manualmediosdecultivo (1)

Autores: Alfredo Guilln, Nora Bravo

2008

Preparacin de Medios de Cultivo y Reactivos

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PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS PARA EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

CLINICA

AUTORES

Alfredo Guilln Oneeglio

Mdico Cirujano

Profesor Asociado

Facultad de Tecnologa Mdica, Universidad Nacional Federico Villarreal.

Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Alas Peruanas

Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Peruana Los Andes

Jefe de Microbiologa, Laboratorio, Clnica San Borja.

[email protected]

Nora Bravo Cruz

Biloga

Profesor Asociado

Facultad de Ciencias Naturales y Matemtica, Universidad Nacional Federico Villarreal

Cubierta: Foto de una placa de agar TCBS con un cultivo de Vibrio cholerae

Lima, Marzo del 2008

1ra Edicin.


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TABLA DE CONTENIDO

Pag. Pag.

Introduccin 3 Caldo peptonado alcalino 38

Medios de cultivo 4 Caldo peptonado con cloruro de sodio 39

Componentes de los medios de cultivo 7

Clasificacin de los medios de cultivo 9 Caldo tripticasa soya 40

Preparacin de medios 10 Caldo urea segn Stuart 41

Criterios de calidad de los medios de Medio de Mueller Hinton 42

Cultivo 14 Medio de transporte de Amies 43

Descripcin de los medios de cultivo 16 Medio de transporte de Cary y Blair 44

Agar azul de bromotimol - lactosa - Medio MR VP (rojo de metilo y Voges

cistina (Brolacin o Cled) 17 Proskauer) 45

Agar almidn 18 Medio OF (oxidacin/fermentacin)

Agar bilis esculina 19 segn Hugo y Leifson 46

Agar chocolate 20 Medio SIM (sulfuro, indol, movilidad) 47

Agar citrato de Simmons 21 Preparacin de reactivos y colorantes 48

Agar DNAsa 22 Colorantes de Gram 49

Agar EMB (eosina - azul de metileno) 23 Colorantes para Ziehl Neelsen 50

Agar lisina fierro (LIA) 24 Estndar de turbidez Escala de

Agar Mac Conkey 25 Mc Farland 51

Agar Mac Conkey Sorbitol 26 Prueba de oxidasa 52

Agar manitol salado 27 Reactivos para MR VP 53

Agar nutritivo 28 Bibliografa 54

Agar Saboraoud glucosa 4% 29

Agar sangre 30

Agar sangre azida 31

Agar SS (Salmonella Shigella) 32

Agar TCBS (tiosulfato, citrato, bilis,

sacarosa 33

Agar tripticasa soya (TSA) 34

Agar urea segn Christensen 35

Agar XLD (xilosa, lisina, desoxicolato) 36

Caldo infusin cerebro corazn (BHI) 37


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INTRODUCCION

El laboratorio de microbiologa clnica necesita para el procesamiento de muestras preparar medios de cultivo que permitan el desarrollo de un gran nmero de bacterias diferentes y adems necesita medios para la identificacin, pruebas de patogenicidad y determinar la susceptibilidad antibitica de lo que han aislado. Para la preparacin de medios y reactivos necesitan contar con manuales de procedimientos que describan paso a paso como deben hacer para que el medio resultante sea el adecuado para la muestra o microorganismo investigado, pero tambin debe ser preparado siguiendo reglas estrictas que garanticen un buen desempeo y que el resultado no pueda ser alterado. Existen una serie de manuales, disponibles tanto en formato fsico como electrnico, orientados para laboratorios de microbiologa generales, con muchos medios descritos para la parte clnica, farmacutica, industrial, alimentos, etc. Este manual describe los medios mas utilizados en la parte clnica, en los cuales los laboratorios necesitan solo unos pocos que le permitan un adecuado diagnstico y pruebas complementarias. Se ha incluido la preparacin del medio de hemocultivo. Esta primera edicin no esta completa, faltan algunos medios y reactivos que se aadirn en las prximas ediciones. En la bibliografa se estn colocando los libros sobre medios de cultivo mas utilizados en nuestro medio.


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MEDIOS DE CULTIVO

1. GENERALIDADES

Las necesidades nutricionales de las bacterias varan considerablemente; mientras que algunas slo requieren de sustancias simples por lo que son llamadas bacterias no exigentes, otras necesitan de sustancias complejas como la sangre, el suero, la albmina o plasma y se les llama bacterias exigentes.

Los medios de cultivos son sustancias o compuestos nutritivos que permiten el desarrollo microbiano en el laboratorio, el pH est generalmente entre 6,8 a 7,6 en el caso de medios usados en microbiologa clnica. Estos medios nos van a permitir lo siguiente:

Aislamiento de microorganismos. Identificacin y clasificacin de bacterias. Conservacin de cultivos. Obtencin de toxinas, enzimas, antibiticos y otros metabolitos. Realizar pruebas especiales, como la susceptibilidad antimicrobiana. Crecimiento y recoleccin para la preparacin de antgenos usados como diagnstico o

tratamiento (vacunas).

2. ASPECTOS HISTRICOS

El siglo XIX fue una poca de grandes cambios en la historia de la microbiologa, uno de ellos fue el descubrimiento de los agentes infecciosos que causaban enfermedades, y un paso importante fue el aislamiento de las bacterias de los tejidos y fluidos biolgicos. Lus Pasteur (1822-1895) y Roberto Koch (1843-1910) fueron las mayores figuras en el establecimiento de la ciencia de la microbiologa, identificando los agentes causales de una gran cantidad de enfermedades infecciosas bacterianas en el siglo XIX.

2.1. Roberto Koch - El Padre de los medios de cultivo

Los xitos de Koch en bacteriologa estuvieron basados en su tcnica de usar medios de cultivo que eran slidos y transparentes para cultivar las bacterias y separarlas en colonias de organismos para posterior identificacin. Su primer xito fue el aislamiento de Bacillus anthracis, el reconocimiento de la espora como forma de resistencia del organismo y la prueba de especificidad patolgica, causando la enfermedad del ntrax en animales experimentales despus de varios pasajes del organismo a travs de cultivos artificiales. Este ltimo paso estableci los postulados de Koch-Henle, los cuales fueron publicados en 1882: el organismo debe ser constantemente asociado con la enfermedad; este debe ser aislado y crecer en cultivo puro y el cultivo puro debe mostrar que induce la enfermedad cuando es inoculado dentro de animales experimentales.

El trabajo con ntrax fue emprendido usando portaobjetos cubiertos, sellados con aceite. Los lquidos de cultivo usados fueron suero estril de vaca o humor acuoso tomado del ojo de un buey. Koch ide el primer microscopio con "platina caliente" y de esta manera incub los cultivos mientras observaba directamente el desarrollo del crecimiento bacteriano y la esporulacin.

La importancia de los postulados de Koch fue demostrada cuando obtuvo cultivos de bacilos similares al ntrax del profesor Ferdinand Cohn en el Instituto de Fisiologa de Plantas en Breslau. Estos organismos no eran patognicos en animales de experimentacin y fueron ms tarde clasificados como Bacillus subtilis. Lo ms importante fue que los postulados de Koch establecieron la especificidad del organismo y enfermedad. Sin el cuidadoso trabajo con cultivos puros, no podra haberse establecido la bacteriologa clnica.

2.2. El Desarrollo de los Medios Slidos

Aunque su trabajo, publicado en 1876, fue el comienzo de la fama de Koch como bacterilogo, l supo que la tcnica que us requera una meticulosa preparacin y no garantizaba obtener cultivos


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puros. El buscaba un mtodo simple y confiable que pudiera ser fcilmente llevada a cabo en un laboratorio bacteriolgico.

Koch tena conocimiento de los intentos anteriores de investigadores para hacer crecer organismos en una superficie slida; Bartolomeo Bizio haba publicado en 1832 la aparicin de "manchas de sangre" sobre el pan y obleas comunes y fue capaz de subcultivar el organismo sobre otra superficie de pan en cultivo puro y ponerle el nombre a una bacteria que actualmente se conoce como Serratia marcescens. Schroeter en 1872, llev a cabo un trabajo similar en bacterias cromognicas, hacindolos crecer sobre varios sustratos slidos tales como papa, albmina de huevo coagulado, pasta de almidn y carne.

Aunque satisfactoria para organismos comensales cromognicos, el mtodo fall cuando se intent con organismos patgenos no pigmentados. Koch observ que pocos organismos patgenos crecan sobre papa y la opacidad de los otros substratos disponibles evitaba la adecuada inspeccin de las colonias que crecan. Luego se dedic a describir varios caldos, los cuales podan soportar el crecimiento de bacterias patgenas y un medio slido que era la gelatina nutritiva.

La tcnica de Koch fue verter gelatina nutritiva preesterilizada sobre placas de vidrio estriles y permitir la formacin de un gel transparente y claro, bajo una campana o jarra protectora. El gel fue inoculado con un asa cargada estriando la superficie y luego llevado a una incubadora. Despus de la incubacin, las colonias aisladas de organismos eran cultivados sobre otras placas o en la base o pico de gelatina en tubos que tenan un tapn con algodn.

Koch se dio cuenta que su tcnica era aplicable tambin para valorar el nmero y grupo de microorganismos hallados en el aire, agua, tierra, alimentos, etc. En 1881 demostr el mtodo en el Congreso Mdico Internacional en Londres, ante una audiencia que inclua a Luis Pasteur y Joseph Lister.

2.3. La Placa de Agar

Aunque la placa de gelatina nutritiva fue el mayor avance sobre cualquier sistema precedente, la gelatina tena dos desventajas: cambiaba de gel a sol por encima de los 25 C, imposibilitando que este sea incubados a 37 C y era hidrolizado por la gelatinasa, una enzima producida por la mayora de bacterias proteolticas.

Este problema fue resuelto por la sustitucin de la gelatina por agar. El crdito para el uso del agar en bacteriologa debe otorgarse a Fanny Eilshemius (1850-1934) quien naci en New Jersey. Fanny viaj a Europa en 1874 y se cas con Walter Hesse (1846-1911), un doctor de distrito en Schwartzenberg, Sajonia. El Dr. Hesse estaba experimentando con la bacteriologa del aire y uso medios con gelatina para revestir las superficies interiores de tubos de vidrio. Al igual que otros investigadores, el observ que la gelatina se disolva a altas temperaturas ambientales y se licuaba en presencia de enzimas bacterianas. Frau Hesse, quien fue tambin la tcnica e ilustradora de Walther, sugiri el uso del agar, que ella y su madre usaban para preparar jaleas de fruta segn la recomendacin que le fue dada por unos amigos holandeses que vivieron en Java. El agar haba sido usado por generaciones como agente gelificante, satisfactorio para climas clidos.

