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PWYECTO 69-88. UHEi FOBECYT. 1

Análisis de la efectividad del gen ya clonado y su uso en kanamicina como vehículo para transformar papayas

criollas, hawaianas y maradol.

INFORME FINAL PROYECTO NO. 69-00

Línea FODECYT Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

CONCYT 3 de septiembre del 2001 al 30 de noviembre del 2002

Licda. Margarita Palmieri, Universidad del Valle de Guatemala Dr. Guillermo Sánchez, IPM/CRSP Dr. Wayne Parrott, Universidad de Georgia, Estados Unidos Dr. Michael Deom, Universidad de Georgia, Estados Unidos Raque1 Mendizábal, Universidad del Valle de Guatemala José Miguel Seijas, Universidad del Valle de Guatemala Luis López, Universidad del Valle de Guatemala

Financiado por: SENACYT, línea FODECYT

IPMICRSP

Universidad de Georgia, E.E.U.U.

Universidad del Valle de Guatemala

INDICE GENERAL

PAGINA

1. INTRODUCCION ........................................................................ 1

11. PALABRAS CLAVE .................................................................... 2

111. ANTECEDENTES ........................................................................ 2

IV. OBJETIVOS .................................................................................. 5

1.- General

2.- Específicos

V. HIPOTESIS .................................................................................... 5

VI. METODOLOGIA ......................................................................... 6

a. Capacitación de personal de laboratorio y campo ................. 6

b. Transformación del Agrobacterium tumefaciens con

el gen de interés, en este caso, el gen de la cápside de

PRSV-p ........................................................................... ............ 6

c. Transformación de embriones de papaya criolla,

hawaiana y maradol, utilizando Agrobncterium

tumefaciens ................................................................................ 6

d. Selección y verificación de embriones transformados ........... 7

e. Diferenciación, germinación y enraizamiento de

embriones transformados ......................................................... 8

f. Evaluación de plantitas mediante métodos

moleculares ................................................................................ 8

g. Aclimatación de plantitas de papaya transformadas ............ 9

h. Traslado de plantitas al invernadero ...................................... 9

i. Producción continua de embriones para su . I transformacion .......................................................................... 9

j. Verificación de la transformación de la plantita . P . por métodos biologicos ........................................................... 11

k . Estudio de plantitas de papaya transformadas

y seleccionadas con el gen de higromicina que se

encuentran actualmente a nivel de invernadero .................. íí VI1 . RESULTADOS ........................................................................ 12

VI11 . DISCUSION ................................................................................. 25

IX . CONCLUSIONES ........................................................................ 27

.............................................................. X . RECOMENDACIONES 27

................................................... XI . IMPACTO DEL PROYECTO 27

............................................ XII . CRONOGRAMA DEL TRABAJO 28

XIII . BIBLIOGRAFIA ......................................................................... 29

XIV . APENDICES ................................................................................ 30

xv . EJECUCI~N FINANCIERA ..................................................... 3s

INDICE DE FIGURAS PÁCINA

1. Obtención de radiculas a partir de las semillas

de papaya hawaiana inmadura ..................................................... 10

2. Gel del PCR realizado a las colonias de Agrobacterium

tumefaciens. Todas las colonias analizadas presentaron

el gen de la cápside del virus PRSV-p .......................................... 12

3. Gel de agarosa con muestras de colonias de A.

tumefaciens transformadas con el gen de la cápside

del virus PRSV-p. Colonias descongeladas para

transformación de embriones ....................................................... 13

4. Rosetas de embriones transformadas y en crecimiento

de papaya criolla, hawaiana y maradol ....................................... 16

5. Muestra de un gel de PCRs de embriones de papaya.

Muestra de embriones con presencia del gen y sin

Presencia del gen ............................................................................ 17

6. Embriones transformados en diferenciación .............................. 18

7. Etapa de secado (hardening) ........................................................ 18

8. Plántulas de papaya en las etapas de germinación

y enraizamiento .............................................................................. 19

9. Plantitas de papaya transformadas en enraizamiento ............... 20

10. Radiculas de semilla inmadura de papaya criolla en

crecimiento y producción de embriones ...................................... 21

11. a-Papayas transformadas macho, b- papayas hembras

y hermafroditas no transformadas en el invernadero

de Jocotillo, c- flor de papaya hembra, d- flor de

.......................... papaya macho, e- flor de papaya hermafrodita 23

12. Plantitas de papaya criolla no transformadas negativas

......................... para el virus de la mancha anular de la papaya 24

INDICE DE GRÁFICAS PAGINA

1. Obtención de radículas a partir de las semillas

de papaya hawaiana inmadura ..................................................... 14

2. Rosetas de embriones no transformados sobrevivientes

en las diferentes concentraciones de kanamicina ....................... 15

3. Comparación entre los porcentajes de los embriones

transformados en cada etapa del proyecto, tanto para

kanamicina como para higromicina ............................................ 22

INDICE DE TABLAS PAGINA

1. Total de embriones transformados con el vector que

contiene el gen de kanamicina para selección ............................ 17

Análisis de la efectividad del gen ya clonado y su uso en vectores con resistencia a kanamicina como vehículo para transformar papayas criollas,

hawaianas y maradol.

Investigador Principal: Licda. Margarita Palmieri, Universidad del Valle de Guatemala Investigadores Asociados: Dr. Guillermo Sánchez, IPMICRSP; Dr. Wayne Parrott y Dr. Michael Deom. Universidad de Georgia, Estados Unidos; Raquel Mendizábal, J O S ~ Miguel Seijas y Luis López, Universidad del Valle de Guateniala.

1. Introducción.

La papaya es uno de los productos que tiene gran potencial para ser un producto de exportación de éxito para Guatemala, ya que se considera que tienen una demanda creciente de 15 años según estudios en los Estados Unidos. Uno de los obstáculos más grandes para la producción de papaya de buena calidad en Guatemala, es el virus del anillado de la papaya (PRSV-p), el cual ha causado pérdidas de plantaciones completas sobre todo en el área sur del país. Productores han tratado en vano de resolver el problema mediante uso de químicos, eliminación de plantas infectadas por el virus y otras medidas pero no han podido erradicar la enfermedad de sus plantaciones. En Guatemala se han hecho ya los primeros esfuerzos para producir papayas con resistencia a PRSV-p insertando el gen de la cápside del virus al genoma de la papaya y utilizando como criterio de selección de colonias resistentes al gen que codifica para el antibiótico de higromicina. Se utilizó este antibiótico no sólo porque es un antibiótico que no se usa mucho a nivel humano sino porque la eficiencia de obtener una planta transformada, es mayor con higromicina que con los otros antibióticos (kanamicina). Se han logrado plantitas con el gen insertado y actualmente están en espera de evaluaciones más específicas como pruebas de inoculación mecánica del virus y evaluación de sus características agrícolas y organolépticas.

Hace aproximadamente un año se publicó un documento por Food and Drug Administration (FDA) en el cual aparece una guía de los antibióticos que son aceptados para la industria y para uso como genes de resistencia en plantas transgénicas. Publican una evaluación de la seguridad de algunos antibióticos marcadores de resistencia que pueden incluirse en productos transgénicos. El FDA recomienda la kanamicina (gen kan ') como el antibiótico más aceptable para estos propósitos, después de haber realizado una evualuación completa de este gen. El gen de la higromicina en cambio necesita tener una evaluación más detallada porque aunque no se usa en humanos puede tener un uso importante en veterinaria (FDNCFSAN Guide, 1999) y contribuir en gran porcentaje a crear nueva resistencia en humanos.

Nuevos esfuerzos para construir un nuevo vector con resistencia a kanamicina para introducir la resistencia a PRSV-p a embriones de papaya se llevaron a cabo. Actualmente se cuenta con el vector modificado y se ha introducido a Agrobacterium tumefaciens para transformar los embriones de papaya. Esta técnica de transformación es una tecnología que puede aplicarse aquí en Guatemala con mayor facilidad, ya que se ha hecho con anterioridad. Según Yang et al., 1996, es una técnica que tiene una eficiencia alta.

