGACAGAGATT

S10_1499219.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGACTCACTTTGAACTGACAGAGATC

S10_1499219.C1 AGCACAGAATTCACAAGTTCTCTCCATT

S10_1806176.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAAGCCAAATCCTTCTCCAGCAGTT

S10_1806176.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCAAATCCTTCTCCAGCAGTC

S10_1806176.C1 GGAAAATGAGATTCCAATTGAAGCAATAAA

S10_1879648.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGGTCTTCTCTTCTGCATCTCA

S10_1879648.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAGGTCTTCTCTTCTGCATCTCT

S10_1879648.C1 CAGCAGCTTGTAGTCTCTAACTAAAAAGAA

S10_2044171.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAATTCTTTTGCCATAATTTCAACAACAACG

S10_2044171.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAATTCTTTTGCCATAATTTCAACAACAACA

S10_2044171.C1 CAAAGCAGCATAGCAGAAACTTTTTCTTTT

S10_2124809.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTGTATTTGCACGAGCAATGTGAC

S10_2124809.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTGTATTTGCACGAGCAATGTGAT

S10_2124809.C1 CATCAAGCAATATATTTGCAGCCTTGACAT

S10_2206450.A1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACTTCGTCATCCACAGGCGTA

S10_2206450.A2 GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACTTCGTCATCCACAGGCGTC

S10_2206450.C1 AGGAAGAGGTAGTTGAGGCAGCTTT

5

4

3

Primers

1

2

7

6

12

11

10

9

8

Tabla-C4. Secuencias de los primers coincidentes con los marcadores

moleculares utilizados para el mapeo fino del QTL MAK_10-1.

A1 y A2 corresponden a cada alelo, C1 el encebador común.


Tabla-C5. Análisis de QTL MAK_10-1 y genotipo de este mismo.

Line Rep Plant EARO ECD EALF ABS HAR SSC FIR 42

31

42

89

58

10

89

93

79

10

10

79

6

13

98

63

2

14

15

86

0

14

99

21

9

18

06

17

6

18

79

64

8

20

44

17

1

21

24

80

9

22

06

45

0

R1 R1- 35 36 35 3 36 10.6 3.15 V H H H H H H H H H H H

R9 R9- 33 37 36 1 41 V V ND H H H H H ND H H H

R4 R4- 33 39 38 1 43 5 2.75 ND V V H H H H H H H H H

R19 R19- 34 35 34 3 36 7.4 2.825 V V V V H H H H H H H H

R18 R18- 32 33 33 3 34 9 2.4125 V V V ND H H H H H H H H

R17 R17- 35 38 36 1 41 8.5 3.375 V V V V H H H H ND H H H

R15 R15- 34 34 33 3 34 7.2 3.0625 V V V V H H M H H H H H

R21 R21- 33 32 31 2 36 7.5 3.25 V V V V H H H H H H H H

R20 R20- 40 33 32 3 34 8 5 V V V V H H H H H H H H

R7 R7- 33 42 39 2 45 V V ND V H H H ND H H H H

R5 R5- 33 36 36 1 41 7 2.0625 ND V V V H H H H ND H H H

R22 R22- 34 33 33 3 33 8.5 2.25 V V V V V V H H ND H H H

R25 R25- 32 32 32 3 33 3 3.9125 V V V V V V H H H H H H

R24 R24- 33 32 31 3 32 9 3.8125 V V V V V V V H H H H H

R28 R28- 30 38 37 1 42 10.2 3.1875 V V V V V V V V V H H H

R26 R26- 32 32 33 1 39 6.4 2.5875 V V V V V V V V ND H H H

R29 R29- 31 34 34 3 34 7.6 3.3125 V V V V V V V V ND V ND ND

R30 R30- 32 35 35 2 39 9.5 2.525 V V V V V V V V V V V H

Ved 85 Ved-85 34 34 33 3 35 10.2 3.15 VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED

Ved 86 Ved-86 35 36 35 3 38 5 1.5 VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED

Ved 87 Ved-87 34 34 34 2 39 7.8 1.775 VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED VED



R34 R34- 34 39 38 2 42 6.4 1.9375 V V V ND V V V V V V V V

R32 R32- 35 36 35 2 39 3.6 5 H V V V V V V V V V V V

R33 R33- 40 37 37 2 42 7.9 5 ND V V V V V Negative V V V V V

R35 R35- 39 37 36 1 41 5.8 4.175 H V V V V V V V H V V V

R36 R36- 39 39 38 2 42 4 3.8125 H V V V V V V V V V V V

R37 R37- 39 38 38 1 43 6.5 4 H V V V V V V V ND V V V

R39 R39- 41 39 39 3 44 3.5 4.625 H V V V V V V V V V V V

R40 R40- 42 37 37 1 42 8.2 4.875 M V V V V V V V H V V V

R105 R105- 39 33 33 3 35 8 3.85 H H H V V V V V ND V V V

R54 R54- 36 35 36 1 41 5 3.0625 H H H V V V V ND V V V V

R42 R42- 41 38 38 1 44 6.4 5 H H H V V V V V V V V ND

R46 R46- 43 36 35 1 40 9.8 4.625 H H H V V V V V V V V V

R48 R48- 43 39 36 2 41 7.4 4.1875 H H H V V V V V V V V V

R41 R41- 37 38 37 1 41 6 5 H H H H V V V V V V V V

R44 R44- 38 35 36 1 41 6 4.6125 H H H H V V V V V V V V

R49 R49- 42 36 31 1 36 9.6 4.125 H H H H V V V V V V V V

R50 R50- 41 37 36 3 41 9.2 5 H H H H V V V V V V V V

R51 R51- 39 37 38 1 43 7.8 4.6875 H H H H V V V V V V V V

R23 R23- 31 31 30 3 31 2.15 H H H H H H V H ND H H H

R52 R52- 37 37 37 1 42 4 3.95 H H H H H H H V H V V V

R53 R53- 37 37 36 1 41 6 4.175 H H H ND H H H V V V V V

R56 R56- 32 38 37 1 42 5.4 4.2875 H H H H H H H H V V V V

R57 R57- 39 37 37 1 42 6.5 4.3125 H H H H H H H H V V V V

R58 R58- 39 36 36 1 41 5 3.125 H H H ND H H H H H V V V

H 1 H-1 41 38 36 1 41 8.2 5 H H H H H H H H H H H H

H 2 H-2 38 37 35 2 40 9 4.125 H H H H H H H H H H H H

H 3 H-3 40 37 37 1 42 8 5 H H H H H H H H H H H H

H 4 H-4 39 36 37 1 42 6.4 4.825 H H H H H H H H H H H H

H 5 H-5 33 33 34 3 34 4 3.0875 H H H H H H H H H H H H

H 6 H-6 40 39 37 3 42 10 3.6375 H H H H H H H H H H H H

H 7 H-7 35 33 32 1 37 6.6 5 H H H H H H H H H H H H

R2 R2- 38 32 31 3 35 6 5 H H H H H H H H H H H H

R59 R59- 39 38 37 1 42 7.5 5 M H H H H H H H H H H H

R60 R60- 42 38 39 1 44 8.8 5 M H H H H H H H H H H H

R62 R62- 41 34 35 1 40 6 4.375 M H H H H H H H ND H H H

R72 R72- 39 39 37 2 42 7.2 5.55 M H H H H ND H H H H H H

R65 R65- 42 38 38 1 43 8.4 5 H M M H H H H H H H H H

R66 R66- 42 36 38 1 43 7.8 5 M M M H H H H H H H H H

R68 R68- 41 38 37 1 42 6.8 4.5 M M M H H H H H H H H H

R70 R70- 39 36 36 2 41 8 5.75 M M M H H H H H H H H H

R64 R64- 38 38 38 1 43 6.2 4.95 M M M M H H H H H H H H

R67 R67- 39 33 34 1 38 7.8 5 M M M M H H H H H H H H

R69 R69- 44 37 38 1 43 7 4.375 M M M M H H H H H H H H

R71 R71- 43 32 37 1 43 7.6 5 M M M M H ND H H H H H H

R75 R75- 39 39 37 1 42 6 5 ND M ND M M M H H H H H H

