manual zearalatest - solcampo

ZEARALATEST

MANUAL DE INSTRUÇÕES

PORTUGUÊS

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ÍNDICE PÁGINA

1.0 Introdução

1.1 Objetivo do Uso 03 1.2 Princípio 03 1.3 Aplicabilidade e Aprovação 03 1.4 Limitações 03 1.5 Amostragem 03 1.6 Prazo de Validade e Condições de Estocagem 0 4 1.7 Procedimento geral Zearalatest 05 1.8 Procedimento geral Zearalatest para HPLC 06

2.0 Preparo e Calibração do Equipamento 2.1 Calibração do fluorímetro série 4 07 2.2 Calibração do Mini-fluorímetro MF-2000 09 2.3 Passos para preparo da filtração 10 2.4 Ajuste do suporte da bomba 11 2.5 Limpeza do equipamento 12

3.0 Preparo de Reagentes e Teste

3.1 Preparo das soluções de extração 13 3.2 Preparo de solução de diluição 13 3.3 Preparo de soluções de de Revelador ZearalaTest 13 3.4 Checagem de reagentes 13

4.0 Procedimentos para fluorímetro Materiais e equipamentos requeridos para procedimen to fluorimétrico 15 4.1 Milho 16 4.2 Rações 17 4.3 Sorgo 18

5.0 Procedimentos para HPLC Materiais e equipamentos requeridos para procedimen to HPLC 19 Milho, Sorgo e Rações 20

6.0 Precauções 6.1 Precauções Gerais para procedimento Fluorimétr ico 21 6.2 Soluções de problemas no procedimento fluorimét rico 22

7.0 Assistência técnica no Brasil 23 8.0 Responsabilidades 23 9.0 Informação Adicional 23

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1.1 OBJETIVO DO USO Zearalatest é um método quantitativo para detecção de zearalenona em milho, rações para aves e sorgo. Zearalatest é um teste utilizado em ampla variedade de locais, de unidades armazenadoras no campo e laboratórios de controle de qualidade nas indústrias até laboratórios de análises do governo – qualquer lugar onde análises rápidas, fáceis e acuradas de zearalenona, podem prevenir contaminação e melhorar a qualidade dos alimentos. Pode ser executado em menos de 15 minutos, excluindo-se o preparo da amostra, e não requer habilidades especiais. 1.2 PRINCÍPIO A zearalenona é uma mjcotoxina estrogênica produzida pelo fungo Fusarium graminearum. A zearalenona induz a feminização em animais em concentração de 1 ppm em alimentos. Concentrações altas (50 – 100 ppm) podem interferir na concepção, ovulação, implantação, desenvolvimento fetal e viabilidade de novas concepções. Amostras são preparadas pela mistura com uma solução de extração, trituração e filtração. O extrato é então aplicado em uma coluna Zearalatest com anticorpos específicos para zearalenona. Neste estágio, a zearalenona se liga aos anticorpos da coluna. A coluna é então enxaguada com água para livrar a coluna de imunoafinidade de impurezas. Pela passagem de metanol através da coluna, as zearalenonas são removidas dos anticorpos. Esta solução metanólica pode ser injetada em HPLC ou quantificada em um fluorímetro. Estas etapas estão representadas na seção 1.7 e 1.8. 1.3 APLICABILIDADE E APROVAÇÃO Zearalatest foi otimizado para fornecer medidas quantitativas de zearalenonas em milho, rações para aves com 17% de proteína e sorgo. Assistência para determinação de zearalenonas em “commodities” não listadas neste manual pode ser obtida contatando-se nosso Departamento de Assistência Técnica.

1.4 LIMITAÇÕES Este teste foi desenvolvido para uso de acordo com os procedimentos e reagentes descritos nas páginas a seguir. Não utilize material com prazo de validade vencido. Modificações nestas instruções podem não gerar resultados ótimos. 1.5 AMOSTRAGEM Micotoxinas não ocorrem em toda semente de um lote ou podem ocorrer apenas numa pequena porção de sementes do lote. Devido a ampla faixa de concentração de micotoxinas entre sementes individuais num lote contaminado, variações de amostra para amostra podem ser grandes. É importante obter uma amostra representativa de um lote. O produto deve ser coletado de diferentes locais de um lote estático baseado num parâmetro de referência. Este plano de amostragem pode ser traçado do topo ao fundo do lote. As amostras obtidas do lote devem ser trituradas e homogeneizadas e uma sub-amostra deve ser retirada para a análise. Para maiores informações sobre amostragem de grãos, consulte as publicações FGIS a seguir: FGIS Aflatoxin Handbook FGIS Grain Inspection Handbook, Book 1, Grain Sampling FGIS Mechanical Sampling Systems Handbook Quantidades limitadas destas publicações estão disponíveis gratuitamente, sob consulta. Escreva

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para: USDA - APHIS, MSD - HSB PDMS Room 1 A 28 4700 River Road Riverdale, MD 20737 1.6 PRAZO DE VALIDADE E CONDIÇÕES DE ESTOCAGEM Armazene à temperatura ambiente. Armazenagem a temperaturas acima de 30º C por períodos prolongados pode reduzir o prazo de validade. Se a estocagem acima de 30ºC for prevista, todos os produtos podem ser armazenados a 4ºC. Recomenda-se utilizar reagentes à temperatura ambiente (18 – 22ºC).