Este estudio tuvo dos propósitos fundamentales, el primero fue el de transformar nuevos embriones de papayas criollas, papayas tipo hawaiano variedad 'Sunrise' y tipo maradol y el segundo, la comparación de la eficiencia de este nuevo vector con kanamicina (gen kan ') con el vector anterior conteniendo higromicina. Se comparó la eficiencia para transformación (presencia del gen insertado) y eficiencia para producir nuevas plantitas. Todas las técnicas para hacer este tipo de transformaciones se conocían con anterioridad, se evaluaron las concentraciones de kanamicina a ser consideradas como selectivas de embriones transformados. En este proyecto se pretendió llevar las plantitas obtenidas hasta la etapa de invernadero, inocular mecánicamente las plantitas con el virus PRSV-p y verificar que realmente había presencia del gen para explicar los resultados de la inoculación mecánica. Lamentablemente las plantitas sólo fueron llevadas hasta la etapa de enraizamiento por la tardanza que tuvo en reaccionar en el medio de selección con kanamicina.

11. Palabras clave.

Transgénicos, vectores, pruebas de hibridización, polimerasa en cadena, gen marcador, antibiótico, gen de selección, inoculación mecánica, diferenciación, embrión.

111. Antecedentes.

Hasta el momento la papaya en Guatemala, no es un producto en el mercado internacional por diversas razones entre los que destacan la falta de tecnología de producción adecuada, las enfermedades, uso de semillas criollas no seleccionadas y sobre todo el problema del virus del anillado de la papaya (PRSV-p). La presencia de este virus a veces permite que la planta produzca frutos pero su apariencia y calidad no es adecuada para exportación. Este agente patógeno, el PRSV-p, es un potivirus cuyo control se dificulta porque es transmitido por áfidos de manera no persistente. Un campo de papaya joven puede quedar totalmente infectado en el lapso de 3 a 4 meses, siendo más rápido entre más cerca están las plantas de papayas Apéndice 1. Esfuerzos para el control del vector con insecticidas de todo tipo no han sido exitosos y se ha obtenido escaso éxito con el uso de aceites impidiendo que adquiera las partículas virales al introducir su estilete (Clough, G, et al, 1995). Para el control de este virus también se han hecho esfuerzos, incluyendo protección ci-uzada, pero no han dado los resultados esperados (Ploetz, R. et al., 1994). La papaya sin embargo se considera con gran potencial para ser un rubro muy alto en las exportaciones guatemaltecas, ya que estudios en Estados Unidos indican que la papaya tiene una demanda creciente de 15 años. Guatemala además, posee el clima y extensiones grandes con las condiciones apropiadas para su cultivo. La papaya se ha iniciado a sembrar en el área norte (Petén) para fortalecer el cultivo y producción de este producto.

El cultivo de papaya en Guatemala, es de alta rentabilidad y de gran aceptación para su consumo tanto en forma fresca como procesada. Además, la papaya es una de las fi-utas más cultivadas en regiones tropicales y subtropicales por su sabor y su riqueza nutricional en

vitaminas A y C además de ser fuente de papaína, enzima digestiva de mucha utilidad en la industria.

Actualmente en Guatemala existen varias compañías que están dedicándose a la producción de papaya y todas tienen problemas con este virus, tanto en el área sur como en el oriente. A pesar de estos problemas con el virus, están tratando de mantenerse en el mercado hasta poder contar con un producto que sea más resistente o tolerante y que les permita poder producir sin tantas pérdidas, un fruto de calidad para exportación. Para ellos es muy importante contar con una solución como lo es una papaya con resistencia al PRSV-p ya que resistencia natural al virus no ha sido encontrada en la naturaleza (Fitch, M. et al., 1992). Una medida de este tipo se considera que tendría gran beneficio para los agricultores. La incorporación de resistencia a este virus en los cultivares es factible ya que el virus debe liberarse de la cápside antes de poder replicar su ARN para que la enfermedad pueda proseguir su curso. Por esto se ha mostrado que plantas con el gen de las proteínas de la cápside incorporado, están protegidas contra la infección de ese virus (Clough, G., et. al., 1995). Se pueden utilizar dos metodologías para lograr introducir esta resistencia a las plantas, mediante una bacteria, Agrobacterium tumefaciens (Yang, J.S., et al. 1996 ) y mediante una pistola a presión (Fitcli, M. et al. 1992). En este proyecto se utilizará la primera metodología porque además de no requerir de equipo sofisticado como la pistola a presión para lanzar los proyectiles, ha sido reportada como muy eficiente en cuanto a la obtención de plantitas transformadas (Yang, J.S. et al., 1992). La resistencia derivada de patógenos (PDA) ha sido el mecanismo más utilizado, sin embargo hay otros acercamientos que pueden ser más efectivos en algunos casos pero que la infraestructura en Guatemala no está preparada para utilizarlos y los resultados todavía están en experimentación. (Deom, 2000, en preparación).

La incorporación de resistencia de un virus a una planta, es una práctica que tiene ventajas sobre la obtención de resistencia del mismo hospedero. La ventaja de los genes virales es que pueden ser identificados, aislados y clonados fácilmente debido a los genomas pequeños de los virus, en cambio en el hospedero esto se dificulta más tanto por el tamaño del genoma como por las grandes cantidades de ADN repetitivo que puede tener un organismo. Este tipo de resistencia se deriva del concepto clásico de protección cruzada. Se hipotetiza que la presencia de algún componente vira1 (cápside), es responsable de conferir protección interfiriendo con el anclaje, entrada y con la falta de formación de cápside del virus así como puede ser por competencia de factores limitantes o interferencia con la replicación (Grumet 1994). A pesar de existir otros enfoques para conferir resistencia a plantas, en el caso de este virus se ha comprobado en países como Hawaii que sí se puede conferir resistencia mediante este acercamiento aunque no para todas las cepas del virus (Gonsalves 1998). Otros acercarnientos serían muy difíciles de implementar en este momento en Guatemala por las facilidades con que se cuentan y la papaya transgénica es necesario que se produzca lo más rápido posible, ya que el tiempo es factor crítico para las compañías exportadoras de papaya y para los agricultores ya que con los daños y pérdidas que causa el virus, no es mucho lo que se pueden sostener.

En Guatemala, el área sur es el área de mayor producción papayera y la incidencia del PRSV-p fue del 37% en 1998 (Sánchez et al. 1999), con alta posibilidad de aumentar y

acabar con las plantaciones de papaya en poco tiempo, algo similar a lo que ocurrió en Hawaii hace algunos años (Gonsalves 1998).

Previos estudios a nivel de laboratorio fueron enfocados a la obtención de papayas transgénicas con resistencia al virus del anillado de la papaya (PRSV-p) en papayas criollas y hawaianas pero fueron llevados a cabo utilizando el antibiótico higromicina como medio de selección de las papayas transformadas de las no transformadas. El federal drug agency (FDA), en diciembre de 1999, publicó un listado de los antibióticos aceptados por ellos como inocuos a la salud humana y10 biodiversidad. Entre los antibióticos aceptados se encuentra la kanamicina pero no la higromicina. Esto se debe a que la higromicina no es utilizada con humanos aunque sí se utiliza en veterinaria. Por lo tanto, estas papayas no se podrán exportar a Estados Unidos u a otros países o utilizar para el mercado y consumo humano, hasta que no se hagan estudios más profundos con este antibiótico. Esto estimuló a que se hicieran nuevas pruebas para elaborar nuevos vectores pero ya no utilizando higromicina sino kanamicina como el antibiótico de selección. Este antibiótico fue aprobado por FDA y es considerado como el antibiótico más aceptado para estos trabajos (FDAISFSAN, 1999). Por este motivo se procedió a elaborar otro vector para transformar embriones de papaya. A este vector se le introdujo el gen de la kanamicina para poder seleccionar a los embriones transformados de los no transformados (Apéndice 2).

