EVALUACIÓN Y MANIPULACIÓN DE EMBRIONES

TECNOLOGÍA EN REPRODUCCIÓN ANIMAL

MANUAL DE INSEMINACIÓN ARTIFICIAL EQUINA

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Manual de IA Equina

Inseminación artificial en caballos Ventajas de la IA • Reduce el riesgo de transmisión de enfermedades entre los reproductores • Disminuye la incidencia de infección uterina, una de las principales causas de

infertilidad en la yegua • Permite la cubrición de yeguas en las que la monta natural resulta arriesgada o no

quedan preñadas • Mayor seguridad para los animales y operarios • Facilita el intercambio genético entre criadores en todo el mundo Fases de la IA 1. Selección del semental 2. Colección del semen 3. Evaluación del semen 4. Conservación del semen 5. Aplicación del semen 1. Selección del semental. El historial de los sementales es importante, y debe incluir la

información Referente a la libido, capacidad de acoplamiento, fertilidad (si el semental ha sido utilizado en el pasado), enfermedades o lesiones, y cualquier medicación recibida. Se debe realizar un examen físico general, observando si hay síntomas de cojeras (particularmente de los cuartos traseros) y posibles enfermedades hereditarias que pueden afectar a la capacidad reproductiva del semental. Los órganos genitales deben evaluarse a fondo. El pene y el prepucio deben estar libres de lesiones. Los testículos y el epidídimo deben tener el tamaño, la forma y la consistencia adecuada. Los testículos deben estar libres dentro del escroto. Los órganos genitales internos son evaluados por palpación y ultrasonografía rectal. El examen de los sementales debe consistir en: 1. Historia y examen físico 2. Cultivo de muestra de la uretra antes y después de la eyaculación 3. La colección y la evaluación de dos o más eyaculados para la evaluación del

semen (número de espermatozoides, motilidad, y morfoanomalias).

2. Colección del semen. Para la colección del semen, se puede utilizar una yegua en celo o un maniquí (Foto 1: Maniquí para sementales, modelo Hannover. Ref 11200/0000). Es importante limpiar el maniquí después de cada colección, para evitar cualquier tipo de contaminación.

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Foto 1. Maniquí para sementales, modelo Hannover. Ref 11200/0000

Se debe provocar la erección, presentando al semental una yegua en celo. Si el pene esta cubierto de secreciones, se puede utilizar de vez en cuando un jabón suave. El semen se recoge con una vagina artificial (Foto 2: Sistema Hannover Ref 11220/0145 y accesorios; Foto 3: Sistema Colorado Ref 11230/0000 y accesorios; Foto 4: Sistema Missouri Ref. 11245/0000 y accesorios), que debe tener una temperatura interna de 44-48ºC a la hora de la colección. La vagina artificial debe ser lubricada con vaselina o con un lubricante estéril no espermicida (Foto 5: Priority care Ref 11905/0140 y accesorios para toma de temperatura).

Foto 2. Sistema Hannover Ref. 11220/0145

Foto 3. Sistema Colorado Ref. 11230/0000

Foto 4. Sistema Missouri Ref. 11245/0000

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Foto 5 Priority care Ref 11905/0140 y termómetro para vagina

El semental comenzará a empujar, y la eyaculación puede ser detectada observando los movimientos de la cola y poniendo la mano en la parte ventral del pene, para sentir las pulsaciones de la uretra que acompañan a la eyaculación. La eyaculación se produce en tres fracciones: pre-seminal, fracción rica en espermatozoides y la fracción de gel. El volumen medio del eyaculado oscila entre los 75-120ml (depende de la raza) y pueden realizarse entre 2-3 colecciones. Al semental se le da un descanso, y entonces se recoge un segundo ejaculado.

Es muy importate cumplir los protocolos de higiene estricta durante la colección del semen, así como el cuidado y limpieza de todos los equipos utilizados para la colección. Las bacterias pueden ejercer un efecto doblemente negativo sobre el éxito de la inseminación: por una parte las bacterias condicionalmente patógenas pueden llegar con el semen al genital de la yegua, provocando allí – en el caso más desfavorable – una inflamación del útero. Por otra parte, ciertas bacterias ejercen un efecto negativo sobre la motilidad espermática. Un problema frecuente son las infecciones por Pseudomonas aeruginosa, un germen, que se encuentra de preferencia en baños de agua y pisos húmedos, provoca una reducción manifiesta de la motilidad en semen refrigerado dentro de las primeras 24horas.

