manual practicas ing de productos biologicos

8/17/2019 Manual Practicas Ing de Productos Biologicos

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

ACADEMIA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA

INGENIERÍA DE PRODUCTOS BIOLÓGICOSLABORATORIO

Elaboraron:I.B.T. V r!n"#a C$%& ' In(an)I.B.T. *+#)or Mol"na ,"-+n '

D"#" -br /011


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PRÓLOGO

La unidad de aprendizaje nació como respuesta a las necesidades encontradas en la indufarmacéutica nacional y para que los egresados de la carrera de Ingeniería Farmacéutica pu

competir más eficientemente al incorporarse a ésas fuentes de trabajo.Podemos definir a un Producto iológico como cualquier !irus" suero terapéutico" to#ina" antito#i producto análogo$ aplicable a la pre!ención o tratamiento de enfermedades %umanas.

&l presente 'anual de Prácticas del Laboratorio de Ingeniería de Productos iológicos.

(onsta de seis prácticas)*. Prueba de efecti!idad de antibióticos en diferentes microorganismos.+. ,eterminación de la capacidad del medio de culti!o para permitir el crecimiento de

microorganismos.

-. Producción de anticuerpos en conejos.. ,ise/o teórico por bioinformática de una !acuna.0. 1nálisis del proceso de producción de interferón %umano por tecnología recombinante.2. 1islamiento de insulina a partir de páncreas bo!ino.

1barca las seis unidades temáticas que comprende el programa.


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EVALUACIÓN DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA DE PRODUCTOSBIOLÓGICOS 2 DE AGOSTO /013

La e!aluación del Laboratorio corresponde al 34 de la calificación que se asienta en las actas.

La e!aluación del curso se realizará en tres e!aluaciones departamentales.

&l alumno debe obtener una calificación mínima de seis 52.36 para aprobar.

&n caso de presentar e#amen e#traordinario se deberá presentar un e#amen práctico teórico de los conocimientos adquiridos en el semestre.

Los aspectos a e!aluar son)&l desempe/o y trabajo en el laboratorio 5*346"La bitácora 5*346" y

La entrega del reporte escrito correspondiente a la práctica realizada 57346.

&l reporte escrito debe contener al menos los siguientes apartados)

*. Introducción+. 8bjeti!os-. ,iagrama de flujo del trabajo realizado

. 9esultados0. ,iscusión de resultados2. (onclusiones

:. ;ugerencias 5opcional67. ibliografía consultada.

FI9'1 ,& (8


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3PRÁCTICA No. 1

Prueba de efectividad de antibióticos en diferentes microorganismos.

OBJ TI!O " N RA#$Determinar la eficacia de diferentes antibióticos.

OBJ TI!O% %P CI&ICO%$Conocer los métodos que existen para determinar la eficacia terapéutica de un antibiótico.Realizar la curva patrón de penicilina, estreptomicina y tetraciclina de acuerdo a la farmacopea.

INTRO'(CCI)NLas infecciones bacterianas son un problema de salud a nivel mundial: esto es particularmente cierto para lospa ses subdesarrollados, donde estas enfermedades también causan una pérdida económica importante.!ara una quimioterapia sistémica, un a"ente antibacteriano ideal debe ser se"uro en dosis terapéuticas altasdosis, f#cil de administrar, incapaz de inducir resistencia y de ba$o costo% para determinar la factibilidad y lre" menes óptimos de dosificación se deben de efectuar cuidadosos estudios farmacoló"icos y farmacocinéticos.Los antibióticos son compuestos solubles derivados de ciertos microor"anismos y que in&iben el crecimiento deotros.La eficacia terapéutica de los antibióticos es demostrada por el efecto in&ibitorio del crecimiento de unmicroor"anismo sobre un medio de cultivo espec fico para cada antibiótico.'xisten dos métodos "enerales para demostrar esta in&ibición% el método de cilindro(placa y el ensayoturbidimétrico, el primero depende de la difusión a través de un cilindro y sobre una placa solidificada de a"ar enuna ca$a petri de tal manera que se adiciona un microor"anismo de prueba dependiendo del antibiótico a ensayary la in&ibición se determina en un #rea circular alrededor del cilindro que contiene el antibiótico. 'l métodoturbidimétrico depende del crecimiento microbiano en un medio de cultivo l quido que es favorable para ecrecimiento en la ausencia del antibiótico.

