manual de prácticas de bacteriología
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SINALOAESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE
MANUAL DE PRACTICAS DE BACTERIOLOGIA
Departamento de parasitología rama de fitopatología
Ing. Jesús Gpe Loredo Vega
Juan José Ríos, Ahome, Sinaloa 16 de junio del 2008.
INDICE
Pag.INTRODUCCION............................................................................................i
INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DE
FITOPATOLOGIA..........................................................................................1
PROBLEMAS Y CONTROVERSIAS RELATIVOS A LA IDENTIFICACION Y
CARACTERIZACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS...........................2
PROGRAMA DE TRABAJO...........................................................................3
PRACTICA # 1 ESTERILIZACION DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE
MEDIOS DE CULTIVO..................................................................................3
PRACTICA # 2 ELABORACION DE MEDIOS DE CULTIVO..........................5
PRACTICA # 3 METODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS..................9
PRACTICA # 4 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD.........................................13
PRACTICA # 5 METODOS DE CARACTERIZACION E IDENTIFICACION
DE BACTERIAS FITOPATOGENAS.............................................................16
PRACTICA # 6 TECNICAS DE TINCION PARA DETERMINAR FORMA,
TAMAÑO Y AGRUPACION CELULAR........................................................19
PRACTICA # 7 REACCION DE KOH............................................................21
PRACTICA # 8 TINCION DE CAPSULA.......................................................22
PRACTICA # 9 OBSERVACION DE SINTOMAS CAUSADOS POR
FITOBACTERIAS........................................................................................23
BIBLIOGRAFIA...........................................................................................26
Laboratorio de fitopatología
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Laboratorio de fitopatología
INTRODUCCION
La vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de
enseñanza-aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que se
reproduce para el caso particular de la bacteriología.
Las bacterias fitopatógenas son organismos unicelulares, que poseen pared
celular pero carecen de una membrana que separe al núcleo del resto del citoplasma,
característica que las hace diferentes a los organismos eucarióticos.
El presente manual se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones
prácticas para que los estudiantes que estén cursando la materia de bacteriología, tengan
las herramientas básicas para trabajar en el manejo de bacterias en el laboratorio de
fitopatología. De tal manera que se incluyen los procedimientos empleados para el
análisis de muestras de vegetales en la identificación y/o detección de bacterias
fitopatógenas, también se incluyen los pasos a seguir en la esterilización del material a
utilizar por ejemplo cristalería y medios de cultivo, así como el manejo del material
vegetal para lograr aislar al agente causal, pruebas para evaluar su patogenicidad, su
identificación y caracterización, además se incluyen las diferentes fórmulas para la
elaboración de medios de cultivo y reactivos para tal fin.
Agradezco a los doctores José A. Quintero Benítez y Miguel A. Apodaca
Sánchez, que gracias a la gran experiencia de ambos, contribuyeron con sus comentarios
y sugerencias para la recopilación e integración de las prácticas del presente trabajo.
También expreso mi agradecimiento al profesor Marco A. Uribe Domínguez por su
valiosa colaboración en la organización y ordenamiento de la información de este
manual.
Siempre serán bienvenidas las críticas constructivas de colegas y de estudiantes
para actualizar de manera permanente el presente trabajo.
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Laboratorio de fitopatología
INSTRUCCIONES PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DE FITOPATOLOGIA
El laboratorio constituye un lugar de trabajo para la enseñanza y la
investigación. Los mayores peligros que presenta no lo son ni el fuego ni las descargas
eléctricas, sino el “descuido y la irresponsabilidad” de los usuarios.
Para la conservación y mejor servicio de los laboratorios de fitopatología, las
personas que deseen usarlo deberán apegarse a las siguientes disposiciones:
LIMPIEZA
Los materiales de desecho deberán depositarse en el recipiente de basura, no
dejarlos nunca sobre la mesa o tirarlos al suelo.
El material de vidrio que se use deberá llevarse inmediatamente al lavadero para
que el ayudante lo tenga limpio para su uso inmediato.
El material usado por los alumnos en actividades extra-clase, deberá ser lavado
por el mismo.
Cuando no se utilicen las mesas de trabajo, deberán permanecer libres de polvo
y de otros materiales: no dejar materiales innecesarios sobre ellas.
Cuando el caso lo amerite, se deberán cubrir el material (tubos, cajas de petri,
material vegetal, etc…) con un papel polietileno, indicando su nombre y la fecha en que
lo deja.