El agar es un polisacrido derivado de algas rojas. Sus temperaturas de disolucin (85-90C) y gelificacin (34-42C) lo hicieron ideal para los medios de cultivo. El Dr. Hesse hall este agente gelificante estable al calor y enzimas, slido, transparente y fcilmente esterilizable, altamente satisfactorio para sus estudios del aire. Cuando l visito a Koch durante unas semanas en su nuevo laboratorio en el Imperial Health Agency a finales de 1881, le pas esta informacin. Koch ensay el agar y estuvo igualmente impresionado con su rendimiento en los medios de cultivo. El lo us en sus investigaciones sobre el bacilo tuberculoso y lo mencion en el subsecuente manuscrito en una corta oracin. Hesse public su reporte sobre la bacteriologa del aire en 1884 pero no fue hasta 1939 que Fanny Hesse recibi pblicamente el crdito que se mereci por su contribucin a la bacteriologa, cinco aos despus de su muerte.

La simple creacin de una placa de agar, transparente y estril, el cual poda ser incubado a temperaturas de hasta 60 C, que an as pueda ser inoculado en fro y en estado licuado a 40 C para obtener conteos de unidades formadoras de colonias de bacterias, persisten como las bases de la bacteriologa prctica.

En 1887 Richard Petri, otro investigador que trabajaba con Koch, modific la placa plana de vidrio y la campana en la placa, por placas dobles de 10-11 cm de dimetro y 1-1,5 cm de altura. La contribucin de Petri permanece hasta nuestros das como un ejemplo de buen diseo funcional el


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cual no ha sido alterado, excepto que ahora puede estar hecho de plstico descartable.

2.4. El desarrollo comercial de los medios de cultivo

Koch y sus contemporneos usaron infusiones o extractos de carne como el lquido nutritivo base para el crecimiento de organismos. El extracto de carne fue bien conocido en Alemania, siguiendo el trabajo de Justus von Liebig y su "extractum carnis", un extracto concentrada de res. Este producto era tambin muy caro para ser producido comercialmente en Europa pero George Giebert estableci la produccin a gran escala en Fray Bentos en Uruguay.

Aunque el extracto de carne es una fuente valiosa de factores de crecimiento de la bacteria, este no tiene suficientes nitrgeno para dar un crecimiento ptimo. Frederick Loeffler, cuando estaba investigando Corynebacterium diphtheriae, adicion peptona y cloruro de sodio a la infusin de carne, elevando a la vez los niveles de nitrgeno y presin osmtica a concentraciones satisfactorias para el crecimiento de las bacterias.

La peptona, descrita por Lehmann en 1849 que era un derivado de la digestin enzimtica de la carne, fue producida en el siglo XIX como un producto farmacutico y prescrito para desrdenes nutricionales. E. Merck de Damstadt report en 1892 la elaboracin de peptona para ser usada en la preparacin de los medios de cultivo. Entre 1912 y 1913 E. Merck describi peptonas producidas a partir de la digestin de albmina srica y de casena.

2.5. Produccin de medios deshidratados

Por tradicin los extractos de carne fueron preservados por concentracin por lo que el agua disponible (aw) inhiba el crecimiento de cualquier organismo contaminante. Peptonas y otras protenas hidrolizadas fueron preservadas, a escala comercial, por desecamiento del producto final en vaco para producir un grnulo grueso. Ms tarde, un mtodo ms eficiente y menos daino fue usado, la liofilizacin.

En Inglaterra el pionero en este campo fue Frederick Chopping, quien demostr los medios de cultivo deshidratados en 1910 en una reunin de la Sociedad Microscpica. El expandi la produccin de medios deshidratados en el stano de su casa y ms tarde se traslad a una pequea fbrica local durante la Primera Guerra Mundial.

Doerr manifiesta en el "Hanbuch der Mikrobiolgischen Technik" de Kraus y Uhlenjut que l haba preparado medios en polvo en 1909 secndolos sobre un cristal. W.D. Frost en 1910 presenta en una reunin de "Society of American Bacteriologists" muestras de sus medios deshidratados. La aplicacin prctica de la deshidratacin de medios de cultivo fue iniciada y preparada por Laboratorios Difco de USA en 1915, bajo la direccin del Dr. J.W. Bunker.

Existen actualmente muchas compaas que producen medios deshidratados, y tambin medios listos para ser inoculados lo cual hace que la bacteriologa y la micologa hayan llegado a un grado muy grande de desarrollo.


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COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Roberto Koch reconoci que no exista un medio de cultivo universal, el cual pudiera soportar el crecimiento de todas las bacterias, por lo que empezaron a aparecer diferentes frmulas y modificaciones de estas. En 1930 Levine y Schoenlein describieron 2543 medios publicados, no se conoce el nmero actual de medios existentes.

La expansin de la microbiologa de la medicina a la agricultura, procesamiento de alimentos y aplicaciones industriales ha sido responsable del incremento de los medios de cultivo. As como el desarrollo de medios indicadores, diferenciales y selectivos, que contienen sustancias inhibitorias tales como qumicos, antimicrobianos y colorantes, en diferentes concentraciones y combinaciones.

Sin embargo el laboratorio de Microbiologa Clnica no puede tener una amplia gama de medios, por lo general tiene 10 a 20 medios de uso comn, y algunos medios especiales que son utilizados solo cuando el mdico solicita alguna prueba especial, el aislamiento de determinados agentes por la naturaleza de la enfermedad que tiene el paciente.

Un examen de los catlogos de los productores de medios de cultivo revelara muchas frmulas diferentes de los medios. Ellos varan de unos pocos constituyentes a largas listas de componentes cuya funcin en el medio podra no ser obvia. Es posible, sin embargo, identificar una estructura comn en cada frmula y deducir la funcin de sus ingredientes. De esta manera los componentes podran caer dentro de una o ms de las siguientes categoras:

1. Nutrientes aminados y nitrogenados: Relativamente pocos organismos pueden utilizar protenas calentadas y desnaturalizadas como fuente aminada y nitrgenada porque necesitan depender de la excrecin de enzimas proteolticas extracelulares. Por lo tanto, es necesario suplementar con peptonas, protenas predigeridas por hidrolisis cida, extractos o infusiones acuosas de materiales proteicos.

2. Factores de crecimiento: Una serie de diversos complejos, como sangre, suero, vitaminas, NAD, a menudo sustancias termolbiles, esenciales para el crecimiento de microorganismos fastidiosos o particularmente exigentes, los cuales no se presentan en medios no suplementados. Estos factores no solo cumplen un rol nutricional, por ej. la sangre completa en medios de cultivo para el aislamiento de Bordetella, Neisserria, Campylobacter y Legionella sino tambin actan como un agente protectivo contra radicales txicos.

3. Fuente de Energa: Usualmente glucosa, lactosa o algn carbohidrato similar que puedan ser fcilmente utilizadas con la intencin de suministrar una fuente fcilmente accesible de energa. Existen medios sin carbohidratos, y en su lugar tienen peptonas o sustancias similares, como citrato, como fuente de carbono y energa.

4. Sales tamponadas: por ej. Sales de fosfato, acetatos y citratos, que si bien pueden dar una fuente de energa, sirven para mantener la estabilidad del pH si se produce fermentacin de los carbohidratos. Debe notarse, sin embargo, que los tampones salinos comunes usados en los medios de cultivo podran tambin quelar metales esenciales.

5. Sales minerales y Metales: como fosfatos, sulfatos, Ca+ +, Mg+ +, Fe+ + +, Mn+ + y trazas de metales que pueden ser adicionadas en macro (mg/l) o micro (g/l) niveles para mejorar el crecimiento. Los metales esenciales estn normalmente presentes como contaminantes en otros componentes del medio, en adecuados niveles para el crecimiento microbiano. Los suplementos especficos a menudo estn ausentes, a menos que sean para superar los efectos quelantes de componentes competidores en el medio. Una comn razn para el uso de estos aditivos es el mejoramiento e identificacin de una reaccin bioqumica particular. En estas circunstancias ellas actan como sustancias indicadoras, por ej. Fe+ + y sulfitos.

6. Agentes selectivos: que pueden ser agentes qumicos, antibiticos, colorantes inhibidores, etc. Una amplia variedad de sustancias inhibidoras han sido usadas en los medios de cultivo. Los agentes qumicos tradicionales son menos precisos que los antibiticos y colorantes, sin embargo, se debe tener en cuenta que en un medio selectivo no todos los organismos no deseados podran ser inhibidos, ni todos los organismos deseados podran crecer. La selectividad de qumicos y colorantes es afectada por la cantidad y tipo de sustancias nutrientes presentes que pueden disminuir o mejorar


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la selectividad.

7. Colorantes indicadores: como el Rojo de fenol, rojo neutro, prpura de bromocresol. Estos colorantes son adicionados para indicar cambios en el pH del medio, durante y despus del crecimiento de microorganismos, particularmente cuando se ha aadido azucares a la frmula. Estos colorantes pueden ser txicos para algunos organismos de manera que la cantidad presente es crtica y se debe realizar un adecuado control de calidad con organismos conocidos.

8. Agentes gelificantes: El agar es el agente gelificante predominante usado debido a sus ventajas naturales. No es, sin embargo, un agente inerte; es un extracto de algas y contribuye con metales, minerales, sulfato, piruvato, etc., as como ejercer un efecto significante sobre la unin con el agua. Tambin se puede utilizar gelatina o alginato.

Cuando los constituyentes individuales de los medios son colocados en una o ms de las categoras arriba mencionadas, la explicacin de la frmula puede ser advertida.


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CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1. Por su estado fsico en:

Slidos cuando contiene entre 1,2 a 1,5% de agar Semislidos, que tienen entre 0,3 a 0,8% de agar Lquidos, llamados caldos, cuya concentracin de agar es 0 a 0,1%

2. De acuerdo a su aplicacin en:

Medios comunes o simples: que permiten el desarrollo de la mayora de las bacterias sobre todo las no exigentes, como el caldo peptonado, el caldo nutritivo o el agar nutritivo.