3. Evaluación del semen. La valoración de los eyaculados incluye el registro del volumen, concentración, motilidad, y formas anormales. Los materiales que entran en contacto con el semen deben estar a la misma temperatura que el semen (aproximadamente 37ºC evitando el choque térmico), limpios, secos y no tóxicos. Durante la colección, el semen se filtra para quitar el gel y cualquier suciedad (Filtro para semen Ref. 11245/3100). Se debe registrar:

3.1. Volumen: volumen total de semen libre de gel se puede medir con una probeta graduada (Probeta graduada Ref. 15426/0250)

3.2. Motilidad: la motilidad total y progresiva se valora inmediatamente después de la colección poniendo una gota del semen en un portaobjetos temperado y examinándola al microscopio (Foto 6. Microscopio de contraste de fases CX31 Ref. 12004/0331 y accesorios). Las muestras concentradas se pueden diluir con el diluyente de semen que se vaya a utilizar o con una solución salina. El semen puro y el diluido se deben evaluar varias veces

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para la determinación de la longevidad del eyaculado. Los sementales fértiles tienen que tener al menos 2 x 109 espermatozoides con motilidad progresiva, la morfología espermática debe ser normal en cada uno de los eyaculados recogidos.

Foto 6. Microscopio de contraste de fases CX31 Ref. 12004/0331 y accesorios

Es importante que el semen se caliente suavemente a 37ºC antes de la evaluación. La motilidad en masa, se evalúa con una gota de semen no diluida en un portaobjetos sin cubrir y observado a microscopio (x40).

La motilidad individual se determina en una muestra diluida con un medio salino o diluyente para semen de equino. Se coloca una gota de esperma diluido en un portaobjetos, se tapa con el cubre objetos, y se examina a x200-400. La proporción de esperma que se está moviendo progresivamente a través del campo visual es estimada buscando grupos de espermatozoides (aproximadamente 10) y estimando cuantos tienen una motilidad progresiva y cuantos no la tienen. El ambiente y las condiciones en las que hace la valoración son muy variables, por lo que es necesario que siempre la temperatura del semen antes de la valoración sea la adecuada. Por lo tanto, eyaculados con valores de motilidad progresiva de ≥60%, son aceptables. Si la motilidad es inferior al 50% el eyaculado no es considerado apto para la congelación. La presencia de células extrañas en la muestra debe ser comprobada mientras se valora la motilidad. Este método de valoración es subjetivo y depende mucho de la persona que hace la valoración. En la actualidad existen otros sistemas más objetivos para el análisis de la motilidad, son los sistemas de análisis por imágenes (Foto 7 Sistema de análisis por imagen SpermVision® Ref. 12049/0586), que permite valorar de forma precisa los diferentes parámetros seminales, analizando la motilidad y concentración en tiempo real (menos de 2 segundos).

Foto 7 Sistema de análisis por imagen SpermVision® Ref. 12049/0586

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3.3. Concentración: se puede valorar usando una cámara de contaje (Cámara de contaje Ref. 15150/4771) en la que se pone una muestra de semen diluido 1:20 con una solución de cloruro sódico formolado y examinándola al microscopio para realizar el contaje y posteriormente calcular la concentración total mediante la fórmula de conversión (x106

espermatozoides / ml). Para una valoración más exacta se utiliza el espectrofotómetro calibrado para determinar la concentración del eyaculado (Foto 8 Fotómetro SpermaCue Ref. 12300/0500). El número total de espermatozoides se calcula como concentración x volumen.

Foto 8 Fotómetro SpermaCue Ref. 12300/0500

3.4. Morfología: Se fija una muestra de semen en una solución salina con formaldehído y se observa con microscopio de contraste de fases x1000. También se puede determinar la morfología mediante tinción del semen (Colorantes Spermac Ref. 15405/0000; Eosina G Ref. 15405/0025: Nigrosina Ref. 15405/0029). Al menos se debe contar 100 espermatozoides. Las formas anormales más frecuentes son: - Cabezas sueltas - Cabezas con formas extrañas - Gotas citoplasmáticas - Colas dobladas - Acrosomas defectuosos

Si el primer eyaculado es aceptable, el segundo eyaculado debe contener aproximadamente la mitad del número de espermatozoides del primero, pero el porcentaje de anormalidades debe ser el mismo, así como la motilidad. Si existen diferencias es necesario obtener un tercer eyaculado. El tercer eyaculado debe tener aproximadamente la mitad de los espermatozoides del segundo eyaculado, y la misma morfología y motilidad.