EL MATERIAL QUE NO REUNA ESTAS CONDICIONES, PODRA SER
DESECHADO POR EL AYUDANTE O ENCARGADO DE LIMPIEZA.
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PROBLEMAS Y CONTROVERSIAS RELATIVOS A LA IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS
Siempre es interesante observar que cualquier sistema de clasificación para un
grupo de organismos se reviste de una marcada artificialidad, ya que no pasa de ser una
tentativa del hombre para agrupar o disponer de manera ordenada y sistemática un
conjunto de elementos que, de por si, son variables, mutables heterogéneos en cuanto a
innumerables características.
Siendo así, una justa y perfecta caracterización de un elemento de ese conjunto
se torna a veces difícil y sujeto a muchas variaciones y errores. Por ejemplo, aspectos
como variaciones biológicas, equivocaciones cometidas en la realización de pruebas o
interpretación de sus resultados, todo esto dificulta aún más la identificación de un
elemento.
Al contrario de lo que sucede con las plantas y algunos microorganismos, sólo
el estudio de caracteres anatómico-morfológicos de la célula bacteriana no es suficiente
para la identificación de género o especie. Por esa razón, un conjunto complejo de
aspectos como fisiología, bacteriófagos, patogenicidad, etc.., debe ser examinado
cuando se pretende identificar un aislamiento bacteriano.
Cuando se trata de la identificación de las bacterias patógenas al hombre o a
animales, las pruebas bioquímicas constituyen el más importante y casi exclusivo
criterio para la identificación. Sin embargo, en el caso de las bacterias fitopatógenas,
aunque la patogenicidad sea uno de los principales criterios, muchos otros son
importantes y deben ser considerados, como pruebas bioquímicas, morfología celular,
aspectos de las colonias en determinados medios de cultivo, relación con el oxigeno
libre, medios selectivos, técnicas especiales, métodos de coloración, etc.
Ninguno de esos criterios tienen valor real si se emplean de manera aislada y
deben ser considerados en conjunto si se pretende tener seguridad en la identificación.
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PROGRAMA DE TRABAJO
PRACTICA # 1 ESTERILIZACION DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
El microbiólogo y el fitopatólogo necesitan frecuentemente trabajar con
materiales y equipos estériles, en el caso de medios de cultivo la esterilidad es obligada
antes de usarlos.
La esterilización es el proceso mediante el cual se obtienen sustancias o
materiales libres de organismos vivos. Los métodos de esterilización pueden ser
químicos o físicos. Entre los métodos físicos se encuentra el calor, las radiaciones y la
filtración. El método químico incluye el uso de gases o sustancias líquidas con
propiedades biocidas.
OBJETIVOS: Que el alumno comprenda el concepto de esterilización y aprenda a
utilizar los aparatos usados en el laboratorio para este fin.
PROCEDIMIENTO
ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO
1). Revise que el agua se encuentre al nivel de la rejilla basal.
2). Introducir el material a utilizar.
3). Cierre el recipiente correctamente.
4). Abra la válvula de escape para que salga el aire seco y encienda la olla de presión.
5). Un minuto después de que empieza a salir el aire y vapor, cierre la válvula de escape. El
tiempo de esterilización se empieza a contar hasta que la aguja alcance 15 libras/pulgada
cuadrada.
6). Mantenga el aparato de 15-20 libras durante el tiempo deseado, regulando la flama del
mechero.
7). Concluido el tiempo de esterilización, apague el aparato, espere a que baje a cero presión
antes de sacar con cuidado el material caliente.
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Laboratorio de fitopatología
ADVERTENCIA: nunca deje el aparato encendido sin vigilancia.
ESTERILIZACION CON CALOR SECO
1). Deposite el material seco y limpio en la estufa.
2). Cierre perfectamente y encienda el interruptor.
3). Ajuste el regulador a la temperatura deseada, cheque la temperatura con el termómetro y
cuente el tiempo de esterilización cuando se alcance la temperatura requerida (100-180 oC).
4). Concluido el tiempo de exposición, apague el aparato.
ADVERTENCIA: no saque cristales muy calientes de la estufa, pues al contacto con el aire
frío o caliente se revientan.
RESULTADOS Y DISCUSION
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PRACTICA # 2 ELABORACION DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboración de un
medio que proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su
reproducción, los cuales se les conoce como medios de cultivo.
Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de
carbono y nitrógeno, minerales y vitaminas.
Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los
medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos,
polisacáridos, ácidos e hidroxiácidos ya sean solos o en combinación.
En cuanto a las fuentes de nitrógeno también existe una gran diversidad.