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1.7 PROCEDIMENTO GERAL ZEARALATEST

EXTRAÇÃO DA AMOSTRA Misturar 20g de amostra moída com 5g de sal e 50 ml de metanol:água (80:20) Misturar a alta velocidade por 2 minutos. Filtrar em papel de filtro qualitativo.

DILUIÇÃO E FILTRAÇÃO Diluir 10ml do extrato com 40 ml de Tampão PBS/0,1% Tween-20. Filtrar com filtro de microfibra.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

Passar 10ml de filtrado pela coluna de afinidade. Lavar a coluna com 10ml de Tampão PBS/0,1% Tween-20. Lavar depois com 10 ml de água destilada. Eluir as zearalenonas da coluna com 1ml de metanol HPLC. Coletar o eluato na cubeta.

QUANTIFICAÇÃO Injetar em HPLC OU Adicionar 1 ml de revelador ao eluato e agitar. Colocar a cubeta em um fluorímetro. Verificar leitura digital após 5 min.

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1.8 PROCEDIMENTO GERAL ZEARALATEST PARA HPLC

EXTRAÇÃO DA AMOSTRA Misturar 20g de amostra moída com 2g de sal e 50 ml de acetonitrila:água (90:10). Misturar a alta velocidade por 2 minutos. Filtrar em papel de filtro qualitativo.

DILUIÇÃO E FILTRAÇÃO (0-50ppm) Diluir 1 ml do extrato com 49 ml de água. (0-5 ppm) Diluir 10 ml do extrato com 40 de água. Filtrar com filtro de microfibra.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE Passar 10ml de filtrado pela coluna de afinidade. Lavar a coluna com 10ml de água. Eluir as zearalenonas da coluna com 1,5ml de Metanol HPLC. Coletar o eluato na cubeta.

QUANTIFICAÇÃO Adicionar 1,5 ml de água deionizada ao eluato.

Agitar em vortex. Injetar de 100 – 200 ul em HPLC.

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2.1 CALIBRAÇÃO DO FLUORÍMETRO SÉRIE 4

1. Ligue o equipamento com auxílio do botão ON/OFF localizado na parte traseira.

2. Pressione a tecla SELECT TEST até aparecer Zearalatest no visor. Então

pressione ENTER. 3. O fluorímetro lerá:

START CALIBRATION . . . OPEN THE LID INSERT RED VIAL Levante a tampa e coloque a ampola vermelha do padrão de calibração. Certifique-se

que a ampola está totalmente encaixada e abaixe a tampa . 4. O visor lerá:

HIGH CAL 0,45 PPM Se este é o valor desejado para a ampola vermelha, pressione ENTER. De outra

forma, entre com o valor de calibração desejado pressionando as teclas numéricas, segundo o procedimento específico. Confirme o aparecimento do valor desejado no visor e pressione ENTER. 5. O visor lerá: READING HIGH CAL . . . SAVING HIGH INTENSITY E então:

OPEN THE LID INSERT GREEN VIAL

Levante a tampa, retire a ampola vermelha e coloque a ampola verde, novamente

certificando-se que a ampola está totalmente encaixada e abaixe a tampa. 6. O visor lerá:

LOW CAL - 0,05 PPM Se este for o valor desejado da ampola verde para o método utilizado pressione

ENTER. Se não, entre com o valor determinado para o método específico a ser utilizado. Confirme o aparecimento do valor desejado no visor e pressione ENTER. 7. O visor lerá: READING LOW CAL . . . SAVING LOW INTENSITY E depois:

OPEN THE LID

Levante a tampa e retire a ampola verde. 8. O visor lerá:

VICAM V 1.1 READY

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O visor pode mostrar outro número para indicar qual versão do software está instalada.

9. Pressione SELECT TEST o visor lerá: ZEARALATEST Pressione ENTER 10. O visor lerá: START RUN TEST . . . OPEN THE LID 11. Coloque a ampola amarela do padrão de calibração para micotoxinas. A leitura da ampola amarela encontra-se listada na seção de procedimentos. 12. O fluorímetro está agora pronto para realizar a leitura das amostras. O fluorímetro série 4 precisa ser calibrado uma vez por semana.

• Para recalibrar o fluorímetro: pressione a tecla STOP. Pressione a tecla OPTIONS até que apareça no visor:

CALIBRATE TEST

Então pressione ENTER. O visor deve indicar:

ZEARALATEST

Caso contrário, pressione SELECT TEST até que ZEARALATEST apareça no

visor e então pressione ENTER.

Coloque as ampolas vermelha e verde do padrão de calibração para micotoxinas e calibre o equipamento conforme descrito anteriormente. • Para correr um teste: pressione SELECT TEST até que apareça no visor. ZEARALATEST (ou o teste desejado)

Pressione ENTER • Para cancelar qualquer procedimento: pressione STOP

Para maiores detalhes sobre o uso do fluorímetro, favor consultar o Manual de Instruções do Fluorímetro.

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2.2 CALIBRAÇÃO DO MF-2000 TM : Mini Fluorímetro VICAM V1.0 A calibração será necessária apenas se a unidade for desligada ou após 24 horas da última calibração.