Los estudios previos ya están encaminados. Esfuerzos conjuntos con la Universidad de Georgia llevó a hacer las primeras pruebas. Ya se cuenta con un vector con resistencia a kanamicina que se puede utilizar en la transformación de embriones de papaya. Este proyecto se inició a nivel de la transformación de los embriones con Agrobacterium tumefaciens. Los pasos que se siguieron y el tiempo aproximado de crecimiento de embriones hasta la obtención de plántulas se presenta en el apéndice 3. Estos embriones transformados duran aproximadamente 3-4 meses para poder ser diferenciados, 2 para enraizamiento y luego se deben trasladar a invernado para hacer las pruebas de resistencia tanto mediante inoculación mecánica de las mismas con extractos de virus, como con pruebas de la polimerasa en cadena e hibridización. Si las plantitas llegan a producir semillas y se puede analizar su progenie se correrán Northern y Southern blots para verificar que estén también transformadas pero esto dependerá de la tasa de crecimiento de las plantitas que salgan positivas a la inoculación mecánica y a las pruebas de PCR. Lo más importante fue identificar las plantas madres transgénicas, inocularles el virus y ver si de verdad muestran resistencia. Si el PCR de la plantita sale positivo, se procederá con el Southern blot. Si la plantita llega a la etapa de producción de fruto, se evaluará la calidad de éste en grados brix (sabor y dulzura).

Un aspecto importante es que este estudio intentó abarcar no sólo germoplasma de papayas hawaianas de exportación del tipo solo sino también involucrar germoplasma de papaya exportación tipo maradol que está siendo sembrada en varias áreas de Guatemala siendo muy apetecida por su fuerte color naranja y finalmente germoplasma de la criolla para incrementar y mejorar el mercado interno así como para conservar el patrimonio nacional y ayudar al pequeño agricultor.

El impacto de este proyecto se enfocó hacia los agricultores con plantaciones de papaya, no importando si es agricultor pequeño o si es a través de cooperativas. Estos detalles se fortalecieron conforme el proyecto progresó, pues se evaluaron hasta donde se pudo, las plantitas que se detectaron como transformadas.

IV. Objetivos.

1.- General:

Obtención de papayas tipo criollo, hawaiano y maradol con resistencia a PRSV-p utilizando como criterio de selección a la kanamicina y su evaluación a nivel de invernadero mediante pruebas moleculares y biológicas.

2.- Específicos:

1- Utilizar pPZP201Bk con el gen de la cápside del PRSV-p, vector con resistencia a kanamicina en A. turnefaciens para tranformar embriones de papaya hawaiana, maradol y criolla.

2- Evaluación de embriones transformados mediante la técnica de la polimerasa en cadena.

3- Diferenciación y enraizamiento de embriones transformados.

4- Adaptación de plántulas a invernadero.

5- Selección de plántulas transformadas mediante pruebas moleculares.

6- Evaluación de plántulas transformadas mediante inoculación del virus.

7- Inicio de obtención y verificación de transformación de semillas y plántulas hijas.

V. Hipótesis.

Papayas transgénicas utilizando el gen de kanamicina como criterio de selección, pueden ser desarrolladas.

1 VI. Metodología.

Este proyecto presentó varias etapas, la metodología utilizada para cada una de ellas, se describe a continuación.

a) Capacitación de personal de campo y de laboratorio.

Se capacitaron inicialmente dos auxiliares de laboratorio en las etapas que requerían de mayor cantidad de trabajo, tales como lo son la generación de radículas y la propagación de embriones. Los auxiliares también fueron entrenados en etapas de selección de embriones transformados, diferenciación de embriones, secado y germinación. Además de los auxiliares se capacitó a la asistente de laboratorio y a un estudiante recién egresado de la carrera de bioquímica., quienes se entrenaron en la transformación, selección y diferenciación de embriones de las tres variedades de papaya (criolla, hawaiana y maradol), además de entrenarse en todas las otras etapas que se muestran en el Apéndice 3.

b) Transformación del Agrobacterium tumefaciens con el gen de interés. en este caso, el gen de la cápside de PRSV-p.

En esta etapa se utilizó la técnica de 'heat shock' para introducir el vector pPZP201BK que contiene el gen de la cápside del virus PRSV-p, al Agrobucterium tumefaciens. El A. tumefuciens que se utilizó es el LB-4404. Las colonias transformadas se seleccionaron en medio YM y10 YEP con kanamicina 50 uglml y 100uglml de estreptomicina. Se corroboró la presencia del gen de la cápside en las colonias de A. tumefaciens con PCR utilizando los

4 primers diseñados para aislar el gen de la cápside de las plantas infectadas con PRSV-p. Las secuencias de los primers utilizados se presentan a continuación (Sánchez et al. 2001):

PRVSNOTI: ATA AGA ATG CGG CCG CAA CAA TGG CCT CCA AAA ATG AAG CTG TGG ATG C

PRVHIII: CCC AAG CTT TTA GTT GCG CAT ACC CAG G

c) Transformación de embriones de papaya criolla, hawaiana y maradol, utilizando Agrobacterium tumefaciens.

Al iniciar el proyecto en octubre del 2001 se contaban con 12 alícuotas de Agrobacterium tumefaciens en almacenaje a menos ochenta grados centígrados. Dichas alícuotas se utilizaron para generar cultivos bacterianos a mayor escala utilizando 10 microlitros de dicha alícuota. Antes de utilizar los cultivos para tranformar embriones, se tomaron nuevas alícuotas para su almacenaje a -80°C. Asimismo, se sembraron placas Yep con 50 uglml de kanamicina y 100ug/ml de estreptomicina, para que crecieran las colonias transformadas del A. tumefaciens. Los cultivos se dejaron crecer hasta alcanzar una

L

concentración equivalente a 600 unidades de absorbancia. Se colocaron 40 u1 del caldo de Yep con kanamicina 50 y estreptomicina 100 y se esparcieron en las placas con medio sólido. Se tomaron varias colonias de la placa y se les corrió PCR para detectar la presencia del gen

de la cápside. El PCR llevado a cabo se encuentra citado en Sánchez et al, 2001. Las transformaciones se hicieron a partir de las colonias de A. tumefaciens que presentaron el inserto. Cada vez que se hizo una transformación y se utilizó un cultivo bacteriano a gran escala, se generaron más alícuotas para almacenaje.

Se continuó con la transformación de los embriones de papaya utilizando los cultivos de A. tumefaciens LB4404, citados anteriormente.

Los embriones de papaya se pusieron en contacto directo con el cultivo del A tumefaciens durante cinco minutos, se centrifugaron y se agregó al pellet de bacterias con embriones, 25 m1 de medio MSD20 pH 5.8. Se centrifugaron por 3 minutos y se cambió el medio de nuevo. Esto se repitió 3 veces. Se decantó el medio hasta dejar una pequeña fracción junto con los embriones. Estos se colocaron en una caja petri con servilleta estéril. Los embriones se sembraron en medio MSD20 pH 5.8 sólido por dos días, en luz indirecta, previo a su transferencia a medio de selección (Palmieri et al 2000).

d) Selección y verificación de embriones transformados.

A los dos días, los embriones se trasladaron a medio de selección: MSD20 pH 7 con kanamicina. Las concentraciones de kanamicina más adecuadas, se determinaron utilizando embriones de papaya no transformada y varias concentraciones del antibiótico. Las concentraciones de kanamicina utilizadas fueron de 50ugIm1, 100 uglml, 150 uglml, 200 uglml, 250 uglml y 300 uglml, en medio MSD20 pH7. Fitch et a1.1992, reportó concentraciones entre 100 y 150 uglml de kanamicina, como concentraciones ideales para selección. Grumet, 1994, reporta que el uso de concentraciones de kanamicina 75 (uglml) durante las 4 primeras semanas y el aumento de kanamicina a 150uglml en las etapas

- posteriores, proporciona mejores resultados. La prueba de concentraciones de kanamicina se llevó a cabo dos veces, la primera utilizando el diámetro de las rosetas y su variación en el tiempo y la segunda contando los números de rosetas muertas y determinando el porcentaje de sobrevivencia de las mismas. Se agregó al medio Mefoxín (500ug/ml), un antibiótico para controlar el A. tumefaciens. Se sembraron todos los embriones transformados en forma de rosetas. Se cambiaron a medio nuevo cada 3 ó 4 semanas. Cuando los embriones presentaron crecimiento abundante, se seleccionó una parte de los mismos para correrles PCR y verificar si tenían la presencia del gen. Se evaluaron estos embriones transformados mediante la técnica de PCR que se usa con hojas de papaya pero el método de extracción varió ya que' se hizo una extracción un poco más rápida que ha sido reportada por Higgins et al. 2000. En esta técnica se utilizaron porciones de embriones somáticos que fueron suspendidos en 50 u1 de TPS (Tris, Cloruro de Potasio y EDTA). El tejido se maceró en tubos de microcentrífuga, se calentó a 95 grados centígrados por 10 minutos y se enfrió rápidamente por 2 minutos antes de centrifugar brevemente para sedimentar cualquier materia sólida. Las rosetas de los embriones que presentaron este gen, se pasaron a medio de diferenciación con maltosa y carbón activado. Sin embargo, si el crecimiento de las rosetas de embriones fue mínimo, no se les corrió la prueba de PCR sino hasta la etapa de germinación.

e) Diferenciación, gerrninación y enraizamiento de embriones transformados.