1. Sales inorgánicas bien definidas, aminoácidos y péptidos.
2. Hidrolizados de proteína ya sea de origen animal o vegetal (soya, malta o
levadura).
Las vitaminas. Hasta la fecha se ha encontrado que las vitaminas requeridas para el
crecimiento de las bacterias, pertenecen al grupo B y se adicionan al medio de cultivo
ya sea como componentes individuales o como mezcla en la forma de extracto de
levadura.
Los minerales. Se requieren en cantidades muy pequeñas y en la mayoría de los casos,
vienen como contaminantes de otras sustancias.
Hoy en día existe una gran diversidad de medios de cultivo y el empleo de ellos
depende del tipo de microorganismo deseado y sobre todo de la disponibilidad de
reactivos.
De una manera general, los medios de cultivo, se pueden clasificar en cuanto a su:
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Consistencia, como:
1. Líquidos (caldo nutritivo).
2. Semisólidos.
3. Sólidos (PDA, CPG).
Función, como:
1. Aislamiento (PDA,CPG o Agar Nutritivo).
2. Diferenciales (B de King, CPG-CTZ).
3. Selectivos e inhibitorios (SX).
4. Enriquecimiento.
5. Caracterización.
6. Mantenimiento.
Medios líquidos. Son caldos nutritivos que se emplean cuando se requiere del
crecimiento abundante. Sin embargo, en ellos no se puede determinar si existe
contaminación con otro microorganismo.
Medios sólidos. Facilitan la separación de mezclas de microorganismos y básicamente
están compuestos de dos partes. Una base gelificante y los nutrientes. Para la base
gelificante se puede emplear gelatina, agar o sílical gel.
Medios para aislamiento. Los medios de cultivo para aislamiento deben favorecer el
crecimiento de cualquier tipo de microorganismo por lo que al prepararse deben
contener todos los constituyentes esenciales. Como por ejemplo el agar nutritivo, el cual
puede ser complementado extracto de lavadura, peptona y dextrosa para favorecer el
desarrollo de algunas bacterias.
Medios de enriquecimiento. Pueden ser tanto medios selectivos como inhibitorios pero
sin sustancias gelificantes, de tal manera que enriquezcan el crecimiento del
microorganismo deseado, un ejemplo de este tipo de medios puede ser el de Cristal
Violeta que favorece el desarrollo de bacterias pectolíticas.
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Laboratorio de fitopatología
Medios diferenciales. La adición de ciertos reactivos o compuestos químicos, dentro de
un medio, puede dar como resultado, cambios en el crecimiento de ciertos
microorganismos, lo cual permite una diferenciación entre algunas bacterias.
Medios selectivos e inhibitorios. La adición de ciertas sustancias químicas al agar
nutritivo, evita el crecimiento de un grupo de bacterias, sin inhibir el crecimiento de
otras. Por ejemplo el Cristal Violeta a una concentración específica previene el
crecimiento de bacterias gram positivas sin afectar a las gram negativas. En principio
una puede seleccionar bacterias que pueden crecer sobre un compuesto orgánico poco
usual.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a elaborar medios de cultivo para el
aislamiento de bacterias fitopatógenas.
AGAR NUTRITIVO
Agar nutritivo 23 g
Agua destilada 1000 ml
Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el líquido en dos matraces.
Esterilizar en autoclave a 115 lbs/pulgada cuadrada durante 15 minutos y vaciar en cajas
de Petri. Este medio generalmente se emplea para aislamientos de material vegetal. Es
un medio útil para el aislamiento de especies de Xanthomonas.
MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES (TTC)
Peptona 10 g
Caseína hidrolizada 1.0 g
Glucosa 5.0 g
Agar 12 g
Agua 1000 ml
Ajustar el pH a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una
temperatura de aproximadamente 45-50 0C adicionar solución acuosa de cloruro de
tetrazolio al 1.0% para dar una concentración final de 0.005%. Con este medio de
cultivo se pueden detectar las colonias virulentas y avirulentas de Ralstonia
solanacearum y P. s. p.v. phaseolicola. En el primer caso las colonias virulentas son
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Laboratorio de fitopatología
blancas, fluídas, con centro rojo y para la segunda bacteria las cepas virulentas forman
colonias rojas y las avirulentas son blancas.
MEDIO PARA LA PRODUCCION DE LEVANA
Extracto de carne 3 g
Peptona 10 g
Sacarosa 50 g
Agar 20 g
Agua 1000 ml
Disuelva los ingredientes, esterilice en la forma convencional y vacíe en cajas
esterilizadas.