*AT RIA#+ ,(IPO - R ACTI!O%$

Antibióticos$!enicilina'streptomicina)etraciciclina

*icroorganismos$Staphylococcus aureusBacillus subtilis

*edios de cu tivo$*edio para antibióticos +o. -a"ar y medio l quido*edio para antibióticos +o. /*edio para antibióticos +o. 0/ -es el medio +o. 1 022 m" de *n34 5.6 / 2 por litro

'i u/entes$


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7cido clor& drico 2. +3olución amorti"uadora +o. -Disolver /.2 " de fosfato dib#sico de potasio y 8.2 " de fosfato monob#sico depotasio en 222 ml de a"ua. 7$ustar el p6 con #cido fosfórico 8 + ó 6idróxido de potasio 2 + a p6 9.2 1 (2.2;

PROC 'I*I NTO$Pre0aración de est ndar

'st#ndar de penicilina.!esar la cantidad necesaria para obtener una solución de 22 < ml y realizar las diluciones necesarias paraobtener por lo menos ; puntos de la curva de manera que el punto medio sea .2 < ml

'st#ndar de tetraciclina.!esar la cantidad necesaria para obtener una solución de m" ml y realizar las diluciones necesarias paraobtener ; puntos de la curva de manera que el punto medio sea 2./5 µ " ml

'st#ndar de estreptomicina.!esar la cantidad necesaria para obtener una solución de m" ml y realizar las diluciones necesarias paraobtener ; puntos de la curva de manera que el punto medio sea 02µ " ml.

!reparación del inóculo.'n un tubo de a"ar nutritivo sembrar el microor"anismo de prueba e incubarlo /5 &. 7=adir solución salina estérilsuficiente para obtener una solución a$ustada al /;> de transmitancia a ;82 nm.

*étodo del cilindro(placa.. 7=adir /2 ml del medio +o. / en cada ca$a de petri, una por cada dilución y de$ar solidificar.

/. 7=adir al medio +o. , 2. ml deS. aureus o B. subtilis de la suspensión del inóculo -a$ustada al /;> por cada22 ml.0. 7=adir 2 ml del medio inoculado sobre la placa "elificada de a"ar +o. / y de$ar solidificar nuevamente.5. Colocar / cilindros sobre las placas "elificadas y a=adir ;2µ l de cada una de las diluciones, incubar a 0? C por

/5 &, medir el &alo de in&ibición.

*2todo turbidim2trico. !reparar las diluciones necesarias para el est#ndar y realizar por triplicado el ensayo.

/. Colocar @.2 ml del medio para antibióticos l quido y a=adir 2.2 ml de inóculo.0. Ancluir ó / tubos control, conteniendo l ml de diluyente sin antibiótico y @ ml de medio.5. De la solución de referencia a=adir ml de cada dilución a cada uno de los tres tubos preparados y colocar los

tubos en una "radilla.;. Colocar la "radilla en un ba=o de a"ua a 0? C. Después de la incubación a=adir 2.; ml de formalde& do al />en cada tubo.

9. Leer la absorbancia de los tubos de cada "radilla a ;02 nm a$ustando previamente con los tubos control.


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PR4CTICA /D ) r-"na#"!n la #a5a#" a l - "o #6l)"&o 5ara

permitir el crecimiento de los microorganismos (USP XX)

?sta prueba se lle!a a cabo para comprobar que los medios*edio fluido de tio"licolato y *edio di"erido desoya tripticasa tienen las propiedades necesarias para permitir el crecimiento de microorganismos.