1. Ligue o aparelho utilizando o botão ON/OFF localizado na parte e traseira.

2. As luzes verdes POWER e READY se acenderão indicando que o instrumento está ligado e

pronto para prosseguir os testes. Deixe o instrumento aquecer por 15 minutos.

3. Pressione o botão RUN / STEP. A luz vermelha INSERT RED VIAL se acenderá.

4. Seja a aproxima etapa dentro de 15 segundos ou a luz READY se acenderá.

5. Abra a tampa e coloque a ampola vermelha. Certifique-se que a ampola está completamente

encaixada e feche a tampa.

6. Pressione o botão RUN / STEP. A calibração estará completa quando a luz vermelha INSERT

GREEN VIAL se acender. Seja a próxima etapa dentro de 15 segundos ou a luz READY se

acenderá.

7. Abra a tampa e retire a ampola vermelha e coloque a verde. Certifique-se que a ampola está

completamente encaixada e feche a tampa.

8. Pressione o botão RUN / STEP. A calibração estará completa quando a luz verde INSERT

SAMPLE acender.

9. Abra a tampa e remova a ampola verde a luz INSERT SAMPLE estará acesa.

10. Coloque a ampola amarela para checar a calibração. Pressione RUN / STEP. As luzes BAR

GRAPH acenderão. Verifique o resultado com a faixa aceitável listada no procedimento

apropriado.

11. A luz READY acenderá.

12. Pressione o botão RUN / STEP. A luz INSERT SAMPLE acenderá.

13. Coloque a cubeta contendo o eluato da amostra e pressione RUN / STEP. As luzes BAR

GRAPH acenderão, leia a concentração de toxina utilizando a tarjeta apropriada.

14. Repita os passos 11 e 12 para ler mais amostras.

15. A luz vermelha OVER HIGH CAL será acionada quando a concentração de toxina for mais alta

que a concentração da ampola vermelha.

16. A luz vermelha ERROR se acenderá quando ocorrer um erro de inicialização, quando a

concentração da amostra estiver fora da faixa (muito alta ou muito baixa), quando o calibrador

alto tiver mais fluorescência que o instrumento pode medir ou quando o calibrador baixo tiver

menos fluorescência que o instrumento pode detectar.

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2.3 PASSOS PARA PREPARO DA FILTRAÇÃO

Filtro plissado O primeiro passo para filtração é uma filtração simples através de um filtro de papel plissado para separar o extrato de outras partículas grosseiras da amostra sólida. O filtrado é coletado em um recipiente limpo ou proveta. 1. Abrir completamente um filtro plissado e

colocá-lo em um recipiente limpo. (Opcional: um funil pode ser usado para apoiar o filtro).

2. Dobrar as extremidades do filtro sobre a

borda do copo para mantê-lo no lugar. Manter as dobras plissadas do filtro para maximizar a área da superfície. Isto aumentará a superfície de filtração.

3. Não é necessário esperar todo o extrato

passar através do filtro para continuar.

Filtro de Microfibra O segundo passo da filtração é a filtração por Gravidade do extrato através de um filtro de microfibra. Isto remove qualquer precipitado no extrato e assegura que o extrato passará facilmente pela coluna de afinidade. A filtração em microfibra é realizada imediatamente antes da cromatografia de afinidade. 1. Coloque um pequeno funil no topo da

seringa ou num copo coletor limpo.

2. Coloque suavemente um filtro de microfibra no pequeno funil, pressionando o filtro para dentro do funil com o dedo indicador. Tenha cuidado para não rasgar ou perfurar o filtro.

Montagem do papel de filtro

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2.4 AJUSTE DO SUPORTE DA BOMBA A cromatografia de afinidade Zearalatest é facilmente realizada com coluna de afinidade Zearalatest fixada em um suporte para bomba (item n.º 21010). Este suporte tem uma seringa de vidro de 10 mL que serve como um reservatório para a coluna. Uma grande seringa de plástico com êmbolo e engate fornece pressão de ar para empurrar manualmente o líquido através da coluna. Uma bomba de aquário ajustável (item n.º 20650) pode ser fixada ao tubo da bomba ao invés de uma bomba de seringa, para operar sem usar pressão manual. Um suporte duplo (item n.º 21030), suporte para quatro posições com bomba de aquário (item n.º 21045), e suporte para doze posições (item n.º G1104) são úteis para correr várias amostras ao mesmo tempo. 1. Remover a tampa grande do topo da coluna. 2. Fixar o engate plástico (item n.º G1109) à

coluna. Este engate pode ser reutilizado para colunas adicionais.

3. Coloque um copo para coleta do resíduo sob

a coluna. Mantenha a tampa superior da coluna. Entornar o extrato no filtro de microfibra (veja seção anterior) e coletar a quantidade desejada de extrato em uma seringa de vidro usando a marcação do cilindro da seringa.

4. Aspire através do êmbolo da seringa de

plástico. 5. Inserir engate do final do tubo da seringa.

Remover a tampa da coluna. 6. Aplicar pressão ao êmbolo da seringa de

plástico para empurrar o líquido através da coluna. Manter o fluxo à uma velocidade de 1-2 gotas por segundo. Empurrar todo líquido através da coluna. Repetir para lavagem e eluição.

