manual testes antimicrobianos

Maro - 2006

oPaS/aNVISa/SVS

Controle Interno da Qualidadepara Testes de Sensibilidade a antimicrobianos

Tecnologia em servios de sade

Projeto de Monitoramento e Preveno da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Coordenao do Projeto

Flvia Freitas de Paula Lopes GGTES/ANVISA/MS

Adlia Aparecida Maral dos Santos GIPEA/GGTES/ANVISA/MS

Maria Cndida de Souza Dantas CGLAB/SVS/MS

Valeska de Andrade Stempliuk OPAS/OMS

Elaborao


Colaboradores

Adlia Aparecida Maral dos Santos GIPEA/GGTES/ANVISA/MS

Antonia Maria Machado - Laboratrio Central do Hospital So Paulo - UNIFESP

Eliete Frigatto - Laboratrio Central do Hospital So Paulo - UNIFESP

Heiko Thereza Santana - GIPEA/GGTES/ANVISA/MS

Janana Sallas Coordenao Geral Laboratrios de Sade Pblica DEVEP/CGLAB/SVS/MS

Mrcia de Souza Carvalho Melhem Instituto Adolfo Lutz / So Paulo SP

Maria Rita Elmor Laboratrio de Microbiologia do Hospital Srio Libans / So Paulo SP

Marins Dalla Valle Martino Hospital Israelita Albert Einstein / So Paulo SP

Sociedade Brasileira de Anlises Clnicas

Reviso tcnica

Heiko Thereza Santana GIPEA/GGTES/ANVISA/MS

Janana Sallas DEVEP/CGLAB/SVS/MS

Slvia Figueiredo Costa Hospital das Clnicas FM/USP

Suzie Marie Gomes GIPEA/GGTES/ANVISA/MS


Reviso de texto

Ana Beatriz de Noronha

Esta publicao est sendo realizada no marco do Termo de Cooperao 37 (TC 37) entre a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria / Ministrio de Sade e a Organizao Pan-Americana da Sade/Or-ganizao Mundial da Sade - Representao do Brasil.

Organizao Pan-Americana da Sade/Organizao Mundial da SadeSetor de Embaixadas Norte, Lote 19, 70800-400 [email protected] www.opas.org.br

Impresso no Brasil

m2 - Tecnologia em Servios de Sade

Lista de Figuras

Figura 1

Propagao da cultura de Bactrias

Figura 2

Fluxograma para manuseio e estocagem da Cepa de Referncia

Figura 3

Fluxograma para manuseio da Cepa de Referncia no controle da qualidade

M2 - I - 4

M2 - C1 - 2

M2 - C1 - 3

m2 - Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Lista de Siglas e abreviaturas

Anvisa Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria

ATCC American Type Culture Collection

BaSO4 Sulfato de Brio

CCIH Comisso de Controle de Infeco Hospitalar

CGLAB Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica

CIM Concentrao Inibitria Mnima

CIQ Controle Interno da Qualidade

CLSI Clinical Laboratory Standard Institute

CO2 Dixido de Carbono

CQ Controle da Qualidade

CQIL Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais

DEVEP Departamento de Vigilncia Epidemiolgica

EPC Equipamentos de Proteo Coletiva

EPI Equipamentos de Proteo Individual

ESBL Beta-lactamase de Espectro Estendido

FM/USP Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

GGTES Gerncia-Geral de Tecnologia em Servios de Sade

GIPEA Gerncia de Investigao e Preveno das Infeces e dos Eventos Adversos

IEC International Electrotechnical Commission

ISO Internacional Standards Organization

MH Mueller-Hinton

MS Ministrio da Sade

OMS Organizao Mundial da Sade

OPAS Organizao Pan-Americana da Sade

PCIQ Programa de Controle Interno da Qualidade

pH Potencial Hidrogeninico

POP Procedimento Operacional Padro

SNVS Sistema Nacional de Vigilncia Sanitria

SPVA Sucrose Fosfato Glutamato

SVS Secretria de Vigilncia em Sade

TSB Caldo de Soja Trptica

UNIFESP Universidade Federal Escola Paulista

m2 - Tecnologia em Servios de Sade

Introduo

1. Parmetros para um Programa de Controle da QualidadeI - Fase pr-analticaII - Fase analticaIII - Fase ps-analtica

2. Cepas de referncia 2.1.Definies 2.2. Tabela 1. Indicao de uso das cepas de referncia

Captulo 1

Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia

1. Cepas de referncia 1.1. Manuseio e estocagem

2. Controle de Turbidez para a Preparo do Inculo

3. Mtodo de Disco-Difuso 3.1. Freqncia dos testes de controle da qualidade 3.2. Teste de controle da qualidade dos meios de cultura 3.3.Testesdecontroledaqualidadedaprovaedoperfildesensibilidade

4. Mtodo de Diluio em Caldo ou gar (CIM) 4.1. Freqncia dos testes de controle da qualidade 4.2. Freqncia dos testes de controle da qualidade para testes de triagem 4.3. Testes de controle da qualidade do meio de cultura 4.4. Mtodo de diluio em gar 4.5. Mtodo de diluio em caldo (microdiluio e macrodiluio) 4.6.Testesdecontroledaqualidadedaprovaedoperfildesensibilidade

Captulo 2

Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras

1. Cepas de Referncia 1.1. Cepas recomendadas para testes de CIM de 48 horas por diluio

em caldo 1.2. Cepas recomendadas para testes de CIM de 24 e 48 horas por

microdiluio em caldo 1.3. Cepas recomendadas para disco-difuso

2. Manuseio e estocagem das cepas de referncia 2.1. Preparo das cepas de referncia para armazenamento 2.2. Armazenamento das cepas de referncia 2.3. Manuseio das cepas de referncia nos testes de rotina

Sumrio

M2 - I - 1

M2 - I - 1M2 - I - 1M2 - I - 2M2 - I - 4

M2 - I - 4M2 - I - 4M2 - I - 5

M2 - C1 - 1

M2 - C1 - 1M2 - C1 - 1

M2 - C1 - 4

M2 - C1 - 4M2 - C1 - 4M2 - C1 - 5M2 - C1 - 6

M2 - C1 - 8M2 - C1 - 9M2 - C1 - 9M2 - C1 - 9M2 - C1 - 9M2 - C1 - 10M2 - C1 - 10

M2 - C2 - 1

M2 - C2 - 1

M2 - C2 - 1

M2 - C2 - 1M2 - C2 - 1

M2 - C2 - 1M2 - C2 - 1M2 - C2 - 2M2 - C2 - 2

m2 - Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

3. Freqncia dos Testes de Controle da Qualidade 3.1. Intervalos de CIM 3.2. Testes de sensibilidade a antifngicos

4. Testes de controle da qualidade do Meio de Cultura e Artigos de Plstico

5. Outros Testes de Controle utilizados na macrodiluio e microdiluio 5.1. Controle do crescimento 5.2. Controle de pureza 5.3.Controledaleituradospontosfinaisdareao

6.Testedequalidadedaprovaedoperfildesensibilidade

Captulo 3

Controle da qualidade em testes de sensibilidade realizado por Mtodos Automatizados

1. Elementos essenciais do sistema de gesto da qualidade 1.1 Fase pr-analtica 1.2. Controle interno do laboratrio 1.3. Controle da qualidade dos processos automatizados 1.4. Validao

Referncias Bibliogrficas

Anexos

Anexo I: Procedimentos utilizados para manuteno e estocagem de microrganismos

Anexo II: Planilhas para controle interno da qualidade

Anexo III: Relatrios de Registro da Realizao do Controle Interno da Qualidade - Hospital

Anexo IV: Relatrios de Registro da Realizao do Controle Interno da Qualidade - LACEN

M2 - C2 - 3M2 - C2 - 3M2 - C2 - 3

M2 - C2 - 4

M2 - C2 - 5M2 - C2 - 5M2 - C2 - 5M2 - C2 - 5

M2 - C2 - 5

M2 - C3 - 1

M2 - C3 - 1M2 - C3 - 1M2 - C3 - 1M2 - C3 - 1M2 - C3 - 2

M2 - A - 1

M2 - A - 1

M2 - A - 3

M2 - A - 15

M2 - A - 19

M2 - RB - 1

m2 - I - Tecnologia em Servios de Sade

O programa de controle interno da qualidade um conjunto de aes que visam garantir a

qualidadee reprodutibilidadedosprocessosedos resultadosproduzidospormeiodaverificao

continua dos fatores que interferem nessa. Deve ser visto como uma oportunidade de aprimoramento

das atividades desenvolvidas no laboratrio. Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS)1 a

implantao de um programa da qualidade necessria para:

melhorar a qualidade dos servios de sade;

gerarresultadosconfiveisereproduzveis;

propiciar que resultados interlaboratoriais sejam comparveis;

aumentar a credibilidade do laboratrio entre os mdicos e seus clientes;

motivar os funcionrios a melhorar o desempenho; e

prevenir de complicaes legais que podem seguir a liberao de exames de baixa qualidade.

Muitos fatores interferem na qualidade dos resultados liberados pelo laboratrio de microbiolo-

gia, como por exemplo: (a) a seleo, coleta, transporte e acondicionamento apropriados do espcime

biolgico; (b) o treinamento, comprometimento e motivao do pessoal de laboratrio; (c) fatores

ambientais,comoluminosidadedeficienteouexcessiva,ventilaoecondiesdolocaldetrabalho;

(d) fatores analticos, como baixa qualidade dos reagentes, vidraria, corantes, meios de cultura e falta

de equipamentos precisos; e (e) erros de transcrio de resultados, resultados liberados incompletos

e interpretao errada das provas bioqumicas ou antibiograma1.

Este guia um instrumento que tem como objetivo oferecer subsdios aos laboratrios de micro-

biologia na elaborao do manual de procedimentos operacionais padro (POP) que deve ser construdo

pelo laboratrio. Ele faz parte do Manual de Microbiologia Clnica para o controle de infeco em servios

de sade elaborado e disponvel na pgina eletrnica da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (An-

visa)2. Este deve ser utilizado em consonncia com a Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI),

Boas Prticas de Laboratrios, Norma Brasileira Reguladora - NBR ISO/ IEC 17025 por microbiolgicos

e biolgicos e Resoluo Diretoria Colegiada - RDC 302, de 13 de outubro de 2005.

