UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

MORANA MALNAR

(BUDANOVIĆ)

MAGISTRSKA NALOGA

Magistrski študij laboratorijske biomedicine

Ljubljana, 2015

Fakulteta za farmacijo

MORANA MALNAR

(BUDANOVIĆ)

VREDNOTENJE UJEMANJA REZULTATOV

ELEKTROKEMILUMINISCENČNE METODE IN

ENCIMSKO IMUNSKE METODE Z MIKRODELCI PRI

DOLOČANJU GONADOTROPNIH HORMONOV IN

PROLAKTINA

EVALUATION OF THE AGREEMENT BETWEEN THE

RESULTS OF ELECTROCHEMILUMINESCENCE

IMMUNOASSAY AND MICROPARTICLE ENZYME

IMMUNOASSAY METHOD AIMED AT DETERMINING

GONADOTROPINS AND PROLACTIN

MAGISTRSKA NALOGA

Magistrski študij laboratorijske biomedicine

I

Magistrsko nalogo sem opravlila v laboratoriju Zdravstvenega doma dr. Franca Ambrožiča

v Postojni pod mentorstvom izr. prof. dr. Iztoka Grabnarja, mag. farm., in somentorstvom

Valentine Bude, spec. med. biokem.

ZAHVALA

Zahvaljujem se izjemnemu mentorju in odličnemu izr. prof. dr. Iztoku Grabnarju za

strokovno vodenje, motivacijo in nasvete pri ustvarjanju magistrske naloge. Zahvala gre

tudi somentorici, spec. med. biokem. Valentini Buda, saj mi je omogočila izvedbo

praktičnega dela naloge in mi s svojimi strokovnimi nasveti pomagala pri izbiri teme

naloge in ustrezne strokovne literature. Hvala tudi optimističnemu in skrbnemu kolektivu

laboratorija Zdravstvenega doma dr. Franca Ambrožiča, posebej sodelavki Katarini

Vukadinović za pomoč pri zbiranju testnih vzorcev in vso podporo in vzpodbudo. Iskrena

hvala tudi prijateljici Aniti Brčaninović za pomoč in skrb pri izdelavi naloge. Posebej se

zahvaljujem svojim najbližjim, ki so mi pomagali priti do cilja:

očetu Radomiru in materi Mariji, ki sta me naučila največjih vrednot in principov, ki me

vodijo skozi življenje, ter mi s svojo požrtvovalnostjo omogočila brezskrben študij;

možu Danijelu, ki je moja podpora in najboljši življenjski sopotnik, hvala za nesebičnost,

motivacijo, razumevanje in strpnost, ki jo je imel tekom mojega študija;

sestri Maji, ki me je s svojim optimizmom, vztrajnostjo in uspehi motivirala, da uresničim

svoje cilje;

bratu Krešimiru, ker je med mojim študijem mislil name, ne misleč na sebe.

Velika zahvala gre tudi dedku Krešimiru, s katerim sem se med opazovanjem in vpijanjem

sveta okrog sebe učila prvih črk in številk ter se navdušila za naravoslovne in medicinske

vede;

tastu Ivanu in tašči Aniti, saj se veselita mojih uspehov in mi jih pomagata uresničiti.

Hvala vsem prijateljem in kolegom za nepozabna druženja in lepe spomine tekom študija.

Hvala profesorjem, ki so me usmerjali med šolanjem in mi pomagali najti in uresničiti

svoje potenciale.

II

IZJAVA

Izjavljam, da sem magistrsko nalogo z naslovom Vrednotenje ujemanja rezultatov

elektrokemiluminiscenčne metode in encimsko imunske metode z mikrodelci pri določanju

gonadotropnih hormonov in prolaktina samostojno izdelala pod mentorstvom izr. prof. dr.

Iztoka Grabnarja, mag. farm., in somentorstvom Valentine Bude, spec. med. biokem.

Podpis:

Nalogo je lektorirala Maša Rolih, uni. dipl. slovenistka.

Predsednik komisije: izr. prof. dr. Darko Černe

Mentor: izr. prof. dr. Iztok Grabnar

Somentorica: Valentina Buda, spec. med. biokem.

Član: doc. dr. Žiga Jakopin

III

KAZALO VSEBINE

1. UVOD ----------------------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1 Spolni hormoni --------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1.1 Estrogeni ----------------------------------------------------------------------------------- 1

1.1.2 Gestageni ----------------------------------------------------------------------------------- 2

1.1.3 Androgeni ---------------------------------------------------------------------------------- 2

1.2 Gonadotropna hormona in prolaktin -------------------------------------------------------- 3

1.2.1 Fsh------------------------------------------------------------------------------------------- 3

1.2.2 Lh -------------------------------------------------------------------------------------------- 3

1.2.3 Prolaktin ------------------------------------------------------------------------------------ 4

1.3 Ženski spolni cikel ----------------------------------------------------------------------------- 4

1.3.1 Ovarijski cikel ----------------------------------------------------------------------------- 5

1.3.2 Endometrijski cikel ----------------------------------------------------------------------- 6

1.4 Motnje menstrualnega cikla ------------------------------------------------------------------ 7

1.5 Diagnostika in zdravljenje -------------------------------------------------------------------- 8

1.6 Metode določanja hormonov ---------------------------------------------------------------- 11

1.6.1 MEIA (Microparticle Enzyme ImmunoAssay) metoda ---------------------------- 13

1.6.2 ECLIA (ElectroChemiLuminescence ImmunoAssay) metoda --------------------- 13

2. NAMEN DELA ----------------------------------------------------------------------------------- 16

3. METODE ------------------------------------------------------------------------------------------- 17

3.1 Testni vzorci ----------------------------------------------------------------------------------- 17

3.2 Merilni instrumenti in reagenti -------------------------------------------------------------- 17

3.2.1 Imunološki analizator Axsym ---------------------------------------------------------- 17

3.2.1.1 Princip merjenja Fsh, Lh in Prl -------------------------------------------------- 18

3.2.1.2 Reagenti in dodaten material ------------------------------------------------------ 19

3.2.1.3 Kalibracijski material --------------------------------------------------------------- 20

3.2.1.4 Kontrolni material ------------------------------------------------------------------ 21

3.2.1.5 Rezultati in merilna območja ------------------------------------------------------ 22

3.2.1.6 Referenčne vrednosti --------------------------------------------------------------- 22

IV

3.2.2.1 Princip merjenja Fsh, Lh in Prl -------------------------------------------------- 24

3.2.2.2 Reagenti in dodaten material ----------------------------------------------------- 25

3.2.2.3 Kalibracijski material -------------------------------------------------------------- 27

3.2.2.4 Kontrolni material ------------------------------------------------------------------ 28

3.2.2.5 Rezultati in merilna območja ------------------------------------------------------ 29

3.2.2.6 Referenčne vrednosti --------------------------------------------------------------- 29

3.3 Verifikacija ECLIA metode ----------------------------------------------------------------- 31

3.4 Statistične metode za vrednotenje ujemanja rezultatov dveh različnih analitskih

metod ------------------------------------------------------------------------------------------------- 33

3.4.1 Popolno ujemanje rezultatov ----------------------------------------------------------- 34

3.4.2 Korelacija in linearna regresija -------------------------------------------------------- 34

3.5 Metoda Blanda in Altmana: diagram razlik ------------------------------------------------ 35

3.6 Metoda Krouwerja in Montija: gorski diagram ------------------------------------------- 37

4.1 Rezultati verifikacije ECLIA metode ------------------------------------------------------- 39

4.2 Vrednotenje ujemanja rezultatov z Bland-Altman metodo ----------------------------- 44

4.3 Vrednotenje ujemanja rezultatov s Krouwer-Montijevo metodo ---------------------- 48

5. RAZPRAVA --------------------------------------------------------------------------------------- 52

6. SKLEPI ---------------------------------------------------------------------------------------------- 63

7. LITERATURA ------------------------------------------------------------------------------------- 65

V

KAZALO SLIK

Slika 1: Hormonsko testiranje amenorej ----------------------------------------------------------- 10

Slika 2: Potek MEIA testa --------------------------------------------------------------------------- 15

Slika 3: ECLIA metoda – reakcija imunskega kompleksa z mikrodelcem ------------------- 15

Slika 4: Imunološki analizator Axsym, Abbott Diagnostics ------------------------------------ 18

Slika 5: Imunološki analizator Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH --------------------- 24

Slika 6: Fsh diagram razlik -------------------------------------------------------------------------- 45

Slika 7: Fsh diagram razlik (%) --------------------------------------------------------------------- 45

Slika 8: Lh diagram razlik --------------------------------------------------------------------------- 46

Slika 9: Lh diagram razlik (%) ---------------------------------------------------------------------- 47

Slika 10: Prl diagram razlik-------------------------------------------------------------------------- 47

Slika 11: Prl diagram razlik (%) -------------------------------------------------------------------- 48

Slika 12: Fsh gorski diagram ------------------------------------------------------------------------ 49

Slika 13: Lh gorski diagram ------------------------------------------------------------------------- 50

Slika 14: Prl gorski diagram ------------------------------------------------------------------------- 51

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I: Bolezni in motnje pri katerih se določajo vrednosti gonadotropinov in Prl 11

Preglednica II: Dodatni material, reagenti in raztopine, ki so potrebne za določanje Fsh,

Lh in Prl na analizatorju Axsym -------------------------------------------------------------------- 20

Preglednica III: Referenčne vrednosti: Fsh , Axsym System, Abbott Diagnostics -------- 23

Preglednica IV: Referenčne vrednosti vrednosti: Lh , Axsym System, Abbott, Diagnostics

----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 23

Preglednica V: Referenčne vrednosti vrednosti: Lh , Axsym System, Abbott, Diagnostics

----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 24

Preglednica VI: Dodaten material in raztopine, ki smo jih uporabili za določanje Fsh, Lh

in Prl na Cobasu e 411-------------------------------------------------------------------------------- 26

Preglednica VII: Referenčne vrednosti: Fsh , Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH --- 29

Preglednica VIII: Referenčne vrednosti :Lh , Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH --- 30

Preglednica IX: Referenčne vrednosti: Prl, Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH ------ 30

VI

Preglednica X: Rezultati natančnosti za Fsh in Lh, proizvajalca Roche Diagnostics GmbH

----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 31

Preglednica XI: Rezultati natančnosti za Prl, proizvajalca Roche Diagnostics GmbH ---- 32

Preglednica XII: Izračun kvantilov (centilov/percentilov) in prepognjenih percentilinih

vrednosti ------------------------------------------------------------------------------------------------ 38

Preglednica XIII: Izračun mediane in 5./95. percentila ----------------------------------------- 39

Preglednica XIV: Rezultati vrednotenja natančnosti metode ECLIA ------------------------ 41

Preglednica XV: Rezultati vrednotenja točnosti metode ECLIA------------------------------ 43

KAZALO ENAČB

Enačba 1: Izračun relativne napake (29) ----------------------------------------------------------- 33

Enačba 2: Klasični model merjenja (32) ----------------------------------------------------------- 34

Enačba 3: Pearsonov korelacijski koeficient (32) ------------------------------------------------ 35

Enačba 4: Linearna regresija (32) ------------------------------------------------------------------ 35

Enačba 5: Izračun 95-odstotnih meja ujemanja (IU) pri normalni porazdelitvi napak (32) 36

Enačba 6: Izračun 95-odstotnih meja zaupanja (IZ) pri normalni porazdelitvi napak (32) 36

SEZNAM OKRAJŠAV

A androstendion

Ab protitelo (ang. antibody)

Ag antigen

Ab-Ag kompleks protitelo-antigen

AMP adenozin monofosfat

BMI indeks telesne mase (ang. body mass index)

bpy bipiridil (ang. bipyridyl)

β sistematična napaka merjenja

C ciljna vrednost

C-19 ciklopentanoperhidrofenantren

CK-MB izoencim MB kreatin kinaze (ang. creatine kinase–myocardial band)

CLSI Inštitut za klinične in laboratorijske standarde (ang. Clinical and

Laboratory Standards Institute)

CV koeficient variacije (ang. coefficient of variation)

DHEA dehidroepiandrosteron

VII

DHEA-S dehidroepiandrosteron-sulfat

DNA deoksiribonukleinska kislina (ang. deoxyribonucleic acid)

E absolutna napaka merjenja

ECL elektrokemiluminiscenca (ang. electrochemiluminescence)

ECLIA elektrokemiluminiscenčni imunski test

(ang. electrochemiluminescence immunoassay)

ELISA encimsko imunoabsorpcijski test

(ang. enzyme-linked immunosorbent assay)

EMIT homologni encimsko imunski test

(ang. enzyme-multiplied immunoassay technique)

ERα estrogenski receptor alfa

ERβ estrogenski receptor beta

ε slučajna napaka merjenja

FIA imunofluorescenčni test (ang. fluorescence immunoassay)

FPIA polarizacijski imunofluorescenčni test

(ang. fluorescence polarization immunoassay)

Fsh folikle stimulirajoči hormon

FT3 prosti trijodtironin (ang. free triiodothyronine)

GnRH gonadotropin sproščujoč hormon

H visok (ang. high)

Hb hemoglobin

hCG humani horionski gonadotropin (ang. human chorionic gonadotropin)

125I radioizotop joda

IgA imunoglobulin razreda A

IgG imunoglobulin razreda G

IgM imunoglobulin razreda M

IRMA imunoradiometrijski test (ang. immunoradiometric assay)

IRP International reference preparation

IS mednarodni standardi (ang. International Standards)

IU interval ujemanja/meji ujemanja

IZ interval zaupanja/meji zaupanja

kD kiloDalton

K3EDTA trikalijeva etilendiamintetraoctena kislina

VIII

KV koeficient variacije

L nizek (ang. low)

Lh luteinizirajoči hormon

LIA luminometrični imunski test(ang. luminometric immunoassay)

LIF luteinizacija-zavirajoči faktor (ang. luteinization inhibiting factor)

M srednji (ang. medium)

MEIA encimsko imunski test z mikrodelci

(ang. microparticle enzyme immunoassay)

MES buffer 2-(N-morfolino) etansulfonska kislina

MR magnetna resonanca

MS Microsoft

MU metilumbeliferon

MUP metilumbeliferil fosfat

NIBSC Nacionalni inštitut za biološke standarde in kontrole

(ang. National Institute for Biological Standards and Control)

O/x izmerjena vrednost

17-OH progesteron 17-hidroksi progesteron

PC U1 PreciControl Universal 1

PC U2 PreciControl Universal 2

povp. vr. povprečna vrednost

Prl prolaktin

Pt-Ag kompleks protitelo-antigen

Pth paratiroidni hormon (ang. parathyroid hormone)

R referenčna/sprejeta vrednost

RE relativna napaka (ang. relative error)

RIA radioimunski test (ang. radioimmuno assay)

RTG rentgen

SD standardna deviacija/standardni odklon (ang. standard deviation)

SHBG spolne hormone vezoči globulin (ang. sex hormone binding globulin)

T3 trijodtironin (ang. triiodothyronine)

TEAH tetraetil amonijev hidroksid

TPA tripropilamin

Tsh ščitnica spodbujajoči hormon (ang. thyroid stimulating hormone)

IX

WHO Svetovna zdravstvena organizacija

(ang. The World Health Organization)

aritmetična sredina/povprečje

ZD Zdravstveni dom

ZDM Zdravstveni dom Maribor

X

POVZETEK

V laboratoriju Zdravstvenega doma dr. Franca Ambrožiča v Postojni smo zamenjali

zastareli imunološki analizator Axsym z novim analizatorjem Cobas e 411. Analizatorja se

uporabljata tudi za merjenje serumske koncentracije hormonov, ki uravnavajo ženski

spolni cikel: folikel stimulacijskega hormona (Fsh), luteinizirajočega hormona (Lh) in

prolaktina (Prl). Te so pomembne v večstopenjski diagnostiki motenj ženskega spolnega

cikla. Ker analizatorja uporabljata različni metodi merjenja analitov (Axsym- encimsko

imunsko metodo z mikrodelci (MEIA), Cobas e 411- elektrokemiluminiscenčno metodo

(ECLIA)), smo želeli ugotoviti, kako se ujemajo izmerjene vrednosti. Za analizo ujemanja

meritev smo določili koncentracijo Fsh v 37 vzorcih, Lh v 42 in Prl v 45 serumskih vzorcih

žensk. Za ustrezno vrednotenje ujemanja smo ocenili tudi natančnost in točnost metode ter

sistematično in slučajno napako. Novo elektrokemiluminiscenčno metodo smo zato

verificirali.

Natančnost (znotraj-serijska in meddnevna) metode je bila zadovoljiva pri vseh treh

parametrih. Koeficienti variacije (KV) so bili znotraj priporočljivega kriterija 1–5 % in

primerljivi s KV, ki jih je podal proizvajalec. Meritev Prl je bila najbolj natančna (KVmed-

dnevni 2,67 %) in meritev Fsh najmanj natančna (KVmed-dnevni 4,19 %). Točnost metode je

bila zadovoljiva pri vseh treh parametrih, saj so bila vsa povprečja rezultatov meritev

znotraj referenčnih območij, ki jih je podal proizvajalec. Največjo relativno napako (RE)

smo dobili pri Prl (16,58 %) za nizek nivo PreciControl Universal 1 (PC U1), najmanjšo

RE (največja točnost) pa pri Lh (6,89 %) za visok nivo PreciControl Universal 2 (PC U2).

Za vrednotenje ujemanja rezultatov smo uporabili dve praktični statistični metodi, in sicer

metodi Blanda in Altmana ter Krouwerja in Montija, ki temeljita na enostavnih izračunih

in preglednih grafičnih prikazih. Rezultate merjenja smo statistično analizirali v programu

Microsoft Office Excel. Ujemanja rezultatov meritev smo prikazali v diagramu razlik in v

gorskem diagramu. Obe metodi vrednotenja ujemanja rezultatov sta pokazali, da so pri

vseh analitih prisotne sistematične in slučajne napake, razen pri Fsh, kjer napaka ni bila

statistično značilna. Ugotovili smo tudi, da so razlike v rezultatih med metodama večje pri

višjih koncentracijah analitov. Heteroskedastičnosti razlik med meritvami z različnima

analizatorjema nismo opazili. Ugotovili smo, da je ujemanje ECLIA in MEIA metod

neustrezno in da analizator Cobas e 411 pri vseh testiranih parametrih kaže višje rezultate

kot analizator Axsym. Analizator Cobas e 411 ima tudi širša merilna območja in drugačne

XI

referenčne vrednosti. Ker sta točnost in natančnost ECLIA metode zadovoljivi, je s

praktičnega vidika ujemanje rezultatov obeh metod sprejemljivo.

Ključne besede: vrednotenje ujemanja, folikel stimulacijski hormon, luteinizirajoči

hormon, prolaktin, encimsko imunska metoda z mikrodelci, elektrokemiluminiscenčna

metoda, Bland-Altmanova metoda, Krouwer-Montijeva metoda

XII

ABSTRACT

The laboratory of the Community Health Centre Dr. Franc Ambrožič Postojna has replaced

its obsolete immunoassay analyzer Axsym with the new analzyer Cobas e 411. These

analyzers are used, among other things, also for the determination of female sexual

hormones: follicle stimulating hormone (Fsh), luteinizing hormone (Lh) and prolactin (Prl)

in human serum. The concentrations of these hormones, which are important for multi-

level diagnostics of the female sexual cycle disorders, were measured in different numbers

of samples (Fsh - 37; Lh – 42; Prl - 45).

The aim of the study was to determine whether these two methods can be used

interchangeably taking into account that the two analyzers use different methods of analyte

measurement (Axsym: microparticle enzyme immunoassay method (MEIA), Cobas e 411:

electrochemiluminescence immunoassay method (ECLIA)).

In order to evaluate the assessing agreement between the two methods appropriately we

need to consider the precision (within-run and intermediate) and accuracy of the new

method as well as the systematic and random errors. Therefore, a new ECLIA method was

first verified by determining its precision and accuracy which were found to be adequate

for all three parameters.

The coefficients of variation (CV) of precision were within the recommended criteria (1-

5%) and comparable with the CV which had been determined by the manufacturer. The

measurement of Prl was the most precise (CVintermediate 2,67%) whereas the measurement of

Fsh has been the least precise (CVintermediate 4,19%). The accuracy of the method was

adequate as well. The averages of results regarding the accuracy of the method were within

the expected values which had been determined by the manufacturer. Prl was calculated to

have the highest average relative error (a low level of PreciControl Universal 1 (PC U1) -

16,58%) while the lowest has been estimated for Lh (a high level of PreciControl

Universal 2 (PC U2) 6,89%).

Consequently, the agreement between the two measurement methods was evaluated

according to the two practical statystic methods, such as the Bland-Altman method and the

Krouwer-Monti method which are both based on graphical techniques and simple

calculations.

The results of measurement were statistically analysed in MS Excel. Their agreements

were demonstrated with the Bland-Altman method (difference plot) and the Krouwer-

Monti method (mountain plot).

XIII

Both methods obtained the presence of the systematic and random errors in all parameters

(Fsh, Lh in Prl) whose concentrations had been measured by both analyzers. The

systematic error was not statistically significant only in the case of Fsh. The differences in

results of both methods increased linearly along with the concentration of analytes.

However, there was no heteroscedasticity present.

Thus, it has been statistically verified that these two methods do not agree sufficiently and

that the anlyser Cobas e 411 displays higher results than the anlyser Axsym in the case of

all parameters. Nevertheless, the analyzer Cobas e 411 has wider measuring ranges and

different expected values.

In conclusion, the precision and the accuracy of the ECLIA method were adequate. For this

reason, from the practical point of view, the agreement between the two methods is

acceptable.

Key words: assessing agreement, follicle stimulating hormone, luteinizing hormone,

prolactin, microparticle enzyme immunoassay, electrochemiluminescence immunoassay,

Bland-Altman method, Krouwer-Monti method

1

1. UVOD

1.1 Spolni hormoni

Spolni hormoni so steroidi topni v maščobah. Izločajo jih ženske in moške spolne žleze,

skorja nadledvične žleze in posteljica. Njihovo izločanje uravnavata hipotalamus in

hipofiza, ki se nahajata v bazalnem delu možganov (1). Hipotalamus je 5 do 10 gramov

težek majhen del diencefalona (1). Vsebuje številne znotrajcelične receptorje za hormone:

estrogene (estrogenski receptor alfa (ERα) in estrogenski receptor beta (ERβ)), androgene,

testosteron, progesteron (A in B receptorji), hormone nadledvičnice itd. (1). Hipotalamus

izloča gonadotropin sproščujoč hormon (GnRH), ki spodbudi hipofizo, da začne izločati

Fsh in Lh, ki uravnavata izločanje spolnih hormonov (1). V krvi so spolni hormoni v dveh

oblikah: prosti ali vezani na beljakovine. V glavnem so vezani na spolne hormone vežoči

globulin (SHBG) in v manjši meri na albumin (2). V tarčno celico vstopijo samo nevezani

(prosti) hormoni.

Spolne hormone lahko razdelimo v tri skupine (3):

estrogeni,

gestageni,

androgeni.

1.1.1 Estrogeni

Estrogeni so skupina steroidnih kemičnih spojin in so sestavljeni iz 18 C-atomov. Glavni

predstavniki so estradiol, estron in estriol (4). Naziv so dobili zaradi svojega pomembnega

pomena v estrusu (menstrualnem ciklu) sesalcev (4). So ženski spolni hormoni s številnimi

biološkimi učinki (5, 6):

vplivajo na celično proliferacijo, razvoj tkiv in organov, ki so povezani z

razmnoževanjem,

omogočajo razvoj sekundarnih spolnih znakov,

vplivajo na menstruacijo, ovulacijo in nosečnost,

stimulirajo rast in razvoj dojk in tkiv za produkcijo mleka,

kontrolirajo normalno delovanje urogenitalnega trakta in vazomotorike,

povečujejo osteoblastno aktivnost (pospešeno rast v puberteti),

2

vplivajo na porast ravni beljakovin v telesu (posledica intenzivne rasti spolnih

organov, skeleta in drugih tkiv),

pospešujejo metabolizem in nalaganje maščob v dojkah, predelu zadnjice, stegnih

in podkožju,

vplivajo na prekrvavitev.

Pri ženskah se izločajo iz ovarijskih foliklov, med nosečnostjo pa iz placente in v zelo

majhni meri iz skorje nadledvičnice. Pri moških nastajajo majhne količine estrogenov v

testisih (moških spolnih žlezah) (3). Estrogeni se uporabljajo tudi kot kontracepcijska

sredstva in kot hormonski pripravki pri hormonskem zdravljenju (5). "Določanje njihovih

koncentracij v nosečnosti ima velik pomen pri oceni delovanja placente in so zelo dober

kazalnik funkcije jajčnikov" (4).

1.1.2 Gestageni

Najpomembnejši gestagen je progesteron. Je steroid sestavljen iz 21 C-atomov (4). V prvi

polovici ovarijskega cikla ga izločajo ovariji in skorja nadledvičnice. V drugi polovici ga

bolj intenzivno izloča rumeno telesce (corpus luteum) (3). Skupaj z estrogenom se

sintetizirata iz holesterola ter v manjših količinah iz acetil-koencima A (3). V krvi se veže

na albumine in transkoritin (1). Ta vezava je zelo šibka, zato hormon zelo hitro pride v

tkiva. Metabolizira se v jetrih (3), izloča pa se v obliki 5β-pregnanediol konjugatov (3).

Progesteron se uporablja v naslednje namene: za ohranjanje nosečnosti, pri grozečem

splavu, pri motnjah menstrualnega cikla in kot kontraceptiv (3).