Material:Asa bacteriológicaCajas de PetriCeldas para el espectrofotómetroMatracesPerlas de vidrio estérilesPipetas estériles

Tubos de vidrio co rosca ! tapas Tubos para ce tr"fuga (#alco

$

)%arilla de vidrio para la e&te sió del microorga ismo'ecipie te co agua para desec as las pipetas usadasCi ta para rotularMarcador i delebleMec eros#ra ela

spo jasCerillos o e ce dedor

Equipos:Parrilla eléctrica co agitació mag ética

* cubadoraspectrofotómetroCampa a de +ujo lami arAgitador vórte&

Soluciones:Agua destilada estérilSolució sali a al ,-./0Solució de fe ol al /0

Cepas a utilizar:• Bacteroides vulgatus ATCC .1.23 Clostridium sporogenes ATCC 45// o Aspergillus

niger ATCC 671,1 para el Medio +uido de tioglicolato (M#T)• Bacillus subtilis ATCC 7788 o Candida albicans ATCC 6,286 para el Medio digerido

tr"ptico de case" a ! so!a (M9ST)

Medios de cultivo:Caldo car e para los microorga ismos B. vulgatus 3C. sporogenes ! A. niger -Agar i fusió de cerebro ! cora:ó (;U*9= 9 T*=?>*C=>AT= (M#T)


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9igerido pa cre@tico de case" a 6/-,, g&tracto de levaduras (soluble e agua) /-,, g

Cloruro de sodio 2-/, g9e&trosa mo o idratada 2-/, gAgar gra ulado (co me os del 6/0 de

umedad),-4/ g

Cisti a M 9*= #>U*9= 9 T*=?>*C=>AT= (M#T)FPreparaci#n del in#culo para la determinaci#n de la sensi$ilidad del medio decultivo:

1 partir de un culti!o de caldo carne o bien" de un !ial liofilizado" efectuar una resiembra o ctioglicolato" incubar a -: @( durante 7 %oras.Ob) n#"!n l 5a76 ) # l6lar:(entrifugar a -333 rpm durante *0 minutos" la!ar con solución salina al 3.704 dos !eces. 9esuspendel paquete celular en *0 mL de solución salina al 3.704.1justar esta suspensión a 234 de transmitancia utilizando un filtro !erde 5073 nm6. Ana !ez ajust preparar diluciones decimales de *3B* a *3B7. Por duplicado colocar en placas de gelosa sangre 3.0 mde las diluciones *3B0" *3B2" *3B: y *3B7" e#tender la alícuota ayudándose de una !arilla doblada en ángurecto estéril.Incubar a -: @( durante 7 %oras en atmósfera de anaerobiosis 5sistema de CasBPacD6.>ranscurrido el periodo de incubación" proceder a contar las Anidades formadoras de colonias 5en cada una de las placas seleccionando aquellas placas que muestren no menos de -3 ni más deAF(. (alcular el nEmero total considerando la dilución y el !olumen del inóculo. Atilizar la dilucque muestre un nEmero de AF( menor de *33.D 8arrollo la 5r6 ba.,e cada lote de medio que se prepare" separar tubos$ se usan para probar la sensibilidad del mde culti!o$ - tubos para una segunda prueba" si ésta fuera necesaria y + tubos se utilizan como cde esterilidad del medio de culti!o.


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,e la suspensión ajustada como se indicó anteriormente tomar * mL e inocularla a cada tubo de pruIncubar a -3B-0 @( durante : días. 9e!isar los tubos diariamente y anotar el día en el que aparezccrecimiento 5generalmente aparece al tercer día6. 1) &s con!eniente que al momento de la prueba se efectEe una cuenta en placa" para comprobar q

nEmero de microorganismos del inóculo es el indicado en la A;P 5Anited ;tates P%armacopeia6.PA'A > M 9*= 9*? '*9= 9 S=DA T'*PT*CASA (M9ST)F