Os documentos aqui apresentados contm informaes bsicas acerca da realizao, da freqn-

cia e das indicaes dos testes de controle interno da qualidade (CIQ) dos laboratrios de microbiologia

clnica, na fase analtica.

1. ParMeTroS Para uM PrograMa de CoNTroLe da QuaLIdade2,3

I - FaSe Pr-aNaLTICa

a) garantia da qualidade das amostras clnicas

O laboratrio de Microbiologia deve elaborar um manual de instrues, contemplando os

seguintes itens:

coleta,identificaoeconservaodaamostra;

transporte da amostra, estabelecendo meio recomendado, prazo, condies de temperatura

e padro tcnico para garantir a sua integridade e estabilidade;

Introduo

m2 - I - 2 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

critrios para o preparo do cliente com instrues claras e escritas em linguagem acessvel, sendo

que somente as instrues simples e de fcil compreenso podem ser dadas verbalmente;

critrios para a aceitao ou rejeio das amostras; e

documentao das informaes relacionadas s amostras coletadas, como data, horrio e

responsvel pela coleta e eventuais intercorrncias, garantindo sua rastreabilidade durante

todo o processo.

II - FaSe aNaLTICa

a) Manual de Procedimentos operacionais Padro (PoP)

O laboratrio de Microbiologia deve elaborar os documentos internos de procedimentos,

seguindo as indicaes de GP2-A4 do CLSI (Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals; Ap-

proved Guideline - Fourth Edition (2002) e deste documento.

Os POPs devero conter, no mnimo: tcnica, limites de tolerncia, aceitao e rejeio da amostra,

preparo de reagentes, controle de qualidade (CQ), clculos, critrios de liberao de resultados.

Revisar os documentos, anualmente, ou sempre que ocorrer mudanas nos processos descritos.

Disponibilizar as informaes escritas no ambiente de trabalho.

B) garantia da qualidade tcnica dos colaboradores

Oferecer e documentar capacitao tcnica para as atividades desempenhadas na rotina do

laboratrio de microbiologia.

Manter programa de capacitao para o uso apropriado de equipamentos.

Utilizar equipamentos de proteo individual (EPI) e equipamentos de proteo coletiva

(EPC) e cumprir as normas de biossegurana.

Participar ativamente junto Comisso de Controle de Infeco Hospitalar (CCIH), forne-

cendo dados epidemiolgicos de diferentes agentes etiolgicos de infeco hospitalar e seus

perfisdesensibilidade.

Armazenar cepas de interesse para estudos.

Os resultados dos procedimentos e testes devem ser conferidos quanto exatido, reprodu-

tibilidade e concordncia com os padres de CQ pelo responsvel designado.

C) desempenho dos equipamentos e instrumentos

Elaborar e manter um programa de manuteno preventiva e corretiva dos equipamentos.

Manter registro dirio de temperaturas dos equipamentos de banho-maria, estufa, freezer,

geladeira e meio ambiente.

Fazercontroledaeficciadoprocessodeesterilizaodasautoclaves(Bacillus stearother-

mophilus).

Dispor de manual de funcionamento do equipamento em portugus.

Estabelecer cronograma de manuteno preventiva.

Registrar a manuteno preventiva e corretiva dos equipamentos em uso.

Documentar o estado de calibrao dos equipamentos e instrumentos usados nos processos

analticos, como pipetas automticas e pipetadores, termmetros, centrfugas, microscpios,

espectrofotmetros, turbidmetro, balanas analticas, pHmetro, equipamentos analticos, etc.

Documentaraverificaodofuncionamentodoequipamento.

Documentar a realizao da limpeza dos equipamentos.

Manteredocumentarahigienizaoperidicadefluxos,cabinesdesegurana,capelas,

geladeiras, freezer, banho-maria, centrfugas, estufas, etc.


DocumentarautilizaodecepasderefernciaparaoCIQdeacordocomasespecificaes

do equipamento.

Documentar alertas emitidos pelo equipamento.

Atualizar softwareacadamudana,documentandoasmodificaes.

Definiroslimitesdeaceitabilidadeparaasinexatidesencontradasnascalibraes,verifi-

caes e comparaes entre equipamentos, e garantir a implementao de aes corretivas

para os eventuais desvios.

d) Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais (CQIL)

D1. Corantes e reagentes Respeitar as orientaes escritas dos fabricantes para o uso dos reagentes.

Solicitar cpia dos laudos qualitativos junto ao fabricante para cada lote recebido.

Rotular cada produto com: nome, nmero do lote, concentrao, condies de estocagem,

data do preparo, recebimento, quando foi colocado em uso e prazo de validade.

Testar com controles positivos e negativos antes do uso, conforme o tipo de teste.

SeosresultadosnoforemsatisfatriosnotificarofornecedoreoSNVS.

Descartar o produto se o controle no estiver apropriado.

Definiredocumentarograudepurezadaguareagenteutilizadanasanlises,assimcomo

a forma de obteno e controle dessa gua.

D2. Meios de cultura Documentar a quantidade de meio preparado no laboratrio, nmero do lote, mtodo de

esterilizao, data do preparo, pH, validade e tcnico responsvel pela preparao.

Realizar e documentar teste de esterilidade e desempenho dos meios preparados no labo-

ratrio, utilizando cepas de referncia, tipo ATCC.

Observar o meio quanto a cor, consistncia, profundidade e/ou superfcie, hemlise, presena

de bolhas e contaminao.

Documentar o nmero do lote e a data de recebimento dos meios comerciais. Solicitar ao for-

necedorocertificadodecontroledequalidade,conformerecomendaesdoCLSI.

Documentar os meios que no estejam de acordo com os padres, as aes corretivas tomadas

e informar ao fornecedor e ao SNVS.

D3. Discos e fitas E-test TestarosdiscosoufitasE-testdeantimicrobianos,cartesoupainiscomantibiticos,

diariamente,por20diasconsecutivos,afimdevalidarametodologia.Utilizarcepasde

referncia, tipo ATCC.

Seguir, rigorosamente, as recomendaes do fabricante quanto ao armazenamento dos

discos antimicrobianos.

Documentar os discos de antimicrobianos que no estejam de acordo com os padres CLSI,

as aes corretivas tomadas e informar ao fornecedor e SNVS.

D4. Kits comerciais e anti-soros Verificarsehregistrodokit junto ao ministrio da sade www.anvisa.gov.br

Testar os kits e anti-soros de um novo lote em paralelo com o lote anterior ou com cepas de

referncia, antes de coloc-los em uso. Utilizar controles positivos e negativos, juntamente

com cepas de referncia recomendadas. Documentar os resultados desses testes.

m2 - I - Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Seguir as recomendaes do fabricante para o teste do controle da qualidade.

Registrar as informaes contidas no rtulo do Kit para rastreabilidade do processo.

NotificaraofornecedoreSNVSosdesviosdequalidadeencontrados.

III - FaSe PS-aNaLTICa

Documentar a liberao de resultados, emisso e entrega de laudos.

Garantiraconfidencialidadedosresultadosdoslaudos.

Fornecer aos colaboradores uma avaliao peridica de desempenho do laboratrio no

controleinterno,verificandoaabrangnciaeadequaodessescontroles.

2. CePaS de reFerNCIa6,7

2.1. deFINIeS6

As cepas de refernciadestinam-severificaodosresultadosobtidos,poissuascaractersticas

fenotpicasjsoconhecidas,ouseja,suaidentificaoeseuperfildesensibilidadejforamdeterminados.

Ascepasderefernciadevempossuirumaorigemconfivel,vindodeumlaboratriodereferncia

querealizatestesfenotpicosemolecularesparaconfirmarsuaidentificaoeperfildesensibilidade.

Define-secomocultura de estoque o subcultivo das cepas de referncia. Essa cultura ar-

mazenada no laboratrio de microbiologia (a -20oC ou menos) e descongelada anualmente.

A cultura de trabalho o subcultivo semanal ou mensal da cultura de estoque e ser mantida

no laboratrio (4oC a 8oC) para realizao dos testes dirios ou semanais de CIQ.

Uma passagem a transferncia do organismo de uma cultura vivel para um novo meio

de cultura com crescimento de microrganismos. A hidratao (ou decongelamento) de uma cepa de

referncia no considerada uma passagem ou repique. A primeira passagem ser o subcultivo da

cepa de referncia para a cultura de estoque. A transferncia do microrganismo da cultura de estoque

para a cultura de trabalho ser a segunda passagem (Figura 1).

Cepa de referncia Cultura de estoque

1 passagem

Cultura de trabalho

2 passagem

Figura 1. ProPagao da CuLTura de BaCTrIaS4


MicrorganismosGram-negativos

2.2. Tabela 1: INdICao de uSo daS CePaS de reFerNCIa4,5

Teste indicado

E. coli ATCC 25922- Cepa no produtora de -lactamase.

E. coli ATCC 35218- Cepa produtora de -lactamase

Deve ser mantida a -60oC para prevenir perda

do plasmdeo

E. coli ATCC 51446

K. pneumoniae ATCC 13883

K. pneumoniae ATCC 700603 - Cepa produtora de -lactamase de

espectro ampliado

Deve ser mantida a -60oC para prevenir perda

do plasmdeo

P. aeruginosa ATCC 27853Sensvel aos agentes anti-pseudomas

P. mirabilis ATCC 7002

Qualidade da prova de DD e CIM de enterobactrias

Qualidade da prova de DD e CIM de Pseudomonas, Acinetobacter, S. maltophilia e Burkholderia

Qualidade da prova de DD e CIM de Vibrio colerae

TestesdetriagemeconfirmatriodeESBL

Qualidade da prova em testes automatizados de susceptibilidade em painis de gram negativos

Qualidade da prova de DD e CIM para de -lactmicos e inibidores de -lactamase

Qualidade da prova de DD e CIM para Amoxacilina - Ac. clavulnico de Haemophilus spp

VITEK GNS MIC painel QC set

Testes automatizados para inibidores de -lactamase em painis de gram-negativos

Testes automatizados de para ESBL

Qualidade da prova em testes automatizados de identificaodebacilosgram-negativos

TestesdetriagemetesteconfirmatriodeESBL

Qualidade da prova em testes de diluio em caldo e diluio em gar de P. aeruginosa e outros no-enterobacteriaceas