1.1.3 Androgeni

Androgeni so moški spolni hormoni. Med androgene prištevamo: dehidroepiandrosteron

(DHEA), dehidroepiandrosteron-sulfat (DHEA-S), androstendion (A) in testosteron (2). So

derivati ciklopentanoperhidrofenantrena (spojine C-19), ki imajo številne biološke učinke

(4, 2):

spodbujajo spermatogenezo in spolno dozorevanje v puberteti,

omogočajo razvoj moških sekundarnih spolnih znakov,

pospešujejo linearno rast in zvečanje kostne gostote,

spodbujajo izločanje eritropoetina in posledično produkcijo eritrocitov (1).

Androgene izločajo nadledvičnica in spolne žleze obeh spolov (4). Celice testisov izločajo

največ testosterona, medtem ko celice ovarijev izločajo večje količine androstendiona (4).

Androgeni se uporabljajo za zdravljenje primarnega ali sekundarnega hipogonadizma,

3

karcinoma dojke, anemije itd (3). Posebno klinično uporabo ima v postmenopavznem

obdobju žensk, kjer v kombinaciji z estrogenom pozitivno deluje na počutje in spolni

nagon ter zniža tveganje za razvoj osteoporoze (3).

1.2 Gonadotropna hormona in prolaktin

1.2.1 Fsh

Fsh ali folitropin je hormon, ki pripada družini gonadotropinov. V sinergističnem

delovanju z Lh stimulira dozorevanje in delovanje ovarijev in testisov (7). Po kemični

sestavi je glikoprotein sestavljen iz dveh podenot (α in β verigi (7)). Fsh, Lh, ščitnica

spodbujajoči hormon (Tsh) in humani horionski gonadotropin (hCG) imajo enake α verige,

medtem ko so β verige teh hormonov različne, saj so za vsak hormon specifične (7). Te

verige določajo specifično biološko aktivnost hormonov (7). Molekulska masa Fsh znaša

približno 32 kD (7). Izločanje, delovanje in vpliv Fsh na spolni cikel žene regulira

hipotalamo-hipofizno-ovarijski sistem. Koncentracijo tega hormona v krvnem obtoku

regulirajo steroidni hormoni z mehanizmom negativne povratne zanke (1). V jajčnikih Fsh

in Lh stimulirata rast in dozorevanje folikla ter posledično biosintezo estrogenov znotraj

foliklov (7). Najvišje koncentracije Fsh se kažejo sredi cikla, čeprav je to manj izrazito kot

pri Lh (7). Razpolovni čas Fsh je 4 ure (1). Izloča se prek jeter in ledvic (1).Tekom

življenja žensk se delovanje jajčnikov in izločanje estrogenov spreminja (1). Posledično se

zato spreminjajo tudi koncentracije Fsh (npr. visoke koncentracije Fsh v menopavzi) (1).

Pri moških ima Fsh vlogo spodbujevalca razvoja spermatogonija (7). Določanje

koncentracij Fsh je pomembno pri ugotavljanju različnih motenj v delovanju hipotalamo-

hipofizno-gonadnega sistema (7). Sočasno določanje koncentracij Fsh in Lh je uporabno

pri naslednjih stanjih (7): iskanje vzrokov amenoreje (popolni izostanek menstruacije),

sindrom policističnih jajčnikov, menopavzni sindrom, prirojene bolezni s kromosomskimi

aberacijami, sum na pomanjkanje Leydigovih celic in azospermija pri moških (odsotnost

spermatozoidov v ejakulatu).

1.2.2 Lh

Lh spada v skupino gonadotropinov (8). Stimulira in regulira rast in dozorevanje gonad

(8). Ima molekulsko maso 29,5 kD (8). Sestavljen je iz 121 aminokislin in treh sladkornih

verig (8). Lh se v krvni obtok sprošča pulzirajoče iz gonadotropnih celic adenohipofize (8).

Iz krvnega obtoka preide v ovarije.V ovarijih stimulira rast in dozorevanje folikla ter

sintezo estrogenov in progesterona (8). Lh doseže največjo koncentracijo sredi spolnega

4

cikla (8). Takrat spodbudi ovulacijo in nastanek rumenega telesca (corpus luteum), ki

izloča progesteron (8). Lh v Leydigovih celic testisov spodbuja nastajanje testosterona (8).

Razpolovni čas Lh je 30 minut (1). Izločata ga ledvici in jetra (1). V diagnostiki motenj

spolnega cikla je pomembno sočasno določanje koncentracij Fsh in Lh (7) .

1.2.3 Prolaktin

Prl je hormon, ki ga izloča adenohipofiza (9). Izločanje uravnava hipotalamus, ampak na

drugačen način kot pri ostalih hormonih adenohipofize (10). Hipotalamus namreč zavira

njegovo izločanje (10). Zato je pri različnih poškodbah hipotalamusa in hipofize sekrecija

prolaktina povečana, sekrecija ostalih hormonov pa zmanjšana (10). Izločanje Prl uravnava

tudi dopamin, ki deluje inhibitorno. (10) Dopamin pripada skupini kateholaminov in lahko

poveča sekrecijo Prl za 10-krat (10). Molekulska masa Prl znaša približno 22–23 kD (9).

Sestavljen je iz 198 aminokislin in je v serumu prisoten v treh različnih oblikah (9):

monomerni obliki (80 %), ki je biološko in imunološko aktivna oblika, dimerni obliki (5–

20 %), ki je biološko neaktivna oblika in tetramerni obliki (0,5–5%), ki ima zelo majhno

biološko aktivnost. Prl uravnava razvoj in diferenciacijo mlečne žleze (9). Visoke

koncentracije tega hormona (hiperprolaktonemije) zavirajo steroidogenezo v jajčnikih,

produkcijo in sekrecijo hipofiznih gonadotropinov (9). Med nosečnostjo se pod vplivom

estrogenov in progesterona koncentracije Prl zvišajo (10). Po porodu spodbujevalno deluje

na laktacijo (9). Eden od vzrokov motenj plodnosti pri moških in ženskah je

hiperprolaktinemija (9). Vrednosti Prl se določajo in so pomembne v diagnostiki naslednjih

stanj (9): izostanek ovulacije (anovulacijski cikli), hiperprolaktonemična amenoreja in

galaktoreja (izločanje mlečne tekočine iz dojk izven obdobja laktacije), ginekomastija

(povečanje žleznega tkiva dojk pri moških), azospermija (odsotnost spermijev v ejakulatu)

in pri sumu na karcinom dojke in karcinom hipofize.

1.3 Ženski spolni cikel

Za ženski spolni cikel so značilne mesečne, ritmične spremembe v izločanju hormonov,

spremembe v jajčnikih in spolnih organih (11). Ovarijske spremembe povzročata predvsem

hormona Fsh in Lh (11). Tekom otroštva se ne izločata, zato sta jajčnika neaktivna.

Začneta se izločati med 9. in 10. letom starosti (11). Hipofiza ju izloča v velikih količinah

med 11. in 16. letom starosti, s tem pa se začenja razvoj normalnega mesečnega spolnega

cikla (11). Med posameznicami se ciklusi razlikujejo po pogostosti, trajanju in jakosti (11).

Cikel traja v povprečju 28 dni (11). Vsak mesec se iz jajčnikov sprosti samo eno jajčece, iz

5

katerega se lahko razvije samo en fetus (11). Dogodki tekom cikla pripravijo maternično

sluznico endometrij za implantacijo oplojenega jajčeca (11). Za normalen potek cikla je

potrebno usklajeno delovanje hipotalamusa, hipofize, jajčnikov ter endometrija (11). Glede

na mesto dogajanja lahko cikel razdelimo na ovarijski in endometrijski (11).

1.3.1 Ovarijski cikel

V jajčnikih potekata dve fazi cikla: folikularna in luteinska faza (11). Značilnost

folikularne faze je rast foliklov (11). V jajčnikih novorojenčkov je različno število jajčnih

celic, ki so obdane z enim slojem granuloznih celic (11). Ta skupek imenujemo

primordialni folikel (11). Granulozne celice prehranjujejo jajčece in izločajo oocitni faktor,

ki inhibira delitev tako, da jajčna celica ostane na primordialni stopnji do profaze mejoze

(11). Posledica prve stopnje rasti foliklov je povečanje jajčne celice in rast granuloznih

celic (9). Takrat folikel postane prepoznaven kot primarni folikel (11). Na začetku

ovarijskega cikla se izločajo večje količine Fsh kot Lh (11). Hormona, še posebej Fsh,

povzročata vsak mesec pospešeno rast 6 do 12 primarnih foliklov (11). Samo en folikel

dozori in doseže največjo velikost (11). Temu sledi proliferacija granuloznih celic, ki se

zbirajo v več plasti (11). Oblikuje se teka folikuli (vezivna ovojnica (11)). Celice teke

oblikujejo zunanjo plast (teka eksterna) in notranjo plast (teka interna (11)). Folikel z

vezivno ovojnico imenujemo sekundarni folikel (11). Celice teke interne imajo značilnosti

epiteloidnih celic in izločajo steroidne hormone (estrogene in progesteron (11)). Celice

zunanje plasti so vaskularizirane vezivne celice, ki oblikujejo kapsularni obroč (11).

Proliferaciji sledi razvoj antruma – votline, ki je zapolnjena s foliklovo tekočino in z veliko

količino estrogenov (11). Tako nastane terciarni ali Grafov folikel (antralni folikel (11)).

Zvišano izločanje Fsh lahko povzroči še večjo rast in nastanek vezikularnega folikla (11).

Stopenjski rast foliklov omogočajo hormoni: estrogen, ki povečuje število Fsh receptorjev

in občutljivost granuloznih celic, Fsh in estrogen, ki stimulirata izločanje Lh, estrogen in

Lh, ki spodbudita nadaljnjo proliferacijo in sekrecijo celic teke (11). Po enem tednu (ali

več) rasti preden začne ovulacija, začne en folikel preraščati druge (11). V procesu, ki se

imenuje atrezija, ostali folikli propadejo (11). Predpostavljajo, da je dominanten tisti

folikel, ki ima več Fsh receptorjev (11). Poleg tega estrogeni zavirajo hipotalamus in

posledično tudi rast foliklov (11). Atrezija je izredno pomemben dogodek, ker omogoča

rast samo enega folikla, ki bo šel v proces ovulacije (11). Ovulacija se pri ženski, ki ima

normalen 28-dnevni spolni cikel, pojavi 14. dan po nastopu menstruacije (11). Neposredno

6

pred ovulacijo se zunanja stena folikla razgradi (11). Temu sledi iztekanje tekočine iz

folikla v osrednji del kapsule (11). Ta del poči, tekočina se zlije in izplavlja jajčno celico,

obdano z nekaj tisoč granuloznih celic (11). Ovulacija je sprožena zaradi delovanja Lh in

Fsh (11). Njihove koncentracije se 2 dni pred ovulacijo 2 do 3-krat povečajo (11). Lh

spodbudi izločanje progesterona in nastanek progesteron izločajočih celic (11). Razpad

centralnega dela kapsule povzroča proteolitični encim iz lizosomov, ki ga sprošča zunanja

plast (11). Razpad foliklov je posledica razraščanja krvnih žil v steni folikla in sproščanja

prostaglandinov (11).Luteinska faza se začenja nekaj ur po sprostitvi jajčne celice iz folikla

(11). V procesu luteinizacije nastajajo skupine celic, ki jih imenujemo rumeno telo (corpus

luteum (11)). Rumeno telo sintetizira steroidne hormone (11). Estrogen in progesteron v

luteinski fazi zmanjšujeta izločanje Fsh in Lh (11). Izločanje Fsh dodatno zavira hormon

inhibin, ki ga izločajo luteinske celice (11). Zaradi nizkih koncentracij gonadotropnih

hormonov, luteinske celice involvirajo (11). To pomeni, da rumeno telo izgubi izločevalno

funkcijo in pridobi belo barvo. Tako nastane belo telo (corpus albicans (11)). Proces se

zgodi 26. dan ovulatornega cikla in 2 dni pred menstruacijo (11). Luteinizacijo uravnavata

predvsem Lh in luteinizacija-zavirajoči faktor (LIF (11)). Po končanem procesu se poveča

koncentracija Fsh in Lh v krvi in začne se nov ovulacijski ciklus (11).

1.3.2 Endometrijski cikel

Cikel v endometriju poteka v treh fazah: proliferacijska faza, sekrecijska faza in

menstruacijska faza (11). V fazi proliferacije velike količine izločenega estrogena

spodbujajo proliferacijo epitelijskih celic (11). Med ovulacijo se številne celice strome

povečajo in razvijejo se endometrijske žleze, ki izločajo sluz in na ta način usmerjajo

spermije v maternico (11). Progesteron v sekrecijski fazi spodbuja proliferacijo

endometrija in razvoj žlez (11). Endometrij se odebeli na 5–6 mm in vsebuje

prehranjevalne snovi za oplojeno jajčece (11). Dva dni pred koncem cikla se zmanjšajo

koncentracije estrogena in progesterona in nastopi menstruacijska faza (11). V tej fazi

endometrij involvira in krčijo se krvne žile. Tekom 24–36 ur začne iztekati kri iz krvnih žil

(11). Nekrotični deli se odtrgajo od maternice in vrhnji sloj maternice se odlušči. Tekom

normalne menstruacijske faze se izgubi okoli 40 mL krvi in 35 mL serozne tekočine (11).

7

1.4 Motnje menstrualnega cikla

Sodobno življenje, okoljske spremembe in novi stresorji povzročajo neravnovesje

nevroendokrinega sistema in s tem posledično vse pogostejše motnje menstrualnega cikla.

Motnje lahko razdelimo na (6): juvenilno metroragijo, menstrualne motnje v generativnem

obdobju in predklimakterično metroragijo.

Juvenilna metroragija je menstrualna motnja, ki se pojavlja med 12. in 14. letom starosti,

po prvi menstruaciji – menarhi (6). V tem obdobju centralni živčni sistem še ni povsem

dozorel in to vpliva na hipofizno izločanje hormonov, ki uravnavajo menstrualni cikel (6).

Nepravilno razmerje Fsh in Lh povzroča menstrualne motnje, ki se kažejo kot dolgotrajne

in obilne menstrualne krvavitve, ki jih imenujemo juvenilne metroragije (6). S tem je

povezan tudi anovulacijski cikel. Zaradi izostanka ovulacije in pomanjkanja progesterona

endometrij raste, ampak se ne transformira (6). Stimulacija jajčnikov ni več zadostna in

nastopi tako imenovana "prekinitvena krvavitev"(6). Menstrualne motnje v generativnem

obdobju (obdobje med menarho in klimakterijem) lahko razdelimo modificirano po

Pschyremblu (Pschyrembel, 1969) na motnje v pogostnosti menstrualnih krvavitev in

motnje v jakosti menstrualnih krvavitev (6). Motnje v pogostnosti menstrualnega cikla so

lahko: oligomenoreje, amenoreje, vmesne krvavitve in polimenoreje (6). Oligomenoreja je

blažja motnja in je posledica zmanjšane hormonske dejavnosti jajčnikov (6). Menstrualni

cikli so redni, ampak v daljših časovnih presledkih (več kot 35 dni (6)). Vzrok za to je

lahko daljša proliferacijska faza cikla, ki ne zahteva zdravljenja, ali pa odsotnost ovulacije,

ki je povezana z neplodnostjo (6). Amenoreja je lahko fiziološka ali patološka motnja, ki

se kaže kot izostanek menstruacije več kot 4 mesece (6). Fiziološki izostanek menstruacije

nastopi v obdobjih pred menarho, v času nosečnosti in dojenja ter po menopavzi (6).

Patološka amenoreja pomeni izostanek menstruacije brez fiziološkega vzroka (6).

Etiologija je raznovrstna in motnja zahteva stopenjsko diferencialno diagnostiko (12).

Najpogostejši vzrok primarne amenoreje je organska motnja v razvoju jajčnikov, maternice

in nožnice (6). Ostali vzroki so različna vnetja in zmanjšana hormonska dejavnost

jajčnikov (6). Sekundarno amenorejo, ki je posledica neravnovesja nevroendokrinega

sistema, pogosto sprožijo zunanji stresorji (6). Vzroki centralnih amenorej, ki se

klasificirajo kot hipogonadotropne, so: sindrom policističnih jajčnikov, periferne

endokrinopatije (motnje ščitnice, nadledvične žleze, hormonski tumorji), motnje

hipotalamusa in hipofize (tumorji, vnetja, disfunkcije, hiperprolaktinemija – povišane

vrednosti prolaktina, zapoznela puberteta, psiho-nevro-endokrinološke motnje (12,13)).

8

Ovarijske amenoreje so izrazito hipergonadotropne in hipoestrogene (13). Tipičen primer

primarne ovarijske amenoreje je disgeneza gonad – Turnerjev sindrom (13). Sekundarna

ovarijska amenoreja je fiziološka v menopavzi, patološka pa v predčasni menopavzi in pri

kroničnih anovulacijah (sindrom policističnih jajčnikov (13)). Periferne amenoreje so

eugonadotropne (normogonadotropne). To pomeni, da je os hipotalamus - hipofiza -

jajčniki urejena (13). Motnje se javijo zaradi anatomskih defektov maternice in/ali vagine

(13). Najpogostejši vzrok te amenoreje je Sy. Mayer-Küster-Rokitansky sindrom (agnezija

maternice in vagine (13)). Vmesne krvavitve so motnje, ki se lahko pojavijo pred

menstruacijo, na sredini med dvema menstruacijama ali po končani menstruaciji (6). Tiste,

ki se pojavijo nekaj dni pred menstruacijo, so hormonskega vzroka in so posledica

nezadostnega hormonskega spodbujanja rumenega telesca (6). Vmesne krvavitve so

običajno znak ovulacije in so hormonskega porekla (6). Krvavitve, ki se pojavljajo po

končani menstruaciji, so znak organskih sprememb, kot so: miomi, endometrioza, polipi

(12). Polimenoreja pomeni prepogosto menstrualno krvavitev, ki se pojavlja na 21–24 dni

(6). Polimenoreja, ki je povzročena s skrajšanjem sekrecijske faze menstrualnega cikla,

pogosto povzroča neplodnost (6). Tista, ki je povzročena s skrajšanjem folikularne faze

cikla, se ne zdravi in ne pomeni hujše motnje (12). Motnje v jakosti menstrualnih krvavitev

so razdeljene na hipomenoreje in hipermenoreje (13). Hipomenoreje so šibke menstrualne

krvavitve, ki trajajo 1–2 dni in so v glavnem dedne (13). Niso posledica resnih motenj (13).

V določenih primerih se pojavljajo kot posledica patoloških sprememb endometrija, ki so

nastale po porodih, splavih in vnetjih (13). Hipermenoreje pomenijo obilne in močne

menstrualne krvavitve, ki prenehajo v normalnem, pričakovanem času (13). Menoragije so

zelo močne in dolge menstrualne krvavitve (13). Obe motnji imata organske vzroke, kot

so: vnetja, miomi, polipi, karcinomi itn (13). Predklimakterična (predmenopavzalna)

metroragija je stanje močne anovulacijske krvavitve v obdobju pred menopavzo (13).

Vzrok za to je na nivoju jajčnikov, hipofizna stimulacija je normalna (13). Maloštevilni

folikli v jajčnikih rastejo in izločajo estrogene, endometrij se razvija, ampak do ovulacije

ne pride zaradi bioloških sprememb v jajčnikih (13). Posledica so močne in obilne

krvavitve (13).

1.5 Diagnostika in zdravljenje

Diagnostika in diferencialna diagnostika motenj spolnega cikla temeljita na anamnezi,

fizikalnih pregledih, ultrazvočni diagnostiki, radioloških preiskavah in hormonskih testih

9

(12). Primer takšnega pristopa je diagnostika najpogostejših motenj, amenorej (12). Z

anamnezo pridobivamo podatke o: prisotnih simptomih (ki so lahko rezultat pomanjkanja

estrogenov), poteku in fazi pubertete, razvoju sekundarnih spolnih znakov, poteku motnje

in podatke o tem, ali gre za primarno ali sekundarno amenorejo (12). Predvsem je treba

izključiti nosečnost (12). S fizičnim pregledom, ki vključuje splošni in ginekološki pregled,

pridobimo podatke o telesni teži in višini, indeksu telesne mase (BMI), razvoju

sekundarnih spolnih znakov, morebitnih anomalijah spolnih organov, znakih

hiperandrogenizma (akne, poraščenost), pojavu izcedka iz dojk (12). V diagnostiki so

koristni tudi aparati za ultrazvočno diagnostiko, ki prikazujejo anomalije in delovanje

spolnih organov (12). Kot dopolnilne metode se uporabljajo rentgen (RTG) in magnetna

resonanca (MR) (12)). Če predhodno omenjeni diagnostični pristopi ne razkrijejo

diagnoze, je potrebno izključiti hiperprolaktinemijo, kot možni vzrok amenoreje (14). Nato

se lahko izvedeta dva enostavna hormonska testa: progesteronski (gestagenski) test in

estrogensko progesteronski test (14). Pri progesteronskem testu (gestagenskem testu) se

ocenjuje reakcijo na 10–12-dnevni vnos progestina (sintetičnega nadomestila za

progesteron (14)). Če se v obdobju nekaj dni po prekinitvi vnosa pripravka pojavijo

maternične krvavitve, pomeni, da je izvedeni test pozitiven (14). Če je krvavitev izostala,

je test negativen (14). Pozitiven test pomeni, da je sinteza estrogenov v ovarijih adekvatna,

ampak je nivo progesterona nizek (14). V primeru perzistirajočih amenorej se nadomestno

gestagensko zdravljenje nadaljuje naslednje 3 mesece (14). V primeru negativnega testa se

izvaja estrogen-progesteronski test (estrogen-gestagenski test, estrogen-progestinski test)

na način, da se v organizem v obdobju treh tednov peroralno vnašajo kombinirani

hormonski pripravki (naravni estrogen kombiniran s progestinom ali dvofazni peroralni

kontraceptivi), ki so potrebni za transformacijo endometrija (14). Če po prekinitvi vnosa

pripravkov pride do krvavitve, je test je pozitiven, to pa pomeni, da sta maternica in

endometrij urejena in da je spolni sistem pretočen (12,14). Če krvavitve izostanejo, je test

negativen (14). Vzroki za to so različni: lahko so prisotne anomalije maternice, okvarjena

je funkcija endometrija ali pa so prisotne ovire v odtoku krvi zaradi anatomskih anomalij

(14). Pozitiven estrogen-progesteronski test in negativen progesteronski test pomenita

resne motnje (14). V teh primerih je potrebno ločiti, ali so prisotne primarne ali sekundarne

motnje jajčnikov in ali je prisotna centralna amenoreja (14).

10

Diagnostika se nadaljuje z analizami gonadotropnih hormonov v krvnem serumu (12).

Negativen estrogen-progesteronski test in negativen progesteronski test diagnostiko

usmerjata proti amenorejam zaradi anomalij uterusa (14). Hormonsko testiranje amenorej

prikazuje slika 1 (12, 14).

Slika 1: Hormonsko testiranje amenorej

(prirejeno po viru: Wuttke W, Hinney B. Ovarian function. In: Lothar T. Clinical Laboratory Diagnostics.

Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. 1st ed. Frankfurt, Main, Germany: TH-Books, 1998:

1091–1094.)

Poleg omenjenih hormonov se določajo tudi: estrogen, estradiol, Tsh, Anti-Müllerjev

hormon, androstendion, testosteron in progesteron (12). V preglednici I so prikazana

različna bolezenska stanja in motnje, pri katerih se določajo vrednosti Fsh, Lh in Prl (15).

Nosečnost Da Ne

Fiziološka

amenoreja

Progesteronski

test

Poz

+

ggg

Neg

-

Možni vzroki amenoreje:

centralna amenoreja

primarne okvare jajčnikov

sekundarne okvare jajčnikov

Analize gonadotropnih

hormonov v krvnem

serumu.

Možni vzrok amenoreje:

anomalije maternice

11

Preglednica I: Bolezni in motnje pri katerih se določajo vrednosti gonadotropinov in

Prl

Na drugi stopnji se določajo koncentracije hormonov nadledvične žleze in 17-hidroksi

progesterona (17-OH progesterona) (12). Nekatere motnje (npr. centralna amenoreja)

zahtevajo dinamične analize hormonov, t. j. izvajanje primerjalnih testov, ki ocenjujejo

funkcijo hipofize in perifernih žlez (12). Motnje spolnega cikla so številne in raznovrstne

kot tudi njihovi vzroki. Včasih zdravljenje ni potrebno, včasih pa je dovolj zdraviti samo

znake. Določena stanja zahtevajo zdravljenje s hormonskimi pripravki (12).

1.6 Metode določanja hormonov

"Zaradi zelo majhnih koncentracij hormonov v serumu, plazmi, seču in slini, ki se gibljejo

od mikromolarnih do pikomolarnih, potrebujemo zelo občutljive laboratorijske tehnike"

(2). Za določanje hormonov se uporabljajo imunokemjski testi (2). "Imunokemija je

Hormon Nizke koncentracije v krvnem

serumu Visoke koncentracije v krvnem serumu

Hipofizna gonadotropina:

Fsh in Lh

Sekundarni hipogonadizem

Kallmannov sindrom (dedno

avtosomno

izolirano pomanjkanje

GnRH)

Zmanjšano hipofizno

izločanje Fsh in Lh

Pomanjkanje

gonadotropinov.

Primarni hipogonadizem

Anorhija (prirojeno pomanjkanje obeh testisov)

Okvara testisov

Menopavza

Tumorji hipofize

Prezgodnja puberteta

Sindrom neobčutljivosti na androgene

Luteinska faza menstrualnega cikla

Prl

Hipopituitarizem

Poporodna hipofizna

nekroza

Idiopatski hipogonadotropni

hipogonadizem

Zdravila

Dopaminski agonisti

Ergot derivati

Lévodópa, apomorfin,

klonidin.