Medios especiales: que se forman a partir de un medio simple y se les aade diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada:

Medios de enriquecimiento: permiten el crecimiento de un mayor nmero de bacterias, se utiliza cuando el inculo o muestra tiene un nmero reducido de ellas, ej. caldo tripticasa soya, caldo selenito, medio de hemocultivo.

Medios enriquecidos: cuando se les adiciona sustancias de mayor contenidos nutritivo como sangre de carnero, sangre de conejo, sangre de caballo, huevo, extracto de levadura, etc., permitiendo cultivar bacterias que son exigentes en sus necesidades nutricionales, Ejs.: Agar sangre de carnero para el desarrollo de Streptococcus; Medio de Ogawa para el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis; Agar chocolate para el crecimiento de Neisseria.

Medios selectivos: tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de un tipo de bacterias y al mismo tiempo inhibir el crecimiento de otras. Para esto se les aade al medio de cultivo sustancias llamadas inhibidores, como pueden ser las sales biliares, colorantes, sustancias qumicas e inclusive antibiticos. Ejemplos con el agar SS para el aislamiento de Salmonella y Shigella, Agar TCBS para el cultivo de Vibrio cholerae, y el agar Mac Conkey donde solo crecen enterobacterias.

Medios diferenciales: son los que permiten identificar y/o clasificar a las bacterias, observando la actividad del microorganismo frente a uno o ms substratos y observando su actividad viendo el crecimiento, o el cambio de un indicador de pH. Ejemplos son el agar Triple Sugar Iron (TSI), el Lysine Iron agar (LIA) y el agar Citrato de Simmons, que se utilizan en la identificacin de enterobacterias.

Medio de Transporte: se utiliza para trasladar las muestras desde el sitio de obtencin de la muestra hasta el laboratorio para ser procesado. Ejemplos: Medio de Amies con Carbn y el medio de Cary y Blair.

En muchas veces, se combinan las caractersticas de cada uno de estos tipos de medios y tener uno que puede ser, por ejemplo, enriquecido y selectivo a la vez como el Medio de Thayer Martin, que es un agar chocolate al cual se aadido un suplemento de antibiticos que permite aislar Neisseria gonorrhoeae y evitar la flora bacteriana acompaante.


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PREPARACIN DE MEDIOS

1. Los pasos generales Corrientemente para la preparacin de un medio de cultivo se siguen los siguientes pasos:

Pesado del medio en polvo. Rehidratacin con agua destilada. Disolucin completa (con ayuda del calor en el caso de que se trate de un medio que

contenga agar).

Distribucin en frascos o tubos (si es necesario, dependiendo del tipo de medio). Esterilizacin, que puede ser en la autoclave a 121C, a 15 libras de presin y por 15 minutos

o por filtracin. Algunos medios que son sensibles al calor pueden ser solo calentados y luego distribuidos en placas (plaquo).

Enfriar a 50 55 C. Adicionar suplementos de enriquecimiento (sangre, plasma u otros) o suplementos selectivos

(antibiticos, sustancias qumicas).

Plaquo o distribucin en tubos. Estos pasos varan dependiendo del tipo de medio, por lo que siempre se debe seguir las indicaciones que se encuentran en la etiqueta del frasco o en los manuales de los fabricantes y los de preparacin de medios.

2. Los medios deshidratados

Los medios deshidratados son higroscpicos y sensibles a la humedad, el calor y la luz. Se deterioran con los cambios bruscos de temperatura. Las condiciones de conservacin se pueden encontrar en la etiqueta del producto. Se deben seguir las siguientes indicaciones:

Escribir en la etiqueta el nmero de orden de acuerdo a una base de datos o registro donde se coloquen las caractersticas del frasco.

Escribir en la etiqueta la fecha de recepcin en el laboratorio. Conservar como se indica en la etiqueta, usualmente por debajo de 25C, en un lugar seco,

al abrigo de la luz solar, autoclaves, hornos u otra fuente de calor. Cuando se indique guardar de 2 a 8C.

Comprobar la fecha de vencimiento en la etiqueta, no se debe utilizar frascos vencidos. Utilizar ordenadamente cada lote. No se debe abrir un nuevo envase hasta que el anterior

este vaco.

Despus de utilizar un frasco, asegurar que el envase est bien cerrado y devolverlo a su lugar de almacenamiento.

Solicitar el medio en envase de tamao adecuado de acuerdo a las necesidades normales del laboratorio. Un medio en un recipiente grande que se abre y cierra repetidas veces se deteriora.

Por lo general, los medios granulados son ms resistentes a la humedad que los medios en polvo.

Si solo se dispone de un envase grande (500 g), es conveniente en algunos casos trasvasar a un envase pequeo (de aproximadamente 100 mL), que tenga tapa hermtica, como en el caso de agar XLD o el caldo selenito, los cuales con las condiciones de humedad que hay en algunas ciudades como Lima y las cantidades que se utilizan, pueden deteriorarse rpidamente. La mayor parte de manuales de medios de cultivo indican que no se debe subdividir los frascos pues se puede producir alteraciones por efecto del ambiente, por lo que


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se debe considerar hacerlo solo en casos muy especiales.

Desechar un medio si el polvo no se mueve libremente, si ha cambiado de color o si el aspecto del medio rehidratado es anormal.

3. Preparacin de los medios de cultivo

Pesado de los ingredientes

El material de vidrio debe estar completamente limpio y libre de sustancias detergentes. El matraz a utilizarse debe tener un volumen superior a la cantidad de medio a prepararse, es

decir si vamos a preparar 150 mL de medio de cultivo, el recipiente debe ser por lo menos de 250 mL. No debe llenarse el frasco debido a que al momento de esterilizar, el agua hierve y puede derramarse o ser absorbida por el tapn de algodn.

Para preparar el medio de cultivo a partir de sus ingredientes, estos se debern pesar exactamente uno a uno y colocarlos en el baln.

Para preparar utilizando un medio comercial deshidratado, se debe leer cuidadosamente las instrucciones del fabricante y tomar exactamente la cantidad indicada, teniendo cuidado de cerrar hermticamente el frasco inmediatamente despus de haberlo utilizado.

Agregar el volumen de agua destilada o desmineralizada necesaria, preferentemente en dos partes, primero la mitad del volumen y se agita suficientemente para conseguir una suspensin homognea. Despus se incorpora la cantidad restante, aprovechando de esta para desprender las partculas de medio de cultivo que pudieran quedarse adheridas a la pared interna o en la boca del recipiente .

Foto 1. Se observa un matraz que contiene una cantidad de medio que es la mitad del volumen del frasco, como todava no se ha calentado se puede observar la presencia de partculas de agar en la pared del frasco

Disolucin

Si el medio contiene agar o gelatina, es necesario disolverlo con ayuda del calor. Este calentamiento se puede realizar en un bao Mara, en un mechero con ayuda de una rejilla o utilizando un horno microondas, hasta que se alcance su completa disolucin, esto se reconoce cuando al agitar no se adhiere ninguna partcula de agar a la pared interna del recipiente. No debe olvidarse que todos los medios de cultivo son sensibles al calentamiento, por este motivo no debe calentarse ms de lo estrictamente necesario. Los medios de cultivo


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que no contienen agar o gelatina son solubles en agua fra.

Es necesario que el medio de cultivo se encuentre al pH indicado. Con los medios comerciales y utilizando agua destilada neutra no es necesario su medicin, pero cuando se prepara por componentes es necesario realizarla, para lo cual se utiliza un potencimetro o papel indicador de pH que tenga un rango til de 4,0 a 10,0. El valor de pH se ajusta a los intervalos previstos con la adicin de gotas de cido clorhdrico 1N o hidrxido de sodio 1N.

Preparacin de medios en tubos

Si se utilizan medios semislidos, estos deben ser distribuidos en los tubos que se van a utilizar antes de esterilizarlos, despus de ella dejarlo enfriar en posicin vertical.

Cuando se quieren colocar medios slidos en tubos igualmente se les debe distribuir en sus envases finales y luego de autoclavar dejarlos enfriar en posicin inclinada o semi inclinada.

Esterilizacin

Antes de la esterilizacin es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones pequeas, de ser posible en los recipientes definitivos en los que posteriormente se llevara a cabo el trabajo (a excepcin de las placas Petri).

Si las instrucciones del fabricante no indican otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en la autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Vertido en placas o plaquo

Antes de verter el medio de cultivo en las placas Petri es necesario que el medio se encuentre a una temperatura de 45 a 55C para evitar que se formen gotas de agua de condensacin en la tapa de las placas. En la prctica a esta temperatura es posible sostener el frasco con el medio con la mano desnuda sin quemarse.

Se puede aadir los suplementos nutricionales o selectivos que deben estar a temperatura ambiente, mezclar bien el medio.

Se agita el recipiente que contiene el medio de cultivo en forma circular para asegurar que halla una mezcla uniforme y flameando previamente la boca del recipiente se agregar el medio de cultivo a las placas Petri que se encuentran cerca del mechero, aproximadamente 16 a 18 mL a cada una.

Si se forma burbujas de aire en la superficie del medio, estas se pueden eliminar flameando rpidamente la superficie con la llama del mechero de Bunsen.

Se debe dejar que se enfre el medio de las placas a temperatura ambiente. Si la superficie del medio quedara hmeda, puede colocarse las placas en estufa a 37C, dejando las tapas ligeramente abiertas y con el lado que contiene el medio hacia arriba por 30 minutos.

Luego que el medio este listo, puede colocarse en la refrigeradora si no se va a usar de inmediato. Una placa de cada lote preparado deber colocarse en la estufa a 37C para verificar su esterilidad.

Guardar las placas en posicin invertida en el refrigerador hasta el momento de usar. Precauciones

Se debe evitar volver a disolver los medios o dejarlos ms de 3 horas en bao Mara (50C), sobre si el medio tiene pH cido, lo que produce una hidrlisis del agar y no se gelifica.

En el caso del agar chocolate se debe volver a calentar el medio a 80C y dejarlo por 10 a 30 minutos, hasta que el medio adquiere el color chocolate. Una temperatura ms elevada deteriora el medio. Luego se deja enfriar a 55C para plaquear.

4. Conservacin de medios preparados.

La vida de los medios preparados vara considerablemente. Algunos medios en envases hermticos pueden durar hasta 6 meses a baja temperatura.