Para la valoración de sementales la colección de semen se hace diariamente durante 7-10 días antes de que un eyaculado sea representativo (es decir que la evaluación del semen sea constante en las colecciones sucesivas). El número de espermatozoides después de ≥2 días de descanso debe estar sobre ≥8-10 mil millones en el primer eyaculado, y aproximadamente 4 mil millones en el segundo eyaculado. La motilidad total de los espermatozoides debe ser de ≥65%, y la motilidad progresiva ≥45%.

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4. Conservación del semen. Una vez que se colecte el semen, se determinq la motilidad, la concentración y el número de anomalías morfológicas. Se calcula los espermatozoides con motilidad progresiva, se les añade el diluyente y el antibiótico necesario para mejorar la supervivencia del semen. La temperatura de conservación del semen dependerá del tiempo que necesitemos mantener su viabilidad: semen fresco, Refrigerado o congelado. En el semen fresco, se diluye y se insemina la yegua inmediatamente. Para el semen Refrigerado, los diluyentes de elección son los que tienen como componentes principales yema de huevo (Diluyente Gent Ref. 13571/0045) o sustitutivos de yema de huevo (AndroMed®-E Ref. 13573/0020), leche descremada (EquiPro Ref 13570/0201). La congelación de semen requiere la eliminación del plasma seminal mediante centrifugación (Foto 9 Centrífuga Ref. 14602/0500), para lo cual el semen se prediluye (1:1) con el diluyente que se vaya a utilizar o con un diluyente específico (Merck I diluyente de centrifugación Ref 13565/0001). La dilución se hace a una temperatura de 35ºC ( el semen se distribuye en tubos de centrífuga y se añade unos 3-4cc de un medio especial para la centrifugación del semen (CushionFluid Ref.13580/0001). Con CushionFluid, la centrifugación del semen se puede realizar hasta 1000G durante 20 minutos. Después de la centrifugación los espermatozoides se diluyen en el medio adecuado para su uso en fresco o para la congelación.

Foto 9. Centrífuga Ref. 14602/0500

La higiene durante el procesado de semen es clave para impedir el desarrollo de bacterias en el semen. La adición de antibióticos puede compensar en parte el efecto de la contaminación bacteriana del semen, que puede afectar considerablemente los resultados de la inseminación. Sin embargo, el semen refrigerado de ciertos sementales, procesado con diluyente libre de antibióticos, puede tener después de 24 horas una calidad claramente superior que el semen del mismo eyaculado que ha sido procesado con diluyente adicionado de antibióticos. Puede ser, por tanto, conveniente utilizar diluyentes libres de antibióticos para mejorar las cualidades del semen de ciertos animales, cuya calidad como semen refrigerado es insatisfactoria.

4.1. Semen Refrigerado. Se preparan dosis de 20 ml de volumen con una concentración final de 400 x 106 espermatozoides. La temperatura final de conservación es de +5ºC. La dilución se hace a 35º-37ºC, por lo que el diluyente debe estar temperado a esa temperatura (Foto 10 Baño María Ref. 14078/0001).

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Foto 10 Baño María Ref. 14078/0001

El volumen de la dosis es de 10-30ml para el semen fresco, con una concentración de 100-500 millones de espermatozoides, y de 30-60ml para semen conservado con una concentración de 400-500 millones de espermatozoides (el grado de dilución oscila entre 1:1 a 1:6). El descenso de temperatura debe realizarse en un plazo de 2-3 horas. Para una mayor precisión en la preparación de las dosis el uso de sistemas de dilución con calibración automática optimizan la producción de dosis (Foto 11 Smart Dispenser Ref. 13200/0700). La dosis deben agitarse suavemente y de forma regular durante su conservación (Foto 12 Rodador mezclador Ref. 14340/0500).