Ostale endokrine bolezni

Hipotiroidizem

Addisonova bolezen

Sindrom policističnih jajčnikov

Presežek glukokortikoidov – normalne ali

zmerno povišane vrednosti prolaktina

Ektopična nastajanje prolaktina

Prezgodnja puberteta

Nevrogene motnje

Stres, nosečnost, dojenje

Kronična okvara ledvic

Okvara jeter

Idiopatski vzroki

Amenoreja

Galaktoreja

Hipofizne lezije

Hipotalamične lezije

12

področje laboratorijskega dela, ki uporablja protitelesa (Ab) ali druge molekule imunskega

odziva kot kemijski reagent" (16). Princip imunokemijskih metod je merjenje neke snovi

na osnovi reakcije med antigeni (Ag) in Ab (2). V teh reakcijah je ena od komponent

vedno označena (2). "Označevalec je lahko radioizotop, encim, dolgoživi radikal,

fluorescenčna ali luminiscenčna snov ali bakteriofag" (2). "Vrsta označevalca pogojuje

tehniko merjenja, ki je z druge strani pogojena z različnimi možnostmi detekcije (2)".

Poznamo kompetitivne in nekompetitivne teste (17).V kompetitivnih imunoloških testih

je količina označenega Ag omejena, količina neoznačenega pa je neznana (17). Pride do

tekmovanja med označenim in neoznačenim Ag za omejeno število vezavnih mest Ab

(17). Čim več je Ag v vzorcu, tem manj označenega Ag se veže na Ab (17). Pri

nekompetitivnih testih imamo neomejeno število označenih primarnih Ab in je količina Ag

sorazmerna s količino Ab (17). Razlikujemo tudi homogene in heterogene imunološke

teste (17). Homogeni ne zahtevajo ločevanja nevezanih kompleksov od vezanih

kompleksov, saj sta encim kot substrat del reakcije (17). So lažji in hitrejši za izvedbo kot

heterogeni testi, ki zahtevajo ločevanje vezanih kompleksov Ag-Ab od nevezanih

kompleksov (17)".

V kliničnih laboratorijih se uporabljajo različni imunokemični testi. Glede na označevalce

razvrščamo metode na (2, 16):

izotopske, kjer je označevalec radioaktivni tritij ali radioizotop joda ( 125

I)

(radioimunski test (RIA), imunoradiometrijski test (IRMA)) in

neizotopske, kjer je označevalec encim (encimsko imunoabsorpcijski test (ELISA),

homologni encimsko imunski test (EMIT), MEIA), fluorofor (imunofluorescenčni

test (FIA); polarizacijski imunofluorescenčni test (FPIA)) in luminiscenčna snov

(luminometrični imunski test (LIA), ECLIA).

Izotopske metode so primerne za ligande z nizko kot tudi z visoko molekulsko maso (2,

16). So visoko specifične, dobro občutljive in so uporabne samo v heterogenih sistemih (2,

16). Pomanjkljivost teh metod je relativno kratka življenska doba izotopov ter škodljiv

vpliv na izvajalca analize (2). Neizotopske metode so večinoma homogene in se

uporabljajo za analize snovi z nizko molekulsko maso (16). Poleg prej omenjenih

neizotopskih metod sem uvrščamo tudi nefelometrijske, turbidimetrijske in lateks

aglutinacijske metode, vključno s koloidno agregacijo (16). Prednost homogenih

neizotopskih metod pred izotopskimi je: enostavnejša izvedba, dostopnost za

avtomatizacijo in neškodljivost za laboratorijsko osebje (2, 16). Za določanje serumskih

13

koncentracij Fsh, Lh in Prl smo uporabili dva imunokemijska, neizotopska testa: MEIA in

ECLIA.

1.6.1 MEIA (Microparticle Enzyme ImmunoAssay) metoda

MEIA metoda je encimsko imunska metoda, ki uporablja raztopino lateks mikrodelcev za

merjenje analitov (17). Mikrodelci so majhne kroglice, obložene z Ab, kar je specifično za

analit, ki ga merimo (17). Učinkovita površina mikrodelcev povečuje kinetiko testa in

zmanjšuje čas inkubacije (17). Zato je izvedba MEIA testa hitrejša kot izvedba ostalih

imunokemijskih testov (17). Ta metoda se je začela uporabljati zaradi avtomatizacije

meritev velikih molekul, kot so označevalci (17): srčne funkcije, plodnosti, rakavih

bolezni, presnove, ščitnične funkcije, hepatitisa itd. Metoda zahteva naslednje komponente,

ki so raztopljene v specifičnem pufru (17):

mikrodelci obloženi z molekulo (Ag, Ab ali virusni delec),

označen konjugat – najpogosteje se uporablja encim alkalna fosfataza in

encimski substrat – fluorescenčni 4-metilumbeliferil fosfat (4-MUP).

Postopek (17): 1. Mikrodelci obloženi z molekulo (npr. z Ab proti analitu, ki ga merimo) in

vzorec (v katerem je analit) se inkubirajo in oblikujejo reakcijsko zmes. 2. Alikvot

reakcijske zmesi se prenese na matriks iz steklenih vlaken. Matriks služi za pritrditev

kompleksov. 3. Ab, konjugirana z alkalno fosfatazo, se vežejo na kompleks mikrodelcev.

4. Matriksu se doda 4-MUP encimski substrat. 5. Konjugat katalizira hidrolizo 4-MUPa do

metillumbeliferona (MU). 6. Meri se količina dobljenega fluorescenčnega produkta MU, ki

je sorazmerna koncentraciji analita v testnem vzorcu (nekompetitivna oblika testa (17)).

Postopek prikazuje slika 2.

1.6.2 ECLIA (ElectroChemiLuminescence ImmunoAssay) metoda

ECLIA metoda temelji na elektrokemiluminiscenčnih reakcijah (ECL). ECL reakcije se

pojavljajo s številnimi molekulami, vključno s spojinami rutenija, osmija, renija in drugih

elementov (18). V teh reakcijah visoko reaktivne spojine nastajajo iz stabilnih

predhodnikov na površini elektrod, medsebojno reagirajo in tako proizvajajo svetlobo (18).

Razvoj ECLIA temelji na uporabi rutenij (II)-tris (bipiridil (bpy)) kompleksa in

tripropilamina (TPA (18)). Končni kemiluminiscenčni produkt nastane v detekcijskem

koraku. Kemiluminiscenčne reakcije, ki vodijo do emisije svetlobe iz rutenijevega

kompleksa, se prej sprožijo električno kot kemično (18). To se doseže z uporabo napetosti

imunskih kompleksov, ki so pritrjeni na kroglice, obložene s streptavidinom (18). Prednost

14

električno spodbujene kemiluminiscenčne reakcije je, da se celotna reakcija lahko

natančno nadzoruje (18). Dostopne so 3 oblike testa: kompetitivna oblika-za

nizkomolekulske analite (npr. prosti trijodtironin (FT3)), "sendvič" oblika

(eno/dvostopenjska) – za analite večje molekulske mase (Fsh, Lh, Prl) in "premostitvena"

oblika – za določanje Ab v vzorcu (imunoglobulinov razreda G (IgG), imunoglobulinov

razreda M (IgM), imunoglobulinov razreda A (IgA) (18)). Princip in postopek

kompetitivne metode (18): V prvem koraku se vzorec in specifično Ab (npr. specifično

anti-trijodtironin (anti-T3) Ab), ki je označeno z Ru2+

kompleksom prenesejo v testno

posodico. Po prvi inkubaciji se doda T3 označen z biotinom in paramagnetne kroglice

obložene s streptavidinom. Prosto vezavno mesto označenega Ab zasede kompleks "Ab-

hapten". Celotni kompleks s kroglicami povezuje interakcija biotina in streptavidina. Po

drugi inkubaciji se imunski kompleksi premestijo v merilno celico in se "magnetno

ulovijo" na delovne elektrode. Nevezani reagent in vzorec se spereta. V

elektrokemiluminiscenčnoj (ECL) reakciji je konjugat derivat rutenija in

kemiluminiscenčna reakcija je električno stimulirana. Meri se količina oddane svetlobe, ki

je obratno sorazmerna količini Ag v testnem vzorcu. Koncentracija Ag se ovrednoti in

izračuna s pomočjo kalibracijske krivulje, ki je bila določena z uporabo standardov znanih

koncentracij Ag (18). Princip in postopek "sendvič metode" (18): 1. inkubacija: testni

vzorec, monoklonalna specifična Ab (npr. monoklonalno Fsh-specifično Ab), obložena z

biotinom, in monoklonalna specifična Ab (npr. monoklonalno Fsh-specifično Ab),

označeno z rutenijevim kompleksom, formirata "sendvič imunski kompleks"; 2.

inkubacija: po dodatku mikrodelcev, obloženih s streptavidinom, se kompleks veže na trdo

fazo. Vezavo omogoča interakcija biotina in streptavidina (slika 3). Reakcijska zmes se

prenese v merilno celico. Mikrodelci se "magnetno ulovijo" na površje elektrod. Nevezane

snovi se sperejo. Z dovajanjem napetosti elektrodam se inducira ECL reakcija in emisija

svetlobe, ki se meri s fotopomnoževalcem. Količina oddane svetlobe je sorazmerna

količini Ag (npr. Fsh) v vzorcu. Koncentracija Ag se izračuna s pomočjo kalibracijske

krivulje (18). Princip "premostitvene metode" (18) je podoben "sendvič princip" z razliko,

da se test uporablja za detekcijo Ab v vzorcu, ne pa Ag. V tem primeru reagenti vsebujejo

Ag, ki so označeni z biotinom in rutenijevim kompleksom. V prvem koraku pride do

vezave Ab iz testnega vzorca z Ag iz reagenta in se oblikuje imunski kompleks. V

naslednjem koraku imunski kompleks reagira s kroglicami, obloženimi s streptavidinom,

preko reakcije "biotin-streptavidin". Po drugi inkubaciji se reakcijska zmes prenese v

15

merilno celico. Imunski kompleksi se vežejo na elektrode. Nevezani vzorec in reagent se

spereta. V ECL reakciji je konjugat derivat rutenija in ECL reakcija je električno

stimulirana. Meri se količina oddane svetlobe, ki je sorazmerna količini analita v testnem

vzorcu. Koncentracija Ab se ovrednoti in izračuna s pomočjo kalibracijske krivulje (18).

Slika 2: Potek MEIA testa

(prirejeno po viru: http://www.drtanandpartners.com/wp-

content/uploads/2014/05/learning_immunoassay.pdf, dostopno: 08. 10. 2014)

Slika 3: ECLIA metoda – reakcija imunskega kompleksa z mikrodelcem

(prirejeno po viru: http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/gaertner-markus-2004-09-

24/HTML/image008.jpg, dostopno: 08.10.2014)

16

2. NAMEN DELA

Motnje menstrualnega cikla zahtevajo stopenjsko diferencialno diagnostiko. Del te

diagnostike je tudi določanje serumskih koncentracij gonadotropnih hormonov in Prl. Za

določanje hormonov so dostopne različne imunokemijske metode, ki se razlikujejo v

specifičnosti in občutljivosti, hitrosti merjenja rezultatov, težavnosti izvedbe in končno tudi

v ceni. Zato je pomembno, da vsak laboratorij glede na zahteve dela in lastne možnosti

izbere ustrezno metodo. Katero metodo in merilni instrument bomo izbrali, je odvisno od

več dejavnikov. Poznati moramo lastnosti analitov, ki jih določamo, lastnosti posameznih

metod in dostopno merilno tehnologijo.

S časom se razvijajo inovativne tehnologije, ki ponujajo različne prednosti. Omogočajo

izvajanje testov visoke kakovosti in hitrih rezultatov. Po drugi strani se v laboratorijih

pojavlja potreba po zamenjavi zastarelih merilnih instrumentov z novimi, učinkovitejšimi.

V laboratoriju Zdravstvenega doma dr. Franca Ambrožiča bomo zamenjali imunokemični

analizator Axsym proizvajalca Abbott z analizatorjem Cobas e 411 proizvajalca Roche.

Abbottov analizator uporablja MEIA metodo, analizator proizvajalca Roche pa ECLIA

inovativno metodo. Na obeh analizatorjih bomo merili serumske vrednosti gonadotropnih

hormonov (Fsh, Lh) in Prl v vzorcih ginekoloških pacientk Zdravstvenega doma dr. Franca

Ambrožiča v Postojni. V nalogi bomo ugotavljali, ali sta merilna instrumenta Axsym in

Cobas e 411 med seboj izmenljiva in če lahko uporabljamo enega namesto drugega.

Zanima nas, kako dobro se ujemajo izmerjene vrednosti na obeh aparatih. Najprej bomo

ugotavljali točnost in natančnost merjenja Fsh, Lh in Prl na Cobasu e 411 z namenom

verifikacije nove metode, nato pa bomo ugotavljali primerljivost med aparatoma. Za

ocenjevanje ujemanja moramo izbrati prave relevantne atribute merjenja in povedne načine

njihovega prikaza. Dobljene rezultate in ujemanje metod za vse tri parametre bomo

nazorno grafično prikazali in opisno ocenili s pomočjo dveh praktičnih in enostavnih

statističnih metod: Bland-Altmanovo metodo (diagram razlik) in Krouwer-Montijevo

metodo (gorski diagram).

17

3. METODE

3.1 Testni vzorci

Primerni vzorci za določanje koncentracij Fsh (19, 7), Lh (20, 8) in Prl (21, 9) so humani

krvni serum ali plazma (zbrana v epruveto z Na-heparinom ali s trikalijevo

etilendiamintetraocteno kislino (K3 EDTA)). Fsh, Lh in Prl smo določali v krvnih serumih.

Pacientkam, ki so bile napotene iz ginekoloških ambulant in so imele naročene prej

omenjen hormone, smo z venskim odvzemom po standardiziranem postopku (22) odvzeli

kri v epruveto z ločevalnim gelom in brez antikoagulanta. Vzorce smo pustili na stojalu 30

minut in jih potem centrifugirali 10 minut na 3000 obratov/min. Preverili in uklonili smo

mehurčke, ki bi motili analize. Izvedli smo analize hormonov na analizatorju Axsym in

analizatorju Cobas e 411. Potrebno je poudariti, da smo z vsakim vzorcem, reagentom,

kalibratorjem in kontrolo rokovali kot s potencialno kužnim materialom. Koncentracije Fsh

smo merili v 37 vzorcih, Lh v 42 vzorcih in Prl v 45 vzorcih. Za rutinsko merjenje

posameznega hormona je potrebno vsaj 150 µL vzorca (19, 20, 21). Vzorci za določitev

omenjenih hormonov so stabilni 24–48 ur na temp. 2–8°C (19, 7). Vzorci, zmrznjeni na -

20 °C, so stabilni 6 mesecov (7, 8, 9). Da bi se zmanjšal učinek izhlapevanja, je

priporočena izvedba vseh analiz znotraj dveh do treh ur od vstavljanja v analizator (19, 7).

Po končanih analizah smo vzorce, porabljene reagente, kontrole in kalibratorje primerno

odložili med infektivni odpad.

3.2 Merilni instrumenti in reagenti

Serumske koncentracije Fsh, Lh in Prl smo določili na dveh imunoloških analizatorjih: 1.

Axsym, proizvajalca Abbott (Abbott Laboratories Diagnostics Division, (slika 4))

2. Cobas e 411, proizvajalca Roche (Roche Diagnostics GmbH, slika (5)).

Uporabili smo tovarniško pripravljene reagente, raztopine in dodatni material. Pripravo

reagentov in potrebnega materiala smo izvedli po navodilih in priporočilih proizvajalca.

3.2.1 Imunološki analizator Axsym

Imunološki analizator Axsym za serumsko določanje Fsh, Lh in Prl uporablja MEIA

imunokemijski test (princip testa je opisan v poglavju "Metode določanja hormonov"). V

nadaljevanju besedila sledi opis postopka merjenja analitov, potrebnih reagentov, raztopin,

18

kalibracijskega in kontrolnega materiala, ki smo ga uporabili za izvedbe testa oz. za

določanje koncentracij hormonov.

Slika 4: Imunološki analizator Axsym, Abbott Diagnostics

(vir: http://www.alibaba.com/product-detail/AXSYM-ABBOTT-Analyzer-Original-

Reagents_106145798.html, dostopano: 08.10.2014)

3.2.1.1 Princip merjenja Fsh, Lh in Prl

V reakcijske posodice, ki jih vstavimo v analizator, se odpipetirajo vzorci in reagenti, ki so

potrebni za določanje Fsh hormona (19). Posodice se prenesejo v analizni center, kjer sledi

nadaljnje pipetiranje (19). Najprej se odpipetirajo vzorec, z anti-β Fsh obloženi mikrodelci

in Tris pufer (19). Sledi vezava Fsh iz vzorca in mikrodelcev, obloženih z anti-β Fsh, ki

oblikujejo kompleks "Ab-Ag" (19). Alikvot reakcijske zmesi, ki vsebuje kompleks "Ab-

Ag", vezan na mikrodelce, se prenese na celični matriks (19). Mikrodelci se ireverzibilno

vežejo na matriks iz steklenih vlaken (19). Nevezani material se izpere s pufrom za

spiranje (19). V celični matriks se doda anti-α Fsh Ab, konjugirano z alkalno fosfatazo

(19). Konjugat se veže na "Ab-Ag" kompleks (19). Celični matriks se ponovno izpere (19).

Sledi dodajanje substrata 4-MUP v celični matriks (19). Dobljeni fluorescenčni produkt se

meri z MEIA optičnim sistemom (19). Po podobnem postopku in principu poteka merjenje

Lh in Prl, razlika je le v uporabljenih reagentih (20, 21).

19

3.2.1.2 Reagenti in dodaten material

Fsh reagenčni kit Axsym (za izvedbo 100 testov) vsebuje naslednje komponente (19):

reagenčna steklenička 1: 1 steklenička (9,9 mL), ki vsebuje mikrodelce, označene z

mišjimi monoklonskimi Ab proti Fsh, in Tris pufer s proteinskimi stabilizatorji.

Konzervans: natrijev azid.

Reagenčna steklenička 2: 1 steklenička (13,4 mL), ki vsebuje konjugat, sestavljen iz

kozjih poliklonskih Ab proti Fsh, in alkalne fosfataze, Tris pufer s proteinskimi

stabilizatorji. Minimalna koncentracija: 0.1 μg/mL. Konzervans: natrijev azid.

Reagnečna steklenička 3: 1 steklenička (17,3 mL) Wash Buffer tekočine, ki vsebuje

surfaktant (snov, ki zmanjšuje površinsko napetost).

Reagenčna steklenička 4: 1 steklenička (50,2 mL) Tris pufra z 0,3 M NaCl.

Konzervansi: natrijev azid in protimikrobne učinkovine.

Lh reagenčni kit Axsym (reagenčni komplet za izvedbo 100 testov) vsebuje naslednje

komponente (20):

reagenčna steklenička 1: 1 steklenička (7,5 mL), ki vsebuje mikrodelce, označene z

mišjimi monoklonskimi Ab proti Lh, in Tris pufer. Konzervans: natrijev azid.

Reagenčna steklenička 2: 1 steklenička (14,2 mL), ki vsebuje konjugat sestavljen iz

kozjih poliklonskih Ab proti Lh in alkalne fosfataze, Tris pufer s proteinskimi

stabilizatorji. Minimalna koncentracija: 0,5 μg/mL. Konzervans: natrijev azid.

Reagenčna steklenička 3: 1 steklenička (26,5 mL) Tris pufra z 0.3 M NaCl.

Konzervansi: natrijev azid in protimikrobne učinkovine.

Prl reagenčni kit Axsym (za izvedbo 100 testov) vsebuje naslednje komponente (21):

Reagenčna steklenička 1: 1 steklenička (9,3 mL), ki vsebuje mikrodelce, označene z

mišjimi monoklonskimi Ab proti Prl, in Tris pufer. Konzervans: natrijev azid.

Reagenčna steklenička 2: 1 steklenička (9,0 mL), ki vsebuje konjugat, sestavljen iz

zajčjih poliklonskih Ab proti Prl, in alkalne fosfataze, Tris pufer s proteinskimi

stabilizatorji. Minimalna koncentracija: 0.1 μg/mL. Konzervans: natrijev azid.

20

Reagenčna steklenička 3: 1 steklenička (11,4 mL) Assay Diluent tekočine, zajčji

serum. Konzervans: natrijev azid.

Dodatni material in reagente prikazuje preglednica II.

Preglednica II: Dodatni material, reagenti in raztopine, ki so potrebne za določanje

Fsh, Lh in Prl na analizatorju Axsym

Dodatni material

Reakcijske posodice (ang. reaction vessels)

Celični matriksi (ang. matrix cells)

Vzorčne posodice (ang. sample cups)

Ostali reagenti in raztopine

Raztopina 1 MUP: 4 stekleničke (1 steklenička = 230 mL). Raztopina 1 MUP vsebuje 4-metilumbeliferil

fosfat, 1.2 mM in adenozin monofosfat (AMP) pufer. Konzervans je natrijev azid. Shranjuje se na temp. 2–8

°C. Ne sme se zamrzniti, ko se vzame iz hladilnika, je potrebno takoj porabiti. V reag. krožniku analizatorja

je uporabna 14 dni.

Raztopina 3 Matrix Cell Wash: 4 stekleničke (1 steklenička = 1000 mL). Raztopina 3 vsebuje 0,3 M NaCl

in Tris pufer. Konzervansi so: natrijev azid in protimikrobne učinkovine.

Raztopina 4 Line Diluent: 1 steklenička (V=10 L). Raztopina 4 vsebuje 0.1 M fosfatnega pufra.

Konzervansi so: natrijev azid in protimikrobne učinkovine. Shranjuje se na 15–30°C.

Probe Cleaning Solution: 4 stekleničke (1 steklenička=110 mL)/2 steklenički (1 steklenička = 220 mL).

Raztopina vsebuje 2 % tetraetilamonijev hidroksid (TEAH). Shranjuje se na 15–30 °C.

Priprava reagentov: reagenti, ki smo jih uporabili za določanje analitov, so bili že

pripravljeni. Vzeli smo jih iz hladilnika in jih takoj dali v reagenčni krožnik. Shranjevanje

in stabilnost reagentov: reagenčne komplete smo po navodilih proizvajalca hranili na

temperaturi 2–8 °C v hladilniku (19, 20, 21). Stabilni so do rokov, ki so označeni na

embalaži (19, 20, 21).

3.2.1.3 Kalibracijski material

Za merjenje Fsh smo uporabili komplet, ki vsebuje 2 steklenički (vsaka 4 mL) Fsh

kalibratorja (19). Kalibracijska raztopina 1 vsebuje predelani goveji serum, kalibracijska

raztopina 2 pa človeški Fsh, ki je pripravljen in predelan v govejem serumu (19). Kot

21

konzervans je uporabljen natrijev azid (19). Koncentracija Fsh v kalibracijskih raztopinah

je določena z Fsh 1. mednarodnim standardom (IS) 92/510 Svetovne zdravstvene

organizacije (WHO) in znaša: 0 IU/L v kalibracijski raztopini 1 in 100 IU/L v

kalibracijski raztopini 2 (19).

Za merjenje Lh smo uporabili komplet, ki vsebuje 2 steklenički (vsaka 4 mL) Lh

kalibratorja (20). Kalibracijska raztopina 1 vsebuje telečji serum, kalibracijska raztopina 2

pa človeški Lh, ki je pripravljen in predelan v telečjem serumu (20). Kot konzervans je

uporabljen natrijev azid (20). Koncentracije Lh v kalibracijskih raztopinah so določene z

WHO Lh 2. IS 80/552 standardom (20): 0 IU/L v kalibracijski raztopini 1 in 25 IU/L v

kalibracijski raztopini 2.

Za merjenje Prl smo uporabili komplet, ki vsebuje 2 steklenički (vsaka 4 mL) Prl

kalibratorja (21). Kalibracijska raztopina 1 vsebuje Tris pufer s proteinskimi stabilizatorji,

kalibracijska raztopina 2 pa človeški Prl in Tris pufer s proteinskimi stabilizatorji (21). Kot

konzervans je uporabljen natrijev azid (21). Koncentracije Prl v kalibracijskih raztopinah

so določene z WHO Prl 3. IS 84/500 standardom: 0 μg/L v kalibracijski raztopini 1 in 30

μg/L v kalibracijski raztopini 2 (21).

Predhodno pripravljene kalibracijske raztopine smo rahlo premešali. V prvo vzorčno

posodico (ang. sample cup) smo nakapljali 350 μL kalibracijske raztopine 1, v drugo pa

350 μL kalibracijske raztopine 2. Postopek je isti pri vseh treh parametrih. Pri izbiri

volumna smo upoštevali priporočila proizvajalca (19, 20, 21). Po uporabi kalibracijske

raztopine shranjujemo na temp. 2–8°C (19, 20, 21). Stabilne so do izteka roka, ki je

označen na embalaži (19, 20, 21).

3.2.1.4 Kontrolni material

Kontrolne raztopine so razdeljene v 3 stekleničke (3 nivoji: nizek L (ang. low), srednji M

(ang. medium) in visok H (ang. high) (19)). Volumen kontrolne raztopine v vsaki

steklenički je 8 mL (19). Kot konzervans je uporabljen natrijev azid (19). Tovarniško

pripravljene kontrole smo pred uporabo rahlo premešali. Pri tem smo bili pozorni na

nastanek mehurčkov, ki bi motili analizo. V vsako vzorčno posodico smo kanili 200 μL

posamezne kontrolne raztopine. Pri izbiri volumna smo upoštevali priporočila proizvajalca

(19). Postopek je isti pri vseh treh parametrih (20, 21). Po uporabi kontrolne raztopine

shranjujemo na temp. 2–8°C (19). Stabilne so do izteka roka, ki je označen na embalaži

22

(19). Kontrolne raztopine za Fsh vsebujejo humani Fsh, pripravljen v telečjem serumu

(19). Razpon koncentracij Fsh v kontrolnem materialu L je 3.5–6.5 IU/L (povprečna

vrednost (povp. vr.) je 5 IU/L), v kontrolnem materialu M je 18–32 IU/L (povp. vr. je 25

IU/L) in v kontrolnem materialu H je 53–97 IU/L (povp. vr. je 75 IU/L) (19).