Se debe tener en cuenta de que los colorantes y algunas sustancias inhibitorias son sensibles a la luz y el calor por lo que es importante conservar todos los medios preparados fuera de la


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luz. NO se deben congelar los medios. Los medios recin preparados son superiores los conservados.

Se deben examinar los medios preparados antes de ser inoculados. Observar si hay presencia de contaminacin, cambios en el color, hemlisis o signos de deshidratacin como retracciones, fisuras o cambios de volumen. Desechar cualquier placa o tubo defectuoso.

No se debe incubar las placas toda la noche como prueba de esterilidad, es conveniente secar las placas en la incubadora por 10 a 30 minutos antes de inocular, esto es importante sobre todo cuando se inoculan muestras de heces, en los cuales la presencia de Proteus puede dar un crecimiento en velo que impide realizar el diagnstico de enteropatgenos. Algunas bacterias son sensibles al cambio de temperatura, por lo que una preincubacin es importante para tener los medios a una temperatura adecuada.

Foto 2: Conservacin de medios diferenciales en tubos de vidrio con tapn de jebe

5. Rendimiento del medio de cultivo en diferentes envases

Cantidad de medio preparado

100 mL 250 mL 500 mL 1 L

Tubos con 2 mL 50 125 250 500

Tubos con 2.5 mL 40 100 200 400

Tubos con 3 mL 33 82 165 330

Tubos con 4 mL 25 62 125 250

Tubos con 5 mL 20 50 100 200

Placas 100 x 15 5-6 12-15 25 - 30 50-60

Placas medio Mueller Hinton 100 x 15

4-5 10-12 24 48-50

En el caso de las placas, si obtenemos un nmero mayor del especificado, indica que el medio que hemos preparado esta muy delgado y no le estaremos ofreciendo a la bacteria los nutrientes suficientes para su desarrollo o si es un nmero menor indicara que el medio es muy grueso y estamos desperdiciando material. Esto es crtico sobre todo en el agar Mueller Hinton que se utiliza para los antibiogramas debido a que la norma indica que debe tener una profundidad de 4 mm.


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CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS

Como cualquier reactivo o procedimiento de laboratorio, los medios de cultivo deben pasar controles de calidad para asegurar que en la preparacin o conservacin de los medios se han seguido los pasos necesarios para que el producto no sea alterado y evitar resultados que pueden conducirnos hacia un diagnstico errado.

Para eso se debe utilizar medios de casas comerciales que cumplan normas de calidad, buenas prcticas de manufactura y una adecuada distribucin que garantice sus productos.

En el laboratorio se debe contar con un programa de control de calidad que es parte del sistema de aseguramiento de la calidad del laboratorio.

1. Control de calidad de los medios preparados

El laboratorio de microbiologa deber realizar el control de calidad para comprobar si las caractersticas del medio estn dentro de la especificacin y si la metodologa de preparacin del medio resulta satisfactoria. Cada lote de medio debera someterse a un programa mnimo de ensayo que asegure su aceptacin:

pH: Comprobar el pH del medio preparado al final cuando este alcance la temperatura ambiente (25C), que debe coincidir con lo sealado en la etiqueta.

Esterilidad: Se toma una muestra representativa de cada lote, que es incubado de 2 a 5 das. Despus de la incubacin no debe haber desarrollo microbiano. Las muestras deben ser descartadas.

Capacidad de crecimiento y presencia de reacciones tpicas: sembrar el medio con cepas conocidas o cepas de referencia como las ATCC.

Estabilidad: el medio preparado debe mantener por un tiempo razonable (dependiendo del tipo de medio) sus caractersticas siempre que se guarde de una manera apropiada.

Si el medio no rene las condiciones deseadas, se debe anotar la naturaleza del problema, el mtodo de preparacin, el nmero de lote y la fecha de recepcin y comunicarse con el departamento de Servicio Tcnico del proveedor.

2. Control de calidad de la conservacin de medios preparados

Los medios preparados deben descartarse cuando se observen cualquiera de estas caractersticas. Es importante investigar porque se han producido pues en algunos casos se puede remediar en la preparacin de los siguientes lotes.

Rajadura de las placas: se han colocado demasiadas placas una encima de otra o se ha ejercido un aumento de peso sobre ellas.

Rajadura en la superficie del medio: medio se ha conservado demasiado tiempo o ha estado en algn lugar con una temperatura alta.

Variaciones en el volumen del medio: el medio se ha secado. Hemlisis: tiempo de conservacin muy prolongado. Cristales en el medio. Presencia de burbujas: contaminacin. Presencia de cogulos de agar: temperatura de plaqueo muy baja. Cambio de color normal. Contaminacin. Falla en la inhibicin de microorganismos saprofitos.


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3. Fallas y causas en la preparacin de medios de cultivo:

Valor de pH incorrecto: o Medir el pH por encima de los 25C. o Sobrecalentamiento en la esterilizacin, vuelta a fundir o calentamiento prolongado a

50C.

o Solucin incompleta del medio. o Mala calidad del agua. o Recipiente mal lavado o con residuos qumicos. o Mala conservacin del medio deshidratado o vencido.

Turbidez o precipitacin: o Mala calidad del agua. o Sobrecalentamiento. o pH incorrecto. o Solucin incompleta.

Oscurecimiento: o Sobrecalentamiento. o Solucin incompleta. o Alteracin del pH.

Foto 3. Se observa dos tubos de agar lisina hierro de diferentes marcas, una de ellas es de color violeta mientras que el otro presenta un color rojizo que dificulta la observacin de las reacciones bioqumicas.

Gel blando: o Bajo porcentaje de agar en el medio. o Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos. o Sobrecalentamiento. o Mala homogenizacin del medio.


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o Exceso de agua. Crecimiento bacteriano pobre:

o Exceso de calentamiento. o Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente. o Alteracin en el pH.


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DESCRIPCION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO


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AGAR AZUL DE BROMOTIMOL LACTOSA CISTINA (BROLACIN O CLED)

Aplicacin

Es un medio con lactosa y cistina, deficiente en electrolitos. Se utiliza para el aislamiento, identificacin presuntiva y recuento del nmero de bacterias en orina; favorece el crecimiento de todos los MO existentes en orina y proporciona una buena diferenciacin morfolgica de las distintas colonias.

Frmula (en gramos por litro)

Extracto de carne 2 g Peptona 7g

L-cistina 0,128 g Extracto de levadura 2 g

Lactosa 10 g Azul de bromotimol 0,03 g

Agar 12 g

pH final = 7.3 aprox. a 25 C

Preparacin

1. Se suspenden 33g en un litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio completamente.

2. Se esteriliza en la autoclave a 121C durante 15 minutos. Se mezcla bien antes de verter en placas.

3. Las placas con medio son de color azul verdoso y claras.

4. Marcar las placas con BR o CLED

Fundamento

El medio favorece el crecimiento de las bacterias existentes en orina por no contener sustancias inhibidoras y por los nutrientes que contiene. La lactosa permite diferenciar organismos fermentadores de lactosa, que al degradarla viran el indicador de azul verdoso a amarillo; las lactosa negativas alcalinizan el medio produciendo un viraje a verde o azul intenso. La deficiencia de electrolitos del medio evita el crecimiento en velo o "swarming" de especies de Proteus. El crecimiento de Streptococcus se puede visualizar si se aade suero o plasma al medio.

Interpretacin:

Se realiza a las 18 a 24 h. de incubacin a 37 C. teniendo en cuenta que las bacterias lactosa positivas dan colonias amarillas y las lactosa negativas son azules; los estreptococos y Staphylococcus dan colonias amarillas pequeas.

Control de calidad

Cepas de Ensayo % de recuperacin Viraje

Escherichia coli >70% Amarillo

Proteus mirabilis >40% Azul

Pseudomonas aeruginosa >70% Azul

Staphylococcus aureus >70% Amarillo


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AGAR ALMIDON

Aplicacin

El agar almidn es utilizado para cultivos de organismos que se analizan para determinacin de hidrlisis del almidn para su identificacin o para estudios comparativos.


Extracto de carne 3 g Almidn soluble 10 g

Agar 12 g

pH final: 7.5

Preparacin

1. Se suspenden 25 gramos en un litro de agua destilada

2. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente.

3. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C.

4. Repartir en placas Petri 100 x 15.

5. El color del medio preparado es mbar claro ligeramente opalescente.

6. Marcar las placas como ALM

Interpretacin:

Se realiza a las 18 a 48 horas y se le aade una solucin de Lugol al medio, las bacterias que hidrolizan el almidn presentarn un halo claro alrededor de la colonia.

Control de calidad

Cepas de ensayo Hidrlisis Recuperacin

Bacillus subtilis + Buena

Escherichia coli - Buena

Staphylococcus aureus - Buena


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AGAR BILIS ESCULINA

Aplicacin Es un medio diferencial para aislamiento e identificacin presuntiva de Streptococcus del grupo D.


Extracto de carne 3 g Peptona 5 g

Bilis de buey 40 g Esculina 1 g

Citrato Frrico 0,5 g Agar 15 g

pH final = 6.6 aprox.

Preparacin

1. Disolver 64,5 g en 1 L de agua destilada.

2. Calentar hasta disolver completamente.

3. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. a 15 lb de presin.

4. Vertir en placas o tubos inclinados segn se desee.

5. El medio preparado es mbar medio oscuro a oscuro, ligeramente opalescente, el medio con esculina tiene un tinte azulado.

6. Marcar los tubos o placas con BE

Fundamento

Los estreptococos del Grupo D pueden crecer sobre agar con bilis e hidrolizar la esculina, impartiendo al medio un color marrn oscuro dado por el citrato frrico. Las bacterias Gram positivas diferentes a los Streptococos grupo D son inhibidos por las sales biliares. Algunos Streptococos de otros grupos pueden crecer sobre el medio con bilis pero no hidrolizan la esculina por lo que no jmparten color al medio.

Interpretacin:

Se incuba de 18 a 24 h. A 35-37C.

Pueden crecer bien en el medio Streptococcus del grupo D y bacilos gramnegativos. Estreptococos del grupo D y que hidrolizan la esculina dan al medio alrededor de las colonias un tinte marrn oscuro.