R76 R76- 40 35 35 1 39 7.8 5 M M M M M M H H H H H H

R73 R73- 43 34 33 1 38 7.2 5 M M M M M M M H ND H H H

R74 R74- 38 35 36 1 41 6.5 5 M M M M M M M H H H H H

R77 R77- 42 35 33 1 38 6.2 5 M M M M M M M M H H H H

R78 R78- 41 32 30 1 35 4.6 4.875 ND M M M M M M M M H H H

R84 R84- 40 37 36 1 41 8.4 4.875 M M M M M M ND M M M M M

R87 R87- 40 38 37 3 41 9 4.4 M M M M M M M M M M M M

MAK10-1 1 MAK10-1-1 42 38 40 1 45 9.1 4.5625 MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK


MAK10-1 3 MAK10-1-3 38 38 38 1 42 5 2.75 MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK


MAK10-1 5 MAK10-1-5 39 38 38 1 43 6 5 MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK

MAK10-1 6 MAK10-1-6 43 36 38 1 43 6.4 5 MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK MAK




R79 R79- 32 31 33 1 38 9.5 2.85 H M M ND M M M M ND M M M

R80 R80- 41 31 30 3 32 8.3 3.825 H M M M M M ND M M M M M

R82 R82- 38 38 36 2 41 6.8 5 H M M M M M M ND M M M M

R88 R88- 37 36 36 1 43 9.5 4.5 H M M M M M M M M M M M

R89 R89- 35 33 32 1 38 8.2 5 H H H M M M M M M M M M

R92 R92- 34 44 41 1 46 6 4.875 H H H M M M M M M M M M

R99 R99- 40 41 39 3 41 6.6 3.875 H H H M M M ND M M M M M

R100 R100- 38 36 36 1 41 7 4.125 H H H M M M ND M M M M M

R90 R90- 34 42 41 1 46 6.2 4.625 H H H H M M M M M ND M M

R94 R94- 30 36 35 2 39 H H H H M M ND M M M M M

R98 R98- 39 37 37 2 42 9.5 3.875 H H H H M M M ND M M M M

R102 R102- 33 34 33 3 34 5 4.4375 H H H H M M M M M M M M

R103 R103- 41 34 33 2 37 8.4 5 ND H H H H H H M M M M M

R111 R111- 34 34 33 3 34 H H H H H H H H H H M M

R106 R106- 42 33 33 3 34 5 4.675 V M M V M M M M M M M M

R113 R113- 46 35 34 3 35 4.6 4.9375 M H H H V V ND V ND V V V

R114 R114- 45 33 32 3 34 4.6 4.6875 M V V M H H H ND H V V V



UPC - BarcelonaTech

Tabla- C6. Log10 (tabla superior) de los P-value de todos los fenotipos y -Log10 (tabla inferior) de los mismos.

valores

423142 895810 899379 1010796 1398632 1415860 1499219 1806176 1879648 2044171 2124809 2206450

EARO 2.09E-10 1.27E-05 5.67E-05 2.35E-03 0.8038754 0.8038754 0.87391723 0.5893243 0.9019923 0.25019173 0.0694847 0.04582011

ECD 2.66E-01 5.79E-01 6.88E-01 8.39E-01 0.9917379 0.9917379 0.71052361 0.4424407 0.4279348 0.50574869 0.5915885 0.58231599

EALF 1.78E-02 8.18E-01 7.10E-01 7.79E-01 0.70041907 0.70041907 0.55008421 0.2442662 0.2463967 0.30450245 0.39527971 0.42336727

ABS 0.00298 0.00792 0.00914 0.027 0.35111459 0.35111459 0.76483491 0.8660624 0.2457387 0.3313108 0.2322796 0.25301445

HAR 4.18E-03 2.43E-01 1.74E-01 3.07E-01 0.92577363 0.92577363 0.74261704 0.2529903 0.1302422 0.33927239 0.28168719 0.31723582