Kontrolne raztopine za Lh vsebujejo humani Lh, pripravljen v govejem serumu (20).

Razpon koncentracij Lh v kontrolnem materialu L je 3.5–6.5 IU/L (povp. vr. je 5 IU/L), v

kontrolnem materialu M je 30–50 IU/L (povp. vr. je 40 IU/L) in v kontrolnem materialu H

je 57–103 IU/L (povp. vr. je 80 IU/L (20)). Kontrolne raztopine za Prl vsebujejo humani

Prl in Tris pufer s proteinskimi stabilizatorji (21). Razpon koncentracij Prl v kontrolnem

materialu L je 6–10 μg/L (povp. vr. 8 μg/L), v kontrolnem materialu M je 16–24 μg/L

(povp. vr. je 20 μg/L) in v kontrolnem materialu H je 32–48 μg/L (povp. vr. je, oz. 40 μg/L

(21)).

3.2.1.5 Rezultati in merilna območja

Rezultate Fsh, Lh in Prl, ki jih je podal analizator na osnovi kalibracijske krivulje (19, 20,

21), smo vnesli v Microsoft (MS) Office Excel in jih ustrezno statistično ovrednotili

(priloga 1, priloga 3, priloga 5). Merilno območje za Fsh je 0,37–150 IU/L (19), za Lh je

0,5–250 IU/L (20) in za Prl je 0,6–200 μg/L (21). Spodnje meje merilnih območij

predstavljajo najnižje koncentracije analitov, ki jih sistem lahko izmeri/zazna (19).

Koncentracije, ki presegajo zgornjo mejo merilnih območij, je potrebno redčiti po

protokolu za ročno redčenje vzorcev, saj sistem nima možnosti avtomatiziranega redčenja

(19).

3.2.1.6 Referenčne vrednosti

Referenčne vrednosti za Fsh, ki jih določa proizvajalec (19), so prikazane v preglednici

III. Vrednosti in območja so dobljena na osnovi študije, ki je zajemala 150 zdravih moških,

35 žensk v postmenopavznem obdobju (niso bile na nadomestni hormonski terapiji) in 44

zdravih žensk v normalnem spolnem ciklu (19).

23

Preglednica III: Referenčne vrednosti: Fsh , Axsym System, Abbott Diagnostics

Spol in faza cikla Število vključenih v študijo

(N)

Povprečje

Razpon vrednosti

(IU/L)

Ženske v folikularni fazi 144 4.94 3.09–7.90

Ženske v sredini menstrualnega

cikla 42 10.39 2.27–18.51

Ženske v luteinski fazi 138 2.76 1.38–5.52

Ženske v postmenopavznem

obdobju 35 61.15* 30.57–106.32

Moški 150 3.77 1.13–12.51

Referenčne vrednosti za Lh, ki jih določa proizvajalec (20), so prikazane v preglednici IV.

Vrednosti in območja so dobljena na osnovi študije, ki je zajemala 19 zdravih moških, 26

žensk v postmenopavznem obdobju in 26 zdravih žensk v normalnem spolnem ciklu (20).

Preglednica IV: Referenčne vrednosti vrednosti: Lh , Axsym System, Abbott,

Diagnostics

Spol in faza cikla Število vključenih v študijo

(N) Povprečje

Razpon vrednosti

(IU/L)

Ženske v folikularni fazi 96 6 1–18

Ženske v sredini menstrualnega

cikla 21 44 24–105

Ženske v luteinski fazi 92 5 0.4–20

Ženske v postmenopavznem

obdobju 26 34 15–62

Moški 19 5 2–12

Referenčne vrednosti za Prl, ki jih določa proizvajalec (21), so prikazane v preglednici V.

Vrednosti in območja so dobljena na osnovi študije, ki je zajemala 189 navidezno zdravih

posameznikov (ženske in moški (21)).

24

Preglednica V: Referenčne vrednosti vrednosti: Lh , Axsym System, Abbott,

Diagnostics

Spol Število vključenih v študijo

(N)

Povprečje

Razpon vrednosti

(μg/L)

Ženske 102 7.97 1.39–24.20

Moški 87 5.60 1.61–18.77

Slika 5: Imunološki analizator Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH

(vir: http://www.adriamed.com.mk/en/products/roche-diagnostics/cobas-e-411/, dostopno: 08.10.2014)

3.2.2.1 Princip merjenja Fsh, Lh in Prl

Obstajajo 3 oblike testa, ki se lahko izvajajo na Cobas e 411 analizatorju (18):

kompetitivna oblika, "sendvič" oblika (eno/dvostopenjska), in "premostitvena" oblika

(Metode določanja hormonov: ECLIA (18)). Koncentracije hormonov smo merili z

dvostopenjsko "sendvič" metodo, ki se uporablja za merjenje koncentracij analitov večje

molekulske mase (18). Sledi opis postopka in principa meritve na primeru Fsh. Izvedba

testa je potekala 18 minut na naslednji način (7): tekom prve inkubacije 40 μL vzorca,

monoklonsko Fsh-specifično Ab, obloženo z biotinom, in monoklonalno Fsh-specifično

Ab, označeno z rutenijevim kompleksom, oblikujejo "sendvič kompleks". V drugi

inkubaciji po dodatku mikrodelcev, ki so obloženi s streptavidinom, se kompleks veže na

trdno fazo. To omogoča interakcija biotina in streptavidina. Reakcijska zmes se nato

aspirira v merilno celico. Mikrodelci se "magnetsko ulovijo" na površino elektrod.

Nevezane snovi se izperejo s tekočino ProCell. Z dovajanjem napetosti elektrodam se

25

spodbudi kemiluminiscenčna emisija, ki se meri na fotopomnoževalcu. Pridobivanje

rezultatov omogoča kalibracijska krivulja, ki jo analizator specifično generira z 2-točkovno

kalibracijo in "master krivuljo" (črtna koda reagenta). Postopek in princip merjenja Lh in

Prl potekata tako kot merjenje Fsh (8, 9). Razlika je v volumnu vzorca, ki v primeru Lh

znaša 20 μL (8) in v primeru Prl 10 μL (9), ter v sestavi reagenčnega kompleta (8, 9).

3.2.2.2 Reagenti in dodaten material

Fsh reagenčni komplet Cobas e 411 vsebuje naslednje komponente (7):

M: mikrodelci označeni s streptavidinom (bel pokrov), 1 steklenička (6,5 mL):

mikrodelci označeni s streptavidinom (0,72 mg/mL); konzervans.

R1: anti-Fsh Ab označeno z biotinom (siv pokrov), 1 steklenička (10 mL):

biotinilirana monoklonska (mišja) anti-Fsh Ab (0,5 mg/L), 2-(N-morfolino)

etansulfonska kislina (MES pufer 50 mmol/L, pH 6,0); konzervans.

R2: anti-FSH-Ab~Ru (bpy)32+

(črn pokrov), 1 steklenička (10 mL): monoklonska anti-

Fsh mišja Ab označena z rutenijevim kompleksom (0,8 mg/L), MES pufer (50

mmol/L, pH 6,0); konzervans.

Lh reagenčni komplet Cobas e 411 vsebuje naslednje komponente (8):

M: mikrodelci označeni s streptavidinom (bel pokrov), 1 steklenička (6,5 mL):

mikrodelci označeni s streptavidinom (0,72 mg/mL); konzervans.

R1: anti-Lh Ab označeno z biotinom (siv pokrov), 1 steklenička (10 mL): biotinilirana

monoklonska mišja anti-Lh Ab (2,0 mg/L), Tris pufer (50 mmol/L, pH 8,0);

konzervans.

R2: anti-Lh-Ab~Ru (bpy)32+

(črn pokrov), 1 steklenička (10 mL): monoklonska anti-

Lh mišja Ab označena z rutenijevim kompleksom (0,3 mg/L), Tris pufer (50 mmol/L,

pH 8,0); konzervans.

Prl reagenčni komplet Cobas e 411 vsebuje naslednje komponente (9):

M: mikrodelci označeni s streptavidinom (bel pokrov), 1 steklenička (6,5 mL):

mikrodelci označeni s streptavidinom (0,72 mg/mL); konzervans.

R1: anti-Prl Ab označeno z biotinom (siv pokrov), 1 steklenička (10 mL): biotinilirana

monoklonska mišja anti-Prl Ab (0,7 mg/L), fosfatni pufer (50 mmol/L, pH 7,0);

konzervans.

26

R2: anti-Prl-Ab~Ru (bpy)32+

(črn pokrov), 1 steklenička (10 mL): monoklonska anti-

Prl mišja Ab označena z rutenijevim kompleksom (0,35 mg/L), fosfatni pufer (50

mmol/L, pH 7,0); konzervans.

Priprava reagentov: predhodno pripravljene reagente smo vzeli iz hladilnika in jih

vstavili v reagenčni krožnik. Pri tem smo se izogibali penjenju, ki bi motilo potek analize

(7). Shranjevanje in stabilnost reagentov (7, 8, 9): po uporabi smo reagente shranili na

temperaturo 2–8°C. Po odprtju so reagenčni kiti stabilni 12 tednov, zaprti pa do datuma

poteka roka, ki je označen na embalaži. V analizatorju so stabilni 8 tednov.Sledi opis

potrebnega dodatnega material, raztopin in reagentov (pregledniva VI): ProCell (pH

6,8) je sistemska raztopina, ki vsebuje fosfatni pufer (300 mmol/L), TPA (180 mmol/L),

detergent (< 0,1 % ali 0,1 %) in konzervans (23). Uporablja se za generiranje

elektrokemijskega signala znotraj sistema, za spiranje mikrodelcev, vezanih na

streptavidin iz merilne celice, in prenašanje reakcijske zmesi (23). CleanCell (pH 13,2)

raztopino uporabljamo za čiščenje pretočnega sistema analizatorja in merilne celice po

vsaki meritvi (24). Vsebuje kalijev hidroksid (KOH, 176 mmol/L), detergent (< 0,1 % ali

0,1 %) in je dražilna snov (24). ProCell in CleanCell se shranjujeta na temp. 15–20°C in

sta uporabna do datuma, ki je označen na embalaži (23, 24). Z demineralizirano vodo smo

pripravili 10 % raztopino SysWash, ki se uporablja za spiranje sistema (7). SysClean je

tekočina, ki se uporablja za 2-tedensko vzdrževanje analizatorja (7).

Preglednica VI: Dodaten material in raztopine, ki smo jih uporabili za določanje

Fsh, Lh in Prl na Cobasu e 411

Reagenčni, kalibracijski in kontrolni material

Fsh reagenčni komplet (za izvedbo 100 testov).

Lh reagenčni komplet (za izvedbo 100 testov).

Prl reagenčni komplet (za izvedbo 100 testov).

Fsh CalSet II (4 stekleničke: 2 steklenički Fsh Cal 1 – vsaka vsebuje 1.0 mL kalibratorja 1; 2 steklenički FSH

Cal 2 – vsaka vsebuje 1.0 mL kalibratorja 2).

Lh CalSet II (4 stekleničke: 2 steklenički Lh Cal 1 – vsaka vsebuje 1.0 mL kalibratorja 1; 2 steklenički LH

Cal 2 – vsaka vsebuje 1.0 mL kalibratorja 2).

Prl CalSet II (4 stekleničke: 2 steklenički Prl Cal 1 – vsaka vsebuje 1.0 mL kalibratorja 1; 2 steklenički PRL

Cal 2 – vsaka vsebuje 1.0 mL kalibratorja 2).

PreciControl Universal (za 4 x 3mL) kontrolni komplet: PC U1 (2 steklenički : 2 x 3.0 mL kontrolnega

27

seruma) in PC U2 (2 steklenički: 2 x 3.0 mL kontrolnega seruma).

Dodatne raztopine/tekočine

ProCell (6 x 380mL) – spiralna tekočina

CleanCell (6 x 380mL) – tekočina za čiščenje merilne celice

SysWash (1 x 500 mL) – dodatek za spiralno tekočino

SysClean (5 x 100mL) – tekočina za sistemsko čiščenje analizatorja

Dodatni material

CalSet Vials – posodice za kalibracijski material in priložene črtne kode

ControlSet Vials – posodice za kontrolni material in priložene črtne kode

Sample Cups – vzorčne posodice

AssayCup (60 x 60) – reakcijske posodice

AssayTip (30 x 120) – nastavki za pipetiranje

Adapter za SysClean tekočino

Waste posoda – posoda za trdi odpad (nastavki za pipetiranje, reakcijske posodice)

Proizvajalec: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

3.2.2.3 Kalibracijski material

Za merjenje Fsh smo uporabili liofilizirani Fsh CalSet II (4 x 1 mL), ki vsebuje konjski

serum, ki mu je dodan humani Fsh v dveh koncentracijskih razponih: ~ 1.0 IU/L

kalibracijska raztopina 1 in ~ 55.0 IU/L kalibracijska raztopina 2 (25). Metoda je

standardizirana po encimsko-imunski metodi določanja Fsh (2. International reference

preparation (IRP) WHO referenčni standard 78/549 (25)).

Za merjenje Lh smo uporabili liofilizirani Lh CalSet II (4 x 1 mL), ki vsebuje humani

serum, ki mu je dodan humani Lh v dveh koncentracijskih razponih: ~ 1.0 IU/L

kalibracijska raztopina 1 in ~ 45.0 IU/L kalibracijska raztopina 2 (26). Metoda je

standardizirana po 2. mednarodnem standardu za določanje LH (Nacionalni inštitut za

biološke standarde in kontrole (NIBSC), 80/552, (26)).

Za merjenje Prl smo uporabili liofilizirani, puferirani Prl CalSet II (4 x 1,0 mL), ki vsebuje

konjski serum, ki mu je dodan rekombinantni Prl v dveh koncentracijskih razponih: ~ 0,09

μg/L kalibracijska raztopina 1 in ~ 94,0 μg/L kalibracijska raztopina 2 (27). Metoda je

28

standardizirana po 3. IRP WHO referenčnem standardu 84/500 (27). Pred uporabo smo

kalibracijske materiale raztopili v 1 mL destilirane vode in jih pustili 20 do 25 minut na

temperaturi 20–25 °C, da se stabilizirajo (25, 26, 27). Naredili smo alikvote po 250 µL. Za

takojšnjo kalibracijo vsakega hormona smo uporabili 250 µL, preostale alikvote smo

shranili na temperaturo -20 °C. Vsak reagenčni komplet, ki je označen s črtnimi kodami,

vsebuje specifično informacijo o kalibraciji za določeni lot reagenta (25). Po kalibraciji

smo dobili ustrezno krivuljo. Vse parametre smo kalibrirali po odprtju vsakega

reagenčnega kompleta z novo "lot številko" (25, 26, 27). Proizvajalec priporoča izvajanje

kalibracije po enem mesecu (pred uporabo istega reagenčnega kompleta z isto lot številko),

po sedmih dneh (kadar uporabljamo isti reagenčni komplet), po potrebi (kadar so kontrole

izven določenih mejah (25)).

3.2.2.4 Kontrolni material

Uporabili smo Elecsys PCU kontrolni set, v dveh koncentracijskih nivojih (nizka in visoka

vrednost) za izvajanje kontrole kakovosti in nadzor točnosti ter natančnosti meritve naših

parametrov (28). Set vsebuje humani, liofilizirani serum, ki smo ga raztopili v 3 mL

destilirane vode (28). Material smo rahlo premešali in pustili stati na temperaturi 20–25°C,

30 minut, da se popolnoma raztopi in homogenizira. Tako pripravljen material smo

razdelili v štiri alikvote (en alikvot vsebuje 500 μL raztopljenega kontrolnega seruma) v

zato priložene in s črtnimi kodami označene posodice za oba nivoja (PC U1 in PC U2). En

par kontrol smo uporabili, ostale pa smo shranili na -20 °C. Kontrolo smo izvajali vsak dan

pred merjenjem konc. Fsh/Lh/Prl v vzorcih in po kalibraciji. Neodprt kontrolni set se

shranjuje v hladilniku do poteka roka uporabe (28). Alikvoti shranjeni na temperaturi -20

°C so stabilni 1 mesec, na temperaturi 2–8°C pa 3 dni (28). Tisti, ki so v analizatorju, so

stabilni do 5 ur (28).

Razpon koncentracij Fsh v kontrolnem materialu L je 13,02–24,18 IU/L (povp. vr. 18,6

IU/L), v kontrolnem materialu H 36,89–68,51 IU/L (povp. vr. 52,7 IU/L).

Razpon koncentracij Lh v kontrolnem materialu L je 8,30–12,71 IU/L (povp. vr. 10,5

IU/L), v kontrolnem materialu H 41,16–63,04 IU/L (povp. vr. 52,1 IU/L).

Razpon koncentracij Prl v kontrolnem materialu L je 8,91–13,65 μg/L (povp. vr. 11,28

μg/L), v kontrolnem materialu H 32,30–49,48 μg/L (povp. vr. 40,89 μg/L).

29

3.2.2.5 Rezultati in merilna območja

Analizator samodejno izračuna koncentracije analitov v vzorcu in jih poda v mIU/mL ali

IU/L enotah (Fsh in Lh). Rezultate Prl poda v μIU/mL ali mIU/L ali v ng/mL. Pri Fsh

ikterija (bilirubin < 64 mg/dL ali < 1094 μmol/L), hemoliza (hemoglobin (Hb) < 1,0 g/dL

ali < 0.621 mmol/L), lipemija (endogeni lipidi < 1900 mg/dL) in biotin (< 246 nmol/L ali <

60 ng/mL) ne vplivajo na rezultate testa (26). Pri Lh ikterija (bilirubin < 66 mg/dL ali <

1129 μmol/L), hemoliza (Hb < 1,0 g/dL ali < 0.621 mmol/L) , lipemija (endogeni lipidi <

1900 mg/dL) in biotin (< 205 nmol/L ali < 50 ng/mL) ne vplivajo na rezultate testa (8). Pri

Prl ikterija (bilirubin < 30 mg/dL ali < 513 μmol/L), hemoliza (Hb < 1,5 g/dL ali < 0.932

mmol/L) , lipemija (endogeni lipidi < 1500 mg/dL) in biotin (< 164 nmol/L ali < 40

ng/mL) ne vplivajo na rezultate testa (9). Rezultate izmerjenih parametrov smo vnesli v

MS Office Excel in jih ustrezno statistično ovrednotili (priloge 1, 3, 5). Merilno območje je

opredeljeno kot spodnja meja zaznavanja in maksimum "Master krivulje" (7). Merilno

območje za Fsh in Lh je isto: 0,100–200 IU/L (7, 8). Vrednosti, ki so pod spodnjo mejo

zaznavanja, analizator poda kot < 0,100 IU/L (7, 8). Vrednosti, ki presegajo merilno

območje, poda kot > 200 IU/L (7, 8). Merilno območje za Prl je 0,0470–470,00 μg/L (9)).

Vrednosti, ki so pod spodnjo mejo zaznavanja, analizator poda kot < 0,0470 μg/L (9).

Vrednosti, ki presegajo merilno območje, poda kot > 470 μg/L (9). Redčenje vzorcev ni

potrebno zaradi širokih merilnih območji (7, 8, 9).

3.2.2.6 Referenčne vrednosti

Referenčne vrednosti za Fsh, ki jih določa proizvajalec, so prikazane v preglednici VII

(7). Vrednosti in območja so dobljena na osnovi študije, ki je zajemala 319 moških, 376

žensk v folikularni fazi cikla, 56 v ovulacijski, 349 v luteinski in 181 žensk v

postmenopavznem obdobju (7).

Preglednica VII: Referenčne vrednosti: Fsh , Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH

Spol in faza cikla Število vključenih v študijo

(N)

Fsh (IU/L)

Percentile

50. 5. 95.

Ženske v folikularni fazi 376 6,9 3,5 12,5

Ženske v ovulacijski fazi 56 12,3 4,7 21,5

30

Ženske v luteinski fazi 349 3,6 1,7 7,7

Ženske v postmenopavznem obdobju 181 67,0 25,8 134,8

Moški 319 4,6 1,5 12,4

Referenčne vrednosti za Lh, ki jih določa proizvajalec, so prikazane v preglednici VIII (8).

Vrednosti in območja so dobljena na osnovi študije, ki je zajemala 322 moških, 316 žensk

v folikularni fazi cikla, 56 v ovulacijski, 280 v luteinski in 132 žensk v postmenopavznem

obdobju (8).

Preglednica VIII: Referenčne vrednosti :Lh , Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH

Spol in faza cikla Število vključenih v študijo

(N)

Lh (IU/L)

Percentile

50. 5. 95.

Ženske v folikularni fazi 316 5,9 2,4 12,6

Ženske v ovulacijski fazi 56 30,8 14,0 95,6

Ženske v luteinski fazi 280 4,3 1,0 11,4

Ženske v postmenopavznem obdobju 132 29,1 7,7 58,5

Moški 322 4,0 1,7 8,6

Referenčne vrednosti za Prl, ki jih določa proizvajalec, so prikazane v preglednici IX (9).

Vrednosti in območja so dobljena na osnovi študije, ki je zajemala 300 zdravih

krvodajalcev: 102 moška in 198 žensk, ki niso noseče (9).

Preglednica IX: Referenčne vrednosti: Prl, Cobas e 411, Roche Diagnostics GmbH

Spol in faza cikla Število vključenih v študijo

(N)

Prl (μg/L)

Percentile

50. 2,5-97,5

Ženske (ki niso noseče) 198 10,6 4,79-23,3

Moški 102 7,30 4,04-15,2

31

3.3 Verifikacija ECLIA metode

Pred rutinsko uporabo nove metode jo je treba ovrednotiti: validirati in verificirati (29).

Validacijo ECLIA metode je zagotovil proizvajalec, mi smo metodo le verificirali (29). V

ta namen smo ugotavljali natančnost in točnost metode. Natančnost metode (ang.

precision) nam pove stopnjo skladnosti med rezultati, ki smo jih dobili z merjenjem pod

določenimi pogoji (ista metoda, enak poskusni material in oprema, isti laboratoriji in

analitik (29)). Da bi ocenili natančnost naše metode, smo izvedli teste ponovljivosti, ki smo

jih ovrednotili s koeficientom variacije (KV (29)). KV je relativna mera razpršenosti

podatkov in se izraža kot kvocient med standardnim odklonom (SD) in aritmetično sredino

( (29, 30)). SD je mera, ki opisuje razpršenost rezultatov in je definirana kot kvadratni

koren iz variance (druge mere razpršenosti (29, 30)). je ena od mer centralnih vrednosti

podatkov (29, 30). Predstavlja srednjo vrednost, ki je definirana kot vsota vseh vrednosti,

deljena s številom enot, na katerih je bila spremenljivka izmerjena (29, 30). Kot vzorec

smo uporabili "pool serum" človeškega izvora, ki smo ga naredili iz 10 serumskih vzorcev

različnih pacientk (dobili smo 20 mL seruma). Tri dni zapored (13. 11., 14. 11. in 15. 11.

2012) smo izvajali po 6 meritev Fsh, Lh in Prl iz istega "pool seruma". Dobljene vrednosti

smo vnesli v preglednico programa MS Office Excel. V istem programu smo izračunali

povprečja, SD in KV. Analize smo izvajali v istem analizatorju (Cobas e 411), iz istega

vzorca ("pool seruma"), z enakimi reagenti in materialom proizvajalca Roche Diagnostic.

Postopke analize je izvajal isti analitik. KV, ki ga je podal proizvajalec, smo primerjali s

KV, ki smo ga izračunali za posamezni parameter. Upoštevali smo priporočljiv kriterij za

KV: 1 % do 5 % (31). V preglednici X so prikazani rezultati natančnosti (znotraj-serijska

ponovljivost/within-run precision in meddnevna ponovljivost vzorcev izven

serije/intermed. precision/total precision) za Fsh in Lh, ki jih je podal proizvajalec (7, 8).

Rezultati natančnosti za Prl so prikazani v preglednici XI (9).

Preglednica X: Rezultati natančnosti za Fsh in Lh, proizvajalca Roche Diagnostics

GmbH

Meritve na cobas e 411 analizatorju: Fsh in Lh

Znotraj serijska

natančnost/ponovljivost/within-

run precision

Meddnevna

natančnost/ponovljivost

vzorcev izven

serije/Interm.precision

(Fsh)/total precision

(Lh)

32

Parameter Vzorec Povprečje

(IU/L) SD (IU/L) KV (%) SD (IU/L)

KV

(%)

Fsh

Človeški

serum 1 1.2 0.02 1.8 0.06 5.3

Človeški

serum 2 50.4 0.74 1.5 1.90 3.8

Človeški

serum 3 103 1.85 1.8 5.24 5.1

PC U1 11.1 0.22 2.0 0.41 3.7

PC U2 28.9 0.40 1.4 0.85 2.9

Lh

Človeški

serum 1 0.54 0.01 1.8 0.03 5.2

Človeški

serum 2 27.19 0.21 0.8 0.54 2.0

Človeški

serum 3 50.72 0.41 0.8 1.01 2.0

PC U1 9.38 0.11 1.1 0.19 2.0

PC U2 44.82 0.42 0.9 0.83 1.9

Za določanje natančnosti (ponovljivosti) so uporabili Elecsys reagente, človeške "pool

serume" in kontrolni material PC U1 in PC U2. Postopek so izvedli po preoblikovanem

protokolu (EP5-A, Inštitut za klinične in laboratorijske standarde (CLSI:), in sicer 6

meritev dnevno, 10 dni zapored (n = 60 meritev).