Preparaci#n de los in#culos para la determinaci#n de la sensi$ilidad del mediode cultivo:

a. 8btención de esporas de Bacillus subtilis .;embrar el B. subtilis en tubo conteniendo agar GI 5inclinado6" incubar por a -: @( 7 %o>ranscurrido el período de incubación" cosec%ar el culti!o y resuspender en solución salina en u pro!isto de perlas de !idrio estériles 5para la %omogenización del culti!o6" agitándolo en el !(alentar el culti!o a :3 @( durante -3 minutos. La!ar tres !eces centrifugando a -33 rpm durante minutos con solución salina estéril al 3.704 y resuspender finalmente en 03 mL de agua destiestéril. (alentar nue!amente a :3 @( por -3 minutos. ;embrar una placa de GI para obser!a

!iabilidad de las esporas.1justar la suspensión a 234 de transmitancia utilizando un filtro !erde 5073 nm6. Ana !ez ajustadsuspensión" preparar diluciones decimales *3B* a *3B: y sembrar por duplicado en cajas de Petri * mL dcada una de las - Eltimas diluciones" colocar sobre el inóculo apro#imadamente +0 mL de agar pre!iamente fundido y enfriado a 0 @( 5técnica de !aciado en placa6" %omogenizar y dejar soel agar" incubara -: @( por + %oras. >ranscurrido el periodo de incubación" proceder a contar laen cada una de las placas" se deben seleccionar aquellas que presenten no menos de -3 ni más dAF(. (alcular el nEmero total considerando la dilución del inóculo. Atilizar la dilución que muestrnEmero de AF( cercano a *33 5no más de *336.

b. 8btención de la suspensión deCandida albicans .

;embrar el microorganismo en tubos de agar GI inclinado e incubar a -: @( por 7 %oras.>ranscurrido el periodo de incubación cosec%ar el culti!o" resuspender en *0 mL de solución sa%omogenizar.1justar la suspensión a 34 de transmitancia utilizando un filtro !erde 5073 nm6. Ana !ez ajust preparar diluciones decimales de *3B* a *3B7. Gacer cuenta !iable de las cuatro Eltimas dilucionesiguiendo el método de !aciado en placa 5como en el inciso a.6.Atilizar la dilución que muestre un nEmero cercano a *33 AF(" no más de *33.

D 8arrollo la 5r6 ba:,e cada lote de medio de agar soya tripticasa que se prepare" separar *2 tubos" de los cualesutilizarán para probar la sensibilidad del medio" 2 tubos para una segunda prueba" si esta necesaria y + tubos se utilizan como control de esterilidad del medio de culti!o.,e las suspensiones preparadas se inoculan * mL de cada una en cuatro tubos de medio y la segundlos cuatro complementarios.Incubar a +3 H+0 @( durante : días. 8bser!ando diariamente y anotando el día en que apacrecimiento. 1) &s con!eniente %acer una cuenta en placa como se indicó para el medio de tioglicolato" para comp

que el nEmero de microorganismo del inóculo es el indicado.

E&al6a#"!n:


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;i ambos medios fallan para obtener crecimiento de los microorganismos en una concentración d*33 microorganismos por mL" se deben in!estigar los medios en cuestión y la forma de prepararloIgualmente determinar si los microorganismos están en las condiciones óptimas y si el procedimse %a seguido correctamente.

REFERENCIA'anual de laboratorio de producción y control de biológicos" ta. ed." IP


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PR4CTICA 3.PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN CONE,OS.

OB,ETIVOS.• 8btener dos inmunógenos bacterianos" uno de naturaleza proteínica 5antígeno G 6" y o

naturaleza lipopolisacarídica 5antígeno 8 6 deSalmonella thyphimurium .• &l alumno ensayará las técnicas de inmunización con los animales de uso más comEn

laboratorio" practicando algunos de los esquemas de inmunización ya establecidos.• &fectuar la purificación de gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a

saturación final del --4.• &l alumno conocerá distintas maneras de poner en e!idencia la reacción de precipitación que o

cuando un antígeno soluble interacciona con su anticuerpo %omólogo.