Testesautomatizadosparaverificaodaconcentrao de ction e pH com aminoglicosdeos em painis de gram-negativos

Qualidade da prova em testes automatizados de identificaodebacilosgram-negativos

m2 - I - Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

MicrorganismosGram-positivos

2.2. Tabela 1: INdICao de uSo daS CePaS de reFerNCIa4,5

Teste indicado

Adequao do meio para testes de sulfonamidas e trimetropim, DD e CIM

Qualidade da prova de CIM para Enterococcus spp

Teste de triagem de alto nvel de resistncia aos aminoglicosdeos e vancomicina

Qualidade da prova em testes automatizados de identificaoesusceptibilidadedegram-positivos

Teste de triagem de alto nvel de resistncia aos aminoglicosdeos e vancomicina

Testes automatizados de susceptibilidade a vancomicina para gram-positivos

Qualidade da prova em testes de DD para Staphylococcus spp, Enterococcus spp

Qualidade da prova em testes de CIM para Staphylococcus spp

TesteconfirmatriodesusceptibilidadeaOxacilina

Qualidade da prova em testes automatizados de identificaoesusceptibilidadedegram-positivos

TesteconfirmatriodesusceptibilidadeaOxacilina

Qualidade da prova de DD da susceptibilidade de S. pneumoniae ou Streptococcus spp

E. faecalis ATCC 29212- Sensvel a vancomicina, ampicilina e altos nveis de aminoglicosdeos

E. faecalis ATCC 51299 - Resistente a vancomicina e altos nveis de aminoglicosdeos

S. aureus ATCC 25923- Cepa no produtora de -lactamase

S. aureus ATCC 29213- Cepa produtora de -lactamase

S. aureus ATCC 43300 - Resistente a oxacilina

S. pneumoniae ATCC 49619- Intermedirio para penicilina

Leveduras

Qualidade da prova em testes automatizados de identificaodeleveduras

Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por CIMeDDdefluconazol

Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por CIM de leveduras

Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por DDdefluconazol

Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por DDdefluconazol

C. albicans ATCC 14053

C. parapsilosis ATCC 22019

C. kruzei ATCC 6258

C. albicans ATCC 90028

C. tropicalis ATCC 750

m2 - C - Tecnologia em Servios de Sade

1. CePaS de reFerNCIa

1.1. MaNuSeIo e eSToCageM

As cepas de referncia tm um nmero mximo de geraes a qual podem ser submetida, so

cinco passagens a partir da cepa de referncia original6.Onmeroindefinidodepassagenspodecom-

prometer principalmente a pureza da cultura e as caractersticas fenotpicas de algumas bactrias.

Seguindo os procedimentos descritos neste documento e em condies ideais de armazenagem,

a passagem para a produo das culturas de estoque pode ser anual e a passagem das culturas de

trabalho pode ser realizada a cada trs semanas.

Algumas cepas devem ser mantidas em condies especiais devido a suas caractersticas in-

trnsecas (ex. cepas exigentes).

As cepas de controle da qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e mtodos

empregados para testes de isolados clnicos.

No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referncia devem ser mantidas a tem-

peratura de -20oC, ou menos, (de preferncia a -60oC ou menos, ou em nitrognio lquido)

em meio estabilizador recomendado.

Meios utilizados para a manuteno das cepas de referncia (Figura 2):

Skin milk a 20% (p/v) de leite desnatado em p dissolvido em gua destilada, autoclavar

a 121oC por 20 minutos.

Caldo de soja trptica a 10 - 20% de glicerol (v/v), autoclavar 121oC por 20 minutos.

Sanguedecoelhodesfibrinado.

OBS: Os criotubos com selo de proteo interna so os mais utilizados para o processo de arma-

zenamento dessas amostras. Os criotubos so preparados com antecedncia, em volumes que

em geral esto em torno de 0,5mL por tubo, e previamente testados quanto esterilidade.

A) Partindodacepaoriginalliofilizada:

Ressuspenderacepaliofilizada,conformeasrecomendaesdofabricante.

Homogenizar o frasco.

Semearemmeiodeculturaespecfico(garSangue,MacConkeyougarChocolate).

Fazer dois repiques.

IdentificaratravsdeprovasbioqumicasmanuaisouautomatizadasecoloraodeGram.

Realizar testes de sensibilidade antimicrobianos.

Depoisdecertificaraidentificaoeostestesdesensibilidade,armazenaracepa.

Transferir as colnias recentes de 18 a 24 horas, em 15 frascos estreis (criotubos), para cada

cepa de referncia a ser utilizada no controle.

Etiquetar os frascos com o nome do microrganismo, nmero da cepa de referncia, a data

do armazenamento e o ms a ser utilizado (janeiro a dezembro). Nos outros trs frascos,

colocar a data dos trs anos seguintes para realizar o mesmo procedimento.

Armazenar em freezer 20oC ou 60oC (Figura 2).

Captulo 1

Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia

m2 - C - 2 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Figura 2. FLuxograMa Para MaNuSeIo e eSToCageM da CePa de reFerNCIa

gar de acordo com o microrganismo

especfico

2 placas de gar especfico+1gar Seletivo

Armazenar todas

Freezer - 20C ou - 60C

Identificaoeconfirmao

Provas Bioqumicas e Colorao de Gram

Testedeperfildesensibilidade

(Antibiograma)

Jan. Fev. Mar. Abr. Mai. Jun. Jul. Ago. Set. Out. Nov. Dez.

ATCC liofilozada

Hidratar

1 Repique

Verificaraviabilidade,pureza das colnias

2 Repique

Validao

Fazer o banco200620072008


B) Partindodacepacongelada:

Retirar o criotubo com a cepa (ex.: janeiro) do freezer e com o auxlio de uma ala bacterio-

lgica,semearaamostraaindacongeladaemmeioespecfico.

Incubar a placa por 18 a 24 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.

Fazer um segundo repique utilizando duas placas.

Numa das placas, fazer os testes de sensibilidade a antimicrobianos (para a 1 semana).

Na outra placa, semear a cepa em trs tubos de gar Meller Hinton inclinado.

Incubar por 18 a 20 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.

Colocar esses tubos na geladeira ( 2 a 8oC) para serem utilizados nos testes de sensibilidade

aos antimicrobianos para a 2a, 3a e 4a semanas do ms, repicar apenas uma vez.

Esse procedimento deve ser realizado para todas as cepas envolvidas no CIQ (Figura 3).

OBS:Asculturascongeladasou liofilizadasdevemsercultivadasduasvezesantesdese

realizar os testes de sensibilidade.

Ateno especial manuteno do organismo (subcultivo mnimo) e seu armazenamento

(ex.- 60oC ou menos) so particularmente importantes para as cepas CIQ E. coli ATCC 35218

e K. pneumoniae ATCC 700603, visto que tem sido documentada a perda espontnea do

plasmdeoquecodificaa-lactamase.

Deve-se preparar um novo lote de cultivos se forem obtidos resultados aberrantes.

Figura 3. FLuxograMa Para MaNuSeIo da CePa de reFerNCIa No CoNTroLe da QuaLIdade

gar MH inclinado

Janeiro

1 Repique

2 Repique

Geladeira

O 2 repique para o uso na 1 semana

2 semana 3 semana 4 semana

m2 - C - Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

2. CoNTroLe de TurBIdez Para a PreParo do INCuLo 7

Para padronizar a densidade do inculo para um teste de sensibilidade, deve-se usar um con-

trole de turbidez de BaSO4, equivalente a uma soluo padro 0,5 de McFarland ou seu equivalente

ptico (ex., suspenso de partculas de ltex). A soluo padro 0,5 de McFarland de BaSO4 pode ser

preparada da seguinte maneira.

Acrescenta-se uma alquota de 0,5mL de BaCl2 0.048 mol/L (1,175% v/v BaCl

2 2H

2O)

a 99,5mL de H2SO

4 0,18mol/L (1% v/v), homogeneizando constantemente para manter

a suspenso.

Adensidadecorretadocontroledeturbidezdeveserverificadausandoumespectrofotmetro

com fonte de luz de 1-cm e cubeta apropriada para determinar a absorbncia. A absorbncia

da soluo padro 0,5 de McFarland dever variar de 0,08 a 0,10 utilizando um comprimento

de onda de 625 nm.

A suspenso de sulfato de brio deve ser transferida, em alquotas de 4 a 6 mL, para tubos

com tampas de rosca do mesmo tamanho usados para cultivar e diluir o inculo bacteriano.

Esses tubos devem ser selados hermeticamente e armazenados em local escuro, tempera-

tura ambiente.

O controle de turbidez de sulfato de brio deve ser agitado vigorosamente num misturador

mecnicotipovrtexantesdecadauso,verificandoseestuniformementetrbido.Nocaso

de precipitao visvel, o controle deve ser substitudo. As suspenses de partculas de ltex

devem ser misturadas invertendo-as suavemente, e no num misturador tipo vrtex.

Oscontrolesdesulfatodebriodevemsersubstitudos,ousuasdensidadesverificadas,

todo ms.

3. MTodo de dISCo-dIFuSo

O mtodo de Kirby-Bauer ou disco-difuso recomendado para algumas combinaes micror-

ganismo/ antimicrobiano e muito utilizado em nosso meio. Sua praticidade, baixo custo e facilidade

operacional facilitam a implantao deste mtodo nos laboratrios de microbiologia clnica.

Alguns fatores relacionados ao preparo do meio de cultura e sua composio podem interferir

noresultadofinalliberadopelolaboratrio.Aconfirmaodaqualidade,esterilidadeecomposio

do meio de cultura devem ser avaliadas atravs dos testes de CIQ.

3.1. FreQNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade

A freqncia dos testes de CIQ deve ser no mnimo mensal. Entretanto, as recomendaes

nacionais e internacionais2,6 preconizam testes semanais. Essas recomendaes devem ser seguidas

se a estrutura ou a capacidade do laboratrio permitir.

A introduo do programa de CIQ inicia-se com a realizao de testes dirios, passando, em

fase posterior, para a realizao mensal dos testes.