Preglednica XI: Rezultati natančnosti za Prl, proizvajalca Roche Diagnostics GmbH

Meritve na cobas e 411 analizatorju: Prl

Znotraj serijska

natančnost/ponovljivost/within-

run precision

Meddnevna

natančnost/ponovljivost

vzorcev izven

serije/Interm.precision

Parameter Vzorec Povprečje

(μg/L ) SD (μg/L) KV (%) SD (μg/L) KV (%)

Prl

Človeški

serum 1 14.1 0.559 4.0 0.700 5.0

Človeški

serum 2 33.7 0.728 2.2 1.22 3.6

Človeški

serum 3 127 2.30 1.8 3.54 2.8

Človeški

serum 4 232 4.53 2.0 8.55 3.7

PC U1 7.24 0.235 3.3 0.306 4.2

PC U2 27.3 0.724 2.6 0.916 3.4

33

Za določanje natančnosti so uporabili Elecsys reagente, človeške "pool serume" in

kontrolni material PC U1 in PC U2. Postopek so izvedli po preoblikovanem protokolu

(EP5-A, CLSI), in sicer 6 meritev dnevno, 10 dni zapored (n = 60 meritev).

Točnost (ang. accuracy) ali pravilnost metode nam pove, kako blizu je rezultat meritve

njegovi resnični oz. sprejeti vrednosti (referenčni vrednosti (29)). Izražamo ga kot napako

(sistematično napako), ki določa pravilnost rezultata/postopka (29). Napaka je lahko

absolutna (E) ali pa relativna (RE (29)). Absolutna napaka pomeni razliko med izmerjeno

(O) in sprejeto (referenčno/ciljno (C)) vrednostjo (C, E = O-C (29)). Relativno napako

izražamo v odstotkih proti sprejeti vrednosti, ki jo moramo poznati (enačba 1,(29)). Z

namenom da ugotovimo, če bomo z uporabo ECLIA metode dobili pravilne rezultate, smo

analizirali kontrolni material PC U, in sicer na obeh nivojih: PC U1 in PC U2. V istem

kontrolnem materialu smo izvedli 20 meritev konc. Fsh, Lh in Prl ter spremljali, če smo

dobili predpisane rezultate (rezultate znotraj referenčnih območji za oba nivoja). Izračunali

smo povprečja, SD, KV in RE (enačba 1) za posamezni parameter. Iz vrednosti RE smo

dobili podatke, koliko naše povprečne vrednosti odstopajo od povprečnih vrednosti, ki jih

je podal proizvajalec. Natančnost in točnost smo določili po delovnih navodilih (ZDM)

Službe za laboratorijsko diagnostiko: Uvajanje preiskave v rutinsko delo (31).

Enačba 1: Izračun relativne napake (29)

3.4 Statistične metode za vrednotenje ujemanja rezultatov dveh različnih

analitskih metod

V medicinskih laboratorijih se zelo pogosto zamenjujejo stari merilni instrumenti z novimi,

ki so preprostejši, cenovno ugodnejši, hitrejši ali kako drugače primernejši. Da bi lahko

uporabili en analizator namesto drugega, moramo oceniti, kako dobro se ujemajo z njima

izmerjene vrednosti (32). Obstajajo različni pristopi in metode za ocenjevanje ujemanja.

RE= ((Xizmjerena- Xciljna) / Xciljna) × 100

RE: relativna napaka

Xizmjerena: povp. vrednosti, ki smo jih izmerili

Xciljna: povp. vrednosti, ki ga je podal proizvajalec

34

Pogosto uporabljani metodi sta korelacija in linearna regresija, čeprav včasih zanju nista

primerna (32). Zato smo v nalogi uporabili alternativni pristop ocenjevanja ujemanja

rezultatov, ki temelji na grafičnih tehnikah, prikazih in enostavnejših izračunih (32).

3.4.1 Popolno ujemanje rezultatov

"Popolno ujemanje pomeni enako točnost in natančnost dveh metod (32)." Pri našem

merjenju je bistveno, da so dobljene vrednosti meritve čim bližje resnični (referenčni

vrednosti) R in da je variabilnost čim manjša. Pomemben je odnos med naslednjimi

parametri: dobljena/izmerjena vrednost (x), resnična vrednost (R), sistematična napaka

(pristranskost β) in slučajna napaka merjenja ((ε);enačba 2 (32)). Vsaka dobljena vrednost

se nekoliko razlikuje od resnične vrednosti. Ta odklon je posledica sistematične in slučajne

napake (32). Prva napaka je posledica nepravilnega izvajanja merjenja ali je povezana z

merilnim instrumentom, druga je posledica slučajnih, nepričakovanih vplivov in zato

privzamemo, da je porazdelitev normalna in je srednja vrednost nula (32). Na tej osnovi pa

ne moremo oceniti ujemanja (32). Vzrok za to je, da ne poznamo resnične vrednosti in

ujemanje lahko ocenimo le s pomočjo omenjenih napak (32). Pri tem je pomembno, da je β

= 0 in ε = čim manjši (32). Napake lahko ovrednotimo le z izračunom razlike parov

meritev, ki smo jih izvedli v obeh analizatorjih z dvema različnima metodama (32). Če pa

vzamemo kot resnično vrednost nek zlati standard merjenja, potem ne bi šlo več za

ujemanje, temveč za vprašanje umerjanja novega analizatorja (32). Nas je zanimala

praktična enakovrednost metod in ne umerjanje ali napovedovanje rezultatov ene metode

na podlagi druge.

Enačba 2: Klasični model merjenja (32)

3.4.2 Korelacija in linearna regresija

Korelacija kot mera linearne povezanosti predstavlja odnos med kovarianco rezultatov

obeh metod in zmnožkom njunih SD (enačba 3 (32)). Najpogosteje je izražena s

Pearsonovim korelacijskim koeficientom (enačba 3 (32)). Tako opisuje variabilnost

rezultatov obeh metod v odnosu z variabilnostjo rezultatov vsake posamezne metode (32).

Pearsonov koeficient korelacije ne zajema točnosti in variabilnosti razlik parov (natančnost

(32, 33)). Posledica tega, da korelacija ne zajema točnosti, je, da lahko popolnoma

x = R+ β + ε

35

korelirajo rezultati (ρ=1), ki se sploh ne ujemajo (ne ležijo na črti enakosti, oz. so daleč od

nje (32, 33)). Ko preverjamo metode, v glavnem uporabljamo celotni razpon vrednosti.

Posledica tega je večja korelacija, ki pa nikakor ne pomeni dobrega ujemanja vrednosti

(32). Zaradi naštetih razlogov lahko zaključimo, da korelacija ni toliko primerna za

ocenjevanje ujemanja. Omogoča pa druga vrednotenja, kot je npr. primerjanje skupine

rezultatov v celoti (32). Linearna regresija omogoča napovedovanje vrednosti ene

spremenljivke na podlagi druge (32, 33). Razmerje med spremenljivkami, ki korelirajo,

prikazuje linearna enačba 4 (konstanta k – naklon regresijske premice, n – presečišče na

ordinatni osi (32)). Za ocenjevanje ujemanja ni primerna metoda, ker ne vključuje točnosti

in natančnosti (32, 33). Iz vrednosti naklona premice in presečišča (naklon 1 kot domnevna

ustreznica natančnosti in presečišče 0 kot domnevna ustreznica točnosti) ne moremo

oceniti ujemanja za posamezne pare meritve (32). Možno je oceniti samo povprečno

skladanje za skupino (32). Pri ocenjevanju ujemanja imata napako obe spremenljivki (32).

Linearna regresija predpostavlja vrednosti neodvisne spremenljivke brez merske napake

(32, 33). Poleg tega pri ocenjevanju ujemanja ne želimo napovedovati rezultatov ene

metode iz rezultatov druge. Regresija je pomembno statistično orodje v drugih primerih

primerjav (npr. umerjanje ali pa dejansko napovedovanje rezultatov ene metode na podlagi

druge (32)).

Enačba 3: Pearsonov korelacijski koeficient (32)

Enačba 4: Linearna regresija (32)

3.5 Metoda Blanda in Altmana: diagram razlik

Statistična metoda, ki je najbolj primerna za ocenjevanje ujemanja in je postala standard, je

metoda J. Martina Blanda in Douglasa G. Altmana (32). Metoda temelji na izračunih

povprečja vseh parov meritev in razlike vseh parov meritev, ki sta izvedena na obeh

analizatorjih (32). Povprečja se nanesejo na absciso (x os) in razlike na ordinato (y os)

(33). "Zaradi tega, ker resnične vrednosti v posameznem paru meritve ne poznamo, pravita

ρxy = σ2xy / σxσy

y = kx + n

36

avtorja, je njena najboljša ocena povprečje meritev (32)." Z razlikami posameznih parov

meritev ocenimo variabilnost (32). Pristranskost (sistematično napako) ocenimo iz

povprečja teh razlik (32). Naslednji korak je določitev 95-odstotnega intervala

ujemanja/meji ujemanja (IU, enačba 5) in 95-odstotnega intervala zaupanja/meji zaupanja

(IZ, enačba 6 (33). Pri tem so pomembni: povprečje razlik (μ), njihov standardni odklon

(σ), normalna porazdelitev razlik (napak) in število enot (N)/skupno štev.meritev (32). "Ker

sta ti meji ujemanja vzorčni oceni s svojo lastno standardno napako, je to napako treba

upoštevati za natančno določitev razpona meja ujemanja (33). Njena velikost je odvisna od

variabilnosti razlik in velikosti vzorca (33).

Enačba 5: Izračun 95-odstotnih meja ujemanja (IU) pri normalni porazdelitvi napak (32)

zgornja 95-odstotna meja ujemanja

IU = μ + 1,96 σ

spodnja 95-odstotna meja ujemanja

IU = μ - 1,96 σ

Enačba 6: Izračun 95-odstotnih meja zaupanja (IZ) pri normalni porazdelitvi napak (32)

zgornja 95-odstotna meja zaupanja

IZ = μ + 1,96 σ/√N

spodnja 95-odstotna meja zaupanja

IZ = μ - 1,96 σ/√N

Bland -Altmanov diagram razlik lahko prikaže naslednje odklone (32):

(relativno) točnost s povprečjem razlik in odmik od tega,

natančnost z razpršenostjo razlik in odmik od tega,

trend,

heteroskedastičnost.

Ustrezno ujemanje pomeni, da je dovolj velik delež razlik na Bland-Altmanovem diagramu

dovolj majhen oz. dovolj blizu nuli (32). Zato moramo predhodno določiti praktično

nepomembno razliko (δ0) oz. praktično sprejemljivo mejo razlik med metodama (32).

Sistematična napaka je vsak odmik povprečja razlik od nule (32). To napako je možno

37

računsko korigirati, če na diagramu ni drugih odklonov (32). Na oceno sprejemljivosti

ujemanja zelo vpliva variabilnost napak (32). Če je ta velika, je to resna pomanjkljivost

(32). Trend pomeni, da se povprečna napaka spreminja z velikostjo merjene vrednosti (32).

Spreminjanje variabilnosti, ki se kaže kot porazdelitev točk na diagramu v obliki troblje, se

imenuje heteroskedastičnost (32). V tem primeru se morajo podatki logaritemsko

transformirati (32).

Ujemanje metod za vse 3 parametre smo vrednotili in prikazali po predhodno opisanem

postopku: izračunali smo razlike dobljenih vrednosti, povprečja vseh parov meritev,

relativno razliko, aritmetično sredino in standardni odklon vseh razlik (32). Potem smo

izračunali 95-odstotni IZ za aritmetično sredino in 95-odstotni IU za spodnjo in zgornjo

mejo (32). Za vsak parameter smo naredili 2 diagrama razlik: prvi diagram, ki prikazuje

absolutne vrednosti ujemanja, in drugi diagram, ki prikazuje relativne vrednosti ujemanja.

Diagram, ki prikazuje relativne vrednosti ujemanja, je bolj pregleden in uporaben v

primerih, ko je prisoten trend, oz. ko se je povprečna napaka spreminjala z velikostjo

merjene vrednosti (v primeru Lh in Prl). Na osnovi izračunanih povprečji razlik smo

ugotavljali prisotnost/odsotnost sistematične napake (32). V primeru, da je bila prisotna

sistematična napaka (povprečja razlik so bila različna od vrednosti "0"), smo na osnovi

izračuna 95 % IZ ocenili, ali je ta napaka značilna/velika ali neznačilna/majhna: statistična

napaka pri stopnji tveganja 5 % ni bila značilna, kadar je 95 % IZ vključeval vrednost "0"

(32). Na podlagi 95 % IU smo ugotovili prisotnost/odsotnost slučajne napake: večji, kot je

bil interval, večja je bila napaka (32). Prisotnost trenda smo ocenili na podlagi regresijske

premice (32). Iz diagramov smo sklepali tudi o heteroskedastičnosti: če so bile točke na

diagramu v obliki "troblje", je to pomenilo spreminjanje variabilnosti oz. prisotnost

heteroskedastičnosti.

3.6 Metoda Krouwerja in Montija: gorski diagram

Gorski diagram ali "diagram prepognjene empirične kumulativne porazdelitve" je

komplementaren Bland-Altmanovem diagramu in ima določene prednosti (32):

neobčutljivost za skrajne vrednosti, lažje ugotavljanje osrednjih 95-odstotnih podatkov

(tudi pri porazdelitvi, ki ni normalna), lažja ocena percentilov velikih razlik in lažja

primerjava različnih porazdelitev (32). Prednost je tudi to, da lahko na istem diagramu

prikažemo krivulje za več parov metod in tako ocenimo obnašanje dveh ali več novih

metod v primerjavi z referenčno (32).

38

Gorske diagrame za vse 3 parametre smo naredili na naslednji način (32): izračunali smo

razlike vseh parov meritev in te razlike rangirali, oz. jih razvrstili po velikosti. Rangiranim

vrednostim smo dodelili centile (percentile; preglednica XII). Percentilne vrednosti smo

dobili tako, da smo v programu MS Office Excel izračunali "utežena povprečja"

(preglednica XII). Dobljene percentilne vrednosti smo "prepognili" tako, da smo vsem

percentilom, ki so imeli vrednost večjo kot 50, dodelili vrednost 100-percentile

(preglednica XII). Narisali smo diagram: na os absciso smo nanesli razlike parov vrednosti

in na os ordinato izračunane "prepognjene" vrednosti. O razhajanju med metodama smo

sklepali na osnovi vrha krivulje: če med metodama ni bilo sistematičnega razhajanja, je bil

vrh krivulje nad vrednostjo "0", sicer je bil vrh nad mediano razliko (32). Mediana, ki smo

je predhodno izračunali (preglednica XIII), je uporabna v primerih, ko je statistična

spremenljivka porazdeljena nesimetrično (32). Izračunali smo tudi 5. In 95. percentil

(preglednica XIII), na podlagi katerih smo ugotovili interval, znotraj katerega se nahaja 90

% razlik v meritvah med metodama (32).

Preglednica XII: Izračun kvantilov (centilov/percentilov) in prepognjenih

percentilinih vrednosti

Izračun kvantilov (centilov/percentilov)

p (percentil) ima vrednost od 1–100;

n je število enot

n× p/100 ni celo število→ k je navzdol zaokrožen n× p/100; vrednost kvantila p je (k+1)-ta največja vrednost

n× p/100 je celo število→ definiramo m1= n× p/100 in m2= n× p/100+1; vrednost kvantila p je povprečje med m1-to in

m2-to največjo vrednostjo

Izračun centilov v MS Office Excelu

Uteženo povprečje pri X(n-1) p+1. Vrednost centila p dobimo tako, da izračunamo uteženo povprečje vrednosti Xi in Xi+1,

kjer je i celi del vrednosti (n-1) p+1.

n je število enot

p je velikost centila, deljeno s 100

Xi je vrednost spremenljivke X na i-tem mestu (spremenljivka je razvrščena po velikosti od najmanjse do največje).

"Prepognjene" percentilne vrednosti

percentili > 50 → 100-percentile

39

Preglednica XIII: Izračun mediane in 5./95. percentila

a) Izračun mediane

Mediana pomeni tisto vrednost, od katere ima polovica enot manjše ali enake, polovica enot pa večje ali enake vrednosti

spremenljivk.

1. Podatke razvrstimo po velikosti.

2. a) Ce je n liho število: mediana enaka vrednosti srednje enote, oziroma: mediana je

m-ta največja vrednost, pri čemer je m= (n+1)/2.

b) Ce je n sodo število: mediana je povprečje vrednosti srednjega para podatkov,

oziroma: mediana je povprečje m1-te in m2-te največje vrednosti, pri čemer je

m1= n/2 in m2= n/2+1.

b) Izračun 5./95. percentila

5./95. percentil= k+1 mesto

k= percentil×n/100

Metodi Blanda in Altmana ter Krouwerja in Montija temeljijo na enostavnih izračunih in

preglednih grafičnih prikazih. Ta pravilen statistični pristop nam je omogočil ustrezno

vrednotenje ujemanja rezultatov naših metod.

4. REZULTATI

Prvi del rezultatov se nanaša na verifikacijo metode ECLIA oz. na vrednotenje rezultatov

natančnosti in točnosti. Drugi del predstavljajo rezultati vrednotenja ujemanja z Bland-

Altmanovo metodo in Krouwer-Montijevo metodo.

4.1 Rezultati verifikacije ECLIA metode

Rezultati vrednotenja natančnosti metode so prikazani v preglednici XIV. Po izvedenih

testih ponovljivosti smo primerjali izračunan KV za vsak parameter s KV, ki ga je podal

proizvajalec (preglednica X, preglednica XI). Na osnovi tega smo sklepali o natančnosti

nove metode. Upoštevali smo tudi priporočen kriterij za KV 1–5 %. Rezultati vrednotenja

točnosti metode so prikazani v preglednici XV. Po izvedenih meritvah parametrov iz

kontrolnih vzorcev smo izračunali RE za povprečje rezultatov vsakega posameznega

parametra. Kot ciljne vrednosti oz. ciljna povprečja smo izbrali vrednosti, ki jih je podal

proizvajalec (preglednica XV). Poleg RE, na osnovi katerih smo sklepali o točnosti

metode, smo kot kriterij zadovoljive točnosti upoštevali referenčne vrednosti kontrolnega

materiala, ki jih je podal proizvajalec (preglednica XV).

40

Vrednotenje natančnosti ECLIA metode

Pri vseh treh parametrih smo izračunali KV: znotraj serij/znotraj dneva in celokupni/med

dnevi/znotraj treh dni. Dobljene KV smo primerjali s KV, ki jih je podal proizvajalec. Pri

tem smo upoštevali tisti KV proizvajalca, ki je podan za povprečne vrednosti rezultatov, ki

so bile najbližje našim povprečnim vrednostim rezultatov. Poleg tega, smo upoštevali

priporočljiv kriterij za KV 1–5 %. Prvi dan merjenja Fsh za povprečje rezultatov 30,67

IU/L smo dobili KV 1,80 %. Drugi dan merjenja za povprečje rezultatov 31,14, IU/L smo

dobili KV 1,05 %. Tretji dan merjenja za za povprečje rezultatov 28,49 IU/L smo dobili

KV 1,82 %. Proizvajalec je za povprečje rezultatov 28,9 IU/L podal vrednost KV 1,4 %. Iz

tega lahko sklepamo, da so naši KV znotraj serij primerljivi s KV proizvajalca. Drugi dan

smo dobili najnižji KV (tudi nižji od KV proizvajalca), tretji dan pa najvišji KV. Naši KV

so znotraj priporočljivega kriterija za KV 1–5 %. Povprečje rezultatov izmerjenih v

obdobju treh dni znaša 30,10 IU/L in KV 4,19 %. Proizvajalec je za povprečje rezultatov

28,9 IU/L podal vrednost KV (meddnevna/znotraj treh dni) 2,9 %. Iz tega lahko sklepamo,

da je naš celokupni KV (4,19 %) nekoliko višji kot KV proizvajalca, ampak je primerljiv

in se nahaja znotraj priporočljivega kriterija 1–5%. Vsi izračuni in podatki so prikazani v

preglednici X in preglednici XIV. Prvi dan merjenja Lh za povprečje rezultatov 15,62 IU/L

smo dobili KV 0,73 %. Drugi dan merjenja za povprečje rezultatov 15,59 IU/L smo dobili

KV 1,11 %. Tretji dan merjenja za povprečje rezultatov 14,62 IU/L smo dobili KV 0,71 %.

Proizvajalec je kot v primeru Fsh meril koncentracije Lh v vzorcih različnih konc. nivojev

(preglednica X). Glede na to, da se povprečja rezultatov proizvajalca razlikujejo od naših

povprečji rezultatov, nismo primerjali naše vrednosti KV z vrednostmi KV, ki jih je podal

proizvajalec. Vsi dobljeni KV so nižji od 2 % in so znotraj priporočljivega kriterija.

Najnižji KV smo dobili tretji dan merjenja, najvišji pa drugi dan merjenja. Povprečje

rezultatov, izmerjenih v obdobju treh dni, znaša 15,27 IU/L in KV 3,24 %. Tudi celokupni

KV (3,24 %) je znotraj priporočljivega kriterija, ampak ga iz že omenjenih razlogov nismo

primerjali s celokupnim KV, ki ga je podal proizvajalec. Vsi izračuni in podatki so

prikazani v preglednici X in preglednici XIV. Prvi dan merjenja Prl za povprečje

rezultatov 16,09 μg/L smo dobili KV 0,86 %. Drugi dan merjenja smo za povprečje

rezultatov 15,67 μg/L dobili KV 1,51 %. Tretji dan merjenja smo za povprečje rezultatov

15,32 μg/L dobili KV 2,88 %. Proizvajalec je za povprečje rezultatov 14,1 μg/L podal

vrednost KV 1,4 %. Iz tega lahko sklepamo, da so naši KV znotraj serij primerljivi s KV

proizvajalca. Najvišji KV smo dobili tretji dan meritve, najnižji pa prvi dan (nižji od KV

41

proizvajalca). Vsi KV so znotraj priporočljivega kriterija. Povprečje rezultatov, ki smo ga

dobili merjenjem znotraj treh dni, znaša 15,69 μg/L, KV znaša 2,67 % in je primerljiv s

KV proizvajalca (5,0 %). Nahaja se tudi znotraj priporočljivega kriterija. Vsi izračuni in

podatki so prikazani v preglednici XI in preglednici XIV.

Preglednica XIV: Rezultati vrednotenja natančnosti metode ECLIA

Dnevi Št. meritev Fsh (IU/L) Lh (IU/L) Prl (μg/L)

1. dan

1. 31,17 15,68 16,01

2. 30,37 15,49 15,93

3. 31,43 15,48 16,01

4. 30,15 15,67 16,08

5. 30,79 15,77 16,26

6. 30,10 15,63 16,26

Povprečje 30,67 15,62 16,09

SD 0,55 0,11 0,14

KV 1,80 0,73 0,86

2. dan

1. 31,55 15,63 15,71

2. 31,02 15,73 15,63

3. 31,48 15,79 15,66

4. 30,87 15,30 15,42

5. 31,19 15,54 16,09

6. 30,74 15,53 15,48

Povprečje 31,14 15,59 15,67

SD 0,33 0,17 0,24

KV 1,05 1,11 1,51

3. dan

1. 28,57 14,75 15,54

2. 28,42 14,53 15,50

3. 29,05 14,62 15,53

4. 28,65 14,54 15,35

5. 27,64 14,73 14,51

6. 28,63 14,53 15,46

Povprečje 28,49 14,62 15,32

SD 0,52 0,10 0,44

KV (%) 1,82 0,71 2,88

Celokupno povprečje (3 dneh) 30,10 15,27 15,69

SD 1,26 0,49 0,42

KV (%) 4,19 3,24 2,67

42

Vrednotenje točnosti ECLIA metode

Za vrednotenje točnosti smo za vse tri parametre izračunali relativne napake (RE %). RE

nam kažejo, za koliko % se naša dobljena povprečja rezultatov (za PC U1 in PC U2)

razlikujejo od povprečja rezultatov, ki jih je podal proizvajalec. Poleg tega smo ugotavljali,

ali so naše meritve znotraj referenčnih območij, ki jih je podal proizvajalec. Pri Fsh znaša

povprečje rezultatov za PC U1 20,32 IU/L in je znotraj referenčnega območja, ki ga je

podal proizvajalec. Iz RE (9,25 %) lahko sklepamo, da je naše povprečje rezultatov za 9,25

% višje od povprečja rezultatov proizvajalca. Povprečje rezultatov za PC U2 znaša 58,53

IU/L in se tudi nahaja znotraj referenčnega območja. Iz RE (3,60 %) lahko sklepamo, da je

naše povprečje rezultatov za 11,1 % višje od povprečja rezultatov proizvajalca. Vse

izmerjene vrednosti Fsh (za PC U1 in PC U2) se nahajajo znotraj referenčnih območij. Pri

Lh povprečje rezultatov za PCU1 znaša 11,80 IU/L in je znotraj referenčnega območja, ki

ga je podal proizvajalec. Iz RE (12,38 %) lahko sklepamo, da je naše povprečje rezultatov

za 12,38 % višje od povprečja rezultatov, ki ga je podal proizvajalec. Povprečje rezultatov

za PC U2 znaša 55,69 IU/L in je tudi znotraj referenčnega območja. Iz RE (6,89 %) lahko

sklepamo, da je naše povprečje rezultatov za 6,89 % višje od povprečja rezultatov

proizvajalca. Tudi v primeru Lh so vsi rezultati meritev (za PC U1 in PC U2) znotraj

referenčnih območij. Pri Prl povprečje rezultatov za PC U1 znaša 13,15 μg/L in je znotraj

referenčnega območja, ki ga je podal proizvajalec. Iz RE (16,58 % ) lahko sklepamo, da je

naše povprečje rezultatov za 16,58 % višje od povprečja rezultatov, ki ga je podal

proizvajalec. Povprečje rezultatov za PC U2 znaša 45,35 μg/L in je tudi znotraj

referenčnega območja. Iz RE (10,91 %) lahko sklepamo, da je naše povprečje rezultatov za

10,91 % višje od povprečja rezultatov proizvajalca. Vsi rezultati meritev (za PC U1 in PC

U2) se nahajajo znotraj referenčnih območij. Rezultati naših meritev in meritev

proizvajalca (povprečne in referenčne vrednosti) so prikazane v preglednici XV.