INTRODUCCIÓN.INMUNI9ACIÓN Y SANGRADO DE ANIMALES.

Inmunización es el proceso" natural o artificial" mediante el cual un indi!iduo competente desauna respuesta inmunológica al entrar en contacto con un antígeno.

(uando un inmunógeno penetra al organismo" es captado y procesado por las cél presentadoras de antígeno 5(P16" lle!ándose a cabo una serie de interacciones celulares que in!olutambién a los linfocitos > y a los linfocitos . (omo resultado se induce una respuesta inmunoló primaria con la consecuente formación de anticuerpos" los cuales se detectan en el suero a partcuarto día de inmunización 5fase lag6" incrementando su concentración lentamente 5fase logllegar aun má#imo 5meseta6 para posteriormente decaer rápidamente. &n este tipo de respue

isotipo principal de inmunoglobulina producido es Ig'" seguida por una peque/a cantidad de IgC baja afinidad.&n un segundo contacto con el inmunógeno" la fase lag disminuye considerablemente

alcanza una concentración de anticuerpos apro#imadamente diez !eces mayor que en una resp primaria$ el isotipo dominante en este caso es IgC" y presenta una mayor afinidad por el antígeno

&l isotipo de anticuerpo producido puede reflejar la diferencia en la ruta de inmunizaciónnaturaleza del inmunógeno" así como la !ía por la cual el antígeno es procesado y presentadiferentes poblaciones de linfocitos.

Para que un antígeno pueda actuar como un buen inmunógeno debe fa!orecer la cooperaentre las células > y . An mismo antígeno puede no tener la misma inmunogenicidad en diferespecies animales" ya que esto depende de las características gen éticas" así como de la edad y se

indi!iduo inmunizado.La dosis del inmunógeno es un factor importante para lograr una respuesta inmunológicque cantidades e#cesi!as o mínimas del antígeno pueden inducir el fenómeno de tolerancia" el cudefine como un estado de noBrespuesta aun antígeno en particular.

&l estado físico del antígeno 5particulado o soluble6 debe tomarse en cuenta para desigruta de inmunización" es decir" los antígenos particulados 5bacterias" eritrocitos" c preferentemente son introducidos dentro del organismo por !ía intra!enosa" mientras que los antígen solución pueden introducirse por di!ersas !ías" como intramuscular 5I'6" intraperitoneal 5subcutánea 5;(6 e intradérmica 5I,6. &n estas dos Eltimas" se utiliza preferentemente el antí


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acompa/ado de un inmunopotenciador o adyu!ante. &stos agentes actEan inespecíficamente incrementar la respuesta inmune específica aun antígeno dado.

Los adyu!antes se %an clasificado arbitrariamente de acuerdo a los mecanismos de ac propuestos" ya que la mayoría de ellos parecen funcionar utilizando más de un mecanismoadyu!antes pueden actuar a tra!és de la retención y liberación del antígeno" o por efecto direct

macrófagos y linfocitos. La formación de un depósito de antígeno parece ser importante paacti!idad de adyu!antes como aquellos compuestos de alEmina" emulsiones de aceite" liposom polímeros sintéticos. La acti!idad de los adyu!antes como lipopolisacáridos 5LP;6 y muramil dipé5',P6 parece ser mediada principalmente a tra!és de la acti!ación de macrófagos" mientras q

Bordetella pertusis actEa sobre macrófagos y linfocitos.1ctualmente" el adyu!ante de mayor uso en animales de e#perimentación es el de Freund

adyu!ante incompleto de Freund es una mezcla de un aceite mineral 5,raDeol" ayol"


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An); no


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La facilidad de combinación del antígeno con el anticuerpo depende de !arios factores cson el pG" fuerza iónica" temperatura" tiempo" y sobre todo" las concentraciones relati!as de antíanticuerpo.