Foto 11 Smart Dispenser Ref. 13200/0700

Foto 12 Rodador mezclador Ref. 14340/0500

Para el transporte de las dosis seminales es importante mantener la temperatura de +5ºC (Foto 13 Contenedor para transporte Ref. 17229/0001; Equitainer® Ref. 17220/0000).

Foto 13 Contenedor para transporte Ref. 17229/0001; Equitainer® Ref. 17220/0000

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4.2. Semen congelado. Cuando el semen necesita recorrer largas distancias o conservarse durante largo tiempo, la técnica ideal es la congelación. Después de la centrifugación, el semen es diluido con un medio especial para congelación a una concentración final de 200 millones por ml y envasado (Foto 14 Sistema de envasado y sellado MPP1 Ref. 13017/000) en pajuelas de 0.5 ml a 4-5ºC (Foto 15 Vitrina refrigerada Ref. 119-1000). Una dosis de inseminación es de 8 pajuelas que hacen un total de 4ml con 800 millones de espermatozoides. Las pajuelas deben ir identificadas con la fecha de colección, país de origen, raza, número de semental, nombre de la yeguada y número de registro (Foto 16 Easy Coder para impresión de pajuelas sin tinta Ref. 1308/0000).

Foto 14 Sistema de envasado y sellado MPP1 Ref. 13017/000

Foto 15 Vitrina Refrigerada Ref. 119-1000

Foto 16 Easy Coder para impresión de pajuelas sin tinta Ref. 1308/0000

Las pajuelas se congelan en vapores de nitrógeno (Rampa flotante para congelación Ref. 15043/003) o utilizando un biocongelador programable, que permite diseñar la curva de congelación de +4ºC hasta –140ºC (Foto 17 Icecube Ref. 16820/2000).

Foto 17 Icecube Ref. 16820/2000 y pajuelas de congelación

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Una vez alcanzados los –140ºC las pajuelas se introducen directamente en nitrógeno líquido donde quedan almacenadas hasta su uso (Foto 17 Contenedores de almacén Ref. 16520/2006 y Contenedores de transporte Ref. 16502/2001)

Foto 17 Contenedores de almacén Ref. 16520/2006 y Contenedores de transporte Ref. 16502/2001

Para la descongelación se introduce la pajuela a +37ºC durante 35 segundos (Foto 18 Descongeladores Ref. 17043/3542).

Foto 18 Descongeladores Ref. 17043/3542

5. Aplicación del semen. La yegua se prepara para la inseminación en un lugar limpio y tranquilo. La cola se debe atar, para dejar libre la zona perineal y realizar una limpieza en seco con toalla de papel. Las yeguas deben ser inseminadas con al menos 250-500x106 espermatozoides con motilidad progresiva y morfología normal. El semen se deposita en el cuerpo del útero, usando una pipeta de inseminación de plástico estéril a la cual se conecta la jeringa con el semen (Foto 19 Pipetas universales de inseminación Ref. 17209 y Pipetas de inseminación intrauterina profunda Ref. 17209/1165).

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Foto 19 Pipetas universales de inseminación Ref. 17209 y Pipetas de inseminación intrauterina profunda Ref. 17209/1165

Para prevenir cualquier tipo de contaminación se recomienda utilizar material desechable. Los espermatozoides pueden seguir siendo viables en el tracto genital de la yegua durante ≥48hr. Una fertilización exitosa, particularmente si ha de trabajarse con dosis pequeñas de semen, puede realizarse mediante el uso del método endoscópico. Con ayuda del endoscopio es posible depositar bajo control visual una dosis única (una pajuela de 0,5 ml) de semen en la unión útero-tubárica (Foto 20 Endoscopio Ref. 23700/1200). El endoscopio permite una reducción importante de la cantidad de espermatozoides, sin arriesgar el éxito de la inseminación. Esto es de especial interés, cuando se trata de sementales muy solicitados o de disponibilidad de semen limitada.

Foto 20 Endoscopio Ref. 23700/1200

Siempre hay que tener en cuenta que el resultado de la inseminación (el potro) depende de la interacción de tres factores principales: la fertilidad del semental, la fertilidad de la yegua y el manejo reproductivo. Es por ello que se debe asegurar una buena práctica de la inseminación artificial para maximizar los resultados reproductivos.

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