43

Preglednica XV: Rezultati vrednotenja točnosti metode ECLIA

Meritev Parameter

N (štev.meritev) = 20 Fsh (IU/L) Lh (IU/L) Prl

(μg/L)

PC U1: Preci Control

Universal 1 (nizek nivo)

PC U2: Preci Control

Universal 2 (visok nivo)

PC U1 PC U2 PC U1 PC U2 PC U1 PC U2

Referenčne vrednosti

proizvajalca 13,02-24,18 36,89-68,51 8,30-12,71 41,16-63,04 8,91-13,65 32,30-49,48

Povprečne vrednosti

proizvajalca 18,6 52,7 10,5 52,1 11,28 40,89

1. 21,98 55,64 11,94 55,31 12,77 44,59

2. 22,51 63,09 12,56 60,32 13,47 47,26

3. 22,96 58,19 12,23 53,05 12,87 42,34

4. 21,69 58,27 10,43 58,06 12,95 45,47

5. 21,79 56,19 11,95 56,49 12,9 41,47

6. 20,17 57,86 11,72 57,32 11,96 45,48

7. 19,10 58,30 12,01 57,65 13,45 44,74

8. 21,79 56,97 11,47 55,44 13,59 46,09

9. 22,00 57,76 12,47 55,44 12,66 43,45

10. 22,20 58,40 11,63 61,25 13,86 45,03

11. 20,57 64,13 12,04 58,72 12,60 47,54

12. 20,06 59.51 12,44 53,56 13,64 47,39

13. 21,81 57,93 11,57 50,96 13,67 46,74

14. 18,61 57,91 11,34 54,14 13,31 47,54

15. 16,20 59,24 12,23 52,82 13,30 49,16

16. 18,33 57,83 12,19 61,66 13,45 49,15

17. 18,65 58,27 11,24 58,02 13,75 46,54

18. 18,25 59,61 11,65 49,15 13,91 39,61

19. 18,66 60,17 11,47 53,70 12,90 43,44

20. 18,97 56,38 11,49 54,38 11,98 43,98

Povprečje 20,32 58,53 11,80 55,69 13,15 45,35

44

SD 1,87 2,11 0,51 3,31 0,57 2,49

KV (%) 9,21 3,60 4,31 5,94 4,34 5,48

RE (%) 9,25 11,1 12,38 6,89 16,58 10,91

4.2 Vrednotenje ujemanja rezultatov z Bland-Altman metodo

V različnem štev. vzorcev (N) smo izmerili vrednosti Fsh (N=37), Lh (N=41) in Prl

(N=45) na obeh analizatorjih. Za vsak parameter smo izračunali: razlike dobljenih

vrednosti (cobas – axsym), povprečja vseh parov meritev ((cobas-axsym/2)), relativno

razliko (cobas-axsym/(cobas+axsym)/2)), povprečja razlik in standardni odklon vseh

razlik. Rezultati meritev in izračuni so prikazani v prilogah 1, 2 in 3. Za vsak parameter

smo izračunali 95 % IZ za aritmetično sredino in 95 % IU za spodnjo in zgornjo mejo

intervala (priloge 1, 2 3). Podatke, ki jih potrebujemo za vrednotenje ujemanja obeh metod,

smo prikazali grafično (slike 6, 8 in 10). Naredili smo tudi diagrame, ki prikazujejo

relativne vrednosti ujemanja (slike 7, 9 in 11).

V primeru Fsh iz povprečja razlik (polna sredinska črta na sliki 6; 0,15 IU/L) lahko

sklepamo, da je prisotna sistematična napaka, oz. da analizator Cobas e 411 v povprečju

daje za 0,15 IU/L višje rezultate kot analizator Axsym. Sistematična napaka pri stopnji

tveganja 5 % ni značilna, saj 95 % IZ vključuje vrednost "0" (pikčasti črti na sliki 6). Meji

ujemanja nam povesta, da se 95 % razlik v rezultatih nahaja znotraj tega intervala: npr. če

naredimo 100 analiz Fsh, lahko pričakujemo, da bo pri 95 analizah razlika v rezultatih med

analizatorji znotraj [-4,23, 4,52 IU/L]. Poleg sistematične napake je iz prikaza po Bland-

Altmanu razvidna tudi slučajna napaka. To ocenimo s pomočjo 95 % IU (široko črtkani

črti na sliki 6). Iz diagrama je tudi razvidno, da se povprečna napaka spreminja z velikostjo

merjene vrednosti. Ta odnos prikazuje regresijska premica (polna oranžna črta na sliki 6).

Heteroskedastičnosti v tem primeru ni.

45

Slika 6: Fsh diagram razlik

Legenda: (Cobas-Axsym) – razlike parov meritev Fsh, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in analizatorju

Axsym, (Cobas+Axsym)/2 – povprečja parov meritev Fsh, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in

analizatorju Axsym, polna sredinska črta – povprečje razlik, pikčasti črti – meji 95 %IZ za povp.razlik,

široko črtkani črti – meji 95 % IU, polna oranžna črta – regresijska premica.

Slika 7: Fsh diagram razlik (%)

Legenda: (Cobas-Axsym) – relativne razlike parov meritev Fsh, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in

analizatorju Axsym, (Cobas+Axsym)/2 – povprečja parov meritev Fsh, izmerjenih na analizatorju Cobas

e411 in analizatorju Axsym, polna sredinska črta – povprečje razlik, pikčasti črti – meji 95 % IZ za

povp.razlik, široko črtkani črti – meji 95 % IU, polna oranžna črta – regresijska premica.

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

0 20 40 60 80 100

(Co

bas

-Axsym

) (I

U/L

)

(Cobas+Axsym)/2 (IU/L)

Bland-Altmanov diagram: Fsh

-25%

-20%

-15%

-10%

-5%

0%

5%

10%

15%

20%

25%

0 20 40 60 80 100

(Co

bas

-Axsym

) (%

)

(Cobas+Axsym)/2 (IU/L)

Bland-Altmanov diagram: Fsh

46

Slika 8: Lh diagram razlik

Legenda: (Cobas-Axsym) – razlike parov meritev Lh, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in analizatorju

Axsym, (Cobas+Axsym)/2 – povprečja parov meritev Lh, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in

analizatorju Axsym, polna sredinska črta – povprečje razlik, pikčasti črti – meji 95 %IZ za povp.razlik,

široko črtkani črti – meji 95 %IU, polna oranžna črta – regresijska premica.

V primeru Lh iz povprečja razlik (polna sredinska črta na sliki 9; 23,1 %) lahko

sklepamo, da je prisotna sistematična napaka, oz. da analizator Cobas e 411 v povprečju

daje za 23,1 % višje rezultate kot analizator Axsym. Sistematična napaka pri stopnji

tveganja 5 % je značilna, saj 95 % IZ ne vključuje vrednosti "0" (pikčasti črti na sliki 9).

Meji ujemanja nam povesta, da se 95 % razlik v rezultatih nahaja znotraj tega intervala:

npr. če naredimo 100 analiz Lh, lahko pričakujemo, da bo pri 95 analizah relativna razlika

v rezultatih med analizatorji znotraj [-39,0; 86,0 %]. Poleg sistematične napake je iz

prikaza po Bland-Altmanu razvidna tudi slučajna napaka. To ocenimo s pomočjo 95 % IU

(široko črtkani črti na sliki 9). Iz diagrama je tudi razvidno, da se povprečna napaka

spreminja z velikostjo merjene vrednosti. Ta odnos prikazuje regresijska premica (polna

oranžna črta na sliki 9). Heteroskedastičnosti v tem primeru ni.

-10

-5

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100 120 140

(Co

bas

-Axsym

) (I

U/L

)

(Cobas+Axsym)/2 (IU/L)

Bland-Altmanov diagram: Lh

47

Slika 9: Lh diagram razlik (%)

Legenda: (Cobas-Axsym) – realtivne razlike parov meritev Lh, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in

analizatorju Axsym, (Cobas+Axsym)/2 – povprečja parov meritev Lh, izmerjenih na analizatorju Cobas

e411 in analizatorju Axsym, polna sredinska črta – povprečje razlik, pikčasti črti – meji 95 % IZ za

povp.razlik, široko črtkani črti – meji 95 % IU, polna oranžna črta – regresijska premica.

Slika 10: Prl diagram razlik

Legenda: (Cobas-Axsym) – razlike parov meritev Prl, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in analizatorju

Axsym, (Cobas+Axsym)/2 - povprečja parov meritev Prl, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in

analizatorju Axsym, polna sredinska črta – povprečje razlik, pikčasti črti – meji 95 %IZ za povp.razlik,

široko črtkani črti - meji 95 % IU, polna oranžna črta – regresijska premica.

-100%

-50%

0%

50%

100%

150%

200%

250%

0 20 40 60 80 100 120 140

(Co

bas

-Axsym

) (%

)

(Cobas+Axsym)/2 (IU/L)

Bland-Altmanov diagram: Lh

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 10 20 30 40

(Co

bas

-Axsym

) (μ

g/L

)

(Cobas+Axsym)/2 (μg/L)

Bland-Altmanov diagram: Prl

48

V primeru Prl lahko iz povprečja razlik (polna sredinska črta na sliki 11; 17,4 %)

sklepamo, da je prisotna sistematična napaka, oz. da analizator Cobas e 411 v povprečju

daje za 17,4 % višje rezultate kot analizator Axsym. Sistematična napaka pri stopnji

tveganja 5 % je značilna, saj 95 % IZ ne vključuje vrednosti "0" (pikčasti črti na sliki 11).

Meji ujemanja nam povesta, da se 95 % razlik v rezultatih med analizatorji nahaja znotraj

tega intervala: npr. če naredimo 100 analiz Prl, lahko pričakujemo, da bo pri 95 analizah

relativna razlika v rezultatih med analizatorji znotraj [1,0; 34,0 %]. Poleg sistematične

napake je iz prikaza po Bland-Altmanu razvidna tudi slučajna napaka. To ocenimo s

pomočjo 95 % IU (široko črtkani črti na sliki 11). Iz diagrama je tudi razvidno, da se

povprečna napaka spreminja z velikostjo merjene vrednosti. Ta odnos prikazuje regresijska

premica (polna oranžna črta na sliki 11). Heteroskedastičnosti v tem primeru ni.

Slika 11: Prl diagram razlik (%)

Legenda: (Cobas-Axsym) – relativne razlike parov meritev Prl, izmerjenih na analizatorju Cobas e411 in

analizatorju Axsym, (Cobas+Axsym)/2 – povprečja parov meritev Prl, izmerjenih na analizatorju Cobas

e411 in analizatorju Axsym, polna sredinska črta – povprečje razlik, pikčasti črti – meji 95 % IZ za povp.

razlik, široko črtkani črti – meji 95 % IU, polna oranžna črta – regresijska premica.

4.3 Vrednotenje ujemanja rezultatov s Krouwer-Montijevo metodo

Z namenom, da prikažemo porazdelitev razlik med metodama, smo naredili še en grafični

prikaz za vsak parameter, in sicer diagram prepognjene empirične kumulativne

porazdelitve (gorski diagram). Izmerili smo vrednosti Fsh, Lh in Prl na obeh analizatorjih

-20%

-10%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

0 10 20 30 40(Co

bas

-Axsym

) (%

)

(Cobas+Axsym)/2 (μg/L)

Bland-Altmanov diagram: Prl

49

in za vsak parameter izračunali razlike vseh parov meritev (Cobas-Axsym). Razlike smo

razvrstili po velikosti (rangirali) in rangiranim vrednostim dodelili centile (percentile).

Dobljene percentilne vrednosti smo »prepognili« (prepognjeni percentili). Rezultati

meritev in izračuni so prikazani v prilogah 4, 5 in 6. Podatke, ki jih potrebujemo za

vrednotenje ujemanja obeh metod, smo prikazali grafično (slike 12, 13 in 14). Na os

absciso smo nanesli razlike parov meritev (Cobas-Axsym), na os ordinato pa prepognjene

percentile (percentili).

V primeru Fsh lahko sklepamo, da analizator Cobas e 411 daje za 0,37 IU/L višje

rezultate kot analizator Axsym, oz. da je prisotna sistematična napaka. To smo ocenili na

podlagi mediane razlike rezultatov, ki je prikazana na sliki 12 (vrh krivulje). Iz izračuna 5.

in 95. percentila lahko zaključimo, da se 90 % razlik v rezultatih med analizatorji nahaja

znotraj [-3,66; 2,15 IU/L] intervala (slika12).

Slika 12: Fsh gorski diagram

Legenda: (Cobas-Axsym) – razlike parov meritev Fsh; percentili – prepognjene percentilne vrednosti

(percentili >50→100-percentile); modra navpična črta – razlika "0"; vrh krivulje/gore (ni nad vrednostmi

razlike "0" – prisotna je sistematična napaka) – mediana razlike (IU/L); vodoravna polna črta – 5. in 95.

percentil.

Tudi v primeru Lh je prisotna sistematična napaka, saj smo ugotovili, da analizator Cobas

e 411 daje za 1,23 IU/L višje rezultate kot analizator Axsym (slika 13). 90 % razlik v

rezultatih med analizatorji se nahaja znotraj [-1,09; 3,28 IU/L] intervala (slika 13).

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

-12,00 -7,00 -2,00 3,00

perc

en

tili

(Cobas-Axsym) (IU/L)

Gorski diagram: Fsh

50

Slika 13: Lh gorski diagram

Legenda: (Cobas-Axsym) – razlike parov meritev Lh; percentili – prepognjene percentilne vrednosti

(percentili >50→100-percentile); modra navpična črta – razlika "0"; vrh krivulje/gore (ni nad vrednostmi

razlike "0" – prisotna je sistematična napaka) – mediana razlike (IU/L); vodoravna polna črta – 5. in 95.

percentil.

Pri Prl smo ugotovili, da analizator Cobas e 411 daje za 2,33 μg/L višje rezultate kot

analizator Axsym (prisotna sistematična napaka; slika 14) in da se 90 % razlik v rezultatih

med analizatorji nahaja znotraj [0,724; 6,674 μg/L] intervala (slika 14).

0%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

40%

45%

50%

-2,00 3,00 8,00 13,00 18,00 23,00

perc

en

tili

(Cobas-Axsym) (IU/L)

Gorski diagram: Lh

51

Slika 14: Prl gorski diagram

Legenda: (Cobas-Axsym) – razlike parov meritev Prl; percentili – prepognjene percentilne vrednosti

(percentili >50→100-percentile); modra navpična črta - razlika "0"; vrh krivulje/gore (ni nad vrednostmi

razlike "0" – prisotna je sistematična napaka) – mediana razlike (μg/L); vodoravna polna črta – 5. In 95.

percentil.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

-2,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

perc

en

tili

(Cobas-Axsym) (μg/L)

Gorski diagram: Prl

52

5. RAZPRAVA

V medicinskih laboratorijih imamo za cilj zagotoviti kakovostne rezultate. Takšni rezultati,

ki pomenijo "pravilne rezultate ob pravem času", omogočajo tudi kakovostno in uspešno

nadaljnjo obravnavo preiskovanca. Da bi to dosegli, moramo podrobno poznati vsak korak

analiznega postopka, t. j. predanalitično, analitično in postanalitično fazo (35).

Preanalitična faza zajema: izbiro parametrov, ki jih bomo analizirali pri posameznem

preiskovancu (s strani zdravnika), odvzem vzorca, transport vzorca, sprejem, vpis in triaža

vzorcev na sprejemu biološkega materiala (35). Analitična faza pomeni pripravo in analizo

vzorca ter validacijo rezultatov (35). Postanalitična faza se nanaša na kontroliranje in

pošiljanje izvidov k naročniku, arhiviranje vzorcev in izvidov ter sporočanje izvidov

naročniku (po potrebi (35)). Poleg omenjenih korakov analiznega postopka moramo

poznati in izbrati ustrezne analizne metode in merilne instrumente. Za katero metodo se

bomo odločili, je odvisno od več dejavnikov. Želimo si metodo, ki bi imela boljšo točnost

in natančnost (ponovljivost), širše linearno območje in manj možnosti vpliva motečih snovi

(35). Poleg tega je pomembno, da je poraba reagentov in ostalih raztopin čim manjša, da

zahteva manjši volumen vzorca, manj predpriprav vzorca, reagentov in ostalih raztopin ter

da rezultate dobimo v najkrajšem možnem času (35). Takšna metoda je zaželjena, saj

omogoča kakovostne in hitre rezultate ter bistveno znižuje laboratorijske stroške.

Poleg uvedb novih metod obstajajo tudi potrebe za uvedbo novih analizatorjev, ki so

preprostejši za uporabo, cenovno ugodnejši, hitrejši ali kako drugače primernejši (35). Tudi

ta postopek mora biti jasno opredeljen in sledljiv (35). V laboratoriju ZD Postojna smo se

odločili zamenjati zastareli imunokemični analizator Axsym proizvajalca Abbott z

analizatorjem Cobas e 411 proizvajalca Roche. Zaradi tega je bilo potrebno ugotoviti, ali

sta merilna instrumenta med seboj izmenljiva in kako dobro se ujemajo rezultati, ki smo jih

z njima izmerili. Korelacija, ki se najpogosteje izraža s Pearsonovim korelacijskim

koeficientom, omogoča vpogled v razmerje med skupno variabilnostjo rezultatov obeh

metod in variabilnostjo rezultatov vsake metode posebej (primerja obe skupini rezultatov v

celoti, ne parov meritev), ne zajema pa točnosti (32). Ne zajema niti natančnosti, ki se

izraža kot variabilnost razlik parov (32). Točnost in natančnost sta ključna pojma v

pravilnem ocenjevanju ujemanja (32). Korelacija zato ni primerna metoda za ocenjevanje

ujemanja in je nismo izbrali kot "statistično orodje" za primerjanje naših rezultatov. Tudi

linearna regresija ni metoda, ki je priporočljiva za ocenjevanje ujemanja rezultatov dveh

metod. Ta metoda namreč omogoča napovedovanje vrednosti ene spremenljivke na

53

podlagi druge, ne zajema pa točnosti in natančnosti (32). Iz vrednosti naklona in presečišča

lahko sicer ocenimo povprečno ujemanje za skupino, ne moremo pa oceniti ujemanja za

posamezne pare meritev (32). Poleg tega ne upošteva, da imata pri ocenjevanju ujemanja

napako obe spremenljivki (32). Zaradi tega nismo izbrali linearne regresije kot statistične

metode za primerjanje in vrednotenje naših rezultatov.

Da bi bila ocena ujemanja realna in uporabna, mora zajeti enega od naslednjih parov:

točnost in natančnost, pričakovana vrednost in variabilnost (slučajna in sistematična

napaka meritev) (32). Takšno oceno ujemanja omogočata dve metodi, ki sta se do sedaj

uveljavili kot standard: metoda Blanda in Altmana in metoda Krouwerja in Montija (32).

Metodi na podlagi enostavnih statističnih izračunov in nazornih grafičnih prikazov

omogočata enostaven in relevanten vpogled v točnost in natančnost metod ter v njihovo

ujemanje. Iz teh razlogov smo se odločili preizkusiti omenjeni statistični metodi pri

zamenjavi imunoloških analizatorjev. Preden smo pristopili k postopku ocenjevanja

ujemanja MEIA (Axsym) in ECLIA (cobas e 411) metod, je bilo potrebno novo ECLIA

metodo verificirati. To smo naredili tako, da smo ocenili njeno točnost in natančnost.

Za ocenjevanje ujemanja rezultatov, ki smo jih dobili pri merjenju na obeh analizatorjih,

smo izbrali parametre Fsh, Lh in Prl. Omenjene hormone naročajo zdravniki iz

ginekoloških ambulant našega ZD v namen diagnosticiranja in spremljanja zdravljenja

raznovrstnih motenj ženskega spolnega cikla. Motnje, kot so sindrom policističnih

jajčnikov, amenoreje, polimenoreje, oligomenoreje, vmesne krvavitve in številne druge, so

zelo pogoste v sodobnem času in so najpogosteje posledica neuravnovešenosti

nevroendokrinega sistema (6, 12). Na delovanje tako prepletenega sistema vplivajo številni

okoljski stresorji, ki se jim pogosto ne moremo izogniti, motnje pa vplivajo na kakovost

življenja in imajo včasih lahko zelo resne posledice (12). V tem primeru je zato zelo

pomembna večstopenjska diagnostika (12). Z namenom, da preizkušamo statistični metodi

Bland-Altmana ter Krouwer-Montija in ugotovimo, kakšno je ujemanje med rezultati, ki

smo jih izmerili na analizatorju Axsym in analizatorju Cobas e411, smo zbrali serumske

vzorce ginekoloških pacientk ZD, in sicer: 37 vzorcev za merjenje Fsh, 41 vzorcev za

merjenje Lh in 45 vzorcev za merjenje vrednosti Prl. Predhodno pripravljene vzorce smo

analizirali sočasno na obeh imunoloških analizatorjih, rezultate smo vnesli v preglednico

programa MS Office Excel in jih ustrezno statistično obdelali. V nadaljevanju sledi opis in

tolmačenje rezultatov, ki smo jih dobili pri določanju natančnosti in točnosti nove ECLIA

metode, ter tolmačenje rezultatov/ocene ujemanja obeh metod.

54

Natančnost in točnost ECLIA metode

Natančnost merjenja Fsh znotraj dneva/serije je zadovoljiva: vse tri dni merjenja je KV

pod 2 % in je primerljiv s KV, ki ga je podal proizvajalec (1,4 %). Poleg tega so vsi

dobljeni KV znotraj priporočljivega kriterija za KV 1–5 %. Natančnost merjenja Fsh

znotraj treh dni (meddnevna/celokupna natančnost) je tudi zadovoljiva: naš celokupni KV

(4,19 %) je sicer za nekoliko višji kot KV, ki ga je podal proizvajalec (2,9 %), ampak je še

zmeraj znotraj priporočljivega kriterija ua KV 1–5 %. Natančnost merjenja Lh znotraj

dneva/serije je zadovoljiva: vse tri dni merjenja je KV pod 2 %. To pomeni, da je znotraj

kriterija 1–5% in je rezultat sprejemljiv. Glede na to, da se povprečja rezultatov

proizvajalca razlikujejo od naših povprečij rezultatov, nismo primerjali naše vrednosti KV

z vrednostmi KV, ki jih je podal proizvajalec. Natančnost merjenja Lh znotraj treh dni

(meddnevna/celokupna natančnost) je tudi v primeru Lh zadovoljiva: celokupni KV znaša

3,24 % in je znotraj priporočljivega kriterija. Iz že omenjenih razlogov ga nismo primerjali

s celokupnim KV, ki ga je podal proizvajalec. Natančnost merjenja Prl znotraj

dneva/serije je zadovoljiva: vse tri dni merjenja je KV pod 3 % in je primerljiv s KV, ki ga

je podal proizvajalec (1,4 %). Vsi KV so znotraj priporočljivega kriterija. Natančnost

merjenja Prl znotraj treh dni (meddnevna/celokupna natančnost) je zelo dobra: celokupni

KV (2,67 %) je celo nekoliko nižji kot KV, ki ga je podal proizvajalec (5,0 %). Na osnovi

dobljenih rezultatov natančnosti meritev posameznega parametra lahko zaključimo, da je

bila meritev Prl najbolj natančna (KV 2,67 %) in meritev Fsh najmanj natančna (KV 4,19

%). Če bi za sprejemljivo natančnost merjenja omenjenih hormonov postavili kriterij za

KV 1–5%, so meritve vseh treh parametrov zadovoljile natančnosti. Po primerjavi

dobljenih KV vrednosti s KV vrednostmi, ki jih je podal proizvajalec, smo ugotovili, da je

naša KV vrednost za Fsh nekoliko višja in naša KV za Prl nekoliko nižja kot KV

proizvajalca. KV vrednost za Lh nismo primerjali s KV proizvajalca, ker se je naše

povprečje rezultatov merjenja zelo razlikovalo od povprečij rezultatov merjenja

proizvajalca. Rezultati natančnosti ECLIA metode so sprejemljivi pri vseh treh parametrih.

Mogoče bi ocena natančnosti bila boljša, če bi jo določali na več različnih koncentracijskih

nivojih, na različnih vzorcih in dlje časa. Vsak parameter smo namreč merili 3 dni

zaporedoma, opravili 6 meritev dnevno, proizvajalec pa je meril 10 dni po 6 meritev

dnevno. V tem primeru bi morali uporabiti vzorce ali vzorec, v katerem so omenjeni

hormoni/parametri dlje časa stabilni. Lahko bi uporabili vzorce zunanje kontrole kakovosti

z že izmerjenimi/podanimi vrednostmi. Primerjava bi bila mogoče v tem primeru boljša.