Los complejos antígenoBanticuerpo insolubles forman una red tridimensional que deb!oluminosa para que pueda obser!arse" y los reactantes %an de estar en proporciones adecuadas"

el e#ceso de cualquiera de ellos conduce a un cierto grado de solubilización del agregado moleeste %ec%o se e#plica ya que la reacción antígenoBanticuerpo está sujeta a la ley de acción de ma

R a##"!n 5r #"5")a#"!n n - "o l;76" o.Para lle!ar a cabo la reacción" se mezclan cantidades crecientes del antígeno soluble con una canconstante del anticuerpo específico y se mide el precipitado resultante. &n forma semicuantitatestima la cantidad de precipitado formado" e#presándolo en milímetros lineales. (uantitati!ament precipitado se puede analizar mediante la determinación del nitrógeno proteínico en el mismo.

;i los resultados se presentan en forma gráfica colocando en el eje de las abscisas la cantidaantígeno agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado" se obtiene una cur!a en formcampana.

. &n este método sólo uno de los reacti!os

5generalmente el antígeno6 difunde radialmente desde un pozo perforado en el agar en el cual yembebido el otro reacti!o 5generalmente el anticuerpo6. &n la cercanía del pozo" el antígeno está concentración relati!amente alta y forma complejos solubles$ conforme el antígeno difundconcentración !a disminuyendo %asta un punto en que ambos reacti!os alcanzan concentracequi!alentes y entonces se forma un %alo de precipitación. (uanto más alta sea la concentracióantígeno mayor será el diámetro del %alo. &sta prueba se puede realizar de manera cuantitati!aagregan concentraciones conocidas del antígeno de prueba" de tal manera que se pueda construcur!a de calibración.

&ste método se emplea rutinariamente para cuantificar inmunoglobulinas" complemfactores de coagulación" transferrina" alfafetoproteína" entre muc%os otros componentes.


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In-6no "(68"!n obl =O?#$) rlon@>. &ste método se basa en el principio de que el antígeny el anticuerpo difunden a tra!és de un medio semisólido y forman complejos inmunes estables pueden ser analizados !isualmente.

&l método permite identificar sistemas antígenoBanticuerpo mEltiples" establecer la prelación inmunológica entre dos antígenos y %acer estimaciones gruesas sobre la pureza del antíg

del anticuerpo. &s posible emplear también este método para el análisis semi cuantitati!o dconcentración de antígeno" o para conocer el título precipitante de un antisuero. ;u principal des!ees su relati!amente baja sensibilidad 5* mg l33 mL6.

MATERIALES.

Ma) r"al 5or r65o:1dyu!ante completo e incompleto de Freund.1gitador magnético.1gitador Mórte#.

1ntígeno suficiente para inmunizar a los conejos de acuerdo a los protocolos de inmunización.a(l al *34 50 mL6.a/o maría a -:@(.ase magnética.ote metálico de boca anc%a.

(ajas para transporte de animales.(entrífuga clínica.(olorante para marcar los animales.(onejos suficientes para obtener la cantidad de antisuero segEn las necesidades del curso.(%arola con solución de benzal.Naulas para ratones.

'atraz &rlenmeyer de + L.'ec%ero unsen.;olución de timerosal al * 4 5*3 mL6;olución salinaBregulador de boratos 5;;9 6 3.* '" pG :.7.>ripie.

Ma) r"al 5or 76"5o:+ tubos 1gar nutriti!o.

1garosa tipo II" medium &&8 5;igma (%emical6.* fco 1lco%ol al :34 con torundas de algodón.3.0 mL 1ntígeno soluble.

3.- mL 1ntisuero.*3 pzas 1plicadores de madera.(aja de Petri de *0 # *33 mm.

* tubo (aldo nutriti!o.+ tubos (aldo tioglicolato con aceite mineral.* pza Frasco Cerber.* pza Cradilla con plastilina.* pza Cradilla para tubos de ensaye de *3 # :0 mm.* pza Cradilla para tubos de ensaye de *0 mm de diámetro.