Nota: Evite retirar o êmbolo da seringa de plástico, cujo engate está fixado a seringa de vidro. Isto pode deslocar as partículas que suportam a camada de anticorpos e afetar os resultados do teste. As seringas devem ser levantadas antes da eluição para acomodar as cubetas.

Cortar a ponta da tampa da coluna

Seringa de vidro

Suporte para bomba

Seringa para bombear engate

Coluna de afinidade

extrato

Seringa de vidro

Mangueira de conexão

lixo

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2.5 LIMPEZA DO EQUIPAMENTO Antes de Iniciar o teste Zearalatest

Para eliminar fluorescência de fundo assegure-se que o equipamento está limpo e não contaminado com materiais que podem causar fluorescência de fundo. Isto é particularmente importante quando se usa um novo equipamento ou equipamento que não tenha sido usado por um longo período de tempo. Antes de usar o equipamento, este deve ser lavado com uma solução fraca de detergente e então enxaguado abundantemente com água purificada. Isto inclui as seringas de vidro usadas para reservatório da amostra. As seringas são tratadas com um lubrificante para uso com o embolo. O lubrificante necessita ser lavado com um detergente suave e o cilindro da seringa enxaguado completamente com água purificada antes do uso para Zearalatest , outras peças do equipamento que necessitam ser lavadas com um detergente suave e enxaguadas com água purificada antes do uso são pipetas, funis e copo do líquido. Frascos dispensadores necessitam somente ser enxaguados com metanol antes do uso. Entre Análises Após cada análise, o suporte do copo necessita ser lavado com uma solução fraca de detergente e enxaguado completamente com água purificada. O mesmo procedimento de limpeza deve ser realizado para qualquer equipamento que será reutilizado. Não lave os frascos dispensadores com sabão. Frascos dispensadores de metanol necessitam somente ser reabastecidos novamente com metanol. Entre as análises, a seringa deve ser enxaguada com água purificada. Isto será suficiente para prevenir contaminação cruzada de amostras. Após um grande número de amostras ter sido testado, a seringa de vidro deve ser lavada com uma escova e um detergente suave e então enxaguada com bastante água. Não é recomendado lavar e reutilizar as cubetas. Essas cubetas são projetadas para uso de uma só vez e devem ser descartadas. Outras Precauções Importantes • Use somente equipamento indicado pela Vicam. • Evite contato de quaisquer reagentes ou soluções (tais como: metanol, água, extrato, eluato da

coluna ou revelador) com borracha ou plástico flexível suave. Esses materiais podem levar contaminantes fluorescentes para a amostra e, desta forma, afetar os resultados.

Nota: Algumas tampas do copo de liqüidificador são forradas com papelão parafinado. Estes forros não são resistentes ao metanol e soluções aquosas e se desarranjam quando usados para extração da amostra. O extrato será então contaminado com materiais, que podem causar fluorescência de fundo. Liqüidificador com forro de papelão não deve ser usado.

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3.1 PREPARO DAS SOLUÇÕES DE EXTRAÇÃO Os procedimentos Zearalatest utilizam solução metanol/água ou acetonitrila/água para a

extração da zearalenona da amostra. Para preparar a solução: Use reagentes puros (ex.: metanol grau HPLC ou melhor) quando preparar as soluções de extração.

SOLVENTE METANOL (ML)

ÁGUA PURIFICADA (ML)

VOLUME TOTAL (ML)

ACETONITRILA 900 100 1000 (1 litro) METANOL 800 200 1000 (1 litro)

PRECAUÇÃO: O solvente de extração é inflamável. Mantenha o frasco bem fechado quando não estiver em

uso. Prepare a solução de extração toda semana ou conforme a necessidade. As fórmulas acima são para preparo de 1 litro de solução. O volume de solução pode aumentar ou diminuir de acordo com a quantidade de reagente necessária à extração.

3.2 Preparação das soluções de diluição/lavagem: Tampão de lavagem PBS / 0.1% Tween-20 1 mL Tween-20 1000 mL PBS Uma solução 10X concentrada também pode ser adquirida (Vicam, artigo #G1112). A solução 10X concentrada deve ser diluído para 1X com água purificada conforme a necessidade – ex.: diluir 100 mL de 10X concentrado com 900 mL de água pura. 3.3 PREPARO DA SOLUÇÃO REVELADORA ZEARALAT EST Para preparar a solução reveladora Zearalatest diluída:

O revelador ZearalaTest é utilizado para realçar a fluorescência da zearalenona e aumentar a sensibilidade do ZearalaTest. Cada frasco contém 2,5 gramas de cloreto de alumínio sólido, suficiente para 50 análises.