Teste dirio - Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos

e documentar os resultados.

Para passar a realizao dos testes de diria para mensal nenhuma das cinco leituras de halos,

para cada combinao de agente/antimicrobiano, pode estar fora dos limites aceitveis.


Teste mensal - Testar todas as cepas de CIQ no mnimo mensalmente e sempre que qual-

quer novo reagente do teste for utilizado (ex.: um novo lote de gar ou meio, um novo lote

de discos ou outro fabricante de insumos).

Documentar a realizao dos testes de controle da qualidade, anotando os nmeros dos lotes,

meios de cultura, reagentes, discos de antibiticos testados nas respectivas datas e ms.

Sempre que algum resultado dos testes mensal de controle da qualidade estiver fora da faixa

aceitvel, faz-se necessrio implantar ao corretiva6.

Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanas impor-

tantes no mtodo de leitura dos resultados dos testes, estes devem ser realizados por cinco

dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqncia mensal.

3.2. TeSTe de CoNTroLe da QuaLIdade doS MeIoS de CuLTura6

a) Meio de cultura

O meio indicado para os testes de disco-difuso em organismos no fastidiosos o gar Meller-

Hinton (MH).

B) espessura

A espessura do meio deve ser de 4 mm uniformemente distribuda. Volumes mdios utilizados:

60 a 70 mL / placa de 150 mm e 25 mL / placa de 90 mm.

C) esterilidade

Apspreparodasplacas,examinarumaamostrasignificativa(10%)ealeatriadecadalote

dasplacasparaconfirmarsuaesterilidade,mediantesuaincubaoa30C-35Cpor,pelo

menos, 24 horas.

As placas devem ser usadas at sete dias aps o preparo, a no ser que sejam tomadas precaues

adequadas, como embrulh-las em saco plstico, para minimizar o ressecamento do gar.

d) pH

OpHdecadalotedegarMeller-Hintondeveserverificadoquandoogarpreparado.

OmeiogardeverterpHentre7,2e7,4atemperaturaambienteapssolidificao.

A medida do pH deve ser feita preferencialmente atravs de pHmetro apropriado, submerso

emporodemeiosolidificadotemperaturaambiente.Casoestejaforadasespecificaes,

deve-se checar a procedncia do meio, a qualidade da gua e, eventualmente, preparar novo

lote seguindo estritamente as recomendaes do fabricante6.

MtodosdeverificaodepH(verCLSINormaM2-A96 ou norma substituta):

Macerarumaquantidadesuficientedegarparasubmergirapontadeumeletrododo

pHmetro calibrado.

Oupermitirqueumapequenaquantidadedegarsolidifique-seemtornodapontade

um eletrodo do pHmetro calibrado.

Ou em um bquer contendo o gar usar um eletrodo de superfcie devidamente calibrado.

e) efeitos da timidina ou timina

Excesso dessas substncias pode levar a falsas resistncias para sulfa-trimetoprim. Portanto,

deve-se usar meio gar Meller-Hinton com o menor teor possvel de timina ou timidina


O teor de timidina ou timina deve ser testado com Enterococcus faecalis ATCC 29212

com discos de sulfametaxol/trimetoprim. Um meio satisfatrio produzir halos de inibio

ntidoscomdimetro20mm.

F) efeitos de Variao nos Ctions divalentes

As variaes nos ctions divalentes, principalmente magnsio e clcio, afetaro os resultados

dos testes dos aminoglicosdeos e da tetraciclina e variao nos nveis de clcio tambm

afeta os resultados dos testes de daptomicina. Realizar teste de qualidade da prova para

estes agentes antimicrobianos.

G) ArmazenamentodeDiscosAntimicrobianos

Os discos devem ser armazenados conforme indicado a seguir.

Refrigerarosrecipientesatemperaturade8Coumenos,oucongelara-15Coumaisfrio,

num congelador comum (no do tipo frost-free) at o momento de usar.

Os pacotes fechados de discos contendo drogas da classe de -lactmicos devem ser armaze-

nados congelados, com exceo de um pequeno nmero de discos reservados para o trabalho

cotidiano,quepodeserrefrigerado(entre+4oCe+8oC) durante, no mximo, uma semana.

Alguns agentes lbeis (ex., combinaes de cido clavulnico, carbapenmicos e cefaclor)

devem ser armazenados congelados at o uso.

Os recipientes fechados de discos devem ser retirados da geladeira ou congelador uma ou

duas horas antes de serem usados, para que se equilibrem em temperatura ambiente antes

de serem abertos.

Aps retirar o cartucho de discos do pacote selado, coloc-lo num dissecador.

Quando se usa um dissecador, este deve ser tampado hermeticamente, acrescentando-se

um dissecante recomendado. Deve-se deixar que a temperatura do dispensador chegue

temperatura ambiente antes de abri-lo. Evitar umidade excessiva, substituindo o dissecante

sempre que o indicador mudar de cor.

Quando no estiver em uso, o dispensador de discos deve ser mantido refrigerado.

Apenas os discos dentro do prazo de validade do fabricante podem ser usados. Os discos

devem ser descartados no vencimento.

3.3. TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade

Falhas na deteco do padro de resistncia podem estar relacionadas a diversos fatores como:

m qualidade do meio de cultura, disco com baixa concentrao de antimicrobiano, falhas no proce-

dimento, inculo com concentrao de microrganismos fora do preconizado, tempo e temperatura

de incubao inapropriados.

O controle da acurcia dos testes realizados deve ser feito utilizando-se as cepas referncia para

o gnero ou espcie do microrganismo ou classe de antimicrobiano que est sendo testado.

Sero testados os antimicrobianos que fazem parte do antibiograma utilizado na rotina do

laboratrio. Ex. Se o laboratrio testa para Enterococcussppampicilina,ciprofloxacina,clorafenicol,

teicoplanina, vancomicina, quinupristin/dalfopristin, estes mesmos antimicrobianos sero testados

com a cepa referncia S. aureus ATCC 25923 (ver abaixo) para avaliar a qualidade da prova realizada,

e os halos encontrados sero comparados com os valores de referncia7.


Os limites aceitveis para os halos encontrados para as cepas de referncias e os diversos anti-

microbianos so descritos em CLSI norma M100-S167 ou norma substituta.

a) Condies dos testes de controle da qualidade e cepas de referncia usadas para monitorar a acurcia dos testes de disco difuso

enterobactrias

Meio: gar Meller-Hinton

Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo

padro 0,5 de McFarland

Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas

Cepas referncia: E. coli ATCC 25922 e E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmi-

cos/inibidor de -lactamase)

Deteco de eSbl em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis

Testes de triagem e confirmatrio de ESBL



padro 0.5 de McFarland.


Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 700603

P. aeruginosa





Cepas de referncia: P. aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922 e/ou E. coli ATCC

35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase)

Acinetobacter spp, S. maltophilia e B. cepacia





Cepas de referncia: P.aeruginosa ATCC 27853 e E. coli ATCC 25922 e/ou E. coli ATCC

35218 (para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase)

Staphylococcus spp


Inculo: Suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro de 0,5 de McFarland.

Incubao: 33 a 35oC, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para oxacilina, cefoxitina,

meticilina, nafcilina e vancomicina.


Cepas de referncia: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lact-

micos/inibidor de -lactamase), S. aureus ATCC BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de induo

clindamicina)

Enterococcus spp


Inculo: Mtodo de crescimento ou suspenso direta das colnias, equivalente a uma

soluo padro 0.5 de McFarland.

Incubao: 35oC 2 graus, ar ambiente, de 16 a 18 horas; 24 horas para vancomicina.

Cepas de referncia: S. aureus ATCC 25923; E. faecalis ATCC 29212 para os testes de de-

teco de resistncia a altos nveis de aminoglicosdeos.

S. pneumoniae ou Streptococcus spp

Meio: gar Meller-Hinton com 5% de sangue de carneiro

Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0,5

de McFarland.

Incubao: 35oC 2 graus, CO2 a 5%, de 20 a 24 horas.

Cepas de referncia: S. pneumoniae ATCC 49619

Haemophilus influenzae e H. parainfluenzae

Meio: Haemophilus Test Medium ( HTM ) ver CLSI Norma M2-A9

Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0,5

de McFarland

Incubao: 35oC 2 graus, CO2 a 5%, de 16 a 18 horas.

Cepa de Referncia: H. influenzae ATCC 49247, H. influenzae ATCC 49766, E. coli ATCC

35218 (quando testar amoxacilina - cido clavulnico).

4. MTodo de dILuIo eM CaLdo ou gar (CIM)

Os testes de diluio em caldo ou em gar so utilizados para a determinao da sensibilidade in

vitro de um microrganismo a um agente antimicrobiano. Por este mtodo se determina a concentrao

inibitria mnima (CIM) de um antimicrobiano, ou seja, a menor concentrao de antimicrobiano que

inibeocrescimentodeummicrorganismo.Essemtodotambmutilizadonaconfirmaodealguns

perfisderesistnciadetectadosinicialmentepordisco-difuso.

Falhas na deteco do padro de resistncia pelos mtodos dilucionais podem estar relacionadas

a diversos fatores, como: m qualidade do meio de cultura, concentrao de ctions ou pH fora da faixa

recomendada, baixa concentrao de antimicrobiano, soluo estoque de antibitico com concentrao

fora do preconizado, falhas no procedimento tcnico, inculo com concentrao de microrganismos

fora do preconizado, tempo e temperatura de incubao no recomendadas.

Os testes de CIQ avaliam os parmetros crticos para a deteco da resistncia. E devem ser

realizados nas mesmas condies e pelo mesmo pessoal tcnico que realiza os testes de rotina.


4.1. FreQNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade 3,6

A freqncia dos testes de CIQ deve ser no mnimo mensal. Entretanto, as recomendaes

nacionais e internacionais2,6 preconizam testes semanais. Essas recomendaes devem ser seguidas

se a estrutura ou a capacidade do laboratrio permitirem.

A introduo do programa de CIQ inicia-se com a realizao de testes dirios, passando, em

fase posterior, para a realizao mensal dos testes.

Teste dirio Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos

e documentar os resultados.