La diferenciación de los embriones se llevó a cabo en medio de maltosa con carbón activado durante 2 a 4 semanas. En algunos casos se dejó más tiempo. Seguidamente los embriones se secaron en placas de Petri con un pedacito de medio en su interior, durante una semana aproximadamente. Al finalizar la etapa de secado, las plantitas se trasladaron a la etapa denominada germinación. Las hormonas más utilizadas en esta etapa son NAA (ácido naftalen-acético) y 6 BA (Benciladenina), reportadas por Drew, 1987; Drew et al. 1991. Se utiliuzaron dos modalidades de medios, el medio 112 MSO + 0.1 uM NAA y 0.8 uM 6BA y medio MSM6+ 6 BA(2uglml)+ NAA (O.luM), en ambos casos, sólido. Se realizaron subcultivos cada 4 a 6 semanas y se evaluaron cada 2-3 días para identificar contaminaciones, crecimiento, presencia de nuevas hojas y elongación del tallo. Las plantitas que mostraron mucho callo, fueron transferidas a medio MSM6+ 6 BA eliminando el NAA. Durante cada subcultivo se retiró el exceso de callo. La elongación del tallo se vio muy retardada, por lo que tomando como referencia el protocolo proporcionado por el Ing. Luis Molina, del ICTA, se utilizó medio líquido para acelerar el proceso de elongación de las plantulitas. La primera prueba que se hizo con medio MSM6+BA líquido, ayudó a la elongación de las plantitas, por lo que se continuó utilizando esta técnica para probar su eficiencia. Se dejaron las plantitas un máximo de dos semanas en medio líquido y luego fueron trasladadas al mismo medio pero sólido.

Las plantitas con una altura aproximada de 2 cm fueron trasladadas a medio de enraizamiento (112 MSO con ácido indolbutírico - IBA) para estimular la producción de raíces. Para esto, se probaron varias concentraciones de IBA: 2, 4, 8, 12, 18 mgll. Además se incluyó en la prueba el uso de un polvo enraizador llamado Rootex, el cual dentro de su composición contenía 0.30% de IBA. EL Rootex se utilizó a una concentración de 2 mgll en medio L/z MSO. Para las pruebas anteriores, se eliminó el callo de las plantitas previo traslado al medio de enraizamiento. Se observaron las plantitas durante 1 semana aproximadamente. Asimismo, al consultar al Ing. Luis Molina del ICTA, se evaluó el uso-de una solución enraizadora concentrada de IBA (500mgll diluída en etanol al 70%) previo al traslado de la plantita al medio de enraizamiento definitivo (112 MSO + IBA 0.2 mgll). Las plantitas fueron observadas diariamiente durante una semana aproximadamente. Estas plantitas se tornaron blancas, esto sugirió que el aparato fotosintético de las plantitas no estaba siendo estimulado adecuadamente. Por lo tanto se decidió utilizar el medio !h MSO con sucrosa reducida al 1% y al 0.5%. Esta limitación de azúcar, estimula a que las plantitas se vean obligadas a fotosintetizat sus alimentos. Es aquí en donde están la mayor parte de plantitas en la actualidad. Algunas plantitas lograron ser trasladadas a suelo y analizadas para presencia del gen.

f) Evaluación de plantitas mediante métodos moleculares.

Las plantulitas que presentaron más de una hoja fueron evaluadas con PCR para identificar la presencia del gen en las mismas. Para esto se utilizó el método de extracción de CTAB. En este método, las muestras (embriones u hojas) se guardaron en tubos eppendorf de 1.5 m1 rotulados y se pulverizaron con nitrógeno líquido y un pistilo manual. A cada muestra pulverizada se le agregaron 600 p1 de buffer de extracción con CTAB y 3 p1 P-

mercaptoetanol y se agitaron vigorosamente. La mezcla resultante se incubó a 65 O C durante 50-60 minutos, después de lo cual se le hizo una extracción con 500 pl de cloroformo. La mezcla se centrifugó por 5 minutos a 8,000 rpm y se transfirió el sobrenadante (fase acuosa) a un tubo eppendorf nuevo de 1.5 ml, previamente rotulado. A la fase acuosa se le agregaron 0.7 volúmenes de isopropanol y la solución se mezcló suavemente por inversión; luego se centrif~igó 8-10 minutos a 12,000 rpm y se decantó el Iíquido con cuidado de no perder el ADN precipitado en el fondo del tubo. El precipitado se lavó con 100 pl de etanol 70% y se dejó secar al aire por 1-2 horas. El ADN seco se disolvió en 30-50 p1 de buffer TE y se almacenó a -20 O C . Se corrió el PCR según programa reportado por Palmieri et al, 2001. La plantita que no presentó gen de la cápside fue eliminada.

g) Aclimatación de plantitas de papaya transformadas.

Las plantitas que mostraron raíces sanas, se trasladaron a suelo. Este suelo fue una mezcla de 70% de peat moss con vermiculita y piedra pómez (growing mix de SEMECA). Las plantitas se sembraron en vasos estériles, dentro de una magenta con tapadera. Se dejaron en el laboratorio con luz intensa por 16 horas y ocho de oscuridad. La tapa de la magenta se abrió diariamente por un período de tiempo hasta observar que la plantulita se empezaba a marchitar. Esto se hizo durante dos semanas pero cada día se incrementó la cantidad de tiempo que se expuso la plantita a la humedad del ambiente. Al finalizar las dos semanas se quedó completamente expuesta al ambiente. Se vigilaron constantemente para evitar su deshidratación. Se les regó con agua y con medio % MSO Iíquido, diluído diez veces.

Antes de ser trasladadas al invernadero se les tomaron medidas de grosor del tallo, número de hojas, altura y se registró el estado de las mismas.

h) Traslado de plantitas al invernadero.

Las plantitas se lograron trasladar al invernadero se dejaron un día o más en las macetitas para que se adaptaran al nuevo ambiente. Siempre con 16 horas de luz y 8 de oscuridad. Al día siguiente se sembraron en tubetes con tierra y se regaron según las necesidades. Se tomaron medidas de grosor de tallo, número de hojas, altura y un registro del estado de las mismas. Estas permanecerían en el invernadero hasta que tuvieran por lo menos 80 cms de altura.

i) Producción continua de embriones para su transformación. Durante todo el proyecto, se continuó con la producción de embriones de los tres tipos de

papaya para poder transformarlos. Estos embriones pasaron por varias etapas previo a esta transformación. Las etapas son: obtención de radículas, selección de embriones a propagar y propagación de embriones.

La obtención de radículas de semillas se hizo en un inicio a partir de semillas maduras en los tres tipos de papaya (Palmieri et al 2000). Estas semillas empezaron a dar problemas de baja germinación por lo que se inició a producir embriones de radículas provenientes de frutos inmaduros. Esto se decidió por recomendación personal del Dr. Wayne Parrott. El

consideró que este tipo de semilla da mejores resultados en cuanto a menores índices de contamhción asi como mayor potencial de crecimiento. Estas radímlas contienen el embrión cigótico que al ponerse en contacto con el medio de propagación inicia la producción de embriones somáticos. El medio de propagación contiene ácido 2,4 diclorohoxiacético (2-4D), el cual induce la multiplicación no diferenciada del material vegetal. El procedimiento mediante el cual se extrae la semilla del fiuto se muestra en la figura No. 1.