Control de calidad

Cepas de Ensayo Crecimiento Hidrlisis Esculina

Proteus mirabilis Bueno -

Streptococcus bovis Bueno +

Enterococcus faecalis Bueno +

Enterococcus faecium Bueno +


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AGAR CARBON DE JONES KENDRICK

Aplicacin

Es un medio selectivo para el aislamiento de Bordetella pertussis a partir de muestras clnicas como hisopado nasofaringeo. Es util para el trabajo en el campo con pacientes sospechosos de pertussis y en los cuales se obtiene la muestra, se cultivo y es enviada al laboratorio para su procesamiento.


Almidn solubre 10 g Extracto de levadura 3,5 g

Caldo infusin de corazn 25 g Agar 20 g

Carbn 4 g

Suplemento antibitico

Cefalexina 40 mg

Preparacin

1. Se disuelven los ingredientes excepto el carbn en un litro de agua destilada.

2. Mezclar bien y calentar agitando frecuentemente, hasta que hierva un minuto para disolver completamente los ingredientes.

3. Agregar el carbn, mezclar bien y autoclavar a 121 C por 15 minutos

4. Enfriar hasta 50 a 60 C, agregar en forma asptica el antibitico y agitar para obtener una mezcla uniforme del agar y el carbn.

5. Dispensar 20 mL en placas Petri o 10 mL en frascos de 50 mL tipo penicilina.

6. Inclinar los frascos para dar la superficie de diseminacin mas amplia posible, sin que se extienda hasta el cuello de la botella.

7. Controlar la esterilidad durante 24 h. a 37 C

8. Sellar las placas (gutapercha) antes de almacenarlas en refrigeracin o colocar tapones de jebe en los frascos.

9. La viabilidad de los medios en estas condiciones es de 2 a 3 meses.

10. Marcar los frascos o placas con ACJK.

11. Tambin se puede mantener el medio estril en frascos con tapa rosca y aadir el suplemento antibitico cuando se necesita el medio.

Fundamento

El medio de ACJK permite el aislamiento de B. pertussis, el uso de carbn evita el uso de sangre permitiendo un medio con un mayor tiempo de vida. La cefalexina es superior a la penicilina y otros antibiticos para inhibir la flora acompaante.


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AGAR CHOCOLATE

Aplicacin

Para el aislamiento de microorganismos exigentes. Es efectivo para el aislamiento de Neisseria y con adicionamiento de ciertos suplementos (por ej. Suplemento B ver Medio de Thayer-Martin y/o agar Columbia) para el crecimiento de Haemophilus influenzae.

Frmula

Se utiliza como base cualquier agar nutritivo sin inhibidores: por ej. Agar tripticasa soya, Agar Columbia base, Medio GC base, Agar Brucella, etc. al cual se le adiciona 5% de sangre desfibrinada estril.

Preparacin

1. Disolver y esterilizar el medio base segn sea el caso.

2. Enfriar hasta 50 a 60C y agregar 5-10% de sangre desfibrinada estril de carnero.

3. Colocar en un bao Mara a 75 a 80C y mantener a esta temperatura por 10 a 20 minutos agitando constantemente.

4. El medio va a cambiar a un tono pardo (chocolate).

5. Enfriar hasta 50C.

6. Repartir en placas o tubos segn se desee.

7. Marcar los tubos o placas con CHOC

Fundamento

El medio base no tiene inhibidores por lo que permite el crecimiento de cualquier microorganismo. Para lograr el crecimiento de microorganismos que necesitan factor X (hematina) y factor V (NAD) se hace hemolizar a los eritrocitos por accin del calor, para que se libere estos factores al medio. La adicin de suplementos o aditivos enriquecen ms an el medio, de acuerdo al fin buscado. Opcionalmente, la adicin de suplementos antibiticos inhibe la flora acompaante no deseada. La temperatura del bao Mara no debe exceder los 80 C porque sino el agar pierde los factores nutricionales.

Control de calidad

Cepa de ensayo Recuperacin del agente

Neisseria gonorrhoeae Buena

Neisseria meningitidis Buena

Haemophilus influenzae Buena


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AGAR CITRATO DE SIMMONS

Aplicacin

Para la diferenciacin e identificacin de Enterobacteriaceas sobre las bases de utilizacin del Citrato como nica fuente de Carbono.


Sulfato de magnesio 0,2 g Fosfato amnico de sodio 0,8 g

Fosfato de amonio dihidrato 0,2 g Citrato de sodio, tribsico 2 g

Cloruro de sodio 5 g Azul de Bromotimol 0,08 g

Agar 15 g

pH final: 6.8

Preparacin

1. Se suspende 23 g en 1 L de agua destilada

2. Hervir hasta disolver el medio por completo.

3. Distribuir 2.5 mL en tubos de 12 x 75 con tapn de algodn.

4. Esterilizar en la autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.

5. Dejar enfriar los tubos en forma inclinada de tal manera que se obtenga un buen plano inclinado y poco fondo.

6. Cambiar los tapones de algodn por tapones de jebe.

7. El medio preparado es verde.

8. Marcar los tubos con CIT

Fundamento

Organismos que son capaces de utilizar el citrato (como nica fuente carbonada) pueden crecer en este medio. La degradacin del Citrato da lugar a la alcalinizacin del medio de cultivo el medio, el cual vira a un color azul oscuro por el indicador Azul de Bromotimol.

Control de calidad

Cepas de ensayo Color del medio Recuperacin

Enterobacter aerogenes Azul Bueno

Escherichia coli Verde Crecimiento Inhibido

Shigella flexneri Verde Crecimiento Inhibido


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AGAR DNAsa

Aplicacin

Se utiliza para la demostracin de desoxirribonucleasa (DNasa) formada por microorganismos.


Triptosa 20 g Cloruro de sodio 5 g

Acido desoxirribonucleco (DNA) 2 g Agar 15 g

pH final: 7.3

Preparacin

1. Se suspenden 42 g en 1 L de agua destilada.

2. Hervir hasta disolver completamente el medio.

3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 C.

4. Repartir en placas.

5. Las placas con medio son ligeramente opalescentes.

6. Marcar las placas con DNA

Fundamento

Las colonias formadoras de DNasa hidrolizan a su alrededor el ADN contenido en el medio de cultivo hasta una mezcla de mono y polinucletidos. Luego de la incubacin se acidifica el medio con HCl 1N, el que reacciona con el DNA, formndose un precipitado turbio, las colonias DNasa positivas presentan un halo claro alrededor, debido a que en dichas zonas ya no existe DNA pues ha sido degradado.

Control de calidad

Cepas de ensayo DNasa

Staphylococcus aureus Positivo

Staphylococcus epidermidis Negativo


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AGAR EMB (EOSINA, AZUL DE METILENO)

Aplicacin

Para deteccin y aislamiento de Enterobacterias.


Peptona 10 g Lactosa 5 g

Sacarosa 5 g Fosfato dipotsico 2 g

Eosina Y 0.4 g Azul de Metileno 0,065 g

Agar 13,5 g

pH final = 7.1 aprox.

Preparacin

1. Suspender 39 g en 1 L de agua destilada y calentar hasta disolver completamente.

2. Esterilizar en autoclave por 15 a 121 C y 15 lb de presin.

3. Luego agitar suavemente para oxidar el azul de metileno (reducido por la esterilizacin), despus verter a placas.

4. El color final del medio es prpura.

Fundamento

Los colorantes eosina Y y el azul de Metileno actan como inhibidores de la microorganismos Gram positivos y como indicadores para diferenciar las bacterias fermentadoras de las no fermentadoras de lactosa. La sacarosa sirve para detectar ciertos miembros del grupo coliforme que la fermenten ms fcilmente que la lactosa. As, las bacterias que fermenten la lactosa y/o sacarosa precipitarn los colorantes en su entorno por lo que las colonias se apreciarn negro-verdosos con brillo metlico, las que no fermenten la sacarosa ni la lactosa no precipitarn los colorantes por lo que se apreciarn transparentes e incoloras.

Interpretacin:

Las placas se siembran por estra y se incuban 24 h. a 37C.

Colonias Microorganismos

Transparentes, de color mbar. Salmonella, Shigella, patgenos intestinales no fermentadores de lactosa ni sacarosa.

Verdosas con brillo metlico a la luz reflejada, 2 a 3 mm de dimetro, centro negroazulado a la luz transmitida.

Escherichia coli.

Ms grandes que las de E. coli, mucosas, confluentes, con el centro pardo-grisceo a la luz transmitida.

Enterobacter, Klebsiella y otros.

Control de calidad

Cepas de ensayo Crecimiento Color de colonias Brillo metlico

Escherichia coli Bueno Violeta +

Klebsiella pneumoniae Bueno Rosa, centro oscuro -

Salmonella typhimurium Bueno Incoloro, transparente -

Bacillus cereus Nulo/Ligero Incoloro -


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AGAR LISINA HIERRO (LIA) Aplicacin

Este medio, basado en la decarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la fermentacin de la glucosa y la formacin de sulfuros, se usa para diferenciar las especies de Salmonella y Shigella de especies de Citrobacter.


Peptona de gelatina 5 g Extracto de levadura 3 g

Glucosa 1 g Lisina 10 g

Citrato de hierro y amonio 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,04 g

Prpura de bromocresol 0,02 g Agar 13 g

pH final: 6.7 0.2

Instrucciones

1. Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos.

2. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin completa.

3. Distribuir 2,5 ml en tubos de 13 x 100 con tapa rosca.

4. Esterilizar a 121C durante 15 minutos con las tapas parcialmente abiertas.

5. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin.

6. Marcar los tubos con LIA

Fundamento

La lisina presente en el medio es decarboxilada a cadaverina y dixido de carbono; en el proceso interviene la lisina decarboxilasa y el medio aumenta de pH haciendo virar el indicador hacia el prpura, en la totalidad del tubo. En aquellas cepas en que el proceso es de desaminacin (Proteus, Providencia, Morganella spp.) se produce un color rojo sobre el pico de flauta, por el uso de las peptonas. Los organismos que no decarboxilan la lisina, producen una zona alcalina en la zona inclinada y una zona cida en el fondo del tubo. El hidrgeno sulfurado producido ennegrece el medio.

Siembra Por puncin profunda con aguja de inoculacin.

Incubacin 24 horas a 35C.

Control de calidad

Bacteria Reaccin Indol

Shigella flexneri K/A -

Salmonella paratyphi B K/K -

Proteus mirabilis R/A -

Escherichia coli K/K +


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AGAR MAC CONKEY

Aplicacin

Para aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos y diferenciacin entre enterobacterias fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. Se usa tambin para el recuento de coliformes y para aislamiento de bacterias patgenas en agua, aguas residuales, productos alimenticios, etc.