55

Točnost merjenja Fsh za PC U1 je zadovoljiva: povprečje rezultatov naših meritev (20,32

IU/L) je za 9,25 % (RE) višje od povprečja rezultatov, ki ga navaja proizvajalec (18,6

IU/L). Če kot kriterij sprejemljive točnosti postavimo referenčne vrednosti, ki jih je podal

proizvajalec (13,02–24,18 IU/L), lahko zaključimo, da se povprečje rezultatov naših

merjenj nahaja znotraj tega območja in je sprejemljivo. Točnost merjenja Fsh za PC U2 je

tudi zadovoljiva: povprečje rezultatov naših meritev (58,53 IU/L) je za 11,1 % (RE) višje

od povprečja rezultatov, ki ga navaja proizvajalec (52,7 IU/L) in je znotraj referenčnega

območja proizvajalca (36,89–68,51 IU/L). Točnost merjenja Lh za PC U1 je zadovoljiva:

povprečje rezultatov naših meritev (11,80 IU/L) je za 12,38 % (RE) višje od povprečja

rezultatov, ki ga navaja proizvajalec (10,5 IU/L). Če kot kriterij sprejemljive točnosti

postavimo referenčne vrednosti, ki jih je podal proizvajalec (8,30–12,71 IU/L), lahko

zaključimo, da se dobljeno povprečje rezultatov merjenja nahaja znotraj tega območja in je

sprejemljivo. Zadovoljiva je tudi točnost merjenja Lh za PC U2, ker se povprečje

rezultatov naših meritev (55,69 IU/L), ki je za 6,89 % višje od povprečja rezultatov

proizvajalca (52,1 IU/L), nahaja znotraj referenčnega območja proizvajalca (41,16–63,04

IU/L). Povprečje rezultatov merjenja točnosti Prl za PC U1 (13,15 μg/L) je za 16,58 %

višje od povprečja rezultatov, ki ga navaja proizvajalec (11,28 μg/L), ampak je znotraj

referenčnega območja proizvajalca (8,91–13,65 μg/L) in zato lahko sklepamo, da je točnost

merjenja sprejemljiva. Točnost merjenja Prl za PC U2 je tudi zadovoljiva, ker je povprečje

rezultatov naših meritev (45,35 μg/L) znotraj referenčnega območja proizvajalca (32,30–

49,48 μg/L). Od povprečja rezultatov proizvajalca (40,89 μg/L) je višje za 10,91 % .

Vrednosti RE, ki smo jih izračunali za posamezna povprečja rezultatov meritev, se

razlikujejo pri vsakem parametru. Razlika je prisotna tudi med nivoji kontrolnega materiala

(PC U1 in PC U2). Največjo RE smo dobili pri Prl (16,58 %) za nizek nivo PC U1,

najmanjšo pa pri Lh (6,89 %) za visok nivo PC U2. To pomeni, da povprečna vrednost

rezultatov, ki smo jo dobili za Prl za PC U1 (13,15 μg/L), največ odstopa od ciljne

povprečne vrednosti rezultatov, ki jo navaja proizvajalec (11,28 μg/L), oz. je najmanj točna

meritev, in da povprečna vrednost rezultatov, ki smo jo dobil za Lh za PC U2 (55,69 IU/L),

najmanj odstopa od povprečne vrednosti rezultatov, ki jo navaja proizvajalec (52,1 IU/L),

oz. je najbolj točna meritev. Le pri ocenjevanju točnosti merjenja Fsh, smo dobili boljšo

točnost merjenja/manjšo RE na nizkem nivoju PC U1 (9,25 %) kot na visokem PC U2

nivoju (11,1 %). Pri Lh in Prl je točnost merjenja boljša/manjša RE na visokem nivoju PC

U2 (Lh: 6,89 %, Prl: 10,91 %) kot na nizkem nivoju PC U1 (Lh: 12,38 %, Prl:16,58 %).

56

Glede na dobljene rezultate točnosti merjenja, izračunane RE in primerjavo s ciljnimi

vrednostmi, ki jih je podal proizvajalec, lahko zaključimo, da se naše povprečne vrednosti

meritev za vse tri parametre nekoliko razlikujejo od ciljnih vrednosti proizvajalca, oz. so

nekoliko višje (na obeh nivojih). RE ne presegajo 15 %, razen v primeru Prl za PC U1

(16,58 %). Povprečne vrednosti rezultatov meritev za vse 3 parametre so znotraj

referenčnih območij, ki jih je podal proizvajalec, in zato lahko zaključimo, da so naši

rezultati točnosti sprejemljivi. Vzroki za omenjena odstopanja so lahko različni. Poleg

vprašanja stabilnosti reagentov in kontrolnega materiala (shranjevanje in rok uporabe

odprtih raztopin) menim, da je vzrok takšnih rezultatov moja neizkušenost pri rokovanju z

omenjenimi raztopinami – pravilna homogenizacija in temperiranje kontrolnega materiala

(čas, ki je potekel od raztapljanja do alikvotiranja in zmrzovanja kontrolnega materiala).

Mogoče bi bili rezultati boljši, če bi zaradi stabilnosti kontrolnega materiala merjenja

izvedli v krajšem času (npr. 5 ali 10 dni) in bi bilo število meritev večje (vsak dan za vsak

parameter po vsaj 5 meritev). Seveda bi bilo to možno, če bi imeli na razpolago dovolj

kontrolnega materiala, ki bi ga razdelili in zmrzovali v večjih količinah.

Ocena ujemanja rezultatov Fsh, Lh in Prl

Ujemanje rezultatov Fsh smo ocenili tako, da smo interpretirali diagrama Bland-Altmana

ali diagram razlik in Krouwer-Montija ali gorski diagram. Po interpretaciji diagrama

razlik smo zaključili, da sta pri merjenju Fsh prisotni obe napaki: sistematična in slučajna.

V primeru sistematične napake smo ugotovili, da analizator Cobas e 411, ki za merjenje

uporablja ECLIA metodo, v povprečju daje za 0,15 IU/L višje rezultate kot analizator

Axsym, ki za merjenje uporablja MEIA metodo. Ugotovili smo tudi to, da ta napaka ni

značilna oz. velika (95 % IZ [-0,57; 0,87 IU/L]). Iz razpona 95-odstotnih IU [-4,23, 4,52

IU/L] smo zaključili, da je prisotna variabilnost oz. slučajna napaka. Prisoten je tudi trend,

kar pomeni, da se povprečna napaka spreminja z velikostjo merjene vrednosti, oz. da so pri

višjih vrednosti Fsh večje razlike med Cobasom e 411 i Axsymom. Heteroskedastičnosti v

primeru merjenja Fsh ni. Vrh krivulje gorskega diagrama (ki se ne nahaja na vrednosti

"0") potrjuje zaključke, dobljene na osnovi interpretacije diagrama razlik, oz. da je prisotna

sistematična napaka. Mediana, ki znaša 0,37 IU/L, pomeni, da analizator Cobas e 411 v

povprečju daje za 0,37 IU/L višje rezultate kot analizator Axsym. Ta ugotovitev potrjuje

Bland-Altman analizo, da analizator Cobas e 411 daje višje rezultate kot analizator Axsym,

ampak je vrednost nekoliko večja (za 0,22 IU/L). Na osnovi izračuna 5. in 95. percentila

smo zaključili, da se 90 % razlik v rezultatih Fsh nahaja znotraj [-3,66; 2,15 IU/L]

57

intervala. Pri merjenju Fsh smo ugotovili prisotnost sistematične in slučajne napake ter

prisotnost še enega odklona – trenda. Zaradi tega lahko s statističnega vidika zaključimo,

da ujemanje rezultatov ni ustrezno. Po drugi strani sistematična napaka ni bila značilna oz.

velika in bi se dala računsko korigirati, če ne bi bili prisotni drugi odkloni, kot sta

variabilnost in trend. Velika variabilnost napak je resna pomanjkljivost, še posebej če je

prisotna tudi sistematična napaka in skupaj bistveno vplivata na oceno sprejemljivosti

ujemanja. Zaželjeno je, da je skupna variabilnost metod čim manjša. Sprejemljiva

variabilnost (slučajna napaka) je tista, ki bistveno ne vpliva na interpretacijo rezultata oz.

na samo diagnostiko. O sprejemljivosti variabilnosti, ki smo jo dobili pri merjenju Fsh, bi

se morali posvetovati z zdravnikom. Pomembno je, da se variabilnost v primeru našega

merjenja Fsh ne spreminja, oz. da ni heteroskedastičnosti, in da sistematična napaka, ki je

pogosto povezana z instrumentom ali nepravilnim izvajanjem merjenja, ni značilna. Če pa

bi bila heteroskedastičnost prisotna, bi morali logaritemsko transformirati podatke.

Ujemanje rezultatov Lh smo ocenili na podoben način kot pri Fsh. Razlika je ta, da smo o

ustreznosti ujemanja zaključili na osnovi interpretacije diagrama razlik, ki prikazuje

relativne vrednosti ujemanja zaradi preglednejše in enostavnejše interpretacije. Tudi v

primeru merjenja Lh sta prisotni obe napaki: sistematična, ki pomeni, da analizator Cobas

e 411 v povprečju daje za 23,1 % višje rezultate kot analizator Axsym, in slučajna napaka,

ki je razvidna iz razpona 95-odstotnih IU [-39,0 ; 86,0 %]. Sistematična napaka je v tem

primeru velika oz. značilna, ker se povprečje razlik značilno razlikuje od vrednosti "0", oz.

95 % IZ [13,3; 32,8 %] ne vsebuje vrednosti "0" (pri stopnji tveganja 5 %). Iz regresijske

premice smo zaključili, da so pri višjih koncentracijah Lh večje razlike med Cobasom e

411 in Axsymom (proporcionalen odnos), oz. da je večja povprečna napaka pri višjih

koncentracijah Lh. Heteroskedastičnosti ni. Tudi interpretacija gorskega diagrama potrjuje

prisotnost sistematične napake pri merjenju Lh. V tem primeru analizator Cobas e 411 daje

višje rezultate kot analizator Axsym (za 1,23 IU/L), kot je pokazala analiza Blanda in

Altmana. Iz 5. in 95. percentila smo zaključili, da se 95 % dobljenih Lh rezultatov nahaja

znotraj [-1,09; 3,28 IU/L] intervala. Po končanih meritvah Lh parametra z omenjenimi

statističnimi analizami smo ugotovili, da so prisotne: pristranskost, variabilnost, trend in da

heteroskedastičnosti ni. Iz tega lahko sklepamo, da ujemanje rezultatov v primeru Lh ni

ustrezno. Ocena ujemanja je celo slabša kot pri Fsh, ker je sistematična napaka v primeru

Lh značilna oz. velika.

58

Ujemanje rezultatov Prl smo tudi statistično ocenili kot neustrezno ujemanje. Iz diagrama

razlik je razvidno, da Cobas e 411 v povprečju daje za 17,4 % višje rezultate kot analizator

Axsym. To pomeni, da je prisotna sistematična napaka ki je značilna (95-odstotni IZ

[14,9;19,9 %]). Poleg značilne sistematične napake je prisotna tudi slučajna napaka, ki je

vidna iz 95-odstotnega IU [1,0; 34,0 %] intervala. Od ostalih odklonov je prisoten trend,

heteroskedastičnosti ni. Prisotnost pristranskosti potrjuje tud gorski diagram, iz katerega je

razvidno, da analizator Cobas e 411 daje za 2,33 μg/L višje rezultate kot analizator Axsym.

Na osnovi izračuna 5. in 95. percentila lahko zaključimo, da se 95 % dobljenih Prl

rezultatov nahaja znotraj [0,724; 6,674 μg/L] intervala. Rezultati Fsh, Lh in Prl, ki smo jih

izmerili na obeh analizatorjih z različnima metodama, se s statističnega vidika ne ujemajo,

oz. smo njihovo ujemanje ocenili za neustrezno. Pri vseh testiranih parametrih so bili

prisotni odkloni: sistematična napaka (pristranskost), slučajna napaka (variabilnost) in

trend (spreminjanje povprečne napake z velikostjo merjene vrednosti).

Heteroskedastičnosti pri merjenju parametrov ni bilo. Pri merjenju Fsh sistematična napaka

ni bila značilna, pri Lh in Prl pa je bila značilna. Zanimivo in pomembno je to, da

analizator Cobas e 411 pri vseh testiranih parametrih meri višje rezultate kot analizator

Axsym. Variabilnost je bila pri parametrih različna. Njene sprejemljivosti s kliničnega

vidika nisem ocenila, ker ni v domeni te naloge in zahteva dodatna znanja in izkušnje. V

sodelovanju z zdravniki, ki so specialisti na področju ginekologije, bi bila interpretacija

gorskega diagrama in diagrama razlik v tem primeru gotovo boljša in popolnejša. Pri vseh

parametrih smo odkrili, da so razlike med rezultati, ki jih podajata oba analizatorja, večje

pri višjih koncentracijah. Pomembno je tudi to, da se variabilnost v nobenem primeru

merjenja ni spreminjala. Seveda je zaželjeno, da se metodi sistematično ne razhajata in da

je njuna (skupna) variabilnost čim manjša (32). Iz enačbe klasičnega modela merjenja je

razvidno, da te napake lahko ovrednotimo le s pomočjo razlik parov meritev, ki so

opravljene z ECLIA in MEIA metodo. Pri tem je pomembno dejstvo, da ni utemeljeno,

dotlej rabljeno metodo (v našem primeru MEIA metodo), uporabiti kot zlati standard in da

je pri ocenjevanju ujemanja v ospredju praktična sprejemljivost (32). Takšna

sprejemljivost je odvisna od konkretnih okoliščin, kot so: namen meritve (presejalna ali

potrditvena), vrsta in zgradba analita (homogeni in heterogeni analiti), namen uporabe

analizatorja (npr. v enoti za intenzivno nego, urgentni enoti, patronažni enoti) ... Zato bi

bilo pred izvedbo postopkov potrebno opredeliti meje sprejemljivosti ujemanja (32). Za ta

korak menim, da je potrebno posvetovanje z zdravnikom, specialistom na tem področju, ki

59

naše rezultate meritev vrednoti in interpretira. Ujemanja izmerjenih rezultatov nismo

ocenjevali s kliničnega vidika, ampak s statističnega. Ne glede na to nas zanima, zakaj je

prišlo do takšnih neskladjih v rezultatih. Vzrokov je verjetno več. Avtorja B. Hinney in W.

Wuttke (14) navajata, da lahko imunološki testi/metode različnih proizvajalcev dajejo

različne rezultate Fsh in Lh v vzorcih pacientov, ne glede na to, ali so bila uporabljena

monoklonska ali poliklonska Ab in ali sta testa bila kalibrirana po istem standardu in

protokolu. Avtorja sta mnenja, da so neskladja v rezultatih lahko posledica (14):

prisotnosti nespecifičnih, motečih snovi, ki interferirajo (ta primer je bolj izražen

pri RIA metodi kot pri imunometričnih testih),

različne selektivnosti protiteles do različnih glikoziliranih oblikah Fsh in Lh, ki kot

genetske variacije vključujejo razširjene populacije variabilnih glikoziliranih oblik,

sprememb v epitopih (vezavnih mest na antigenu), ki so posledica nekaterih

bolezni, kot je renalna insuficienca in

kinetičnih stanj imunoloških testov/metod.

Kot primer omenjenih neskladnosti pri določanju Fsh navajajo, da je RIA metoda pokazala

< 1 % navzkrižne reaktivnosti z Lh, Tsh in hCG (14). V uporabi sta 2 različna mednarodna

referenčna materiala: WHO 1 st IRP 78/549, ki je minimalno prečiščen izvleček hipofize,

dokler je novejši mednarodni ref. material WHO 83/575 bolj prečiščen (14). Imunološki

testi, ki uporabljajo omenjene standarde in poliklonska Ab, bodo dali višje rezultate Fsh v

vzorcih pacientov kot imunološki testi, ki uporabljajo monoklonska Ab (14). V primeru

neskladnosti rezultatov pri določanju Lh sta poudarila, da je prisoten problem v

standardizaciji Lh testov (14). Vzrok za to so različne vrste Ab (14). Nekatera protitelesa

namreč dobro reagirajo s prosto β-verigo, dokler druga zaznajo hCG, ampak tisto skupino,

ki je bolj specifična za Lh (14). Slednja protitelesa so tako specifična, da sploh ne reagirajo

z genetskimi Lh oblikami/variantami (14). Posledica tega so lahko lažno znižane vrednosti

Lh v vzorcih pacientov (14). Takšne oblike se v nekaterih populacijah pojavljajo zelo

redko, medtem ko je v drugih populacijah takšnih oblik celo do 25 % (14). Za določanje

vrednosti Fsh in Lh se bolj uporabljajo imunometrični testi, ki uporabljajo monoklonska

Ab (14). Ti testi so bolj občutljivi in njihova izvedba je hitrejša v primerjavi s RIA testi

(14). Pri določanju prolaktina so tudi pričakovana neskladja v rezultatih, ki so izmerjeni z

različnimi metodami različnih proizvajalcev (36). Avtor je mnenja, da je vzrok za to

molekulska heterogenost prolaktina (36). Primerljivi rezultati se lahko dosežejo z uporabo

60

istega referenčnega materiala za kalibracijo metode (36). Pomembna je tudi pretvorba enot

v mIU/L in navedba pretvorbenega faktorja (36). Dostopen referenčni kalibracijski

materiali so: WHO 1 st IRP 75/504, WHO 2nd IS 83/562 in WHO 3rd IS 84/500 (36).

Naši rezultati niso slabo primerljivi zaradi slednjega razloga, kajti obe metodi (ECLIA in

MEIA) sta kalibrirani po istem mednarodnem standardu, in sicer: Fsh-2nd IRP WHO

referenčni standard 78/549 (7,19), Lh-2nd IS (NIBSC) 80/552 (8,20) in Prl-3rd IRP WHO

referenčni standard 84/500 (9, 21). Lahko so posledica uporabe različnih vrst Ab, ki so

različno specifična do Ag, ki smo jih določali oz. do njihovih genetskih variant/oblik. V

našem primeru MEIA metoda (Axsym) uporablja v reagentu 1 (za določitev Fsh in Lh)

mišja monoklonska Ab in v reagentu 2 kozja poliklonska Ab (19, 20), metoda ECLIA

(Cobas e 411) v obeh reagentih uporablja mišja monoklonska Ab (7, 8). Za merjenje Prl,

MEIA v reagentu 1 uporablja mišja monoklonska Ab in v reagentu 2 zajčja poliklonska Ab

(21), ECLIA pa v obeh reagentih uporablja samo mišja monoklonska Ab (9). Verjetno je na

dobljene rezultate vplivala tudi moja neizkušenost pri delu z novim analizatorjem,

reagenčnim in kontrolnim materialom (predpriprava, temperiranje in mešanje kontrolnih

vzorcev) ter sama stabilnost testiranih analitov (pomemben je čas od odvzema do analize

vzorca in shranjevanje). Z izkušnjami, ki sem jih do zdaj pridobila, bi verjetno ustvarila

boljše pogoje za analiziranje vzorcev. To pomeni, da bi bila bolj pozorna pri izvedbi

preanalitičnih postopkov, čas, ki je potekel od odvzema vzorca do obdelave, bi bil veliko

krajši, vzorce bi sproti zamrzovala na -20 °C in bi jih nato vse skupaj analizirala pod

enakimi pogoji. Zanimivo bi bilo analizirati vzorce pacientov na več različnih

koncentracijskih nivojih. Tudi to bi lahko vplivalo na oceno ujemanja.

Imunološki testi so zadnja leta zelo napredovali. Po uvedbi prvega RIA testa so se razvile

alternativne metode, ki uporabljajo manj nevarne molekule označevalcev (37). Rokovanje

s takšnim materialom je bolj enostavno in varno za laboratorijske delavce. Pomemben je

tudi dosežek na področju izdelave Ab (37). Danes so dostopna monoklonskaAb, ki so

visoko specifična do posameznih analitov, kar pomeni tudi manj navzkrižnih reakcij (37).

Poleg omenjenega je na izboljšanje ponovljivosti in občutljivosti ter na hitrost izvedbe

posam. testov vplivala avtomatizacija (37). Analizatorji novih generacij so večinoma

popolnoma avtomatizirani. Vsi omenjeni dosežki na področju imunoloških testiranj so

omogočili hitrejšo analizo vzorcev, kar za pacienta pomeni krajši čas hospitalizacije ali

hitrejšo postavitev diagnoze in bolj učinkovito zdravljenje (37). Po drugi strani to omogoča

tudi zmanjševanje stroškov zdravstvenih ustanov. Rezultati Fsh, Lh in Prl, ki smo jih merili

61

na starejšem analizatorju Axsym in novem analizatorju Cobasu e 411, ne kažejo ustreznega

ujemanja. To smo statistično ocenili s primernimi metodami Blanda in Altmana ter

Krouwerja in Montija. Poleg tega statističnega vidika pa je pri ocenjevanju ujemanja

pomembna tudi praktična sprejemljivost. Serumsko določanje omenjenih hormonov je

samo del večstopenjske diagnostike motenj ženskega spolnega cikla. Poleg anamneze in

fizičnih pregledov je potrebno narediti še potrditvene teste – hormonske teste

(progesteronski test, estrogensko-progesteronski test, prolaktin-stimulacijski test),

ultrazvočno diagnostiko, RTG in MR. Potrebna so tudi ponovna merjenja hormonov po

določenem času zaradi spremljanja nihanja vrednosti. ECLIA metoda, ki jo uporablja nov

analizator Cobas e 411, je validirana s strani proizvajalca. Mi smo je verificirali, oz. smo

ocenili, da omogoča merjenje ponovljivih in točnih rezultatov. Iz teh razlogov smo

zaključili, da novo metodo lahko uporabljamo za merjenje serumskih koncentracij Fsh, Lh

in Prl, oz. da lahko obstoječi analizator Axsym zamenjamo z novim – Cobasom e 411.

Uporabnike naših storitev (zdravnike) smo obvestili o menjavi metod določanja

posameznih imunoloških parametrov. Podali smo jim nove referenčne vrednosti in merilna

območja za vsak posamezan parameter in jih opozorili, da nova metoda meri nekoliko višje

rezultate kot predhodna, ampak da ima tudi širša merilna območja. Poslali smo jim tudi

dodatne potrebne podatke, ki se nanašajo na preanalitične, analitične in poanalitične

postopke, ter podatke o prednosti metode. Popolnoma avtomatizirani analizator Cobas e

411 in njegova inovativna ECL tehnologija nam omogočata točne, natančne, hitre in

učinkovite meritve različnih parametrov, kot so: označevalci ščitnične funkcije, parametri

za diagnostiko anemij, parametri za testiranje plodnosti/hormonski testi, označevalci srčne

funkcije, parametri za ugotavljanje nosečnosti, tumorski označevalci, parametri infektivnih

bolezni, kostni označevalci in številni drugi (38). Delo na njem je enostavno, niso potrebne

predpriprave reagentov (manjše je število napak, ki bi vplivale na rezultat), ima širša

merilna območja kot analizator Axsym, ki zmanjšujejo potrebe po redčenjih in ponovitvah

merjenja (38). Poleg tega ECL tehnologija zagotavlja visoko analitično občutljivost

(potrebni so majhni volumni vzorcev, možnost uvedbe inovativnih testov) in omogoča zelo

hitre rezultate nujnih preiskav (znotraj 9 minut, STAT aplikacija za teste: hCG, troponin T

4. generacije, izoencim MB kreatin kinaze (CK-MB), mioglobin, paratiroidni hormon (Pth)

(38)). Reagenčni, kalibracijski in kontrolni material je označen s črtnimi kodami, ki jih

analizator avtomatično prebere, tak sistem omogoča hitro, robustno in varno izvedbo

analiznega postopka (38). Za razliko od do sedaj uporabljane MEIA metode, ECLIA

62

metoda za določanje Fsh, Lh in Prl uporablja v obeh reagentih monoklonska Ab, ki so

visoko specifična. Posledica tega je veliko manj navzkrižnih reakcij (38).

63

6. SKLEPI

Merjenje koncentracij hormonov (Fsh, Lh in Prl) ženskega spolnega cikla smo

opravili z MEIA metodo na starem analizatorju Axsym (proizvajalca Abbott) in z

ECLIA novo tehnologijo na novem analizatorju Cobas e 411 (proizvajalca Roche).

Z enostavnimi statističnimi metodami Blanda in Altmana ter Krouwerja in Montija

smo vrednotili ujemanja metod. Po omenjenih statističnih analizah smo ocenili, da

je ujemanje pri vseh 3 parametrih slabo oz. neustrezno. To smo zaključili na osnovi

prisotnih sistematičnih in slučajnih napak.

Nekoliko boljše rezultate ujemanja smo dobili pri merjenju Fsh, kjer sistematična

napaka ni bila značilna (95-odstotni IZ [-0,57; 0,87 IU/L]). Pri vseh treh parametrih

smo opazili trend – da so razlike med rezultati večje pri višjih vrednosti

parametrov. Heteroskedastičnosti ni bilo v nobenem primeru.

Zaključili smo tudi to, da analizator Cobas e 411 v povprečju meri nekoliko višje

vrednosti vseh testnih parametrov kot analizator Axsym ( pri Fsh za 0,15 IU/L, pri

Lh za 23,1 % in pri Prl za 17,4 %).

Krouwer-Montijeve analize potrujejo analize Blanda in Altmana o neustreznosti

ujemanja pri vseh treh parametrih. Potrjuje tudi to, da v povprečju višje rezultate

meri analizator Cobas e 411 (pri Fsh za 0,37 IU/L, pri Lh za 1,23 IU/L in pri Prl za

2,33 μg/L).

Nova ECLIA metoda je bila ustrezno validirana s strani proizvajalca. Mi smo

metodo verificirali tako, da smo določili njeno natančnost (ponovljivost) in točnost.

Natančnost (znotraj-serijska in meddnevna ponovljivost), ki smo jo ocenili na

osnovi izračunanega KV (%), je bila zadovoljiva pri vseh treh parametrih. To

pomeni, da je celokupni KV znotraj priporočljivega kriterija od 1–5% (Fsh 4,19 %,

Lh 3,24 %, Prl 2,67 %) in primerljiv s KV, ki jih je podal proizvajalec (Fsh 1,4 %,

Prl 4,0 %).