Para passar os testes de dirios para mensais nenhuma das cinco leituras de CIM para cada

combinao de microrganismo/antimicrobiano pode estar fora dos limites aceitveis.

Teste mensal Testar todas as cepas de controle no mnimo mensalmente e sempre que

qualquer reagente do teste for utilizado (ex. um novo lote de gar ou meio, um novo lote de

antimicrobianos ou outro fabricante de insumos).

Sempre que algum resultado dos testes mensais de controle de qualidade estiver fora da

faixa aceitvel, faz-se necessrio implantar ao corretiva3

Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanas impor-

tantes no mtodo de leitura dos resultados dos testes (ex.converso de leitura visual da CIM

para leitura instrumental ou mudana no tipo de painel usado), estes devem ser realizados por

cinco dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqncia mensal.

4.2. FreQNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe de QuaLIdade Para TeSTeS de TrIageM

Testes em placas para triagem de resistncia a vancomicina e de resistncia de alto-nvel de

aminoglicosdeos podem ser realizados no mnimo mensalmente, desde que o laboratrio

realize os testes rotineiramente e os critrios de mudana do sistema de teste de dirio para

mensal tenham sido atingidos.

Se o teste de triagem no for realizado rotineiramente (< que uma vez/semana) ou se o agente

antimicrobianoforlbil(ex.ampicilinas,meticilinas,imipenem,cidoclavulnico,ceflacor

e cefamandole), ser necessria a realizao de testes de controle de qualidade sempre que

o teste de triagem for realizado em amostras clnicas.

4.3. TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade do MeIo de CuLTura

4.4. MTodo de dILuIo eM gar8

Os meios indicados para os testes de diluio em gar so: gar Meller-Hinton ou gar

Meller-Hintoncomsanguelisadodecavaloousanguedesfibrinadodecarneiroa5%.

a) esterilidade

Apspreparodasplacas,examinarumaamostrasignificativadecadalote(10%)paracon-

firmarsuaesterilidade,mediantesuaincubaoa30C-35C,porpelomenos24horas.

As placas devem ser usadas at sete dias aps o preparo, a no ser que sejam tomadas

precaues adequadas, como embrulh-las em saco plstico e proteg-las da luz quando

o antimicrobiano fotossensvel.


B) pH

O pH de cada lote de placas de gar Meller-Hinton ou gar Meller-Hinton com sangue

lisado de cavalo ou sangue desfibrinado de carneiro a 5% deve ser verificado quando o

gar for preparado. O meio gar dever ter pH entre 7,2 e 7,4 temperatura ambiente

aps solidificao.

A medida do pH deve ser feita preferencialmente atravs de pHmetro apropriado, submerso

emporodemeiosolidificadotemperaturaambiente.Casoestejaforadasespecificaes,

deve-se checar a procedncia do meio, a qualidade da gua e, eventualmente, preparar novo

lote, seguindo-se estritamente as recomendaes do fabricante.

MtodosdeverificaodepHverCLSINormaM7-A7ounormasubstituta.

4.5. MTodo de dILuIo eM CaLdo (MICrodILuIo e MaCrodILuIo) 8

O meio indicado para os testes de diluio em caldo Meller-Hinton.

a) esterilidade

Apspreparodomeio,examinarumaamostrasignificativaealeatria(10%)decadalotepara

confirmarsuaesterilidade,mediantesuaincubaoa30C-35Cpor,pelomenos,24horas.

B) pH

OpHdecadalotedecaldoMeller-Hintondeveserverificadoquandoomeioforpreparado.

O meio dever ter pH entre 7,2 e 7,4 temperatura ambiente.

C) efeitos da timidina ou timina

Para determinar a adequao do meio para testes de sulfonamida e trimetropim, os testes

de CIM podem ser realizados com E. faecalis ATCC 29212.Ospontosfinaisdevemserde

fcil leitura (com uma reduo de 80% ou mais no crescimento, quando comparado com o

controle).SeaCIMparatrimetoprim-sulfametoxadolfor0,5/0,95g/mL,omeiopoder

ser considerado apropriado para uso.

Os testes dilucionais para monitorar a acurcia dos resultados devem ser realizados com os

antimicrobianos que fazem parte do antibiograma liberado pelo laboratrio. Para cada gnero ou

espciedebactriasouclassedeantimicrobianosorecomendadascepasderefernciaespecficas.

OslimitesaceitveisparaasconcentraesCIM(g/mL)definidosparaascepasdereferncias

e os diversos antimicrobianos so descritos em CLSI norma M100-S16 ou norma substituta.

4.6. TeSTeS de QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdade

a) Condies dos testes e cepas de controle de qualidade usadas para monitorar a acurcia dos testes de CIM (g/mL).

enterobactrias

Meio

Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions

Diluio em gar: gar Meller-Hinton





Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lactmi-

cos/inibidor de -lactamase)

Deteco de eSbl em K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e P. mirabilis

Testes de triagem de eSbl K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli

Meio: Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions

Concentrao de Antimicrobianos:

Cefpodoxima4g/mLou

Ceftazidima1g/mLou

Aztreonam1g/mLou

Cefotaxima1g/mLou

Ceftriazona1g/mL




Cepas de referncia: E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 700603

Testes de triagem de eSbl P. mirabilis



Cefpodoxima1g/mLou

Ceftazidima1g/mLou

Cefotaxima1g/mLou





Teste confirmatrio de ESBL



Ceftazidima0,25-128g/mL

Ceftazidima/cidoclavulanico0,25/4-128/4g/mLE

Cefotaxima0,25-64g/mL

Cefotaxima/cidoclavulanico0,25/4-64/4g/mL






P. aeruginosa e outros no-enterobacteriaceas (inclue Pseudomonas spp., e outros bacilos gran-negativos no fastidiosos e no fermentadores exceto B. cepacia, B. mallei, B. pseudomallei, S. maltophilia e Acinetobacter spp.)

Meio






Cepas de referncia: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218

(para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase)

Acinetobacter spp., Burkodelia cepacia, S. maltophilia

Meio






Cepas de referncia: P. aeruginosa ATCC 27853; E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218

(para combinaes -lactmicos/inibidor de -lactamase)

Staphylococcus spp.

Meio

Diluio em caldo:CaldoMeller-Hintonajustadocomctions+NaCla2%paraoxa-

cilina, meticilina e nafcilina; Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions suplementado

com50g/mLdeclcioparadaptomicina.

Diluio em gar:garMeller-Hinton,garMeller-Hinton+NaCla2%para

oxacilina, meticilina e nafcilina. Diluio em gar no recomendada atualmente

para daptomicina.

Inculo: Mtodo de suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo padro 0.5

de McFarland.

Incubao: 33 - 35oC, ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para oxacilina, meticilina,

nafcilina e vancomicina

Cepas de referncia: S. aureus ATCC 29213; E. coli ATCC 35218 (para combinaes -lact-

micos/inibidor de -lactamase); S. aureus ATCC BAA-977 e/ou BAA-976 (teste de induo

clindamicina)

Teste de triagem com gar Oxacilina NaCl para S. aureus

Meio: Diluio em gar:garMeller-Hinton+NaCla4%m/ve6g/mLdeoxacilina.


de McFarland.

Incubao: 35oC, ar ambiente, 24 horas.

Cepas de referncia: E. faecalis ATCC 29212 sensvel, E. faecalis ATCC 51299 - resistente.


Teste de triagem com gar Vancomicina para S. aureus

Meio: Diluio em gar:garBHIe6g/mLdevancomicina.


de McFarland.


Cepas de referncia: S. aureus ATCC 29213 sensvel, S. aureus ATCC 43300 - resistente

Enterococcus spp.

Meio

Diluio em caldo: Caldo Meller-Hinton ajustado com ctions ou Caldo Meller-

Hintonajustadocomctionssuplementadocom50g/mLdeclcioparadaptomicina.

Diluio em gar: gar Meller-Hinton. Diluio em gar no recomendada atual-

mente para daptomicina.

Inculo: Mtodo de crescimento e suspenso direta das colnias, equivalente a uma soluo


Incubao: 35oC 2 graus ar ambiente, de 16 a 20 horas, 24 horas para vancomicina.

Cepas de referncia: E. faecalis ATCC 29212

Teste de triagem para alto nvel de resistncia a aminoglicosdeos e resistncia a vancomicina para Enterococcus spp. Tabela 2D M100-S16

Meio

Diluio em gar: gar BHI

Antimicrobianos: 6g/mLdevancomicinaou

2000g/mLdeestreptomicinaou

500g/mLdegentamicina.

Diluio em caldo: meio BHI

Antimicrobianos: 1000g/mLdeestreptomicinaou

500g/mLdegentamicina.



gar:colocar10Ldasuspenso0,5deMcFarlandnasuperfciedaplaca


Cepas de referncia: E. faecalis ATCC 29212 - sensvel, E. faecalis ATCC 51299 - resistente.

m2 - C2 - Tecnologia em Servios de Sade

O CIQ tem como objetivo monitorar os seguintes aspectos:

preciso (repetitividade) e acurcia (exatido) dos resultados obtidos nos testes de sensibilidade;

desempenho dos reagentes utilizados nos testes; e

desempenho dos tcnicos que executam os testes e realizam a leitura dos resultados.

Esse objetivo mais facilmente atingido, com uso de cepas de referncia que tm sua sensibi-

lidade aos antifngicos pr-determinada. No entanto, isso no dispensa a adoo de outras medidas

que melhoram a qualidade dos resultados.

1. CePaS de reFerNCIa9,10

1.1. CePaS reCoMeNdadaS Para TeSTeS de CIM de 48 HoraS Por dILuIo eM CaLdo

Faixa de leitura CIM: Ver tabela 4- M27-A2 ou norma substituta.

Candida parapsilosis ATCC 22019.

Candida krusei ATCC 6258.

1.2. CePaS reCoMeNdadaS Para TeSTeS de CIM de 24 e 48 HoraS Por MICrodILuIo eM CaLdo

Faixa de leitura CIM: Ver tabela 5- M27-A2 ou norma substituta.

Candida parapsilosis ATCC 22019.

Candida krusei ATCC 6258.