- - - - - - - - - -

E Ü R A 1. Obtenci611 de radícdas a partir de ias de papaya hiwaiana 1 1 inmadura

Una vez la radícula ha producido embriones se procede a la selección de los mismos. Para esto, se observaron los embriones en el estereomicroscopio y se eliminaton tanto el callo como los embriones con forma y tamaño a n o d , por ejemplo, muy @S y de fbma no globular. Los que presentaron una forma globular o en forma de dedo, se tsansfllieron a nuevo medio. Estos embriones se colocaron en la cajita formando rosetas de más o menos 12 a 15 embriones. Estos embriones se transfuieron a nuevo medio cada 4 semanas. Cuando mostraron crecimiento activo, se subdividieron en nuevas rosetas. Esta fiie la etapa de propagación. Las rosetas con suficiente material v e g d v o proveniente de la misma semilla, se sometieron al proceso de transformación.

j) Verificación de la transformación de la plantita por métodos biológicos.

Una vez la plantita se ha adaptado a las condiciones de invernadero, se le correría una prueba para verificar su resistencia. Todas las plantitas se inocularían mecánicamente con el virus (Palmieri et al 2000). Después de la inoculación se registrarían datos de aparición de síntomas diariamente y finalmente se les correría una prueba de ELISA. Si las plantitas presentan sintomatologías del virus, se eliminarían o se guardarían como controles, si es que sobreviven.

k) Estudio de plantitas de papava transformadas y seleccionadas con el gen de higromicina que se encuentran actualmente a nivel de invernadero.

Se continuó con el estudio de las papayas criollas y hawaianas que fueron trasladadas al invernadero de Jocotillo en el 2001. Estas papayas fueron machos en su totalidad y estaban en la etapa de producción de flores. Se consiguieron papayas no transformadas hembras y hermafroditas para polinizarlas. Se llevó a cabo la polinización de las mismas de la siguiente manera (ver Apéndice 4):

-Polinización a plantas no transformadas hembras:

e Se seleccionaron flores hembras no abiertas de distintas edades para poder ser polinizadas con el polen de un macho transformado.

e Se cortó la parte apical de la flor y se removieron los pétalos cuidadosamente, dejando descubierto el pistilo.

e Se seleccionó un macho específico y se cortaron flores cerradas maduras. De estas flores se tomó polen con un pincel delgado y se colocó el polen con sumo cuidado sobre el estilo del ovario.

Se marcaron las flores y se registraron datos de desarrollo de la planta y del fruto.

-Polinización a plantas no transformadas hermafroditas:

e Se eliminaron todas las flores macho que estaban en las plantas. Esto se continuó haciendo durante todo el período.

Se seleccionaron flores hermafroditas no abiertas de distintas edades para poder ser polinizadas con el polen de un macho transformado.

Se cortó la parte apical de la flor y se removieron los pétalos cuidadosamente, se retiraron los estambres dejando descubierto el pistilo.

Se seleccionó un macho específico y se cortaron flores cerradas maduras. De estas flores se tomó polen con un pincel delgado y se colocó el polen con sumo cuidado sobre el estilo del ovario.

Se marcaron las flores y se regktmmn datos de desarrollo de la planta y del h t o .

Se controlaron las plantitas de papaya dos veces a la semana para continuar con la poinuraoón y se registraron los datos de pohizaciones efectivas, niirnao de ñutos, tamaño del íhto y otros datos pertinentes. Las papayas se fdizaron y se regaron diariameate por el personal del invernadero.

VL Resultados.

Los resultados obtenidos en este proyecto se exponen a w h m i 6 n .

a) Transformación del APTobacterizun - hmtefmiens con el gen de interés. en este caso. el gen de la ch~side de PRSV-D.

.......................

El Agrobactenun íwneJasciens fbe crecido y analizado para determinar la presencia del gen. En la Figura 2, se presenta un ejemplo de los geles obtenidos en donde se detecta el gen de la *side del PRSV-p en colonias de A. tumefmiens recién transformadas. El tamaño del gen encontrado en estas bacterias, se comparó con el control positivo onghal. Las colonias examinadas en el PCR son: 1,2,3,5,6,7,8,10,12,13, 14,15,16,17,18 en la primera mitad del gel y 19,20,21,22,23,24,26,27,28,29,y 30 en la parte idbior del gel.

I FIGURA 2. Gel del PCR realizado a las colonias de Agrobacr presentaron el gen d @de ( -P.

A- p 1 Marcador 1Kb )

..J analizadas

b) Tmhrmación & embriones de papava criolla hawaiana v maradol utilizando Aarobacteritm tumefaciens.

Para esto se irtilizaron los alícuotas de A. tumefwim a l m a d o s a -80 OC, los cuales se crecieron y se volvió a verifícar la presencia del gen de la cápside del PRSV-p en las colonias de la cepa 22 que corresponde al A. tmeJaciens wn el inserto que tiene gen de kanamicina para seleccibn. Las colonias 1,3,4,5,7,8,12,13,14 fiieron seleccionadas de las que se recuperaron y se utílizaron para la transformación de los embriones. En la Figura 3, se muestra la presencia del gen de la dpside del PRSV-p y su tamaño origid de 864 pares de bases. Se incluyeron en el gei, un control negativo (C-) y un control positivo (C+). Se utilizó un marcador de 1 kilobase.

Coloniíis con el gei d e l a c a p s d e d e Wus PRSVP-p.

Control +

m FIGURA 3. Gel de agarosa con muestras de colonias de Agroboderulm tume$& transformadas con el gen de la cipside del virus PRSV-p. Colonias desconeeladas Dara 1 transformación de embriones.

~~. - - - ~- ~ - ~ .

c) Selección y vdcaci6n de embriones transformados.

En la etapa de selección de los embriones transformados, se utilizaron las concentraciones de kanamicina que evidenciaron ser las más adecuadas en las pruebas de mortalidad de embriones no ~ o r m a d o s . Se llevaron a cabo dos pruebas: la primera midiendo el crecimiento & la rosetas y la segunda contando el número de rosetas sobrevivientes.

Los resultados de las dos pruebas para selección de las concentraciones idóneas de kanamicina se presentan en la Gata 1.

- Prueba en base al crecimiento de rosetas de embriones (diámetro de las rosetas):

En esta prueba, se puede observar que hay dos puntos en las concentraciones mhs bajas de kanamicina que afectaron a los embriones de papaya sin transformar de manera más severa. Las concentraciones de 100 ug/rnl y de 150 uglml son las concentraciones que estimularon mejor respuesta en los embriones, principalmente la de 150 ug/ml. Esta prueba es impartante para seleccionar embriones con una alta probabilidad de ser transformados, si crecen en el medio con el antibibtico. Hay otras concentraciones más altas (250ugfml y 300 ug/ml) que presentaron efectos a veces más fuertes sobre los embriones, pero a estas concentmiones los embriones transformados entran mhs fgcilmente a una etapa de letargo de la cual no salen la mayoría de las veces.

La prueba de sobrevivencia de embriones a d i e n t e s concentracones mostró resultados que se asemejan a los anteriores. La Gráfica 2, muestra los resultados obtenidos en tres lecturas que se hicieron.