MEDIO DE GELATINA
Extracto de carne 3.0 g
Peptona 5.0 g
Gelatina 120.0 g
Agua 1000 ml
La gelatina se adiciona al agua y se deja hidratar durante 15 a 30 minutos y luego se
calienta para disolver la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros
constituyentes. Ajustar el pH a 7, vaciar a tubos y esterilizar a 120 0C durante 20
minutos.
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Laboratorio de fitopatología
PRACTICA # 3 METODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS
INTRODUCCION
El cultivo puro, es una condición artificial en el crecimiento de bacterias bajo
condiciones de laboratorio. Para determinar las características de una especie bacteriana
en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en laboratorio
en cultivo puro. Existe una variedad de técnicas para el aislamiento y desarrollo de
bacterias como son: técnica de estría cruzada y la de vaciado en placa.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar las técnicas para el
aislamiento y obtención de cultivos puros de bacterias fitopatógenas.
PROCEDIMIENTO
Técnica de estría cruzada. Con el asa bacteriológica previamente flameada y enfriada,
se toma una gota de suspensión bacteriana del tubo de ensayo. Se procede a realizar un
estriado (4 o 5 “rayas”) en la caja de Petri . A partir de la ultima “raya” del estriado # 1,
se comienza a rayar el estriado # 2, esto se repite 4 ó 5 veces cuidando de no tocar mas
que la ultima raya del estriado anterior. Todo esto se realiza en el microboy previamente
desinfectado y con la ayuda de una lámpara de alcohol. Al terminar se sellan las cajas y
se incuban a 28 grados centígrados Durante 24-48 hrs.
Técnica de vaciado en placa. Para lograr tener colonias separadas por esta técnica,
primeramente se debe hacer una suspensión (que se puede lograr al suspender el
material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo líquido). De esta
suspensión se toma una gota ó 0.5 ml y se transfieren a otro tubo ó matraz con medio de
cultivo con agar líquido. Esta operación se repite 2 ó 3 veces más, teniendo cuidado de
agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente después de cada
dilución, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja Petri estéril y
después del periodo de incubación se obtendrán colonias separadas.
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AISLAMIENTO Y PURIFICACION
Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de
una enfermedad, es aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo
esta etapa existen diferentes metodologías y la elección de cualquiera de ellas dependerá
del tipo de síntoma, órgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y
equipo disponibles. Entre las técnicas de aislamiento más comunes, se encuentran las
siguientes:
AISLAMIENTO DIRECTO
(Para muestras con marchitez)
PROCEDIMIENTO
1. Con una navaja flameada y enfriada, haga un corte transversal al tallo que
presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo.
2. Haga una ligera presión y espere unos segundos para que de los haces
vasculares salga un exudado bacteriano.
3. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiéralo a
un tubo con agua destilada estéril.
4. Agite el tubo para homogeneizar.
5. Con el asa flameada tome una gota de la suspensión y siembre una caja con
medio de cultivo por el método de estría cruzada.
6. Incube a 28 0C por 24-48 horas.
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INMERSION DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL
(Para muestras con manchas o tizones)
PROCEDIMIENTO
1. Al microscopio estereoscópico observe los tejidos afectados, para detectar la
presencia de exudados, escamas bacterianas, micelio u otras estructuras
fungosas.
2. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparación en fresco y observe
al microscopio compuesto.
3. Si en estas preparaciones observa únicamente células bacterianas, esto le indica
que el síntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo
más seguro es que el síntoma sea ocasionado por un hongo.
4. Seleccione tejido enfermo y lávelo con agua estéril.
5. Corte pequeños trocitos y desinféctelos con una solución de hipoclorito de sodio
al 1% durante 1 a 2 minutos.
6. Decante el hipoclorito de sodio y lave 3 veces con agua esterilizada.
7. Una vez transcurridos los 5 ó 10 minutos, tome una gota de la suspensión con el
asa bacteriológica y siembre con estría cruzada una caja con medio de cultivo.
8. Después del periodo de incubación seleccione las colonias bacterianas que se
asemejen a las del agente causal, y siémbrelas una nueva caja con medio de
cultivo para obtener así, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de
patogenicidad.
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INMERSION DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL
(Muestra con sobrecrecimiento)
PROCEDIMIENTO
1. Con un cepillo pequeño y cerdas suaves lave al chorro del agua la agalla o tejido
con fasciación y luego haga unas fracciones.