Peptona 17 g Proteosa peptona 3 g

Lactosa 10 g Sales Biliares 1,5 g

Cloruro de Sodio 5 g Rojo Neutro 0,03 g

Cristal Violeta 0,001 g Agar 13,5 g

pH final = 7.1

Preparacin

1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada.

2. Se hierve hasta disolver por completo.

3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.

4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 C y se distribuye en placas.

5. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar.

6. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco.

7. Marcar los tubos o placas con MC

Fundamento

Las colonias que fermentan la lactosa producen una acidificacin del medio, lo cual hace que el indicador Rojo Neutro acte impartiendo un color rojo a la colonia. Las que no fermentan la lactosa no varan de color y por lo tanto las colonias se apreciarn incoloras. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas.

Control de calidad

Cepas de ensayo Color de colonias Recuperacin

Escherichia coli ATCC 25922 Rojo Buena

Shigella sonnei Incoloras Buena

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Nula


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AGAR MAC CONKEY SORBITOL

Aplicacin

Para el aislamiento selectivo de Escherichia coli O157 que tiene la propiedad de ser sorbitol negativo mientras que E. coli de otros serotipos son sorbitol positivo. La nica diferencia con el agar de Mac Conkey es la presencia del sorbitol en lugar de lactosa y se le puede aadir Cefixime y telurito de potasio para hacer al medio ms inhibidor


Peptona 17 g Proteosa peptona 3 g

Sorbitol 10 g Sales Biliares 1,5 g

Cloruro de Sodio 5 g Rojo Neutro 0.03 g

Cristal Violeta 0,001 g Agar 13,5 g

pH final = 7.1

Preparacin

1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada.

2. Se hierve hasta disolver por completo.

3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.

4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 C y se distribuye en placas.

5. Si se quiere utilizar para identificacin, distribuir 2 mL en tubos 13 x 100 o 12 x 75, luego esterilizar, dejar enfriar en posicin inclinada y cambiar el tapon de algodn por uno de jebe.

6. Guardar las placas o tubos en refrigeracin, no conservar a temperatura ambiente pues se deteriora el medio rapidamente.

7. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar.

8. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco.

9. Marcar los tubos o placas con MCS

Fundamento

Las colonias que fermentan el sorbitol producen una acidificacin del medio, lo cual hace que el indicador Rojo Neutro acte impartiendo un color rojo a la colonia. Las que no fermentan el sorbitol no varan de color y por lo tanto las colonias se apreciarn incoloras. Se utiliza para diferencia Enterobacter cloacae de Enterobacter zakazakii.

Control de calidad


Escherichia coli ATCC 25922 Rojo Buena

Escherichia coli O157 Incoloras Buena

Proteus mirabilis ATCC 12453 Rojo Buena


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AGAR MANITOL SALADO

Aplicacin

Es un medio selectivo recomendado por Chapman para el aislamiento de estafilococos presuntamente patgenos a partir de alimentos y muestras clnicas. En muchos laboratorios es llamado tambien como Medio Hipertnico o Agar manitol sal rojo de fenol.



d-Manitol 10 g Cloruro de sodio 75 g

Agar 15 g Rojo de fenol 0,025 g

pH final: 7.4 0.2

Preparacin

1. Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada.

2. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos.

3. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

4. Distribuir en placas o en tubos anchos (18 x 150 o mayores)

5. Marcar como MS.

Fundamento

Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

Control de calidad


Staphylococcus aureus A marilla Excelente

Staphylococcus epidermidis Roja Escaso - Bueno

Escherichia coli - No crece

Vibrio parahaemolyticus Amarilla Excelente


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AGAR NUTRITIVO

Aplicacin

El agar nutritivo es un agar de composicin muy simple, se utiliza para el crecimiento de bacterias que no son exigentes en sus requerimientos nutritivos; se le puede utilizar como base para el agar sangre. Se ha utilizado tambin para el estudio de aguas y productos lacteos, y para el aislamiento primario y como base para otros medios.


Extracto de carne 1 g Extracto de levadura 2 g

Peptona 5 g Cloruro de sodio 5 g

Agar 15 g

Preparacin

1 Se suspenden 28 gramos en 1 litro de agua destilada.

2 Se hierve hasta disolver el medio por completo.

3 Se distribuye en tubos de 13 x 100 Se esteriliza en el autoclave a 121C durante 15 minutos.

4 Se marca como AN

Fundamento

El medio es simple, no tiene mayores aditivos; es utilizado para el cultivo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente; pueden crecer una gran gama de microorganismos, se puede omitir el extracto de levadura de la frmula.

Control de calidad

Cepas de ensayo Crecimiento con 5% de sangre de carnero

Neisseria meningitidis Bueno

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Bueno

Escherichia coli ATCC 25922 Bueno


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AGAR SABOURAUD GLUCOSA 4%

Aplicacin

Medio utilizado para el cultivo y diferenciacin de hongos, proporciona un medio favorable en pH y contenido de glucosa, los hongos crecen fidedignamente manteniendo sus estados culturales descritos por Sabouraud.


Neopeptona 10 g Dextrosa 40 g

Agar 15 g

pH final= 5.6 aprox .

Preparacin

1. Se suspende 65 gramos en 1 litro de agua destilada

2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.

3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 libras de presin.

4. Se distribuye en placas o tubos

5. El medio preparado es ambar ligeramente opalescente.

6. Marcar los tubos o placas con SAB

Fundamento

Para el aislamiento primario utilizado en micologia, el contenido de glucosa y el pH que ofrece el medio son favorables para el crecimiento de los diferentes hongos, levaduras y mohos.

Control de calidad

Cepas de ensayo Recuperacin

Aspergillus niger Bueno a excelente

Candida albicans Bueno a excelente

Escherichia coli ATCC 25922 Bueno a excelente

Lactobacillus casei Bueno a excelente

Saccharomyces cerevisiae Bueno a excelente


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AGAR SANGRE

Aplicacin

Es un medio no selectivo, para fines generales, especialmente el aislamiento de organismos exigentes; la adicin de sangre permite determinar si el organismo es hemoltico o no.

Frmula

Agar tripticasa soya, agar Columbia, agar Brucella o base de agar sangre

1 L Sangre desfibrinada de carnero 50 a 100 mL

pH final: 6.8 aprox.

Preparacin

1. Disolver agar en cantidad suficiente para un litro de agua destilada

2. Calentar hasta disolver completamente

3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 C y 15 lbs. de presin.

4. Enfriar hasta 45 o 50 C

5. Aadir 5 a 10 % de sangre de carnero desfibrinada estril, mezclar bien.

6. Verter en placas.

7. El medio con sangre es del color de la misma y no hemolizado.

8. Marcar las placas con AS

Fundamento Es un medio sin inhibidores por lo que puede crecer cualquier microorganismo, la adicin de sangre lo hace un medio enriquecido para el crecimiento de microorganismos exigentes y para la determinacin de hemlisis. El pH ligeramente cido favorece la conservacin de los eritrocitos, las reacciones hemolticas y el crecimiento de ciertos microorganismos como estreptococos y neumococos. El medio no debe tener glucosa porque esta inhibe el desarrollo de hemlisis.

Control de calidad

Cepas de ensayo Recuperacin Hemlisis

Staphylococcus aureus Buena Variable

Streptococcus pyogenes Buena Beta

Streptococcus pneumoniae Buena Alfa


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AGAR SANGRE AZIDA

Aplicacin

El medio es utilizado para el aislamiento de estreptococos y estafilococos. El medio se puede utilizar con o sin sangre.


Triptosa 10 g Extracto de carne 3 g

Cloruro de sodio 5 g Azida de sodio 0,2 g

Agar 15 g

pH final: 7.2

Preparacin

1. Se suspende 33 gramos en un litro de agua destilada.

2. Se hierve hasta disolver completamente.

3. Se esteriliza en autoclave a 121C por 15 minutos y a 15 libras de presin.

4. Si se desea aadir sangre, se enfra el medio a 50C y se aade sangre desfibrinada de carnero a una concentracin final del 5%.

5. El medio preparado es de color rojo cereza.

6. Marcar las placas con AZ o en el caso de usar sangre con AS Az

7. Si se cuenta con azida de sodio, se puede pesar 0,2 g y colocarlo en tubos para aadirlos a un litro de agar tripticasa soya, obtenindose un medio similar. La azida de sodio es txica, por lo que debe manejarse con cuidado siguiendo las indicaciones de la hoja MSDS.

Fundamento

Este medio permite el crecimiento de microorganismos exigentes. La azida inhibe a la flora gram-negativa, en tanto que la flora Gram-positiva se desarrolla ms o menos indemne. La adicin de sangre al medio favorece la interpretacin de hemlisis.

Control de calidad

Cepa de ensayo Crecimiento Hemolisis

Streptococcus pyogenes Excelente Beta

Streptococcus pneumoniae Excelente Alfa

Enterococcus faecalis Excelente Alfa/gamma

Staphylococcus epidermidis Excelente Gamma

Escherichia coli ATCC 25922 Nulo


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AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)

Aplicacin

Es un medio diferencial y selectivo para aislamiento de Salmonella y Shigella a partir de heces, alimentos y otros.


Extracto de carne 5 g Proteosa peptona 5 g

Lactosa 10 g Sales biliares 8,5 g

Citrato sdico 8,5 g Tiosulfato sdico 8,5 g

Citrato frrico 1 g Verde brillante 0,33 g

Rojo neutro 0,025 g Agar 13,5 g

pH final: 7.0

Preparacin

1 Suspender 60 g en 1 L de agua destilada

2 Calentar hasta disolver.

3 NO SE DEBE AUTOCLAVAR.

4 Verter a placas.

5 Las placas con medio son color rojo cereza.

6 Marcar las placas con SS

Fundamento

La bilis de buey, el verde brillante y la elevada concentracin de tiosulfato y citrato inhiben la flora acompaante (Gram + y algunos coliformes) permitiendo el crecimiento de Salmonella y Shigella. Con el tiosulfato e iones de hierro se evidencia la formacin de H2S con el consecuente ennegrecimiento de la colonia. Los coliformes que fermentan la lactosa viran el pH a cido y por el indicador rojo neutro se aprecian colonias rojas. Shigella, Salmonella y otros no fermentadores de lactosa producen colonias transparentes. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa positivas son rosadas hasta rojas.