1.3. CePaS reCoMeNdadaS Para dISCo-dIFuSo

Candida parapsilosis ATCC 22019 Intervalo de valores do halo de inibio (dimetro em

mm),esperadoemtestescomdiscosdefluconazol(25mg)-22-33mm.

Candida albicans ATCC 90028 Intervalo de valores do halo de inibio (dimetro em mm),

esperadoemtestescomdiscosdefluconazol(25mg)-28-39mm.

Candida tropicalis ATCC 750 Intervalo de valores do halo de inibio (dimetro em mm),

esperadoemtestescomdiscosdefluconazol(25mg)-26-37mm.

2. MaNuSeIo e eSToCageM daS CePaS de reFerNCIa

2.1. PreParo daS CePaS de reFerNCIa Para arMazeNaMeNTo

As suspenses-padro, preparadas de acordo com o procedimento delineado a seguir, podem

sermantidasindefinidamente,semriscosignificativodealteraonosperfisdesensibilidade

ao agente antifngico.

Para preparar as cepas para armazenamento, deve-se obedecer ao procedimento abaixo:

Captulo 2

Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras

m2 - C2 - 2 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Cultivar os organismos em placas de Petri, durante uma noite, em gar Sabou-

raud-dextrose, ou em gar batata-dextrose, ou gar enriquecido com digerido de

soja-casena.

Selecionar vrias colnias e realizar testes de sensibilidade apropriados, para de-

monstrar resultados esperados de sensibilidade, halo de inibio no mtodo de

disco-difuso ou CIM na macrodiluio ou microdiluio (ver item anterior para

halos de referncia ou Tabelas 4 e 5 do doc. M27A2 ou norma substituta para valores

esperados de CIM).

Realizar uma subcultura das cepas, que produziram os resultados esperados, no mesmo

meiousadoparaaculturaprimriaeincubarparaqueocorracrescimentosuficiente

(em geral, de um a trs dias).

Examinar,comcuidado,amorfologiaecordascolniasparasecertificardapurezada

cultura.

Suspender as colnias na soluo estabilizante de glicerol a 50%, at fazer suspenso

densaou,seestiverliofilizado,suspendernomeioapropriado.

Distribuir pequenos volumes (uma ou duas gotas) da suspenso turva em recipientes

estreis recomendados para congelamento.

Colocar esses recipientes em freezer (preferencialmente 60oC ou -20oC ) ou em ni-

trognio lquido.

Quando o estoque de recipientes estiver praticamente exaurido, repete-se o processo

para produzir um novo estoque.

2.2. arMazeNaMeNTo daS CePaS de reFerNCIa

Para o armazenamento prolongado das cepas de referncia. As leveduras devem ser cul-

tivadas em gar batata-dextrose e depois congeladas a -70oC. Alternativamente, as cepas

de referncia (no Criptococcus) podem ser cultivadas suspendendo as clulas fngicas em

soluo de glicerol a 50% em pequenos frascos e armazenados a -70oC.

Para armazenamento de curto prazo, as culturas-padro de trabalho, ou seja, de uso rotineiro

nostestes,devemsercultivadasa35C(+2C)emtubosdegar-Sabouraudougarsangue,

emtubosinclinados,atseobservarcrescimentosuficiente,sendodepoisarmazenadas

temperatura de 2 a 8oC, enquanto no so utilizadas nos testes.

2.3. MaNuSeIo daS CePaS de reFerNCIa NoS TeSTeS de roTINa

Todas as culturas usadas em testes de sensibilidade a antifngicos devem ser semeadas em

meio isentos de antibiticos, antes de serem submetidas s anlises.

As cepas de controle de qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e mtodos

empregados para testes de isolados clnicos.

Para o uso das cepas de referncia nos testes de rotina, necessrio realizar os seguintes

procedimentos:

Retirarorecipientedaculturadofreezeroufrascoliofilizado.

Deixardescongelarasuspensocongeladaoureidrataraculturaliofilizada.


Realizar uma subcultura, bem distribuda, em placa de Petri, contendo gar batata-dextrose

eincub-laa35C(+2C)durante24horas.

Retirar quatro ou cinco colnias, realizar subcultura em gar Sabouraud-dextrose ou gar

batata-dextrose e, aps 24h, realizar testes de sensibilidade.

Ascepas-padro,apsseucrescimentoa35C(+2C)por24horasemgar-batata-dextrose,

devemsermantidasemgeladeira,sobtemperaturaentre2a8C,comocultura-padro

de trabalho para uso na rotina. Essas culturas devem ser substitudas de duas em duas

semanas, pelo menos, por outras do estoque congelado.

Realizar sempre os testes de sensibilidade das colnias cultivadas durante uma noite.

Os repiques das culturas de trabalho so preparados a cada duas semanas pelo mtodo de

transferncia seriada.

A cada trs repiques da cultura de trabalho, deve-se descongelar uma nova amostra para

uso em testes de rotina, para diminuir o risco de contaminao.

Deve-se obter uma cultura de trabalho nova sempre que ocorrerem resultados aberrantes.

3. FreQNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade

3.1. INTerVaLoS de CIM

As Tabelas 4 e 5 (CLSI M27-A2 ou norma substituta) apresentam os intervalos de preciso dos

valores de CIM para um nico teste de controle.

Em geral, um dentre 20 valores de CIM, em srie de 20 testes consecutivos, pode estar fora

docontrole(i.e.,foradafaixadefinida),devidosvariaesaleatriasdoteste.Doisresultadoscon-

secutivos, com valores fora do esperado ou mais de dois resultados fora do esperado em 20 testes

de controle consecutivos, exigem medidas corretivas. Toda vez que se tomar medidas corretivas, a

contagem de 20 testes consecutivos recomea.

OBS.: No confundir esse procedimento com o procedimento para estabelecer o desempenho

satisfatrio dos testes de CIM visando realizao de testes de controle da qualidade mensais, ao

invs de dirios.

3.2. TeSTeS de SeNSIBILIdade a aNTIFNgICoS

Para monitorar o desempenho geral dos procedimentos para testes, recomenda-se incluir cepas

de referncia apropriadas, todo dia que o teste for realizado.

Esse procedimento apenas para estabelecer o desempenho satisfatrio dos testes de CIM e

disco-difuso,comafinalidadederealizartestesdecontroledaqualidademensais,aoinvsdedi-

rios. Esse procedimento no deve ser confundido com os passos que devem ser seguidos para tomar

as medidas de correo.

A freqncia do monitoramento dos testes pode ser diminuda se o laboratrio puder docu-

mentardesempenhosatisfatriocomtestesdecontroledirios.Paraessefim,define-sedesempenho

satisfatrio da seguinte maneira:

documentao que comprove que todas as cepas de referncia foram testadas durante cinco

dias consecutivos de testes; e

m2 - C2 - Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

para cada combinao droga-microrganismo, nenhum dos cinco valores de CIM (i.e., valores

de CIM obtidos para uma combinao droga-microrganismo durante cinco dias consecuti-

vos de testes) ou dimetros dos halos de inibio podem estar fora do intervalo de acurcia

definidosnasTabelas4e5emCLSIM27-A2ounormasubstitutaeitemcepasdereferncia

para leveduras.

Quando essas condies forem cumpridas, ser preciso testar cada cepa de referncia pelo menos

uma vez por ms2,6 e sempre que qualquer reagente ou artigo plstico for mudado.

Sempre que for constatado um valor de CIM ou dimetro de halo fora do intervalo de acurcia,

usando o sistema de monitoramento mensal, ser necessrio recomear e manter os testes de con-

trolediriosenquantonosedefinirqualafontedeerroparaoresultadoaberranteearesoluo

do problema no tiver sido documentada da seguinte maneira:

realizar os testes com cepas de referncia apropriadas durante cinco dias consecutivos;

para cada combinao droga-microrganismo, os cinco valores de CIM (ex., valores de

CIM obtidos para uma combinao droga-microrganismo durante cinco dias consecutivos

de testes) devem se manter dentro do intervalo de acurcia definidos nas Tabelas 4 e 5

(CLSI M27-A2);

se a soluo do problema no puder ser documentada (ex., pelo menos um dos cinco valores

de CIM ou dimetro do halo de inibio estiver fora do intervalo de acurcia) ser necessrio

continuar os testes dirios de controle da qualidade;

o retorno adoo de testes mensais exige documentao do desempenho satisfatrio du-

rante cinco dias consecutivos, conforme j descrito;

no caso de algumas drogas, os testes de controle de qualidade devem ser efetuados com

freqncia maior do que uma vez por ms, devido degradao relativamente rpida

da droga.

4. TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade do MeIo de CuLTura e arTIgoS de PLSTICo9

Para controle de lotes de meio de cultura e de artigos plsticos, o procedimento pode ser divi-

dido nos passos abaixo.

Testar cada novo lote de meio usado em tubos de macrodiluio, ou lote de placas de mi-

crodiluio, usando uma das cepas-controle da qualidade relacionadas na Tabela 4 CLSI

M27-A2 ou norma substituta para determinar se os valores de CIM esto dentro do intervalo

esperado; caso contrrio, rejeitar o lote.

Pelo menos um tubo de cada lote deve ser incubado, sem inocular, durante o mesmo perodo

necessriopararealizaroteste,demaneiraaseverificaraesterilidadedomeio.

OslotesnovosdomeioRPMI-1640devemsertestadosparaverificarseseudesempenho

ser aceitvel, antes de us-los em testes de isolados clnicos, visto que estudos recentes

demonstram que alguns lotes no tm desempenho apropriado. O pH do meio RPMI-1640

podevariarde6,9a7,1eopHdomeioMeller-Hintondeveficarentre7,2e7,4.

Registrar os nmeros de lote de todos os materiais e reagentes usados nesses testes.


5. ouTroS TeSTeS de CoNTroLe uTILIzadoS Na MaCrodILuIo e MICrodILuIo

5.1. CoNTroLe do CreSCIMeNTo

Cada srie de tubos na macrodiluio deve incluir um controle de crescimento do meio RPMI

1640, sem agente antifngico, para avaliar a viabilidade das leveduras em teste. Na microdiluio

uma coluna da placa de micro titulao destinada a esse controle. Em testes de caldo, o controle do

crescimentotambmservecomocontroledaturbidezparaaleituradospontosfinaisdereao.