2. Coloque los cortes en un tubo con 3 ml de agua destilada estéril y manténgalos
así durante unos 10-20 minutos.
3. Pase 3 asadas de la suspensión anterior a otro tubo con 3 ml de agua estéril.
4. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estría cruzada.
5. Incube a 22-28 0C durante 2-4 días.
6. Seleccione las colonias bacterianas con características del posible patógeno y
transfiera a las otras cajas con medio de cultivo.
NOTA: Cuando el síntoma se sospecha, ser causado por Agrobacterium, las
colonias se hacen visibles a las 36-48 horas.
RESULTADOS Y DISCUSION
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PRACTICA # 4 PRUEBAS DE PATOGENICIDAD
INTRODUCCION
Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es traída al
laboratorio, se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo según la técnica
usual. No obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela,
pues: a) las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprófitas, por
lo que la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) aparecen en la caja,
colonias de bacterias patogénicas y saprófitas las cuales no se diferencian por su
aspecto. c) las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patogénica, se presentan
avirulentas o perdieron por alguna razón, la patogenicidad.
La demostración de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un
procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los síntomas
típicos de la enfermedad en a planta homóloga. En la mayoría de las ocasiones no
siempre se dispone de este material, siendo más difícil, aún, cuando se tratan de árboles
o plantas que no se encuentran en la región.
Existen pruebas de patogenicidad como la reacción de hipersensibilidad,
pudrición del tubérculo de papa, inoculación a frutos verdes de peral o manzano las
cuales se describen a continuación.
OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar pruebas de patogenicidad de bacterias
fitopatógenas.
REACCION DE HIPERSENSIBILIDAD
La reacción de hipersensibilidad es una prueba muy útil dentro de la
fitobacteriología, porque con ella se puede determinar fácil y rápidamente si una
bacteria es o no es fitopatógena, sobre todo para aquellas bacterias aisladas de muestras
con manchas foliares y tizones, aunque tambien algunas que causan pudriciones pueden
dar la reacción positiva. Esta prueba, también es útil en la identificación de especies de
Pseudomonas del grupo fluorescente.
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PROCEDIMIENTO
Para llevar a cabo esta esta prueba, primeramente se prepara una suspensión
bacteriana con 107 UFC/ml y por medio de una jeringa esterilizada, se infiltra a los
espacios intercelulares de una hoja de tabaco (Nicotiana tabacum) ya sea a través de la
nervadura central o de la lámina foliar.
Las plantas tratadas se mantienen a temperatura ambiente (26-30 0C). Si dentro
de las 24 horas posteriores a la inoculación, la zona infiltrada presenta pérdida de
turgencia o necrosis, la prueba se considera positiva.
PUDRICION DEL TUBERCULO DE PAPA
Para bacterias aisladas de órganos con pudrición, la patogenicidad se puede
valorar con la prueba de pudrición del tubérculo de papa y los resultados se pueden
observar a las 24 horas de haberse realizado.
PROCEDIMIENTO
Un tubérculo de papa de preferencia de la variedad Alpha, se lava, se seca y se
desinfecta superficialmente, bañándolo con etanol al 70%, seguido de un flameado
(evite adicionar mucho alcohol porque al quemarse podrá dañar las capas externas del
tubérculo y se correrá el riesgo de contaminación por bacterias esporuladas como
Bacillus spp. De estos tubérculos se cortan rebanadas de 5mm de grosor y se colocan en
cajas de Petri con papel filtro (previamente esterilizado) se pueden acomodar dos
rebanadas por caja y una de ellas servirá de testigo.
A cada una de las rebanadas se les hace una insición superficial y solo en una de
ellas se pone crecimiento de la bacteria a probar. Finalmente se le adicionan unos 2-3
mm de agua estéril solo para humedecer el papel y crear un ambiente húmedo, se
incuban a 28 0C durante 24-72 horas.
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Laboratorio de fitopatología
A partir de las primeras 24 horas, se palpa el tejido de cada una de las rebanadas
y si la que ha sido inoculada, se siente blanda, indica que la bacteria probada sintetiza
enzimas pectolíticas y es muy probable que sea el agente causal de la pudrición. Al
igual que la prueba anterior, también sirve para diferenciar especies y patovares de
Pseudomonas fluorescentes.
RESULTADOS Y DISCUSION
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Laboratorio de fitopatología
PRACTICA # 5 METODOS DE CARACTERIZACION E IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS
Un prerrequisito indispensable para el control de las enfermedades bacterianas,
es la identificación exacta de ellas. La mayoría de las bacterias que afectan a las plantas
se pueden identificar fácilmente en nivel de género, pero las especies o patovares son
más difíciles de determinar.