O cloreto de alumínio deve ser diluído com 50 ml de metanol grau HPLC. Agitar o frasco até a completa dissolução do sal. O frasco deve permanecer fechado para evitar a evaporação do metanol. A validade do revelador é de 1 mês após diluído. Nos procedimentos ZearalaTest, os níveis de zearalenona são detectados e quantificados por fluorescência. Para utilizar o revelador: Pipetar exatamente 1,0 mL da solução reveladora diluída diretamente na cubeta contendo o eluato da coluna de afinidade e agitar bem antes de realizar a leitura da solução no fluorímetro. Quando utilizar o frasco dispensador, assegure-se que não há bolhas de ar na tubulação antes de dispensar a solução reveladora. 3.4 CHECAGEM DE REAGENTES Nos procedimentos Zearalatest , os níveis de zearalenona são detectados e quantificados

por fluorimetria. Para determinação acurada da concentração é fundamental que a zearalenona na cubeta esteja emitindo fluorescência. Fluorescência de fundo e/ou quimioluminiscência causada por reagentes ou pela cubeta serão erroneamente medidos como zearalenona pelo fluorímetro.

É uma boa prática e fortemente recomendado checar os reagentes e as cubetas para

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certificar-se que não são fluorescentes e não irão contribuir para a medida de fluorescência do fluorímetro. Este é um processo fácil e deve ser realizado diariamente ou toda vez que novos reagentes ou cubetas forem utilizados.

Para checar reagentes e cubetas:

1. Calibrar o fluorímetro.

2. Pipetar 2 mL do metanol utilizado para a eluição da coluna na cubeta.

3. Medir a fluorescência de fundo no fluorímetro. A leitura deve ser 0 ppb.

4. Pipetar 2 mL da água purificada utilizada para lavar a coluna na cubeta.


6. Pipetar 2 mL do revelador diluído na cubeta.


8. Pipetar 1 mL de metanol na cubeta e adicionar 1 mL do revelador diluído. Agitar bem.


***** IMPORTANTE *****

Soluções que não apresentem 0 ppb de leitura devem ser testadas novamente em outra cubeta. Se a solução não ler 0, deve ser descartada e uma nova solução preparada e testada.

Se todas as três soluções apresentarem leitura acima de 0, checar novamente a calibração

do fluorímetro. Se a calibração estiver satisfatória, então há grande possibilidade de que as cubetas estejam defeituosas e um novo pacote de cubetas deve ser utilizado. Certifique-se de utilizar cubetas fornecidas pela Vicam. Outras cubetas podem conter material fluorescente.

Sugestão de auxílio: antes de iniciar a análise de amostras, uma boa checagem de

procedimentos, reagentes e equipamento é realizar um teste sem nenhuma amostra. A leitura no fluorímetro de uma amostra em branco deve ser 0 ppb.

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4.0 PROCEDIMENTOS PARA FLUORÍMETRO MATERIAIS E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PARA PROCEDIME NTO

FLUORIMÉTRICO

Equipamentos Requeridos

Descrição Item nr.

*Proveta graduada, 50 ml 20050 *Escala digital com adaptador AC 20100 *Liqüidificador com jarra em aço inox 20200 *Proveta graduada, 250 ml 20250 *Frasco dispensador de metanol 20501 *Frasco de lavagem, 500 ml 20700 *Estante para cubetas 21010 *Suporte para bomba única posição 21020 *Padrão de calibração 33020 *Funil para filtro, 65 mm (10) 36020 *Fluorímetro série 4 ou G8000 MF – 2000 TM Mini Fluorímetro G8200

Materiais Requeridos


Colunas Zearalatest, para fluorímetro e HPLC (25/cx) G1012 *Pipetas descartáveis (50/pct) 20652 *Papel de filtro canelado VICAM (100) 31240 *Filtro de microfibra, 1.0 um, 9 cm (100) G2005 *Lenço de papel 31967 Tampão PBS/0.1% Tween-20 10X (150 mL) G1112 Revelador ZearalaTest 32011 *Cubetas descartáveis (250/pct) 34000 Metanol, grau HPLC *Copos plásticos descartáveis 36010 Funil para filtro, 65 mm (10/pct) 36022 Água destilada, deionizada ou osmose reversa Cloreto de sódio não-iodizado (sal, NaCl)

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4.1 PROCEDIMENTO ZEARALATEST PARA MILHO

1.0 Calibração: utilize padrão de calibração de mic otoxinas (cód. 33020) VERDE VERMELHO AMARELO

-0,05 0,45 0,2 ± 0,03

2.0 Preparo 2.1 Calibre o fluorímetro.

2.2 Prepare a solução metanol:água (80:20 v/v) toda semana ou conforme a necessidade.

2.3 Prepare o tampão PBS1X / 0.1% Tween 20 todo mês ou conforme a necessidade. 2.4 Certifique-se que os reagentes em branco (1ml metanol HPLC + 1ml mistura de

revelador na cubeta) tem 0 ppm de leitura no fluorímetro calibrado.

3.0 Extração da Amostra

3.1 Pesar 20 g de amostra com 2 g de sal (NaCI) e colocar em um copo de liqüidificador.

3.2 Adicionar ao copo 50 ml de metanol: água (80:20 v/v) ou acetonitrila:água (90:10v/v).

3.3 Tampar o copo do liqüidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos. 3.4 Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.

Coletar o extrato em um recipiente limpo.

4.0 Diluição do Extrato

4.1 Pipetar ou entornar 10 mL do extrato filtrado em uma proveta limpa. 4.2 Diluir o extrato com 40 mL de tampão PBS / 0,1% Tween 20. Misturar bem. 4.3 Filtrar o extrato diluído através de filtro de microfibra de 1,0 µµµµm (artigo # G2005)

na seringa de vidro para medir 10 mL. Use um filtro de microfibra para cada análise.