5.2. CoNTroLe de Pureza

Uma alquota de cada inculo deve ser colocada numa placa de gar Sabouraud-dextrose e in-

cubadatemperaturade35C+2Cathavercrescimentosuficienteparadetectarpossveisculturas

mistas e prover novas colnias isoladas para o caso de se tornar necessrio repetio do teste.

5.3. CoNTroLe da LeITura doS PoNToS FINaIS da reao

Aleituradospontosfinaisdareaodevesermonitorada,periodicamente,paraminimizarpos-

sveis variaes nos resultados de testes de CIM, realizados por diferentes observadores. Todo pessoal

de laboratrio que realiza esses testes dever ler, separadamente, um conjunto selecionado de testes de

diluio. Os resultados devem ser registrados e comparados com os resultados obtidos por um tcnico

experiente. As cepas de referncia, com valores de CIM pr-determinados, so particularmente teis para

essafinalidade,especialmente,emtestescomfluconazol,emquepodeocorrerofenmenodetrailing.

6. TeSTe da QuaLIdade da ProVa e do PerFIL de SeNSIBILIdadea) Condies dos testes e cepas de controle da qualidade usadas para monitorar a acurcia dos testes de CIM (g/mL)

Meio: Diluio em caldo: Meio RPMI -1640 (com glutamina, sem bicarbonato e com indi-

cador vermelho fenol) pH 7,0 0,1.

Inculo: As diferentes operaes de preparo do inculo so as abaixo.

Deve-se realizar a subcultura (repique) dos organismos, em tubos estreis com gar

Sabouraud dextrose ou gar batata-dextrose, executando passagens para assegurar sua

pureza e viabilidade.

O inculo deve ser preparado escolhendo-se cinco colnias com dimetro de ~1mm de

cultura de 24 horas para espcies de As colnias devem ser suspensas em 5mL de soluo

salina estril 0,145 mol/L (8,5g/L NaCl; salina a 0,85%).

A suspenso resultante deve ser colocada em agitador de vrtex durante 15 segundos e a den-

sidadecelular,ajustadacomespectrofotmetro,acrescentando-sesoluosalinasuficiente

para obter a transmitncia equivalente de uma soluo-padro da escala 0,5 de McFarland

em comprimento de onda de 530nm. Esse procedimento fornece uma suspenso-padro de

levedura contendo 1 x 106 a 5 x 106 clulas por mL A suspenso de trabalho produzida fa-

zendo-se uma diluio 1:100 seguida de uma diluio de 1:20 da suspenso-padro com meio

lquido RPMI 1640, resultando em concentrao de 5,0 x 102 a 2,5 x 103 clulas por mL.

Incubao:Atemperaturadeincubaodevepermanecerem35C.


1. eLeMeNToS eSSeNCIaIS do SISTeMa de geSTo da QuaLIdade

1.1. FaSe Pr-aNaLTICa

a) representante/empresa responsvel pelo equipamento

Manual de funcionamento do equipamento no idioma do pas.

Registronacionalecertificadodefuncionamentoin situ do equipamento e de qualidade dos

lotes dos reagentes.

Plano de manuteno preventiva e corretiva do equipamento.

Programa de capacitao para o uso apropriado do equipamento.

Fornecimento de cepas ATCC para o controle interno de qualidade de acordo com as espe-

cificaesdoequipamento.

Atualizao do software a cada mudana.

Comunicao escrita dos problemas registrados que impliquem em mudana da qualidade

dos resultados.

B) usurio

Manual de procedimento do laboratrio para o uso do sistema automatizado.

Capacitao de pessoal no uso do equipamento.

Programa de manuteno preventiva e corretiva do equipamento.

Notificao, autoridade competente,de formaescrita,dosproblemas registradosque

impliquem em mudanas na qualidade dos resultados obtidos.

1.2. CoNTroLe INTerNo do LaBoraTrIo

a) Controle de temperatura

Registro dirio da temperatura ambiental.

Registro dirio da temperatura interna do equipamento.

Registro de alertas do equipamento.

Registro das medidas corretivas tomadas.

B) Preparoepadronizaodoinculo

Se for utilizado turbidimetro, deve-se calibrar e registrar diariamente transmitncia.

Definireregistraraformaeafreqnciadocontroledeesterilidadedasoluodetrabalho.

1.3. CoNTroLe da QuaLIdade doS ProCeSSoS auToMaTIzadoS

A) Listadecepasderefernciarecomendadasparatestesdeidentificao

Recomenda-se testar no mnimo uma cepa de referncia por painel.

Captulo 3

Controle da qualidade em testes de sensibilidade realizadoporMtodosAutomatizados8


Para painis de gram negativos:

E. coli 25922 (qualidade da prova).

P. mirabilis7002(qualidadedaprovadeidentificaodebacilosGram-).

K. pneumoniae13883(qualidadedaprovadeidentificaodebacilosGram-).

Para painis de gram positivos:

S. aureus29213(qualidadedaprovadeidentificaodebacilosGram+).

E. faecalis29212(qualidadedaprovadeidentificaodebacilosGram+).

Para painis de levaduras:

C. albicans14053(qualidadedaprovadeidentificaodelevaduras).

B) Lista de cepas de referncia recomendadas para testes de sensibilidade

Para painis de gram negativos:

E. coli 25922 (qualidade da prova).

E. coli35218(parainibidoresdelactamase).

E. coli 51446 (ESBL).

P. aeruginosa 27853 (concentrao de ctions e pH com aminoglicosdeos).

E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).

Para painis de gram positivos:

S. aureus 29213 (qualidade da prova).

E. faecalis 29212 (quantidade de timina-timidina com SXT).

E. faecalis 51299 (resistncia a vancomicina).

E. coli35218(parainibidoresdelactamase).

1.4. VaLIdao

a) Protocolo de controle da qualidade dirio

Prova diria por 5 dias

Sem erro, seguir com o controle peridico.

1decada5ensaiosapresentaremerro,tomaraescorretivas:

erro bvio6: testar novamente no mesmo dia e, se o resultado for o esperado, continuar

com as provas diria.

erro no bvio6: testar novamente no mesmo dia e controlar por cinco dias consecutivos.

Se todos os resultados estiverem dentro do esperado, passar ao controle mensal.

B) Protocolodecontroledaqualidadeperidico

Recomenda-se realizar os controles a cada ms, utilizando as listas de cepas de refe-

rncia acima mencionadas. Tambm deve ser realizado um controle a cada troca de

lote do painel.

Se os testes mensais apresentarem erros, tomar aes corretivas e retornar aos testes

de CIQ dirios.

m2 - RB - Tecnologia em Servios de Sade

1. WHO. Blood Safety and Clinical Technology Guidelines on Standard Operating Procedures for

MICROBIOLOGY. http://w3.whosea.org/EN/Section10/Section17/Section53/Section482_

1790.htm

2. Manual de Microbiologia Clnica para o Controle de Infeco em Servios de Sade. http://www.

anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/index.htm

3. Oplustil, CP et al. Procedimentos Bsicos em Microbiologia Clnica. So Paulo: SARVIER, 2004.

4. Reference Strains: How many passages are too many? Technical bulletin ATCC n 6. ATCC

Connection 23(2):6-7,2003

5. Ivonne D. Rankin. Aseguramiento de Calidad/Control de Calidad (AC/CC) 65. In: Manual de

Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana. Editora Coordinadora Marie B. Coyle American

Society for Microbiology - Organizacion Panamericana de la Salude. 2005

6. NCCLS/CLSI - Padronizao dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Discodi-

fuso: Norma Aprovada Nona Edio. Documento M2-A9 Vol.26 N 1. Substitui a Norma

M2-A8. Vol. 23 N 1

7. NCCLS/CLSI - Normas de Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 16o

Suplemento Informativo. Documento M100S16. Vol. 26 N 3 - Substitui a Norma M100-S15

Vol. 25 N 1.

8. NCCLS/CLSI - Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluio

para Bactria de Crescimento Aerbico: Norma Aprovada Sexta Edio. Documento M7A7.

Vol. 26 N 2. Substitui a Norma M7-A6 Vol. 23 N 2.

9. NCCLS/CLSI - Mtodo de Referncia para Testes de Diluio em Caldo para Determinao da

Sensibilidade de Leveduras Terapia Antifngica: Norma Aprovada Segunda Edio. Docu-

mento M27-A2 Vol. 22 N 15 Substitui a Norma M27-A. Vol. 17 N 9

10. NCCLS/CLSI - Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts; Approved

Guideline. NCCLS document M44-A Volume 24 Number 15.

11. Programa de Acreditao de Laboratrios Clnicos PALC. Lista de requisitos PALC. Sociedade

Brasileira de Patologia Clnica/ Medicina Laboratorial (SBPC/ML), 2004. http://www.sbpc.

org.br/files/pdf/Requisitos_PALC_versao2004.pdf

12. RelatriofinaldeComitdeExpertosenlaevaluacindeldesempeoparalaidentificacinbacteriana

y antibiograma con mtodos automatizados Brasilia, Brasil. 26 -28 octubre 2004. Vol. 23 N 1

13. Reimer, LG and Carrol, K.C. Procedures for Storage of Microorganisms. In: Manual of Clinical

Microbiology, cap.7, 67-73, 8 edio, 2003.