SSC 5.79E-01 3.20E-01 2.64E-01 8.26E-01 0.64952244 0.64952244 0.99100596 0.5684498 0.5600212 0.03937112 0.04528927 0.02870139

FIR 6.76E-08 9.26E-06 1.29E-05 3.02E-05 0.02128107 0.02128107 0.04497079 0.1692464 0.1297108 0.38679589 0.4156134 0.50965398

(-log10) 423142 895810 899379 1010796 1398632 1415860 1499219 1806176 1879648 2044171 2124809 2206450

EARO 9.68E+00 4.894561352 4.24633101 2.628150372 0.09481126 0.09481126 0.0585297 0.22964565 0.04479717 6.02E-01 1.15811081 1.338943873

ECD 0.57547852 0.237161699 0.162562455 0.076185554 0.00360309 0.00360309 0.14842149 0.35414493 0.36862239 0.29606523 0.22798028 0.234841284

EALF 1.749179314 0.087505651 0.148477485 0.108561956 0.15464204 0.15464204 0.25957082 0.61213662 0.60836511 0.51640921 0.40309548 0.37328272

ABS 2.525783736 2.101274818 2.039053804 1.568636236 0.45455112 0.45455112 0.1164323 0.06245082 0.60952644 0.47976441 0.63398893 0.596854675

HAR 2.379089259 0.613532069 0.759030887 0.513470913 0.03349519 0.03349519 0.12923509 0.59689613 0.88524828 0.46945148 0.5502329 0.498617781

SSC 2.37E-01 0.494802116 0.578375181 0.083233998 0.18740584 0.18740584 0.00392373 0.24530788 0.25179553 1.40E+00 1.34400468 1.54209707

FIR 7.170281047 5.033254431 4.888712613 4.520577303 1.67200654 1.67200654 1.34706948 0.77148056 0.88702386 0.41251815 0.38131046 0.29272458


ANEXO D. RESULTADOS DE LOS CÁLCULOS DE CHI

CUADRADA Y DISTANCIA GÉNICA

• Resultados de las pruebas Chi cuadrado de la bondad de ajuste de una distribución

observada a una teórica que en este caso sería la correspondiente a la segregación

mendeliana 1:2:1 (proporciones poblaciones 25% - 50% - 25%) con el programa

estadístico Minitab para cada línea del proyecto ETHQV8.1

Tabla-D1. Chi cuadrado calculado para R5.




UPC - BarcelonaTech






UPC - BarcelonaTech

En el caso de la R79, el resultado del estadístico de la Chi cuadrado calculado fue mayor que

el de Chi cuadrado crítico (5,9915). Se procedió a realizar una corrección de Bonferroni para

ampliar el rango de aceptación de la hipótesis nula o H0.

Nueva 𝛼 = 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 𝛼

𝑁° 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝑠

Nueva 𝛼 = 0,05

9 = 0,0055

Se consideró la nueva alfa (0,0055) para obtener un nuevo valor de Chi cuadrado crítico o tabulado, la cual fue 10,3859, y por tanto mayor que 10,3636, el valor de Chi cuadrado calculado para la R79.

Tabla -D9. Chi cuadrado calculado para R79.


• Cálculo de la distancia genética del QTL MAK_10-1:

cM=𝑁° 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑎𝑛𝑡𝑒𝑠

𝑁° 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑑𝑖𝑣𝑖𝑑𝑢𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ∙ 100

cM= 116

384 ∙ 100 = 30,21 cM

30,21

2= 15,10 cM

Al tener dos cromosomas Cucumis melo, se dividió entre dos el primer resultado. Para saber la distancia física se restó la posición de un marcador al otro.

2206788 – 424008 = 1782780 pb (1,78 Mb).

15,10 𝑐𝑀

1,78 Mb= 8,47

𝑐𝑀

𝑀𝑏

mapeo fino de dos qtls asociados a la maduraciÓn

Documents