5.0 Cromatografia de Afinidade (coluna)

5.1 Passar 10 mL do extrato filtrado completamente através de uma coluna de

afinidade Zearalatest a um fluxo de cerca de 1-2 gotas/segundo até que o ar passe pela coluna.

5.2 Passar 10 mL de tampão PBS com 0,1% Tween 20 através da coluna a um fluxo de cerca de 2 gotas/segundo.

5.3 Lavar a coluna passando 10 mL de água destilada ou deionizada à razão de cerca de 2 gotas/segundo até que o ar passe pela coluna.

5.4 Eluir a coluna de afinidade pela passagem de 1,0 mL de metanol grau HPLC através da coluna a um fluxo de cerca de 1 gota/segundo e coletar toda a amostra eluída (1 mL) em uma cubeta de vidro.

5.5 Adicionar 1.0 mL do revelador ao eluato na cubeta. Agitar bem e colocar a cubeta num fluorímetro calibrado. Ler a concentração de zearalenona após 300 segundos.

6.0 Limite de Detecção: 0,10 ppm.

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4.2 PROCEDIMENTO ZEARALATEST PARA RAÇÕES


-0,05 0,45 0,2 ± 0,03




revelador na cubeta) tem 0 ppm de leitura no fluorímetro calibrado. 2.5 Certifique-se que 2 ml de água numa cubeta tem 0 ppm de leitura no fluorímetro

calibrado.



3.2 Adicionar ao copo 50 ml de metanol: água (80:20 v/v) ou acetonitrila:água (90:10). 3.3 Tampar o copo do liqüidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos. 3.4 Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.







afinidade ZearalaTest a um fluxo de cerca de 1-2 gotas/segundo até que o ar passe pela coluna.

5.4 Passar 10 mL de tampão PBS com 0,1% Tween 20 através da coluna a um fluxo de cerca de 1 - 2 gotas/segundo.





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4.3 PROCEDIMENTO ZEARALATEST PARA SORGO


-0,05 0,45 0,2 ± 0,03




revelador na cubeta) tem 0 ppm de leitura no fluorímetro calibrado. 2.5 Certifique-se que 2 ml de água numa cubeta tem 0 ppm de leitura no fluorímetro

calibrado.



3.2 Adicionar ao copo 50 ml de metanol: água (80:20 v/v). 3.3 Tampar o copo do liqüidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos. 3.4 Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.







afinidade ZearalaTest a um fluxo de cerca de 1-2 gotas/segundo até que o ar passe pela coluna.

5.6 Passar 10 mL de tampão PBS com 0,1% Tween 20 através da coluna a um fluxo de cerca de 1 - 2 gotas/segundo.





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5.1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PARA PROCED IMENTO HPLC

Equipamentos Requeridos


Proveta graduada, 50 ml 20050 Escala digital com adaptador AC 20100 Liqüidificador com jarra em aço inox 20200 Proveta graduada, 250 ml 20250 Frasco dispensador de metanol 20501 Frasco de lavagem, 500 ml 20700 Estante para cubetas 21010 Suporte para bomba única posição 21020 Funil para filtro, 65 mm (10) 36020 Vortex mixer 23040 Frasco dispensador de metanol 500 ml (0-3 ml) 20501

Materiais Requeridos


Colunas ZearalaTest, para fluorímetro e HPLC (25/cx) G1012 Papel de filtro canelado VICAM (100) 31240 Filtro de microfibra, 1.0 um, 9 cm (100) 31955 Tampão de lavagem para micotoxinas 5X (200 mL) 32014 Revelador ZearalaTest 32011 Cubetas descartáveis (250/pct) 34000 Metanol, grau HPLC Copos plásticos descartáveis 36010 PBS 10Xconc. (150 mL) G1113 Água destilada, deionizada ou osmose reversa Cloreto de sódio não-iodizado (sal, NaCl)

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5.2 PROCEDIMENTO ZEARALATEST HPLC PARA MILHO, SORGO E RAÇÕES

1.0 Configuração do HPLC:

1.1 Coluna C18 , coluna de aço inoxidável 3.9 mm X 150 mm, 4 µm 1.2 Fase móvel: acetonitrila:água:metanol (46:46:8) 1.3 Fluxo: 1,0 mL/min. 1.4 Detector de fluorescência: detector de Fluorescência Kratos Spectroflow 980,

excitação 274 nm, emissão 440 nm.


2.1 Pesar 20 g de amostra com 2 g de sal e colocar em um copo de liqüidificador. 2.2 Adicionar ao copo 50 ml de acetonitrila: água (90:10 v/v). 2.3 Tampar o copo do liqüidificador e bater em alta velocidade por 2 minutos. 2.4 Remover a tampa do jarro e passar o extrato em um filtro de papel plissado.



3.1 Pipetar ou entornar 1 mL do extrato filtrado em uma proveta limpa. 3.2 Diluir o extrato com 49 mL de água destilada por osmose reversa. Misturar bem. 3.3 Filtrar o extrato diluído através de filtro de microfibra (Vicam, artigo # 31955) na

seringa de vidro para medir 10 mL.