- Prueba en base al porcentaje de sobrevivencia de las rosetas de embriones:

GRAFíCA 2. Rosetas de embriones no ~ o r m a d o s sobrevMentes en las díferaks co-Mones de

1

Esta figura muestra de nuevo que las concentraciones entre 75 ug/ml y 15Oug/ml son las que mejor discriminarán entre embriones transformados. Sin embargo, la con&6n de 150 ug/ml es la mejor. Aquí las concentraciones mayores de kammicina, muestran ser menos eficientes que las bajas. A pesar de que 150 @ml es la mejor concentración para matar embriones no t r d o d o s , hay un 40% de embriones que son probablemenie a f d o s pero a largo plazo. Esto causará que a la hora de seleccionar embriones

transformados, pueda o c d r la presencia de algunos no transformados también Por esto podemos decir que los embriones que sobrevivieron en el medio de selección con kanamicina están transformados pero Únicamente con un 60% de certeza. Los embriones que sobrevivieron la etapa de selección (embriones con crecimiento activo) fieron trasladados a medio de diferenciación. En la Figura 4, se pueden observar embriones transformados en medio de selección, tanto en la caja de Petri donde se crecen como vistos a travds del estereoscopio, donde se aprecian con más detalle.

i PAPAYAMARADOL i

A continuación, se presenta un resumen del número de embriones de los tres tipos de papaya que se transformaron con A hmrefaciens conteniendo el gen de kanamicina como marcador de selección. En la Tabla 1, se presenta el total de embriones trandormados según la variedad de papaya.

TABLA 1. Total de embriones trausfonnados con el vector que contiene el gen de kanamicina para selección.

Finalmente, para verificar la presencia del gen en los embriones que estan siendo transformados, se evaluó un método de ex t rhón rápido descrito en Higgins et al. 2000. La metodología utiliza cantidades pequeñas de material para extraer ADN y hacer los PCRs conespondientes. Esto se hizo con el objeto de poder utilizar la mínima cantidad de embriones posible. Se corrió PCR a los embriones W o r m a d o s de papaya criolla y hawaiana. Se corrieron 60 muestras de embriones de los cuales el 15 % presentaron el gen. De estos embriones, el 44% fberon embriones de papaya hawaiana y el 66% restante fbe de embriones de papaya criolla. El 60 % de las extracciones a partir de rosetas de embriones con menos de 5 unidades, presentaron cantidades de ADN adecuadas para los PCRs.

En la Figura 5 se presentan los resultados obtenidos, tanto positivos como negativos, en los PCRs utilizando el método de extmción presentado por Higgbs et al. 2000.

I Banda del- + Residuos del vectm

d) Diferenciación. aerminación v enraizamiento de embriones transformados.

Los embriones transformados y activos en crecimiento se trasladaron al medio de diferenciación MSM6 con carbón activado, en el cual el carbón activado absorberti al ácido 2,4 diclorofemxiacético. Al removerse el 2,4 D, el tejido continuó con la evolución normal que el embrión debía experimentar, por lo que los embriones somáticos se empiezan a diferenciar. La diferenciú,rón es un paso elemental para el desarrollo de la p1ántu.h. La capacidad de los embrionm en diferenciarse se ve mermada por el grado de exposición que hayan tenido al 2,4 D y por el estrés que estos hayan sufido en la trdormación y posterior selección. A la fecha en esta etapa se encuentra el siguiente número de radículas: 45 papaya criolla, 31 papaya bawaiana y 19 papaya maradol. En la Figura 6, se muestran embriones transformados en la etapa de diferenciación.

Embrión en P-& diferenW6n.

La laboratorio definición

FIGURA 6. Embriones t raosfo~dos -

etapa de secado es muy importante ya que en pruebas realizadas en este se ha observado que es necesaria para obtener una raíz de calidad y una mayor en cuanto a la diferenciación de la plántula. En esta etapa se encuentran

aproximadamente 10 radíenlas cuyos embriones fueron transformados y seleccionados mediante kanamicina. En la figura 7, se muestran embriones transformados en la etapa de secado.

La etapa de pyminwión continúa en modificación para lograr que las técnicas tengan repetitividad con todas las plantitas producidas. En el proyecto anterior, se logró establecer según pruebas, que el medio que producía la mejor calidad de raíces era el MSM6, con el fin de mantener el desarrollo de tallos y hojas de la manera deseable. Se decidió agregarle ácido naftalenacético (0.2 mg/l) para la elongación celular, la fbrmación de callo y formación de retoños y raíces y 6 benzilaminopurina (0.02 mgd) para la estimulación de división celular y formación de retoños adventicios y axilares. La respuesta a dichas hormonas no fbe la esperada ya que las rosetas difefenciadas crecieron con una gran cantidad & callo impidiendo así el desarrollo normal del tejido. Según Parrott (comunicación personal, 2002), la causa del callo se debe al uso del regulador de crecimiento ácido naftalenacético, este regulador se debe utilizar únicamente en la última etapa para la inducción de raiz cuando se requiera. Dadas las recomendaciones anteriores acíuaimente se utiliza MSM6 con BA (2.0 mg/l). Las radículas que actualmente se encuentran en esta etapa como plántulas de embriones transformados seleccionados con kanamicina son: 1 papaya crioüa. En la figura 8, se muestran ejemplos de plantitas de papaya en esta etapa.

C FIGURA 8. Phtuias de ~aoava en las etam de eerminación v enmhmiento. m

La inducción de raíces es también elemental para establecer una plántula capaz de aúaptarse a tierra y salir del cuarto de cultivo. Los medios de enfaizamiento establecidos en la metodología con la cual se inició el presente proyecto mostraron eféctos adversos en las plantas. El medio contenía ácido indol butírico (2.032 m@) y riboflavina (1 1.67 mg/l) como hormonas. Los efectos adversos incluyeron: alto palidecimiento de la plántuía, poca generación de raíces, generación de gran cantidad de callo, entre otros. El medio de germinación utilizado anteriormente, MSM6, mostró sin contener ningún tipo de hormona la capacidad de inducir raíces de muy buena apariencia, sin ningún callo. Es por esta razón que se utW este medio desde germbción hasta la etapa de enrahmiento. Se obtuvieron un total & 33 plantuiitas con raíces adecuadas: 24 hawaianas y 9 tipo maradoi, las cuales se trasladaron a suelo. En la Figura 9, se muestran dos de las plantitas en etapa de enraizamiento .

e) Evaluación de p h t h mediante métodos moleculares.

Para evitar disminuir mucho la cantidad de embriones sometidos al proceso de tmdormación, se pensó que a pesar de utilizar muy poca cantidad de embriones el método de PCR, se estaban eliminando embriones tmn&ormados. Por esto se decidió hacer la evaluación a nivel de la etapa de germinación en donde 1 plantita poseía varias hojas. Se evaluaron mediante PCR un total de 340 plantitas de las d e s un 18% mostró presencia del gen de la +side del virus PRSV-p, siendo la mayoría papaya hawaiana. Actualmente hay 630 plantitas esperando ser evaluadas (270 criollas y 345 hawaianas). Las plantitas que no tienen presencia del gen son descartadas.

f ) Aclimatación de plantitas de ~apava transformadas.

Se trasladaron un tdal de 33 phtuiitas a suelo. Todas las plantitas, a excepción de 3 murieron debido a difkrentes causas, principalmente por exceso de humedad. A la fecha no se encuentran plántulas en adaptación a tierra

g) Traslado de ~lantitas al invemadero.

Hasta el momento se trasladaron 3 plant&as al invernadero en la caja inicial, de estas ninguna sobrevivió para sembrar defínitivamente en el invernadero. Murieron a los tres días de ser trasladadas.

h) Producción continua de embriones para su transformación.

La producción de embriones para transformación h e constante durante todo el proyecto. Sin embargo en 3 ocasiones, las semillas de papaya hawaiana y maradol escasearon y no se co~wiguieron por un buen tiempo. Además, las semillas maduras iniciaron a tardarse mucho en germinar y su tasa de germinación bajó hasta un 2 %.

Una modificación que se hizo al protocolo de producción de embriones, fiie la introducción de el uso de semillas inmaduras en lugar de madura por sugerencia del Dr. Wayne Parrott (comunicación personal). Al trabajar con semillas de h t o inmaduro, se logró incrementar la cantidad y la rapidez de obtención de embriones. La Figura 10, muestra la apariencia de las radiadas que están en esta fase.

PlGURA 10. Radículas de semilla inmadura de papaya criolla en crecimiento y producción de embrimek. -

Las radículas obtenidas de fhto inmaduro mostraron crecimiento en aproximadamente la mitad del tiempo que le toma a una radícula obtenida de semilla seca de fruto maduro. En la actualidad se tienen 408 radículas de papaya crioiia, 134 radículas de papaya maradol y 431 radícuias de papaya hawaiana en esta etapa.