Control de calidad

Cepas de ensayo Color de colonias Centro negro Recuperacin

Escherichia coli Rojo No Mala

Shiguella flexneri Incoloras No Buena

Salmonella enteritidis Incoloras Si Buena

Salmonella typhi Incoloras Si Buena

Salmonella paratyphi A Incoloras No Buena

Staphylococcus aureus Ausente


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AGAR TCBS (TIOSULFATO, CITRATO, BILIS, SACAROSA)

Aplicacin

Para el aislamiento y cultivo selectivo de Vibrio cholerae y otros vibriones enteropatgenos (V. parahemolyticus, etc.).


Extracto de levadura 5 g Peptona proteosa 10 g

Sacarosa 20 g Citrato sdico 10 g

Tiosulfato sdico 10 g Bilis de buey 8 g

Citrato frrico 1 g Cloruro de sodio 10 g

Azul de bromotimol 0,04 g Azul de timol 0,04 g

Agar 15 g

pH final = 8,6 aprox.

Preparacin

1. Disolver 89 g en 1 L de agua destilada estril

2. Calentar hasta disolver el medio.

3. NO SE DEBE AUTOCLAVAR.

4. Repartir en placas.

5. El medio es de un color azul verdoso.

6. Marcar las placas con TCBS

Fundamento

Es un medio selectivo para vibrios, ya que las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, as como el medio fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacterias. La bilis de buey inhibe a los microorganismos Gram positivos. La alta concentracin de cloruro de sodio lo hace selectivo para vibrios e inhibe otras bacterias. El indicador mixto Azul de timol- Azul de bromotimol presenta un claro viraje a amarillo por la formacin de cido, incluso en medio fuertemente alcalino.

Solamente algunas cepas de Proteus y enterococos pueden formar colonias en este medio, pero que se distinguen de las de vibrios pues son ms pequeas. Los vibrios y otros microorganismos, que puedan crecer en este medio, que fermenten la sacarosa virarn el pH a cido por lo que las colonias se apreciarn amarillas. Las colonias de vibrios y otros microorganismos que no fermenten la sacarosa sern de color verdes a verdeazuladas o transparentes.

Control de calidad


Vibrio alginolyticus Amarillo Bueno

Vibrio cholerae Amarillo Bueno

Vibrio parahaemolyticus Azul Bueno

Escherichia coli Nulo

Pseudomonas aeruginosa Azul Nulo/Ligero


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AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)

Aplicacin

Es un medio de uso frecuente y general, utilizado como base frecuente del agar sangre. La bondad del medio es que pueden crecer tanto aerobios como anaerobios, el medio carece de inhibidores, por eso se utiliza para el cultivo de una gran variedad de microorganismos.


Triptona 15 g Peptona de Soya 5 g

Cloruro de sodio 5 g Agar 15 g

pH final = 7.3

Fundamento

El medio carece de inhibidores, el contenido de peptonas favorece el crecimiento de una gran variedad de microorganismos

Preparacin

1. Se suspenden 40 gramos en 1 litro de agua destilada

2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.

3. Se esteriliza en la autoclave a 121 C por 15 minutos.

4. Distribuir en placas o tubos

5. Marcar los medios con TSA

6. El medio preparado es de color blanquecino nacarado.

Control de Calidad

Cepas de ensayo Crecimiento sin sangre

Crecimiento con 5% sangre de carnero

Hemlisis

Neisseria meningitidis Excelente Excelente Ninguna

Staphylococcus aureus Excelente Excelente Beta

Streptoccoccus pneumoniae Regular Excelente Alfa

Streptococcus pyogenes Regular Excelente Beta


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AGAR TSI (TRIPLE SUGAR IRON)

Aplicacin

Medio empleado para la clasificacin de enterobacterias que permite investigar la capacidad de fermentar glucosa, lactosa, sacarosa y detectar la presencia de hidrgeno sulfurado.



Cloruro de sodio 5 g Glucosa 1 g

Lactosa 10 g Sacarosa 10 g

Sulfato de hierro y amonio 0,2 g Tiosulfato de sodio 0,2 g

Rojo de fenol 0,025 g Agua destilada 1 L

pH final: 7,3 0.2

Instrucciones

1. Suspender 62,5 g del polvo en un litro de agua destilada.

2. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin.

3. Distribuir en tubos 13 x 100 con tapa rosca o con tapn de algodn

4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 121C.

5. Enfriar dejando un fondo de 2 cm con un plano inclinado corto.

6. El medio es de color rojo

7. Marcar los tubos con las iniciales TSI

Fundamento

La fermentacin de los azcares da lugar a una produccin de cido, que se detecta por medio del indicador rojo de fenol, los cambios de color al amarillo por una acidificacin y a rojo por una alcalinizacin. La menor concentracin de glucosa (0,1%) hace que el cambio sea leve y solo se produzca el cambio en el fondo del tubo, mientras que al estar la lactosa y la sacarosa en mayor concentracin el cambio a acidez se ve en fondo y en el plano inclinado. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Control de calidad

Cepas de ensayo Fondo Plano inclinado

Gas H2S

Escherichia coli A A 2+ -

Shigella flexneri K A - -

Proteus mirabilis K A -

Pseudomonas aeruginosa K K - -

A: cido K: alcalino


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AGAR UREA SEGN CHRISTENSEN

Aplicacin

Para la diferenciacin de bacterias productores de ureasa (degradadores de rea).


Peptona 1 g Dextrosa 1 g

Cloruro de Sodio 5 g Fosfato monopotsico 2 g

Rojo de fenol 0,012 g Urea 20 g

Agar 15 g

pH final: 6,8

Preparacin del medio:

1. Se disuelve 29 g de la base de agar urea (que tiene todos los componentes de la frmula menos el agar) en 100 ml de agua destilada

2. Se esteriliza por filtracin.

3. Aparte, se disuelve 15 g de agar en 900 ml de agua destilada estril.

4. Se esteriliza el agar en autoclave por 15' a 121C.

5. Se enfra a 50-55C y aspticamente se le agrega los 100 ml de concentrado de la base de agar urea.

6. Se mezcla bien y se distribuye 1,5 a 2 mL en tubos estriles 12 x 75.

7. Se inclina los tubos en pico de flauta (aprox. 0,5 cm de profundidad y 1cm de pendiente).

8. El medio de cultivo es claro y de color amarillo-naranja.

9. Se marcan los tubos con AU

10. Se taponan los tubos y se guardan en refrigeracin.

Fundamento

La urea es desdoblada por la enzima ureasa producida por ciertos microorganismos, formando dixido de carbono y amoniaco, este ltimo alcaliniza el medio lo que se comprueba por el viraje de amarillo a rojo-prpura por el indicador rojo de fenol. El agar urea (segn Christensen) es menos tamponado a comparacin del caldo rea (fuertemente tamponado) por lo que puede detectar no slo microorganismos potentes formadores de ureasa (como Proteus) sino tambin los formadores dbiles como Klebsiella, Enterobacter, ciertos micrococos, etc.

Control de calidad

Cepas de ensayo Hidrlisis de la urea Crecimiento

Escherichia coli No - Amarillo Bueno

Klebsiella pneumoniae Si Rojo lento Bueno

Proteus vulgaris Si Rojo rpido Bueno


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AGAR XLD (XILOSA, LISINA, DESOXICOLATO)

Aplicacin

Para el aislamiento y diferenciacin de enterobacterias patgenas, especialmente Salmonella y Shigella en muestras de heces o alimentos.


Extracto de levadura 3 g Sacarosa 7,5 g

Lactosa 7,5 g D-Xilosa 3,5 g

L-Lisina 5 g Desoxicolato de Sodio 2,5 g

Tiosulfato de Sodio 6,8 g Citrato frrico amnico 0,8 g

Cloruro de Sodio 5 g Rojo de fenol 0,08 g

Agar 13,5 g

pH final: 7.4

Preparacin

1. Disolver 55 g rpidamente en un litro de agua destilada estril.

2. Calentar hasta que se disuelva totalmente.

3. NO SE DEBE SOBRECALENTAR NI AUTOCLAVAR.

4. Dejar enfriar a 50-60C y verter inmediatamente en placas

5. El color final del medio es rojo.

6. Marcar las placas con XLD

Fundamento

Se fundamenta en la fermentacin de la xilosa, lactosa y sacarosa, descarboxilacin de la lisina y la produccin de H2S a partir del tiosulfato de sodio y visible por el citrato frrico amnico. Las colonias de enterobacterias que fermentan lactosa, sacarosa y/o xilosa revierten el pH a cido y por el indicador (rojo de fenol) se aprecian amarillas. La gran cantidad de cido formado impide que coliformes que decarboxilan la lisina (LDC+) reviertan el pH a un valor alcalino.

La fermentacin rpida de la xilosa es casi constante en enterobacterias a excepcin de miembros del grupo Shigella, Edwarsiella y Providencia. Las especies de Shigella son lactosa (-), xilosa (-) y LDC (-) por lo que las colonias son rojas (igual al color del medio).

Generalmente las especies de Salmonella son lactosa (-) y sacarosa (-), como descarboxilan la lisina (en mayor concentracin), el pH vara a alcalino, dando colonias rojas a pesar de ser xilosa (+). Salmonella y Edwarsiella se diferencian de Shigella por la produccin de H2S, la cual se aprecia como un punto negro en el centro de las colonias.

Varias de estas reacciones pueden presentarse simultneamente o sucesivamente lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de pH. El desoxicolato acta como un inhibidor (dbil) de coliformes sin disminuir la capacidad de crecimiento de Shigella y Salmonella.

Control de calidad

Cepas de ensayo Color de colonias Centro negro Recuperacin

Escherichia coli Amarillo No Buena

Shigella sp Rojas No Buena

Salmonella enteritidis Rojas Si Buena


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CALDO INFUSIN CEREBRO - CORAZN (BHI)

Aplicacin

Para el cultivo de estreptococos, neumococos, meningococos y otros organismos exigentes, tambin para el cultivo de estafilococos destinados a la prueba de coagulasa. Recomendado para hemocultivos.