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*3 cm Gilo grueso.Goradador de - mm de diámetroNeringas estériles de *.3 mL con agujas de ++ # -+ mm.Neringas estériles de *.3 mL con agujas de +0 # *2 mm.Neringas estériles de *3 mL con agujas de +3 # +0 mm.

Neringas estériles de +3 mL con agujas de +3 # +0 mm.* pza Lámpara.* pza 'atraz &rlenmeyer de *+0 mL.* pza 'atraz &rlenmeyer de +0 mL.* pza 'ec%ero unsen.0.3 mL ripié metálico*2 pzas >ubo capilar.+ pzas >ubo cónico de *0 mL" graduados.* pzas >ubo de ensaye de *3 # :0 mm.0 pzas >ubo de ensaye de *- # *33 mm. con tapón de rosca" estériles.

pzas >ubo de ensaye de *0 # *+0 mm.>ubo para diálisis.

+ pzas Maso de precipitados de +03 mL.

METODOLOGÍA:

A. Ob) n#"!n l an); no


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. (osec%ar el culti!o por centrifugación a -333 rpm durante *0 min.0. ,esec%ar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano en solución salina formaliniza

3.-4" con el objeto de fijar químicamente los componentes microbianos" %asta igualar la turcon la del tubo


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+. Localizar las !enas marginales de la oreja del animal.-. ;ujetar bien la oreja con los dedos medio y anular.

. Limpiar la zona de inmunización con alco%ol al :34.0. Proceder a inyectar al animal. ;i se !a a lle!ar acabo una serie de inmunizaciones" es recomend

comenzar en el e#tremo de la oreja más alejado de la cabeza y se procede a inyectar %acia la

de la oreja.G. In-6n"'a#"!n &;a 86b#6)%n a.*. &legir la zona de inoculación" cortar el pelo del animal con tijeras y limpiar con una torunda.+. Le!antar ligeramente la piel del conejo e introducir la aguja lateralmente" apro#imadament

tercera parte de ésta" y depositar el antígeno. itular los antisueros con los antígenos respecti!os. &n general" los títulos de *)2 3 o mayores sadecuados para el antígeno somático 8 " y para el antígeno G de *)0333 o mayores. &n casose obtengan títulos menores a los se/alados" se recomienda administrar una quinta dosis de - mcuarto o se#to día después del sangrado. &fectuar un nue!o sangrado seis días después dreestimulación.

,. ANTÍGENOS SOLUBLES.Pro) ;na8 8ol6bl 8.Atilizar fracciones séricas como albEmina y gamma globulina.

Pro)o#olo "n-6n"'a#"!n 5ara an); no8 8ol6bl 8.In@ ##"!n

No.T" -5o= ;a8>

F #$a Do8"8 D"8ol& n) V;a

* 3 0 mg *.3 mL de ;;" emulsificados con *.3 mLde adyu!ante completo de Freund

I, en sitiosmEltiples


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+ *0 0 mg *.3 mL de ;;" emulsificados con *.3 mLde adyu!ante incompleto de Freund

I, en sitiosmEltiples

- -3 3.+0 mg ;; IM-* 3.03 mg ;; IM

0 -+ *.3 mg ;; IM

;angrar -. Pr #"5")a#"!n a--a lob6l"na #on 86l(a)o a-on"o.

*. 1justar a :.7 el pG de la solución saturada de sulfato de amonio" con


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7. Atilizar como testigos un tubo capilar conteniendo antisuero más ;; y otro conteniendo antígsin diluir más ;;.

. 'antener los tubos capilares a temperatura ambiente durante + a 7 %.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO.

M. In-6no "(68"!n obl =M+)o o O?#$) rlon@>.*. Preparar +33 mL de una solución de agarosa al 3.*4 en ;;. ,isol!er la agarosa por calentamient9eponer el !olumen perdido por e!aporación con agua destilada caliente. ;umergir los portaobjecuando aEn esté caliente la solución de agarosa" escurrirlos y dejarlos secar 5barnizado6.