La producción de material vegetal requiere la obtención de radículas de las semillas inmaduras previamente dedsinfectadas. Estas radículas contienen el embrión cigótico que al ponerse en contacto con el medio de propagación inicia en la producción de embriones somáticos. El medio de propagación contiene ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2-4D), una auxina que induce la multiplicación no diferenciada del material vegetal.

Una vez la radícula ha producido embriones, estos son tomados y propagados con el fín de tener suficiente material vegetativo proveniente de la misma semilla. Se tienen a la fecha el siguiente número de rosetas de embriones (12 a 15 embriones por roseta) en propagaciión: 39 de papaya criolla, 132 de papaya hawaiana y 33 de papaya maradol.

Cuando las rosetas tuvieron suficiente cantidad de embriones, se tm&ormaron u t i í i ido Agrohxterhn tumefac~ens. Al introducirles el gen de resistencia al virus de la mancha anular también se les inserta un gen de resistencia al antibiótico, M c i n a , con el fin de facilitar la identifícaciión del material recombinante.

En la Gráfica 3, se muestra un resumen del porcentaje de embriones y plantulitas de papaya con que se cuenta en la actualidad tanto seleccionadas con kanamicina como con higromicina. En esta gráñca se puede apreciar a la vez, la eficiencia de la selección de un antibiótico con respecto al otro. Vale la pena recordar, que las plantas seleccionadas con higromicina pasan por las mismas etapas que las seleccionadas con kanamicina.

Cuadro comparativo entra los embriones transformados que se encuentran en cada etapa,

O a C

h P

Etipas

GRAFICA 3. Comparación entre porcentajes de los embriones transformados en cada etapa del proyecto, tanto pam kanamicina como para higromicina

i) Estudio de plantitas transformadas v seleccionadas con el gen de himmicina aue se encuentran en el invernadero de Jocotillo.

En la Figura 11, se muestra el estado en que están las papayas transformadas macho que se trasladaron al invernadero de Jocotillo y que sirvieron para polinizar papayas no tnmsfbrmadas. Asimismo se presenta un ejemplo de flor macho, flor henmafiodii y flor hembra que nos sirvieron como criterio para sexar a las papayas.

Las papayas hembras o hermaffoditas no transformadas fkron donadas por un agricultor de E d l a dedicado al cultivo de papaya en tubetes, nos proporcionó varias papayas hembras y10 hermafiroditas (ver Figora 12).

Se utilizaron 16 plantitas de papaya (6 hembras y 10 hermafditas), que resultaron negativas a la prueba de ELISA para ser p0hkada.s con el polen de las papayas macho transkrmadas. En la Figura 12, se puede observar el estado en que se encontraban las plantitas no transformadas antes de ser p o l i s . En el Aphndice 5, se incluyen las tablas Wmicas con los datos morfológicos de las plantas macho transformadas.

VII. Discusión.

La obtención del Agrobacterium tumefaciens transformado fue un éxito pues todas las colonias obtenidas hasta el momento presentaron el gen de la cápside, a pesar de estar congelados durante un largo período de tiempo. Esto proporcionó las herramientas adecuadas para poder llevar a cabo transformaciones de papaya de cualquier variedad que sea susceptible al virus del PRSV-p y permitió continuar transformando embriones de papaya para el presente estudio.

El procedimiento para transformación de embriones de papaya de las tres variedades fue aceptable ya que el 15 % de los embriones sometidos al proceso de transformación presentaron el gen. Esto es bastante adecuado ya que según Parrott, hay algunos casos en que únicamente se obtiene un 5% de transformación. Lo único que esto implica es que hay que estar produciendo embriones constantemente y transformando para poder obtener un número adecuado de éstos transformados.

Sin embargo, el proceso presentó algunos problemas que se deben resolver. Uno de ellos es la obtención de embriones a partir de semillas maduras de papaya, ya que el procedimiento se ha tornado muy lento. Esto se puede deber a que las semillas tienen un tiempo relativamente largo en almacenamiento, que aunque adecuado, puede afectar su tasa de germinación. Además, el proceso de obtención de nuevas semillas es bastante tardado, ya que ni el proveedor de las mismas (AGEXPRONT), tiene todo el tiempo. Es más, la calidad de la semilla varía enormemente según el lote de semillas. Las semillas de papaya hawaiana variedad Sunrise y las de maradol, son las más difíciles de conseguir. Por lo que se decidió utilizar semillas de fruto inmaduro también. Esto significó una mejora significativa en el método. La velocidad de diferenciación de las radículas fue de por lo menos el doble de velocidad.

Otro problema es la selección de embriones con la concentración idónea de kanamicina. El problema radica primero que nada, en que no se obtuvo una tasa de mortandad del 100% en embriones no transformados al estar en contacto con diferentes concentraciones de kanamicina. Esto se pudo observar al efectuar las pruebas, tanto de crecimiento de rosetas de embriones (diámetro de las rosetas) como la prueba del porcentaje de supervivencia. Siempre hubo un porcentaje bastante alto (40%), que no respondió a estas concentraciones ni al antibiótico en sí. Esto provocó dificultad para seleccionar los embriones activos y descartar los inactivos. Por esto, los embriones se dejaron más tiempo en contacto con el medio de selección que contiene la hormona 2,4-D la cual induce a largo plazo, la dormancia (comunicación personal Dr. Wayne Parrott). Sin embargo, las concentraciones que presentaron mayor respuesta coinciden con las reportadas por Fitch 1992 y Grumet, 1994 (75 uglml y 1 50 uglml).

Como se observa en la Gráfica 3, en la etapa de diferenciación, hay un porcentaje mayor de embriones con el gen de kanamicina que con el gen de higromicina. Esto se puede deberse a que los embriones que fueron seleccionados, efectivamente eran embriones con crecimiento activo.

En la etapa de germinación, ya hay un mayor porcentaje de embriones seleccionados con higromicina. Los porcentajes con kanamicina son mínimos. Esto implica según el Dr. Parrott, que los embriones pueden haber estado en contacto con 2-4 D mucho tiempo, más del adecuado. Estos embriones (semillas), ya no responden a estímulos entrando en una etapa de dormancia y finalmente se mueren.

La etapa más problemática fue la de enraizamiento, esto se debe a que las respuestas de la planta han sido diferentes cada vez que se prueban las diferentes hormonas. Al principio del proyecto, se lograron obtener varias plantitas (33) con raíz adecuada. Después de eso ya no se logró obtener ninguna plantita con raíz. Creemos que el problema radica en la utilización de la hormona BA (6-bencil aminopurina) en lugar de utilizar IBA (ácido indolbutírico). La hormona IBA estaba causando que las plantitas se tornaran blancas por lo que se decidió eliminarla y utilizar BA en su lugar, en la etapa de germinación. Las plantitas han crecido muy bien en cuanto a color, formación de la hoja y brotes axilares, pero no se logra la elongación del tallo. Por esto, se propusieron 2 alternativas que se están evaluando en la actualidad. La primera alternativa, implica el uso de la solución enraizadora IBA en alta concentración, después de haber estado en medio MSM6 con BA (comunicación personal Ing. Luis Molina) y la otra es la introducción del uso de ácido giberélico con IBA en la etapa de germinación y ancymidol con IBA en la etapa de enraizamiento. Las concentraciones idóneas están siendo evaluadas.

Se le está dando mayor énfasis a la última opción porque según Moore 1989, el ácido giberélico induce la elongación de tallo de la plántula favoreciendo al crecimiento del brote apical, el IBA que por ser auxina. estimula la elongación celular, la iniciación de raices y sobre todo porque suprime el crecimiento de brotes axilares estimulando la dominancia apical. En cambio, BA a pesar de ser auxina y estimular la elongación celular, inhibe la formación de raíces y estimula los brotes axilares, suprimiendo la dominancia apical.