Actualmente existen métodos muy sofisticados para la identificación que
incluyen la determinación de la composición y homología del DNA, PCR, la
Taxonomía Numérica los cuales no se pueden realizar para todas las fitobacterias, por lo
que aún se recurre a otras pruebas más sencillas como la determinación de las
características culturales, fisiológicas o bioquímicas así como también a las serológicas
(ELISA).
OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de diferenciar e identificar las bacterias
fitopatógenas a través de la morfología colonial en medios de cultivo.
MORFOLOGIA COLONIAL
El aspecto general del crecimiento bacteriano en medio de cultivo, con
frecuencia nos da una idea acerca de su identidad, por esto es conveniente tomar muy en
cuenta las características de las colonias bacterianas, sobre todo al realizar aislamientos
de patógenos a partir de material enfermo; que de esta manera se pueden descartar todas
aquellas colonias que no presenten las características del patógeno o patogenos
esperados.
Agrobacterium. Colonias blancas circulares y convexas cuya consistencia tiende a
mucoide, de borde liso y al envejecer presentan estriaciones.
Clavibacter. Colonias pequeñas de crecimiento lento, mucoides, convexas de color
amarillo al naranja incluso rosas o rojas.
Erwinia. Colonias blancas, blanco grisáceas, circulares y su consistencia varía de
humeda a mucoide, circulares convexas o pulvinadas. Su diámetro puede oscilar entre
2-5 mm.
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Laboratorio de fitopatología
Pseudomonas. Colonias blanco grisáceo, transparentes o blanco lechoso y opacas,
pueden o no producir pigmentos verde fluorescente difusibles al medio.
Xanthomonas. Colonias amarillo huevo, (aunque puede haber blancas como X.
albilineans), pulvinadas brillantes y de consistencia mucoide, su diámetro oscila entre
1-5 mm).
Pantoea. Colonias amarillo pálido, translucidas de consistencia húmeda, elevación
convexa y bordes lisos.
Ralstonia. Colonias blancas y en las primeras horas de incubación son convexas y
conforme pasa el tiempo se hacen fluidas, no producen pigmento fluorescente en el
medio B de King.
Acidovorax. Colonias blancas, convexas y consistencia húmeda, no producen
fluorescencia en medio BK.
Entre las características de morfología colonial que se toman en cuenta están:
I. El color
II. Tamaño
III. Forma
a) Punteada
b) Circular
c) Filamentosa
d) Irregular
e) Rizoide
IV. Borde
a) Liso
b) Desgastado
c) Ondulado
d) Filamentoso
e) Estriado
V Elevación
a) Plana
b) Elevada
c) Convexa
d) Pulvinada
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Laboratorio de fitopatología
e) Umbilicada
VI Aspecto o consistenca
a) Seco. Cuando al tocarla con el asa se desmorona como si fuera gis.
b) Húmedo. Fácilmente se separa del medio de cultivo.
c) Mucoide. Se levanta un hilo al tocarla con el asa y a veces es difícil
desprenderla del medio de cultivo
VII Características a la luz
1. Luz reflejada
a) Brillante, si refleja a la luz
b) Mate, cuando no refleja luz
2. Luz transmitida
a) Translucida al dejar pasar la luz
b) Opaca, si no deja pasar la luz.
CARACTERISTICAS DE LA MORFOLOGIA CELULAR
Entre las principales características de las células bacterianas se encuentran su
tamaño, forma, arreglo y estructuras, las cuales constituyen la morfología de la célula.
Dependiendo de la especie en particular, las células individuales pueden ser: Esféricas,
con un diámetro aproximado de 1-2µ. Otras bacterias, más alargadas, son los bacilos y
pueden observarse muy delgados o gruesos, cortos o largos y curvos. Estos organismos
también pueden presentar agrupaciones como: bacilos aislados, en pares o en cadenas,
unidos en empalizada o en manojos. Por último algunas bacterias son espiralazas, como
sucede con los espirilos, espiroquetas y treponemas. Es importante reconocer estos
patrones porque son características de grupo taxonómico; por ejemplo las bacterias
fitopatógenas, solo presentan la forma de bacilo.
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PRACTICA # 6 TECNICAS DE TINCION PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACION CELULAR
INTRODUCCION
Como las células bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de
colorantes para hacerlas más nítidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear
técnicas de coloración simples o diferenciales.
OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a utilizar los reactivos para llevar a cabo las
distintas técnicas de coloración de bacterias.
Tinción simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos más valiosos
que se tienen para la tinción de bacterias. Es excelente para las bacterias del género
Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los gránulos. En los bacilos
esporulados (Bacillus), teñidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no
teñidos dentro de células azules.
PROCEDIMIENTO
1. Con el cultivo bacteriano prepare un frotis.
2. Fije al aire.
3. Tiña con azul de metileno de Loeffler durante 1 min.
4. Lave con agua.
5. Escurra y secar.
6. Observe al microscopio.
Tinción diferencial. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas es la “Tinción de
Gram”, porque no solo permite determinar la forma y agrupación de las bacterias, sino
también es de considerable valor en la identificación y clasificación, al separar a las
bacterias en gram negativas y gram positivas.
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Laboratorio de fitopatología
PROCEDIMIENTO
1. En un portaobjetos limpio y desengrasado haga un frotis, séquelo
y fíjelo a la flama.
2. Adicione a inundar la solución de cristal violeta y deje actuar por
1 minuto
3. Decante el colorante y adicione la solución de lugol durante 1
minuto.
4. Decante el lugol.
5. Decolore con etanol, hasta que no salga más colorante.
6. Lave al chorro del agua.
7. Adicione solución de safranina y déjela actuar durante 30
segundos.
8. Decante el colorante y lave con agua.
9. Deje secar al aire y observe al microscopio.
Las bacterias que retienen el primer colorante o sea el cristal violeta se tiñen de morado
y se consideran como gram positivas y las que son decoloradas por el alcohol y
adquieren la coloración roja o parda según el colorante de contraste empleado, son gram
negativas.
RESULTADOS Y DISCUSION
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Laboratorio de fitopatología
PRACTICA # 7 REACCION DE KOH
INTRODUCCION
La determinación del gram de las bacterias, también se puede realizar de una
forma más rápida y sencilla, empleando únicamente solución acuosa de KOH al 3%, la
cual resulta ser una prueba rápida y muy sencilla en la que no influye la edad del cultivo
con los resultados como sucede con la tinción de Gram y el procedimiento es como
sigue:
Objetivos: Que el alumno conozca y aprenda a realizar la prueba de reacción de KOH,
para diferenciar a las bacterias gram negativas de las gram positivas.
PROCEDIMIENTO
1. En un portaobjetos limpio coloque una gota de KOH.
2. Del cultivo bacteriano puro, tome una asada.
3. Mezcle el cultivo con el hidróxido durante unos segundos y
levante lentamente el asa.
4. Si se forma un hilo, la reacción se considera positiva y significa
que la bacteria pertenece al grupo de las gram negativas. Por el
contrario si después de unos minutos no se forma el hilo, la
bacteria es un miembro de las gram positivas.
RESULTADOS Y DISCUSION
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PRACTICA # 8 TINCION DE CAPSULA
INTRODUCCION
La cápsula es una capa gelatinosa y mucoide cuyo espesor puede ser escaso o
por el contrario, importante, hasta el punto de duplicar el volumen de la bacteria. Este
material no solamente no existe en todas las bacterias, sino que en las especies
capsuladas puede no estar siempre presente. Su desarrollo se favorece cuando la
bacteria se cultiva en medios con alto contenido de carbohidratos o cuando se multiplica
dentro del hospedante.
OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de utilizar los reactivos para la coloración de la
cápsula bacteriana y mejorar su observación al microscopio.
PROCEDIMIENTO
1. Se hace un frotis de la bacteria y se fija al aire.
2. La laminilla se cubre con fuccina fenicada fuerte y se calienta ligeramente
durante 1 minuto.
3. El frotis se lava rápidamente con etanol, y después se lava perfectamente con
agua.
4. Se cubre con el mordente de Muir durante 30 seg.
5. Lave con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos ó hasta que el
frotis tome un color rojo pálido.
6. Lave perfectamente con agua.
7. Tiña con azul de metileno de Loeffler durante 30 segundos.
8. Lave con agua y deje secar.
9. Observe al microscopio compuesto, las bacterias se tiñen de rojo y las capsulas
de azul.