KV pri Lh nismo primerjali s KV proizvajalca, ker sta se naša povprečja razlik

rezultatov razlikovala od povprečij razlik rezultatov proizvajalca. Najboljša

natančnost (meddnevna ponovljivost) merjenja je bila pri Prl (najmanjši KV) in

najslabša pri Fsh (najvišji KV).

Točnost merjenja vseh parametrov je bila zadovoljiva na nizkem (PC U1) in

visokem koncentracijskem nivoju (PC U2) kontrolnega materiala. To pomeni, da so

64

bili vsi izmerjeni rezultati oz. povprečja izmerjenih rezultatov znotraj referenčnih

območij, ki jih je podal proizvajalec. Na osnovi izračunanih relativnih napak (za

povprečja rezultatov) smo zaključili, da je bila najslabša točnost merjenja pri Prl

(RE za PC U1 16,58 %) in najboljša točnost pri Lh (RE za PC U2 6,89 %).

Pri izbiri "statističnega orodja" za analiziranje in vrednotenje ujemanja metod

merjenja, je pomembno, da nobene metode ne obravnavamo kot "zlati standard" in

da je vedno v ospredju praktična sprejemljivost.V praksi je serumsko določanje

naših testnih hormonov samo del večstopenjske diagnostike motenj ženskega

spolnega cikla, ki omogoča spremljanje stanja, oz. daje vpogled v nihanja in

spremembe stanja. Nikakor ni edina diagnostična metoda. Zato so naši rezultati

ujemanja s praktičnega vidika sprejemljivi za vse tri parametre.

Nova ECL tehnologija, ki jo analizator Cobas e411 uporablja za meritev Fsh, Lh in

Prl, ima številne prednosti: širše merilno območje (zmanjšano število ponovitev in

manj redčenja), visoko analitično občutljivost (zahteva manjši volumen vzorca) in

možnosti hitrejše izvedbe testov (posebej nujnih, kot so: troponin, β-hCG,

mioglobin, CK-MB ...). Poleg tega so v obeh reagentih uporabljena visoko

specifična monoklonska Ab, kar preprečuje različne navzkrižne reakcije (MEIA

uporablja monoklonska in poliklonska Ab).

Ne glede na to, da sta ujemanji rezultatov merjenja do sedaj uporabljene MEIA

metode in nove ECLIA metode neustrezni, ECLIA tehnologija omogoča merjenja

natančnih in točnih rezultatov Fsh, Lh in Prl. Poleg tega ima širša merilna območja

in omogoča hitrejše analize določenih analitov. Zaradi enostavnejšega in varnega

rokovanja ter izboljšane programske opreme sta analizator Cobas e 411 in nova

ECL tehnologija primerna za merjenja Fsh, Lh in Prl v našem laboratoriju.

65

7. LITERATURA

1. Šimunić V. Menstruacijski ciklus.

http://www.poliklinika-

ivf.hr/docs/ginekologija/V.Simunic%20%20Menstruacijski%20ciklus.pdf (dostopno: 22.

12. 2013).

2. Osredkar J. Hormonska diagnostika. In: Seminar za inženirje in tehnike laboratorijske

medicine, Zbornik predavanj. SZKK, 2010.

3. Kraševec M. Agonisti in antagonisti steroidnih spolnih hormonov. Seminarska naloga,

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 1997: 1–22.

4. Herman M. Primerjava dveh metod za določanje spolne hormone vezočega globulina

(SHBG). Diplomska naloga, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za Farmacijo, 2012: 1–2.

5. http://sl.wikipedia.org/wiki/Estrogen (dostopno: 18. 1. 2013).

6. Meden-Vrtovec H, Vrtovec B. Motnje v menstrualnem ciklusu. Obzornik zdravstvene

nege, 1978; 12: 378–381.

7. Roche Diagnostiscs. Elecsys and cobas e analyzers: Follicle-stimulating hormone

package insert (REF 11775863 122): Intended use; Summary, Roche Diagnostiscs GmbH,

Mannheim, 2010-V17; 1–3.

8. Roche Diagnostiscs. Elecsys and cobas e analyzers: Luteinizing hormone package insert

(REF 11732234 122): Intended use; Summary , Roche Diagnostiscs GmbH, Mannheim,

2007-V 15; 1–3.

9. Roche Diagnostiscs. Elecsys and cobas e analyzers: Prolactin II package insert REF

03203093 190): Intended use; Summary, Roche Diagnostiscs GmbH, Mannheim, 2010-

V4; 1–4.

10. Guyton AC, Hall JE. Pregnancy and Lactation. In: Textbook of Medical Physiology.

9th

ed. Philadelphia, Pennsylvania: W.B. Saunders Company, 1996: 1045–1046.

11. Guyton A.C. Hall J.E. Female Physiology Before Pregnancy; and the Female

hormones. In: Textbook of Medical Physiology. 9th

ed. Philadelphia, Pennsylvania: W.B.

Saunders Company, 1996: 1017–1026.

12. Šimunić V. Poremećaji menstruacijskog ciklusa: Amenoreje i Oligomenoreje,

http://www.ivf.hr/docs/ginekologija/POREMECAJI%20MENSTRUACIJSKOG%20CIKL

USA.pdf (dostopno: 8. 10. 2014).

13. Topalović Z. Značajke i nepravilnosti menstruacijskog ciklusa. Medicus. 2010; 19: 23-

24.

66

14. Wuttke W, Hinney B. Ovarian function. In: Lothar T. Clinical Laboratory Diagnostics.

Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. 1st ed. Frankfurt, Main, Germany: TH-

Books, 1998: 1091–1094.

15. Wallach JB. Endocrine Diseases. In: Handbook of Interpretation of diagnostic tests. 6th

ed. Philadelphia, Pennsylvania: Lippincott-Raven Publishers, 1996: 356–375.

16. Osredkar J. Marc J. Laboratorijski postopki. In: Laboratorijska medicina I. Učbenik za

študente medicine, farmacije in laboratorijske biomedicine. Ljubljana: Fakulteta za

farmacijo, 2012: 143–144.

17. Abbott Diagnostics. Learning Guide Immunoassay.

http://www.drtanandpartners.com/wp-content/uploads/2014/05/learning_immunoassay.pdf

(dostopno: 8. 10. 2014).

18. Roche Diagnostiscs. COBI-CD. Compendium of Background Information: Test

principles , Roche Diagnostiscs GmbH, Mannheim, Germany, 2001–2006: 5–12.

19. Abbott Axsym System. FSH package insert (7A60) , Division, USA, 2005: 1–7.

20. Abbott Axsym System. LH package insert (REF 7A61) , Abbott Laboratories

Diagnostics Division, USA, 2003: 1–7.

21. Abbott Axsym System. Prolactin package insert (REF 7A62) , Abbott Laboratories

Diagnostics Division, USA, 2003: 1–7.

22. Piskar M. Priporočeni postopek za odvzem venske krvi. SZKK, 1999.

23. Roche Diagnostiscs. ProCell (REF 11662988 122), Roche Diagnostics GmbH

Mannheim, Germany, 2013; V 14.0.

24. Roche Diagnostiscs. CleanCell (REF 11662970 122), Roche Diagnostics GmbH

Mannheim, Germany, 2013; V 18.0.

25. Roche Diagnostiscs. FSH CalSet II (REF 03032680 122), Roche Diagnostics GmbH

Mannheim, Germany, 2010; V 8.0.

26. Roche Diagnostiscs. LH CalSet II (REF 03561097 190), Roche Diagnostics GmbH

Mannheim, Germany, 2010; V 8.0.

27. Roche Diagnostiscs. Prolactin II CalSet (REF 03277356 190), Roche Diagnostics

GmbH Mannheim, Germany, 2010; V 4.0.

28. Roche Diagnostiscs. PreciControl Universal (REF 11731416 190; REF 11731416 922-

QCS), Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Germany, 2010; V 5.0.

67

29. Dvoršak K. Vrednotenje metod v imunokemiji, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za

farmacijo, 2010: 3–7.

30. Lederer V. Uvedba določanja prostatno specifičnega antigena v serumu z

elektroluminiscenčno imunokemijsko metodo. Diplomska naloga, Univerza v Ljubljani,

Fakulteta za farmacijo, 2009: 22–23.

31. Furek Z. Uvajanje preiskave v rutinsko delo. Delovno navodilo, ZDM Služba za

laboratorijsko diagnostiko, Maribor, 2008: 1–2.

32. Lajovic J. Ujemanje metod merjenja-praktični pristop. Strokovna revija ISIS, 2010; 10:

44-49.

33. Bland. J.M. Altman D.G. Statistical methods for assessing agreement between two

methods of clinical measurement.

https://www-users.york.ac.uk/~mb55/meas/ba.pdf (dostopno: 10. 10. 2014).

34. Locatelli I. Osnove biomedicinske statistike. Biomedicinska informatika, Univerza v

Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2014: 23–43.

35. Krsnik M. Statistična primerjava dveh metod ob uvajanju novega testa, Univerzitetni

klinični center Ljubljana, KIKKB, Ljubljana.

36. Werder v. K. Prolactin. In: Lothar T. Clinical Laboratory Diagnostics. Use and

Assessment of Clinical Laboratory Results. 1st ed. Frankfurt, Main, Germany: TH-Books,

1998: 1082–1083.

37. Hendriks H.A. Kortlandt W. Verweij W.M. Analytical performance comparison of five

new generation immunoassay analyzers.

https://www.nvkc.nl/publicaties/documents/2000/nr%203/p170/2000-3-170.pdf

(dostopno: 10. 10. 2014).

38. Cobas, Cobas e and Life needs answers. Cobas e 411 analyzer: The immunoassay

analyzer Cobas e 411 2nd

generation platform of ECL technology

http://www.aub.edu.lb/fm/cmop/downloads/cobas_e_411_EN.pdf

(dostopno: 8. 10. 2014).

PRILOGE

Priloga 1. Vrednotenje ujemanja rezultatov Fsh z Bland-Altman analizo

N (štev.

meritev)

COBAS

(IU/L)

AXSYM

(IU/L)

COBAS – AXSYM

(IU/L)

COBAS - AXSYM

(%)

(COBAS +AXSYM) /2

(IU/L)

1 7,46 7,32 0,14 1,9 7,39

2 42,02 52,08 -10,06 -21,4 47,05

3 5,64 5,67 -0,03 -0,5 5,66

4 21,03 21,62 -0,59 -2,8 21,33

5 5,07 5,34 -0,27 -5,2 5,21

6 24,89 28,22 -3,33 -12,5 26,56

7 13,26 12,53 0,73 5,7 12,90

8 29,90 28,22 1,68 5,8 29,06

9 7,72 6,99 0,73 9,9 7,36

10 5,82 5,34 0,48 8,6 5,58

11 17,19 15,39 1,80 11,0 16,29

12 9,79 9,65 0,14 1,4 9,72

13 37,51 36,06 1,45 3,9 36,79

14 11,30 9,31 1,99 19,3 10,31

15 54,98 52,91 2,07 3,8 53,95

16 17,59 16,49 1,10 6,5 17,04

17 8,06 7,21 0,85 11,1 7,64

18 4,31 4,32 -0,01 -0,2 4,32

19 1,78 1,66 0,12 7,0 1,72

20 89,28 94,27 -4,99 -5,4 91,78

21 6,48 6,46 0,02 0,3 6,47

22 3,27 2,90 0,37 12,0 3,09

23 7,86 7,43 0,43 5,6 7,65

24 19,31 16,04 3,27 18,5 17,68

25 8,48 7,17 1,31 16,7 7,83

26 5,24 5,05 0,19 3,7 5,15

27 6,16 5,97 0,19 3,1 6,07

28 9,90 9,37 0,53 5,5 9,64

29 6,56 5,96 0,60 9,6 6,26

30 4,81 4,86 -0,05 -1,0 4,84

31 6,64 7,15 -0,51 -7,4 6,90

32 6,20 5,87 0,33 5,5 6,04

33 6,88 6,42 0,46 6,9 6,65

34 5,61 5,49 0,12 2,2 5,55

35 20,02 18,37 1,65 8,6 19,20

36 5,54 5,41 0,13 2,4 5,48

37 64,43 61,98 2,45 3,9 63,21

Povprečje 0,15 3,9

SD 2,23 8,0

Povprečje

razlik

(IU/L)

Standardni

odklon

(IU/L)

95%IZ za aritm.sred. 95% IU

(IU/L) (IU/L)

0,15 2,23 [-0,57; 0,87] [-4,23; 4,52]

Povprečje

razlik

(%)

Standardni

odklon

(%)

95%IZ za aritm.sred. 95% IU

(%) (%)

3,9 8,0 [1,3; 6,5] [-12,0; 19,0]

Priloga 2. Vrednotenje ujemanja rezultatov Lh z Bland-Altman analizo

N (štev.

meritev)

COBAS

(IU/L)

AXSYM

(IU/L)

COBAS – AXSYM

(IU/L)

COBAS - AXSYM

(%)

(COBAS +AXSYM) /2

(IU/L)

1 3,46 3,00 0,46 14,2 3,23

2 13,73 14,81 -1,08 -7,6 14,27

3 3,89 2,67 1,22 37,2 3,28

4 8,37 7,39 0,98 12,4 7,88

5 7,16 6,92 0,24 3,4 7,04

6 7,11 6,09 1,02 15,5 6,60

7 11,06 9,23 1,83 18,0 10,15

8 64,71 50,57 14,14 24,5 57,64

9 11,95 10,11 1,84 16,7 11,03

10 7,55 7,47 0,08 1,1 7,51

11 10,80 10,89 -0,09 -0,8 10,85

12 10,36 8,78 1,58 16,5 9,57

13 4,35 3,12 1,23 32,9 3,74

14 5,37 3,57 1,80 40,3 4,47

15 4,40 3,42 0,98 25,1 3,91

16 4,78 3,54 1,24 29,8 4,16

17 9,76 7,89 1,87 21,2 8,83

18 5,32 4,85 0,47 9,2 5,09

19 14,55 11,43 3,12 24,0 12,99

20 8,05 6,74 1,31 17,7 7,40

21 6,44 4,97 1,47 25,8 5,71

22 11,11 10,69 0,42 3,9 10,9

23 4,39 3,16 1,23 32,6 3,78

24 8,49 6,94 1,55 20,1 7,72

25 6,84 4,88 1,96 33,4 5,86

26 8,68 6,24 2,44 32,7 7,46

27 9,47 6,19 3,28 41,9 7,83

28 20,84 22,25 -1,41 -6,5 21,55

29 8,20 6,23 1,97 27,3 7,22

30 0,10 0,00 0,10 200,0 0,05

31 42,04 40,49 1,55 3,8 41,27

32 144,30 120,88 23,42 17,7 132,59

33 12,14 12,26 -0,12 -1,0 12,20

34 4,17 2,85 1,32 37,6 3,51

35 9,24 7,13 2,11 25,8 8,19

36 36,61 38,04 -1,43 -3,8 37,33

37 3,01 1,95 1,06 42,7 2,48

38 4,64 2,96 1,68 44,2 3,80

39 5,70 4,88 0,82 15,5 5,29

40 32,86 33,95 -1,09 -3,3 33,41

41 27,79 26,59 1,20 4,4 27,19

Povprečje 1,90 23,1

SD 4,15 31,9

Povprečje

razlik

(IU/L)

Standardni

odklon

(IU/L)

95%IZ za aritm.sred. 95%IU

(IU/L) (IU/L)

1,90 4,15 [0,63; 3,17] [-6,23;10,03]

Povprečje

razlik

(%)

Standardni

odklon (%)

95%IZ za aritm.sred. (%) 95% IU (%)

23,1 31,9 [13,3; 32,8] [-39,0; 86,0]

Priloga 3. Vrednotenje ujemanja rezultatov Prl z Bland-Altman analizo

N (štev.

meritev)

COBAS

(μg/L)

AXSYM

(μg/L)

COBAS – AXSYM

(μg/L)

COBAS - AXSYM

(%)

(COBAS +AXSYM) /2

(μg/L)

1 7,29 6,55 0,74 10,7 6,92

2 11,63 10,72 0,91 8,1 11,18

3 13,31 12,20 1,11 8,7 12,76

4 26,46 22,55 3,91 16,0 24,51

5 12,86 10,89 1,97 16,6 11,88

6 5,62 4,90 0,72 13,7 5,26

7 14,70 12,37 2,33 17,2 13,54

8 15,61 13,52 2,09 14,3 14,57

9 27,88 20,16 7,72 32,1 24,02

10 14,64 12,15 2,49 18,6 13,40

11 19,83 17,08 2,75 14,9 18,46

12 16,59 14,73 1,86 11,9 15,66

13 9,12 7,35 1,77 21,5 8,235

14 17,59 14,06 3,53 22,3 15,83

15 15,79 12,11 3,68 26,4 13,95

16 21,48 16,43 5,05 26,6 18,96

17 24,49 18,34 6,15 28,7 21,42

18 17,99 15,31 2,68 16,1 16,65

19 12,65 10,77 1,88 16,1 11,71

20 10,70 9,61 1,09 10,7 10,16

21 15,11 11,89 3,22 23,9 13,50

22 16,17 11,03 5,14 37,8 13,60

23 18,37 15,08 3,29 19,7 16,73

24 21,85 18,04 3,81 19,1 19,95

25 23,70 19,59 4,11 19,0 21,65

26 8,58 7,74 0,84 10,3 8,16

27 35,77 28,99 6,78 20,9 32,38

28 36,98 30,73 6,25 18,5 33,86

29 14,54 12,12 2,42 18,2 13,33

30 29,51 22,58 6,93 26,6 26,05

31 6,57 5,72 0,85 13,8 6,15

32 11,48 9,49 1,99 19,0 10,49

33 7,60 7,89 -0,29 -3,7 7,75

34 13,36 14,48 -1,12 -8,0 13,92

35 10,36 8,83 1,53 15,9 9,60

36 26,82 26,08 0,74 2,8 26,45

37 17,14 13,94 3,20 20,6 15,54

38 7,11 6,36 0,75 11,1 6,735

39 12,44 8,70 3,74 35,4 10,57

40 9,77 8,38 1,39 15,3 9,075

41 21,97 17,65 4,32 21,8 19,81

42 9,96 8,53 1,43 15,5 9,245

43 17,16 13,49 3,67 23,9 15,33

44 7,61 6,18 1,43 20,7 6,90

45 12,73 11,02 1,71 14,4 11,88

Povprečje 2,72 17,4

SD 1,98 8,6

Povprečje

razlik

(μg/L)

Standardni

odklon (μg/L)

95%IZ za aritm.sred. 95% IU

(μg/L) (μg/L)

2,72 1,98 [2,14; 3,30] [-1,16; 6,61 ]

Povprečje

razlik (%)

Standardni

odklon (%)

95%IZ za aritm.sred. (%) 95% IU (%)

17,4 8,6 [14,9; 19,9] [1,0; 34,0]

Priloga 4. Vrednotenje ujemanja rezultatov Fsh z Krouwer-Monti analizo

N

(štev. meritev)

COBAS

(IU/L)

AXSYM

(IU/L)

COBAS-AXSYM

(IU/L) PERCENTILI PREPOGNJENI PERCENTILI

1 42,02 52,08 -10,06 0% 0%

2 89,28 94,27 -4,99 3% 3%

3 24,89 28,22 -3,33 6% 6%

4 21,03 21,62 -0,59 8% 8%

5 6,64 7,15 -0,51 11% 11%

6 5,07 5,34 -0,27 14% 14%

7 4,81 4,86 -0,05 17% 17%

8 5,64 5,67 -0,03 19% 19%

9 4,31 4,32 -0,01 22% 22%

10 6,48 6,46 0,02 25% 25%

11 1,78 1,66 0,12 28% 28%

12 5,61 5,49 0,12 28% 28%

13 5,54 5,41 0,13 33% 33%

14 9,79 9,65 0,14 36% 36%

15 7,46 7,32 0,14 39% 39%

16 5,24 5,05 0,19 42% 42%

17 6,16 5,97 0,19 42% 42%

18 6,20 5,87 0,33 47% 47%

19 3,27 2,90 0,37 50% 50%

20 7,86 7,43 0,43 53% 47%

21 6,88 6,42 0,46 56% 45%

22 5,82 5,34 0,48 58% 42%

23 9,90 9,37 0,53 61% 39%

24 6,56 5,96 0,60 64% 36%

25 7,72 6,99 0,73 67% 33%

26 13,26 12,53 0,73 69% 31%

27 8,06 7,21 0,85 72% 28%

28 17,59 16,49 1,10 75% 25%

29 8,48 7,17 1,31 78% 22%

30 37,51 36,06 1,45 81% 20%

31 20,02 18,37 1,65 83% 17%

32 29,90 28,22 1,68 86% 14%

33 17,19 15,39 1,80 89% 11%

34 11,30 9,31 1,99 92% 8%

35 54,98 52,91 2,07 94% 6%

36 64,43 61,98 2,45 97% 3%

37 19,31 16,04 3,27 100% 0%

Mediana 0,37

5. percentil -3,66

95. percentil 2,15

Priloga 5. Vrednotenje ujemanja rezultatov Lh z Krouwer-Monti analizo

N

(štev. meritev)

COBAS

(IU/L)

AXSYM

(IU/L)

COBAS-AXSYM

(IU/L) PERCENTILI PREPOGNJENI PERCENTILI

1 36,61 38,04 -1,43 0% 0%

2 20,84 22,25 -1,41 3% 3%

3 32,86 33,95 -1,09 5% 5%

4 13,73 14,81 -1,08 8% 8%

5 12,14 12,26 -0,12 10% 10%

6 10,80 10,89 -0,09 13% 13%

7 7,55 7,47 0,08 15% 15%

8 0,10 0,00 0,10 18% 18%

9 7,16 6,92 0,24 20% 20%

10 11,11 10,69 0,42 23% 23%

11 3,46 3,00 0,46 25% 25%

12 5,32 4,85 0,47 28% 28%

13 5,70 4,88 0,82 30% 30%

14 8,37 7,39 0,98 33% 33%

15 4,40 3,42 0,98 35% 35%

16 7,11 6,09 1,02 38% 38%

17 3,01 1,95 1,06 40% 40%

18 27,79 26,59 1,20 43% 43%

19 3,89 2,67 1,22 45% 45%

20 4,35 3,12 1,23 48% 48%

21 4,39 3,16 1,23 48% 48%

22 4,78 3,54 1,24 53% 48%

23 8,05 6,74 1,31 55% 45%

24 4,17 2,85 1,32 58% 43%

25 6,44 4,97 1,47 60% 40%

26 42,04 40,49 1,55 63% 38%

27 8,49 6,94 1,55 65% 35%

28 10,36 8,78 1,58 68% 33%

29 4,64 2,96 1,68 70% 30%

30 5,37 3,57 1,80 73% 28%

31 11,06 9,23 1,83 75% 25%

32 11,95 10,11 1,84 78% 23%

33 9,76 7,89 1,87 80% 20%

34 6,84 4,88 1,96 83% 18%

35 8,20 6,23 1,97 85% 15%

36 9,24 7,13 2,11 88% 13%

37 8,68 6,24 2,44 90% 10%

38 14,55 11,43 3,12 93% 8%

39 9,47 6,19 3,28 95% 5%

40 64,71 50,57 14,14 98% 3%

41 144,30 120,88 23,42 100% 0%

Mediana 1,23

5. percentil -1,09

95. percentil 3,28

Priloga 6. Vrednotenje ujemanja rezultatov Prl z Krouwer-Monti analizo

N

(štev. meritev)

COBAS

( μg/L)

AXSYM

( μg/L)

COBAS-AXSYM

( μg/L) PERCENTILI PREPOGNJENI PERCENTILI

1 13.36 14.48 -1.12 0% 0%

2 7.60 7.89 -0.29 2% 2%

3 5.62 4.90 0.72 5% 5%

4 7.29 6.55 0.74 7% 7%

5 26.82 26.08 0.74 9% 9%

6 7.11 6.36 0.75 11% 11%

7 8.58 7.74 0.84 14% 14%

8 6.57 5.72 0.85 16% 16%

9 11.63 10.72 0.91 18% 18%

10 10.70 9.61 1.09 20% 20%

11 13.31 12.20 1.11 23% 23%

12 9.77 8.38 1.39 25% 25%

13 7.61 6.18 1.43 27% 27%

14 9.96 8.53 1.43 30% 30%

15 10.36 8.83 1.53 32% 32%

16 12.73 11.02 1.71 34% 34%

17 9.12 7.35 1.77 36% 36%

18 16.59 14.73 1.86 39% 39%

19 12.65 10.77 1.88 41% 41%

20 12.86 10.89 1.97 43% 43%

21 11.48 9.49 1.99 45% 45%

22 15.61 13.52 2.09 48% 48%

23 14.70 12.37 2.33 50% 50%

24 14.54 12.12 2.42 52% 48%

25 14.64 12.15 2.49 55% 46%

26 17.99 15.31 2.68 57% 43%

27 19.83 17.08 2.75 59% 41%

28 17.14 13.94 3.20 61% 39%

29 15.11 11.89 3.22 64% 36%

30 18.37 15.08 3.29 66% 34%

31 17.59 14.06 3.53 68% 32%

32 17.16 13.49 3.67 70% 30%

33 15.79 12.11 3.68 73% 27%

34 12.44 8.70 3.74 75% 25%

35 21.85 18.04 3.81 77% 23%

36 26.46 22.55 3.91 80% 21%

37 23.70 19.59 4.11 82% 18%

38 21.97 17.65 4.32 84% 16%

39 21.48 16.43 5.05 86% 14%

40 16.17 11.03 5.14 89% 11%

41 24.49 18.34 6.15 91% 9%

42 36.98 30.73 6.25 93% 7%

43 35.77 28.99 6.78 95% 5%

44 29.51 22.58 6.93 98% 2%

45 27.88 20.16 7.72 100% 0%

Mediana 2.33

5. percentil 0.724

95. percentil 6.674