+. Preparar una solución de agarosa al *4 en ;;. ,isol!er la agarosa por calentamiento" reponiendo!olumen perdido con agua destilada$ adicionar timerosal %asta una concentración final del 3.(olocar los portaobjetos pre!iamente barnizados y ya secos" en una superficie completam%orizontal y con una pipeta serológica de punta anc%a depositar .3 mL de agarosa al *4 casobre cada uno de ellos. ,ejar gelificar a temperatura ambiente y mantener los portaobjetos dede una cámara %Emeda %asta su uso.

-. Perforar la agarosa segEn el molde proporcionado más adelante y remo!er el gel del interior d perforaciones.

. Llenar con el antisuero el pozo central y con los antígenos los pozos periféricos. (uidar de quse derrame ninguno de los reacti!os fuera de los pozos.

0. Incubar los portaobjetos en una cámara %Emeda" usando una caja de Petri en cuya tapacolocado papel absorbente %umedecido. Incubar a temperatura ambiente durante + a 7 %.

MANE,O DE LOS RESULTADOS.'edir la cantidad de precipitado con la ayuda de una regla. (on los datos obtenidos completarsiguiente tabla y %acer una gráfica en papel milimétrico" anotando en el eje de las abscisconcentración del antígeno y en las ordenadas la cantidad de precipitado en mm" y localizar las

de e#ceso de anticuerpo" de antígeno y la de equi!alencia.Gacer un esquema de los resultados obtenidos identificando las bandas de identidadidentidad parcial y aquellas de noBidentidad.

REFERENCIAS BILIOGR4FICAS.• (ampbell" ,. G.$ Car!ey" N. ;.$ (remer"


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Práctica 5PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

Desde hace mucho tiempo se han aislando de la orina, sangre y otros tejidos, humanos yanimales, proteínas terapéuticas con métodos bioquímicos tradicionales. Así por ejemplo, la

insulina proveniente del páncreas del cerdo regula los niveles de glucosa en sangre dediabéticos tipo l. Sin embargo los tratamientos con proteínas animales que presentandi erencias con respecto a las humanas pueden provocar una importante respuestainmunitaria.

!a diabetes mellitus es una en ermedad cr"nica caracteri#ada por la incapacidad delindividuo de metaboli#ar la glucosa de manera normal debido a una de iciencia parcial o totalde la hormona insulina, por lo que en algunos casos los pacientes diabéticos pueden ser controlados mediante la aplicaci"n de la insulina. $n %é&ico toda la insulina es importada. Su consumo ha sido calculada en '()( ue de *+

g. - para el a o /001 se estimo entre )' y '00 g de esta hormona.

Extracción de insulina pro eniente de páncreas de cerdo!'. 2esar 30 ( de páncreas de 4 de pre erencia neonato5 ganado y adicionar '00 m 6 de

bu er modi icado7u er modi icado. 1* m 6 de metanol, /* m 6 de agua destilada, y ' m 6 de ácidoclorhídrico concentrado

/. 6ncubar por tres horas a 3*89 en agitaci"n.3. $liminar el tejido mediante iltraci"n con doble capa de gasa. De ser necesario iltrar con

papel iltro.:. 9on el tejido recuperado reali#ar nuevamente la e&tracci"n con '00 m 6 de bu er

modi icado durante ' hora en las miasmas condiciones.*. ;untar los dos e&tractos.+. Adicionar hidr"&ido de sodio concentrado hasta obtener un p< en el límite del alcalino o

hasta que se orme un precipitado. 9entri ugar, eliminar el precipitado y medir el volumende sobrenadante.

1. $n tubos de centri uga de *0 m 6 colocar '00 ml sobrenadante.). !a insulina se precipita mediante la adici"n de ' m 6 de metanol y /* m 6 de éter.(. 6ncubar la me#cla en el re rigerador por '/ h'0. 9entri ugar y el precipitado 4insulina5 será lio ili#ado''. =eneralmente se logran obtener en promedio '* mg

manual practicas ing de productos biologicos

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