RefernciasBibliogrficas

m2 - A - Tecnologia em Servios de Sade

aNexoS

aNexO i: ProCedIMeNToS uTILIzadoS Para MaNuTeNo

e eSToCageM de MICrorgaNISMoS

MicrorganismosMtodos de estocagem

Crio conservante

Temperatura de Estocagem

Viabilidade

Fungofilamentoso Subcultivo ------ 4 a 25C 2 a 10 anos

leo mineral ------ ambiente 1 a 40 anos

Seco Terra ou silica gel ambiente 1 a 4 anos

Freezer Glicerol e DMSO1 - 70C -196C 2 a 30 anos

gua destilada

------ ambiente 1 a 10 anos

LiofilizadoSkim milk, glicerol, sacarose e DMSO1

4C 2 a 30 anos

Levedurasgua destilada

----- ambiente 1 a 2 anos

Seco Meio nutriente ambiente 1 a 2 anos

Agar batata dextrose

------ - 70C

Protozorios FreezerGlicerol ou DMSO1 ou sangue +nutriente

- 70C -196C

CongeladorSangue, caldo nutriente+DMSO1

- 20C 40C

Vrus Subcultivo nutriente 4C 6 meses

Freezer SPGA2 - 70C -196C 1 a 30 anos

Liofilizado SPGA2 4C 6 a 10 anos

Bactrias Gram Positivas

Subcultivo -------- ambiente 2 a 3 meses

leo mineral ------- 4C6 meses a 2 anos

CongeladorSucrose, TSB3+glicerol

- 20C 1 a 3 anos

FreezerSkim milk, sucrose,TSB3+glicerol

- 70C a -196C 1 a 30 anos

LiofilizadoSkim milk, sucrose

4C 30 anos

m2 - A - 2 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Adaptada de: Reimer, LG and Carrol, K.C. Procedures for Storage of Microorganisms. In: Manual of Clinical Microbiology, cap.7, 67-73, 8edio.,2003

1 MSDS - dimetil-sulfxido2 SPGA - sucrose fosfato glutamato contendo 1% de

albumina bovina.3 TSB - caldo de soja trptica

MicrorganismosMtodos de estocagem

Crio conservante

Temperatura de Estocagem

Viabilidade

Estreptococos CongeladorSkim milk, sangue de coelho

- 20C 90 dias

FreezerSkim milk, sangue de coelho

- 70C a -196C 90 dias a 1 ano

LiofilizadoSkim milk, sangue de coelho

4C6meses a 30 anos

Bactrias Gram Negativas

Subcultivo ------- ambiente 1 a 3 meses

leo mineral ------- 4C 1 a 2 anos

Congelador Sucrose,lactose - 20C 1a 2 anos

FreezerLactose, sucrose, TSB3+glicerolouSkim milk

- 70C a -196C 2 a 30 anos

LiofilizadoSkim milk+sucrose+lactose

4C 30 anos

Bactrias formadoras de esporos

Subcultivo ------- ambiente 2 meses a 1 ano

leo mineral ------ 4C 1 ano

Seco ------- ambiente 1 a 2 anos

Congelador glicose - 20C 1 a 2 anos

Freezer Skim milk, glicose - 70C a -196C 2 a 30 anos

LiofilizadoSkim milk+lactose

4C 30 anos

Micobactrias Congelador Skim milk - 20C 3 a 5 anos

Freezer Skim milk - 70C a -196C 3 a 5 anos

Liofilizado Skim milk 4C 16 a 30 anos


(Nome do Laboratrio e Logomarca)

REGISTRO DA CALIBRAO DE PIPETAS E MICROPIPETAS

Marca:....................................................................... Volume:......................................................

Agente calibrador: Prprio Laboratrio Terceirizado Fabricante

Metodologia: Espectrofotometria Gravimetria Verificaoporcomparao

R E G I S T R O

aNexO ii: PLaNILHaS Para CoNTroLe INTerNo da QuaLIdade

Informao:Especificaodaexatido,deacordocomaASTM.

Obs.:ParaverificaodepipetasnoprprioLaboratrio,hnecessidadedeequipamentoprprioououtra calibrada, para comparao espectrofotomtrica.

DADOS CONFORMIDADEDATA VALOR OBTIDO CERTIFICADO N. SIM NO

Capacidade nominal (L) Variabilidade (+/- L)

0,5 a 2,0 0,006

3,0 a 5,0 0,01

10 0,02

20 0,03

50 0,05

100 0,08

Data:........./........../............

________________________________________Assinatura/ Visto do Diretor do Laboratrio

m2 - A - Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade

Parmetros Conformidade

DATA VALOR OBTIDO ASSINATURA SIM NO


REGISTRO DA CALIBRAO DE REFRATMETRO OU DENSMETRO

Refratmetro: Densmetro: Marca:........................................................................................

Freqnciadaverificao:Semanal

Fase preliminar: Acertar a D=1,000 com gua reagente tipo I ou II.

Amostra-controle: Soluo de NaCl a 3 % = 1,015

Amostra-controle: Soluo de NaCl a 5 % = 1,022

Amostra-controle: Soluo de Sacarose a 9 % = 1,034

Critriodeaceitabilidade:+/-0,010

Data:........./........../............


R E G I S T R O


DATA DA PREPARAO

Crescimento bacteriano DATA DA LIBERAO

ASSINATURA SIM NO

Data:........./........../............



REGISTRO DA ESTERILIDADE DOS MEIOS DE CULTURA

Meio de cultura: ......................................... Fabricante: ...................................... Lote:..................

Critrio de Aceitabilidade: Estril

R E G I S T R O


Data Valor obtido*Conformidade

Sim NoTipo de gua

ReagenteAssinatura

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

I; II; III

Data:........./........../............


R E G I S T R O


REGISTRO DO CONTROLE INTERNO DA GUA REAGENTE

gua obtida por: Destilao Deionizao Osmose reversa

Outro processo (citar): .........................................................................................

Periodicidade: Diria Semanal Mensal

Marca do condutivmetro: .......................................................................................................................

Critriodeaceitabilidade:Dentrodasespecificaesdaguareagente

Temperatura da medio: ............ C

Obs:1. Quando o Condutivmetro permitir, assinalar o valor obtido em mmho, na coluna*.2. Quando o Condutivmetro possuir apenas indicador luminoso, indicar nas colunas de

conformidade, se a gua Reagente est conforme ou no-conforme.


Data Conforme No-conforme Assinatura

Data:........./........../............


R E G I S T R O


REGISTRO DO CONTROLE DA QUALIDADE DOS CORANTES

Corante: GRAM ZIEHL OU SIMILAR OUTRO (Citar): ...............................................

Lote: ..............................................

Critriodeaceitabilidade:Coloraodasbactriasdeacordocomsuaclassificao


Data Hora Tcnico 35C 36C 37C 38C 39C Outra

Data:........./........../............



REGISTRO DO CONTROLE DA TEMPERATURA

Banho Maria a .........C Estufa a .........C Equipamento automatizado a ...........C

Nmero: .................................................................... Ms: ...........................................................

Localizao: ............................................................... Ano: ...........................................................

R E G I S T R O

(descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: 33 35C)

Manuteno especial:

1. Limpeza/Troca de gua

2. Comprovao da temperatura com termmetro externo

3. Outros procedimentos compatveis:..............................................


Data:........./........../............




Refrigerador (Geladeira) Cmara Fria

Nmero:......................................... Ms:.................................................

Localizao:................................... Ano:.................................................

R E G I S T R O

(descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: 2 8C)

Manuteno especial:

1. Descongelamento/Limpeza

2. Comprovao da temperatura com termmetro externo de mxima e mnima

3. Outros procedimentos compatveis:...............................................................

Temperatura em C

Dia Hora Tcnico 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C Outra

12345678910111213141516171819202122232425262728293031


Data Hora TcnicoTemperaturausada emC

Verificao donvel da gua

Controle da esterilidade

Limpeza mensal

Obs.:

Data:........./........../............


R E G I S T R O


REGISTRO DA MANUTENO DA

AUTOCLAVE E DO CONTROLE DA ESTERILIZAO

Nmero do aparelho:............................................. Fabricante:................... Modelo:.......................

Localizao:............................................................ Ms:.............................. Ano:.............................

Manuteno especial:

1. Limpeza

2. Comprovao da esterilizao, por processos qumicos, fsicos ou biolgicos.

3. Outros procedimentos compatveis:...........................................................................


Data Hora Tcnico 54C 55C 56C 57C 58C Outra

Data:........./........../............




Banho Maria a 56C Nmero: .........................................

Ms:................... Ano ................. Localizao:.....................................

R E G I S T R O

(descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: 54-56C)

Manuteno especial:

1. Limpeza/Troca de gua

2. Comprovao da temperatura com termmetro externo

3. Outros procedimentos compatveis:..............................................


Parmetros Conformidade

DATA R.P.M. ASSINATURA SIM NO

Data:........./........../............


R E G I S T R O


REGISTRO DA CALIBRAO E MANUTENO DE CENTRFUGAS

Centrfuga: Centrfuga Clnica Micro-centrfuga

Marca:...................... Modelo:.................. Nmero: .........................................

Freqnciadaverificaoeaceitabilidade:DeacordocomoPOPespecfico.

Obs.:1. Para a centrfuga clnica, de dessorao, anotar somente a conformidade com o uso dirio.2. Para outras centrfugas, anotar na coluna R.P.M. o valor das rotaes encontradas com o Tacmetro.3. Checar ainda, limpeza, vibraes, calibrao do relgio (se houver), vedao da tampa, carves, etc.4. Copiar este formulrio e preencher um para cada aparelho existente.


Temperatura em C

Dia Hora Tcnico -15C -16C -17C -18C -19C -20C -21C -22C -23C Outra

12345678910111213141516171819202122232425262728293031

Data:........./........../............




Congelador (Freezer)

Nmero: .......................................... Localizao: .....................................

Ms: ................................................. Ano: ................................................

R E G I S T R O

(descrever faixa aceitvel de temperatura ex.: -18 - -22C)

Manuteno especial:

1. Descongelamento/Limpeza

2. Comprovao da temperatura com termmetro externo de mxima e mnima

3. Outros procedimentos compatveis: ...................................................................


DataCausa da no conformidade

Aes corretivas Assinatura



REGISTRO DAS AES CORRETIVAS

(COLOCAR O NOME DO APARELHO)

Nmero:.......................................... Ms:......................................

Localizao:.................................... Ano:......................................

R E G I S T R O

Se for encontrada alguma no conformidade, anotar a causa do problema e as aes corretivas executadas.

Obs.: ....................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Data: ...... / ...... / ......... Data: ...... / ...... / ......... ________________ ________________ Supervisor do Setor Gestor de qualidade


Data Microrganismos Teste realizadoHalo (cm)/

CIM (g/mL)Obs:

E. faecalis ATCC 29212

E. faecalis ATCC 51299

S. aureus ATCC 25923



S. pneumoniae ATCC 49619

Data:........./........../............


aNexO iii: reLaTrIoS de regISTro da reaLIzaodo CoNTroLe INTerNo da QuaL

manual testes antimicrobianos

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