4.1 Passar 10 mL do extrato filtrado (10 mL = 0,08g da amostra) completamente através de uma coluna de afinidade ZearalaTest a um fluxo de cerca de 1-2 gotas/segundo até que o ar passe pela coluna.

4.2 Passar 10 mL de água destilada por osmose reversa através da coluna a um fluxo de 1-2 gotas/segundo até a passagem de ar.

4.3 Eluir a coluna de afinidade pela passagem de 1.5 mL de metanol grau HPLC

através da coluna a um fluxo de 1 gota/segundo ou menos e coletar toda a amostra eluída (1,5 mL) em uma cubeta de vidro. Fluxo por gravidade é aceitável.

4.4 Adicionar 1,5 ml de água destilada ao eluato. Agitar em Vortex. 4.5 Injetar de 100 – 200 ul em HPLC.

5.0 Limite de Detecção: 0,10 ppm. 6.0 Recuperação: a porcentagem de recuperação utilizando este método é de

aproximadamente 90% na faixa de 0 – 50 ppm.

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6.1 PRECAUÇÕES GERAIS PARA O PROCEDIMENTO HPLC 1. Não faça a eluição da coluna com acetonitrila. 2. Eluir a coluna vagarosamente (~ 1 gota/segundo) com 1,5 mL de metanol HPLC. Fluxo por gravidade é

aceitável. 3. O revelador Zearalatest reagirão com qualquer proteína. Mantenha as soluções de reveladores,

eluato da coluna e ponteiras utilizadas para pipetar soluções livre de proteínas (i.e.: impressões digitais). 6.2 PRECAUÇÕES GERAIS PARA PROCEDIMENTO FLUORÍMETR ICO

Sempre utilize equipamentos e reagentes bons e limpos (metanol grau HPLC para eluição e água destilada, deionizada ou osmose reversa). Cheque os reagentes para fluorescência de fundo, conforme descrito na seção 3.3 – Checagem de reagentes. Cubetas não fornecidas pela Vicam podem apresentar fluorescência de fundo e por isso não devem ser utilizadas com os testes Vicam. Certifique-se que o dispensador de metanol está abastecido e livre de bolhas de ar antes de dispensar o metanol. Realize a análise do início ao fim sem interrupções. Use cubetas limpas e evite contaminação da solução eluida na cubeta. Verifique se há contaminantes dentro da cubeta (turbidez, partículas ou bolhas de ar) ou sujeira ou digitais no lado de fora. Limpe a cubeta por fora com um lenço de papel suave e assegure-se que não há partículas no extrato antes de realizar a leitura no fluorímetro. Passe o extrato pela coluna imediatamente após a filtração em microfibra. È normal que a amostra às vezes apresente turbidez após filtração em microfibra. Use apenas os equipamentos especificados pela Vicam. Evite contato de quaisquer reagentes ou soluções (tais como: metanol, extrato, eluato da coluna, revelador) com borracha ou plásticos flexíveis. Estes materiais podem contaminar a amostra com partículas fluorescentes. Certifique-se de utilizar filtro de microfibra 1.0 µm (Vicam, artigo # G2005). Use um novo filtro para cada análise. Proteja os padrões de calibração da luz e esteja atento para o prazo de validade. Não exceda o fluxo de gotejamento recomendado no procedimento.

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6.2 SOLUÇÕES DE PROBLEMAS NO PROCEDIMENTO FLUORIMÉT RICO 1. Problema: falsa leitura alta

Solução:

Checar reagentes. Certifique-se que a água e a solução de eluição têm leitura 0.

Não agite a cubeta colocando nela uma tampa e agitando. Mantenha os dedos afastados do fundo

da cubeta quando estiver agitando-a.

Lave as seringas de vidro novas com água e sabão neutro. Depois, enxágüe com água purificada e

metanol antes de utilizar para remover o lubrificante do êmbolo.

2. Problema: falsa leitura baixa

Solução:

Certifique-se que a metodologia foi seguida corretamente.

Mantenha o fluxo de passagem na coluna recomendado para passagem da amostra, lavagem e

eluição.

Certifique-se que a solução de extração foi feita corretamente e tem menos de uma semana de

preparo.

3. Problema: resultados inconsistentes

Solução:

Compare leituras de uma mesma corrida na coluna com o mesmo filtrado ao mesmo tempo.

Certifique-se que as amostras foram bem trituradas. Amostras diferentes podem dar variações de

resultado devido a variações no conteúdo de zearalenonas. Mesmo porções diferentes de uma

mesma amostra podem variar no conteúdo de zearalenonas.

Proteja o padrão de calibração da luz e reponha anualmente.

Calibre o fluorímetro corretamente para o procedimento adotado.

Siga as instruções cuidadosamente. Analise uma amostra do início ao fim sem parar.

Corra uma amostra conhecida diariamente para servir com um controle diário de precisão. Agite

bem o filtrado antes da diluição.

Certifique-se que o dispensador de metanol está cheio e livre de bolhas de ar antes de usá-lo.

Colete todo o eluato da amostra na cubeta.

Utilize o tempo de leitura de 300 segundos (delay time).