RESULTADOS Y DISCUSION
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PRACTICA # 9 OBSERVACION DE SINTOMAS CAUSADOS POR FITOBACTERIAS
INTRODUCCION
Las bacterias fitopatógenas ocasionan el desarrollo de casi tantos tipos de
síntomas en las plantas que infectan como los que producen los hongos. Producen
manchas y tizones foliares, pudriciones blandas de frutos, raíces y órganos
almacenados, marchitamientos, crecimientos excesivos, sarnas, cancros etc. Cualquiera
de estos tipos de síntomas puede ser producido por las bacterias patógenas de varios
géneros y cada género contiene algunos patógenos capaces de producir diferentes tipos
de enfermedades. Sin embargo, las especies de Agrobacterium, sólo producen
crecimientos excesivos o proliferación de los órganos. Por otra parte, los crecimientos
excesivos también pueden ser producidos por ciertas especies de Corynebacterium y
Pseudomonas. Asimismo, las dos especies fitopatógenas de Streptomyces, sólo
producen sarnas o lesiones en los órganos subterráneos de las plantas. Las especies de
Rhizobium inducen la formación de nódulos en las raíces de las leguminosas.
OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de diferenciar la sintomatología de
enfermedades de importancia en plantas causadas por bacterias.
Los síntomas pueden indicar la existencia de una enfermedad, pero ellos no son
en sí la enfermedad, estos son utilizados como guías para diagnosticar la naturaleza o
causa de una enfermedad en particular. Entre las enfermedades bacterianas encontramos
variados tipos de síntomas, los cuales son divididos en cuatro categorías:
1.- Cambios de color.- Alteraciones presentes en los plastidios, vacuolas o
cloroplastos dando como consecuencia:
Clorosis: Retardamiento o disminución de la clorofila por anormalidades en
los cloroplastos.
Amarillamiento. Disminución de clorofila e incremento de carotenos y
xantofilas.
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Antocianocencia: coloración púrpura como resultado del incremento del
pigmento antocianina.
2.- desintegración de tejidos: Son ocasionados por la acción enzimática o toxinas
que producen los patógenos sobre la pared del hospedante y/o afectando el protoplasma
celular.
Pudrición: áreas muertas debido a la maceración de tejidos con presencia de
exudados bacterianos. Esta pudrición puede ser de consistencia seca o
húmeda.
Cancro: Necrosis restringida en los tejidos corticales de tallos y raíz con
crecimiento secundario, usualmente delimitado por tejido sano.
Necrosis: Áreas donde las células sufren primeramente plasmólisis, colapso
y la muerte. En ocasiones éstas áreas presentan una coloración oscura o
castaña debido a la producción de melaninas.
Tizón: Desintegración rápida de los tejidos seguida por la muerte celular,
esta puede ser parcial o total del hospedante (producción de toxinas) también
definida como lesiones de crecimiento indeterminado.
Mancha: Necrosis localizada en cualquier parte de la planta.
3.- Desarrollo anormal del crecimiento: Ocasionado por alteraciones en las
sustancias reguladoras del crecimiento ya sea aumentando o disminuyendo su
concentración.
Agalla: desarrollo anormal donde las células dañadas sufren el fenómeno de
Hiperplasia (multiplicación excesiva de las células) o Hipertrofia (aumento
de tamaño de las células).
Fasciación: proliferación excesiva de brotes como consecuencia de la
Hipoplasia (poca división celular), presentándose la planta como arrosetada.
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4.- Daños al sistema vascular
Marchitez: Flacidez o pérdida de turgencia de la planta debido al
taponamiento de los vasos que conforman este sistema, ya sea por
estructuras del patógeno, sustancias que las bacterias producen o estructura
del tejido vegetal.
PROCEDIMIENTO
1. Identificar los distintos tipos de síntomas ya señalados, usando para ello las
muestras de material vegetal enfermo que le proporcione el instructor.
2. Describir en forma sencilla al menos un tipo de síntoma característico de cada
enfermedad. En cada caso, indique el patógeno y el nombre común de la
enfermedad. Por ultimo señalar como diferenciar síntomas de enfermedades
causadas por bacterias y hongos y discutir que tan confiable resulta la
identificación de las enfermedades en base a la observación de síntomas.
RESULTADOS Y DISCUSION
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BIBLIOGRAFIA
Agrios, G. N. 2007. Fitopatología. LIMUSA Wiley, México. pp 540-541
Bauer, L. I. 1984. Fitopatología. LIMUSA. Colegio de Postgraduados
Diversos manuales de bacteriología
Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas”
INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados
Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas.
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad
Autónoma de Chapingo.
http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/docs/cursos/fitopato/materiales/
teoricos2007/lecturaBac07.pdf
http://www.sociedadmexicanadefitopatologia.com.mx/
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