Infusin de cerebro de ternero 200 g Infusin de corazn de buey 200 g

Proteosa peptona 10 g Dextrosa 2 g

Cloruro de sodio 5 g Fosfato disdico 2,5 g

pH final: 7.4

Preparacin

1 Disolver 37 g en 1 L de agua destilada.

2 Distribuir a tubos o frascos.

3 Esterilizar en autoclave por 15 min. a 15 lb de presin y a 121C.

4 El caldo tiene un aspecto claro, ligeramente parduzco.

5 Marcar los tubos con BHI

Fundamento

Es un medio enriquecido sin inhibidores, adecuado para el desarrollo de bacterias aerobias y anaerobias. La adicin de agar (0.1-0.2%) al caldo sirve para reducir las corrientes de conveccin y crear de esta manera una tensin de oxgeno similares a las producidas por el tejido, esto favorece el crecimiento de anaerobios y tambin de aerobios. La adicin de 2% de agar favorece el cultivo y aislamiento de Actinomyces israeli. La adicin de 2% de agar y 10% de sangre de caballo desfibrinada favorece el crecimiento de Histoplasma capsulatum y otros hongos como Coccidioides immitis.

Control de calidad

Cepas de ensayo Incubacin Recuperacin

Streptococcus pyogenes 24h/35C aerbica/anaerbica Bueno

Streptococcus pneumoniae 24h/35C aerbica/anaerbica Bueno

Candida albicans 48h/35C aerbica Bueno

Pseudomonas aeruginosa 24h/35C aerbica/anaerbica Bueno

Bacteroides fragilis 2-5 das/35C anaerbica Bueno


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CALDO PEPTONADO ALCALINO

Aplicacin

Para el cultivo y enriquecimiento de especies de Vibrio a partir de material infectado.


Peptona 10 g Cloruro de sodio 10 g

Agua destilada 1 L Extracto de carne (opcional) 3 g

Hidrxido de sodio 1 M c.s.p.

pH final de 8.4 aprox.

Preparacin

1. Se pesan la peptona y el cloruro de sodio y se disuelven en 1 L de agua destilada.

2. Se aade hidrxido de sodio 1M gota a gota hasta que el pH sea de 8.4 aproximadamente.

3. Distribuir 10 mL en tubos de 15 x 125 tapa rosca.

4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 15 lbs. de presin.

5. El caldo es claro incoloro o ligeramente amarillo.

6. Marcar los tubos con APA.

Fundamento

El medio alcalino y el contenido de sal inhiben el crecimiento de las enterobacterias y otras bacterias no deseables mas no as las de vibrios.

Interpretacin:

Se inocula el caldo con la muestra y se incuba a 37C por 24 h. Crece como una pelcula superficial, del cual se toma una asada y se siembra en Agar TCBS.


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CALDO PEPTONADO CON CLORURO DE SODIO

Aplicacin

Esta es una serie de medios diferenciales utilizados para la identificacin y diferenciacin de bacterias del gnero Vibrio y otras bacterias haloflicas. Este medio tiene como base el caldo peptonado y se le aade diferentes concentraciones de cloruro de sodio. La cantidad de medio es suficiente para unas 40 determinaciones.


Extracto de Carne 5 g Peptona 5 g

Agua destilada 500 mL

pH final = 7.3 aprox. a 25 C

Preparacin

1. Pesar los componentes y disolverlo completamente en el agua destilada.

2. Distribuir 100 mL en 5 frascos, marcar los frascos con 0, 3, 5, 7 y 10.

3. Aadir 0, 3, 5, 7 y 10 g de cloruro de sodio a cada frasco segn este marcado.

4. Distribuir 2,5 mL de cada concentracin en tubos de 12 x 75.

5. Colocar los tubos en canastillas marcadas y esterilizar a 121 C por 15 minutos en autoclave.

6. Sacar los tubos de la autoclave, dejar que enfren y cambiar los tapones de algodn por tapones de jebe.

7. Controlar en la estufa por 24 horas para ver la esterilidad.

8. Marcar los tubos con ClNa y la concentracin de sal.

9. Conservar a temperatura ambiente en gradillas en series.

Fundamento

Los medios mide la capacidad de crecimiento de la bacteria en presencia de diferentes concentraciones de cloruro de sodio, lo cual permite diferenciar vibrios marinos de Vibrio cholerae, confirmar la sospecha de Vibrio cholerae no O1 y otras bacterias que pueden sobrevivir en presencia o ausencia completa de sal.

Interpretacin

Se realiza a las 18 a 24 h. de incubacin a 37 C.

Control de calidad

0% 3 % 5 % 7 % 10 %

Escherichia coli ATCC 25923 - - - - -

Vibrio cholerae + + + - -

Vibrio parahaemolyticus - + + + -


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CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB)

Aplicacin

El medio es utilizado como caldo de enriquecimiento por la gama de nutrientes que posee; es muy utilizado para recuperar aquellos microorganismos que se tengan poco inculo.


Triptona (digerido pancretico de caseina)

17 g Soytona (digerido papaico de soya) 3 g

Cloruro de sodio 5 g Fosfato de potasio dibsico 2,5 g

Dextrosa 2,5 g

pH final: 7.3

Preparacin

1. Se aade 30 gramos a 1 litro de agua destilada.

2. Se mezcla bien y se distribuye en los recipientes definitivos.

3. Se puede colocar 2,5 mL en tubos 12 x 75 con tapn de algodn

4. Se esteriliza en la autoclave a 121C durante 15 minutos.

5. Se marcan los tubos con TSB

Fundamento

El medio contiene una muy buena gama de nutrientes lo que lo hace un buen enrriquecidor y recuperador de bacterias que se encuentran en pocas cantidades como es en el caso de los hemocultivos. El caldo presenta una buena base para la adicin de diferentes agregados para la recuperacin de bacterias aerobias como anaerobias de diferentes tipos de muestras.

Control de calidad

Cepas de ensayo Recuperacin

Neisseria meningitidis Bueno

Streptococcus pneumoniae Bueno

Streptococcus pyogenes Bueno

Staphylococcus epidermidis Excelente


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CALDO UREA SEGN STUART

Aplicacin

Para la diferenciacin de microorganismos productores de ureasa (degradadores de rea).


Extracto de Levadura 0,1 g Fosfato monopotsico 9,1 g

Fosfato disdico 9,5 g Urea 20 g

Rojo de fenol 0,01 g

pH final: 6.8

Preparacin del medio:

1. Disolver 38.7 g en 100 mL de agua destilada estril.

2. Esterilizar por filtracin con filtro de 0,45 m, calentar si es necesario hasta 60C como mximo. NO SE DEBE AUTOCLAVAR.

3. Repartir 10 mL a tubos estriles 16 x 100 estriles.

4. El caldo es claro y de color rojo amarillento.

5. Marcar con CALDO UREA (MADRE)

6. Mezclar 1 tubo con 90 mL de agua destilada estril.

7. Distribuir 2,5 mL en tubos de 12 x 75 estriles.

8. Cambiar el tapn de algodn por tapn de jebe y guardar en la refrigeradora.

9. Marcar los tubos con CU.

Fundamento

Los microorganismos que producen ureasa degradan la rea a CO2 y amonaco, este ltimo alcaliniza el caldo produciendo un viraje de su color de amarillo a rojo-prpura a causa del indicador rojo de fenol, eventualmente el crecimiento produce turbidez en el medio. Por ser un medio fuertemente tamponado solamente detecta microorganismos fuertemente productores de ureasa (como Proteus).

Control de calidad

Cepas de ensayo Viraje a rojo

Escherichia coli No

Klebsiella pneumoniae -/+ ligero

Proteus vulgaris Si


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MEDIOS DE HEMOCULTIVO BIFASICO (RUIZ CASTAEDA)

Propsito

Preparar medios de hemocultivo bifsico tipo Ruiz Castaeda para el cultivo de sangre y mdula sea.

Equipos

Autoclave Estufa

Cmara de flujo laminar Presillador

Materiales

Frascos de hemocultivo de 100 mL Tapones de algodn recubiertos de gasa

Tubos 20 x 150 con tapa rosca Tapones de jebe tipo penicilina de 20 mm

Precintos de aluminio de 20 mm Papel Kraft

Pita Agar tripticasa soya

Caldo tripticasa soya Polianetol sulfonato de sodio (SPS)

Hematina Hidrxido de sodio

Preparacin

La cantidad de medio depende del volumen del frasco disponible y de acuerdo al uso que se le va a dar:

Hematina al 0,05%

1. Pesar 50 mg de hematina en tubos 12 x 75 con tapn de jebe y conservarlos a temperatura de refrigeracin como stock.

2. Aadir el contenido de un tubo a 100 mL de NaOH 0,01M. (0,4 g de NaOH para 1 L de agua destilada).

3. Disolver, distribuir 10 mL en tubos 15 x 100 con tapn de jebe.

4. Conservar en refrigeracin hasta el momento de uso.

5. Descartar despus de 6 meses.

Fase slida

1. Pesar 40 g de agar tripticasa soya, aadir 1 L de agua destilada y disolver al calor.

2. Distribuir en los frascos de hemocultivo segn el tamao del frasco.

3. Taponar con tapones de algodn con gasa y cubrir con papel Kraft.

4. Autoclavar a 121C por 15 minutos.

5. Dejar enfriar en posicin inclinado permitiendo que se forme un plano inclinado que llegue cerca de la boca del tubo.

Fase lquida

1. Pesar 30 g de caldo tripiticasa soya y aadir 1 L de agua destilada.

Tamao de frasco de Medio 50 mL 60 mL 100 mL 120 mL

Agar tripticasa soya en mL 10 10 25 35

Caldo tripticasa soya en mL 10 15 25 35


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2. Aadir 0,25 g de polianetol sulfonato de sodio.

3. Aadir 10 mL de solucin de hematina 0,05%.

4. Distribuir el caldo en tubos y dejar entreabierta la tapa.

5. Autoclavar a 121C por 15 minutos y dejar enfriar.

Preparacin del medio

1. Trabajar en la cmara de flujo laminar, en forma asptica aadir el caldo al frasco con agar y luego reemplazar los tapones de algodn con tapas de jebe

2. Para el control de esterilidad se debe incubar todos los frascos en la estufa por tres das, y buscar cada da la presencia de frascos contaminados, despus inclinar cada frasco y baar el plano inclinado con el caldo y devolver los frascos a la incubadora.

3. Despus de los tres das mantener los frascos a temperatura ambiente por 3 das adicionales, siguiendo el mismo procedimient

manualmediosdecultivo (1)

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