Soluções de problemas no fluorímetro Vicam Série-4

1. Problema: display / visor

Solução: limpe a memória e configure o visor como segue:

No “ VICAM READY “ digite a seqüência: 8, 3, 1, 1, 5. O visor mostrará: “CLEAR MEMORY?”,

pressione ENTER. O visor mostrará “CONFIRM CLEAR?”, pressione 1. A memória estará limpa. A

seguir, no “ VICAM READY” , pressione estes números um de cada vez: 7, 5, 7, 6, 1, 2. Você não

verá nenhuma mudança no visor “VICAM READY”. Para equipamentos com número de série maior

que 177, pressione o número 2. Para equipamentos com número de série inferior a 177, pressione

1. Este procedimento configurará o visor para uma revisão. Depois disso, teste o equipamento

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operando-o normalmente.

2. Problema: resultados variam de 0 a 270 ppb na ampola de calibração

Solução: Certifique-se de empurrar as ampolas de calibração e as cubetas totalmente no encaixe

do fluorímetro, de forma que o fundo do frasco toque o fundo da cela de amostra.

7.0 ASSISTENCIA TÉCNICA NO BRASIL

Para assistência técnica favor contatar: SOLCAMPO PABX: (19) 3933-3141 e-mail: [email protected]

8.0 RESPONSABILIDADES Os métodos analíticos descritos acima foram desenvolvidos pela Vicam para serem usados exclusivamente com os reagentes deste teste. O usuário assume todos os riscos do uso dos procedimentos analíticos e produtos Ochratest . A Vicam não fornece garantia de nenhum tipo, expressa ou implícita, além daquela dos produtos Ochratest conforme especificações impressas e padrões de controle de qualidade Vicam. A Vicam optará por consertar ou substituir algum produto ou item, que comprove estar com defeito na manufatura ou material. A Vicam é a empresa exclusiva para reparar ou substituir tais produtos e está no lugar de todas as garantias escritas, expressas oralmente, ou implícitas, incluindo alguma garantia implícita de comercialização ou aptidão para um propósito particular. A Vicam não tem responsabilidade por lucros antecipados ou perdidos, inconveniência ou dano direto, acidental, conseqüente ou, por outro lado, por pessoa ou propriedade, ou por responsabilidade estrita ou negligência originária ou em conexão com o uso destes procedimentos de análise ou produtos Ochratest. O FLUORÍMETRO VICAM FOI DESENVOLVIDO E MANUFATURADO CONFORME AS ESPECIFICAÇÕES DA VICAM E É APROPRIADO PARA UTILIZAÇÃO EM CONEXÃO OU CONJUGAÇÃO COM PRODUTOS, PROCEDIMENTOS E MÉTODOS VICAM APROPRIADOS, ASSEGURANDO UMA APLICAÇÃO CONSISTENTE E ALTAMENTE FIEL DA TECNOLOGIA ESPECIALIZADA PRÓPRIA DA VICAM. PORTANTO, QUALQUER UTILIZAÇÃO DESTE FLUORÍMETRO COM OU EM CONJUGAÇÃO COM QUALQUER PRODUTO QUE NÃO SEJA DA VICAM, COMPROMETE A INTEGRIDADE DA APLICAÇÃO/PROCEDIMENTO E PODE RESULTAR EM DANOS FÍSICOS AO PRODUTO, CUJO DANO CAUSADO, INCLUINDO QUALQUER REPARO DA GARANTIA OU REPOSIÇÃO, NÃO SERÁ DE RESPONSABILIDADE DA VICAM. QUALQUER USO DO FLUORÍMETRO VICAM COM OU EM CONJUGAÇÃO COM PRODUTOS QUE NÃO SEJAM VICAM, APESAR DE PREJUÍZO CAUSADO AO EQUIPAMENTO, PODE DISPENSAR A VICAM DE REALIZAR REPAROS OU REPOSIÇÃO DO PRODUTO DURANTE OU APÓS O PERÍODO DE GARANTIA. As informações e protocolos precedentes, bem como outros produtos desenvolvidos pela Vicam são periodicamente atualizados e revisados com o intuito de aumentar a confiança, otimizar o uso e melhorar a satisfação do consumidor. Quando uma versão melhorada, nova ou substituta de um protocolo ou produto está disponível, a Vicam não se responsabiliza por qualquer informação ou produto anterior, mesmo que o uso do produto ou protocolo anterior esteja dentro da validade. Para manter-se informado sobre qualquer protocolo novo, contate a Vicam por e-mail, fax ou telefone, ou direto com seu representante local. A Vicam não deve ser responsabilizada por qualquer resultado ou desempenho insatisfatório ou incorreto, envolvendo protocolos ou produtos Vicam se o teste ou a amostragem em questão não for conduzida corretamente. O consumidor é unicamente e totalmente responsável por orientar o pessoal técnico envolvido nos testes e amostragem de material de análise, quando da utilização de produtos e protocolos Vicam. Todos os produtos Vicam são protegidos por patente internacional e marca registrada.

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9.0 INFORMAÇÃO ADICIONAL

O presente manual de instruções foi traduzido e editado em português pela Solcampo., visando facilitar ainda mais a compreensão das metodologias indicadas e a aplicabilidade do produto. Todas as informações constantes deste manual são có pia fiel das informações originais constantes do mais recente “ Zearalatest Instruction Manual” e são de total responsabilidade da Vicam L. P.

manual zearalatest - solcampo

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