El ácido giberélico por ser una giberelina, induce el crecmiento de la planta, estimula la elongación del tallo, así como la división celular, induce germinación, pero inhibe la formación de retoños y raíces, de aquí el uso del ancimidol en la etapa de enraizamiento. El ancimidol es un inhibidor de crecimiento utilizado para evitar las malformaciones provocadas a la planta por el exceso del ácido giberélico y rompe la inhibición que el ácido giberélico causa en la formación de raices (Moore 1989 y Mendipweb (2002).

Las plantitas que fueron trasladadas a suelo y que murieron por presencia de hongos y pudrición, fueron sembradas en Peat moss y vermiculita. Se cree que esta mezcla no es adecuada para adaptar a las plantitas ya que además que la vermiculita puede ser tóxica al autoclavearse y que el peat moss tiene un pH muy bajo, mantiene un grado de humedad muy alta , estimulando la proliferación de hongos y la pudrición (Parrott, comunicación personal). Por esto, se inició a utilizar una mezcla de 60% de arena y 40% de tierra. Esto ha dado muy buen resultado, en el traslado de otras plantitas a suelo.

Lamentablemente no se logró trasladar ninguna plantita al invernadero por los problemas que se enumeraron con anterioridad. Sin embargo, hay varias plantitas en etapas anteriores que se están evaluando con las nuevas metodologías.

La variedad de papaya que mejor ha respondido al flujo de procedimientos hasta el momento ha sido la papaya criolla, la papaya hawaiana al inicio no funcionó porque al parecer la semilla no tenía una tasa de germinación muy alta. Actualmente la semilla tiene una mejor capacidad de ser estimulada para producir embriones, por lo que hay un mayor número de embriones en diferenciación que de papaya criolla. La variedad de papaya maradol ha sido la que más problemas ha presentado para ser estimulada a embriogénesis. Probablemente la calidad de la semilla no es buena o su capacidad de germinación es muy baja. Estamos en la búsqueda de nueva semilla de papaya maradol.

VIII. Conclusiones.

1. Se comprobó que el vector pPZP201Bk estaba presente en A. tumefaciens. 2. El A. tumefaciens transformado, es eficiente en un 15% para transformar embriones de

papayas criollas, hawaianas y maradol. 3. La técnica de PCR, es adecuada y eficiente para evaluar la presencia del gen de la cápside

en embriones y plantitas de papaya criolla, hawaiana y maradol. 4. Se logró llevar a cabo la diferenciación de embriones de papaya criolla, hawaiana y

maradol, transformados con el gen de la cápside y con presencia del gen de kanamicina como criterio de selección.

5. La etapa de germinación, fue llevada a cabo con éxito en cuanto a producción de plantulitas sanas, con multiples brotes axilares y de color adecuado. Sin embargo, no se logró estimular la elongación del tallo de forma adecuada para lograr poder transferir a las plantitas al medio de enraizamiento.

6. La metodología de enraizamiento en las plantitas que lograron presentar más de 2 cm de elongación, está en evaluación.

7. La adaptación de plántulas al invernadero y las pruebas biológicas para comprobar la resistencia al virus PRSV-p, no se han llevado a cabo, por falta de plantas enraizadas.

IX. Recomendaciones.

1. Continuar con la evaluación de las metodologías para las etapas de germinación y enraizamiento.

2. Continuar con la comparación de la producción de embriones a partir de semillas de fmto inmaduro y semillas maduras de las tres variedades de papaya.

3. Hacer la identificación de la presencia del gen en la etapa de germinación y no a nivel de embrión.

4. Continuar con las etapas de aclimatación de plantitas, inoculación del virus a las plantitas obtenidas y con evaluaciones agronómicas y organolépticas.

X. Impacto del proyecto.

El impacto de este proyecto será el de poder obtener un producto de exportación capaz de reducir pérdidas y mejorar la situación actual del PRV-p en el campo. Siendo que Guatemala es un país eminentemente agrícola, es necesario poder desarrollar herramientas

adecuadas y eficientes para una producción exitosa de productos que respresentan o pueden representar fiiente de ingresos al país pero también ayudar a los pequeños agricultores a mejorar su situación. Lo más importante es que el incorporar estos procesos tecnológicos a la agricultura del país permitirá que algunos de los problemas afrontados por los agricultores del país sean solventados con soluciones generadas localmente.

XL Cronograma del trabajo.

vernaden> Evaiuaci6n plantitas * biológicos Informe trimestral I Tnfmñnal

I 1 I

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12. ~ánche i , G., M. Palmieri, W. Parrot, M. Deom, L. Vergara, L. López. 2001. "Papayas (Carica papaya L.) de exportación y criollas con resistencia a papaya ringspot virus (PRSV)". Reporte final del Proyecto 25-98, FONACYT; Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología CONCYT

13. Yang, S., T. Yu, Y. Cheng and S. Yeh. 1996. "Transgenic papaya plantsfrom Agrobacterium-mediated transformation ofpetioles of in vitro propagated multishoots". Plant Cells Reports (1 5):459-464.

APENDICES.

APFNDICE 1. SINTOMAS DE PRSV-p EN PAPAYA.

1 ENANISMO 1

1 MANCHAS EN FORMA DE ANILLOS 1

MOSAICO Y DEFORMACI~N DE LAS HOJAS

APENDICE 2. VECTORES UTILIZADOS PARA LA TRANSFORMACI~N DE EMBRIONES DE PAPAYA.

Kan resistame

F a d o ' Ubi-3 Term. ;=$J¡ .---. y r-idam

R) B \

pAPCK A !

(6729 bp)

Ubi3 Promoter nos Tem. '

pPPCK: pAPCH-Vwas cut with SpeüPacl to replace the [Ubiquítin PromHyg-nos Tem] construct with [ubiquitin PromKan-ubi Term] released from pUNPT-l by Spe/Pacl.

9es shom m pamnikss are Muraque

MCS RB

pVSl

pPZP21 OB is a modified pPZP201 with an expanded MCS doni site) unique sitea 3-1-83! CORI-Pacl-EcoRV- Sacl-Kpnl-BamHI-Xbal-Sall-Pstl-Stul- Avrll-Ascl-Hindlll-RB3

aph (arninoplycoside phosphdransferase confwring kanarnycin resistance in bacteria) replaces aadA of pPZP201 B. MCS (muiüple cloning site) unique sites: 5'-LEEcoRLPacLEcoRV- SacLKpnl-BamHLXbalSalLPstIStul-

Created by Joe Naim (UGA) ~ v r l L & ~ ~ i n d l l l - ~ ~ 3 ' .

Created by Joe Naim (UGA)

APENDICE NO. 30 PROCEDIMIENTO A SEGUIR CON EMBRIONES DE PAPAYA.

RADICULAS CODIFICADAS (Hawaiana o Crioiia)

Código: H 6 C IHsD20 pH 7

(4 a 6 semanas)

MASA DE EMBRIONES DE UNA RADICULA (1 caja Petri pequeña* o grande** Iradícula)

Código: # radícula . # masa embriones Diámetro de ia masa: - 1 cm

MSD2OpH 7 (13 meses)

repique cada mes

SELECCION DE LINEAS DE EMBRIONES TRANSFORMADOS

I

-Se colocarán masas de 1.0 cm de diámetro de los embriones transformaáos de cada raáícula en 1 caja

t

TRANSFORMACION DE MASAS POR RADICULA

(Contar masas de - 1.0-1.5 cm a trmsfm)*** MSD20pH 5.8

(2 a-)

Petri grande pero cada caja estará numeraáa coi el número de radiada y cada masita también k n u m d . Se debe agregar antibiótico para matar bacterias.

J

ALMAcEN-0 DUPLICADOS DE MASAS (Una caja Petri por radiada)

WD2OpH 7 (-2 m-)

repique mensual

-Para sdecei6n se ;a& medio con k t i b i ~ ~ a r como Higamicina 0 Kanamicina por 10 que en d cedigo también aparecerá la abreviatura correspondiente. CODIGO: Tipo papaya # radkula antibiótico # iínea = ClHl

MsDZaMH!WpH76MSü2@MK? """" (-2mera perohayqaecrmbiudemcaioada263 reamurrs, nipihidpio=pasatodoy luegoeltejidoslaeltejido~co)

ClHl HlHl

CADA LINEA (Tipo de papaya # radicula antibiótico # línea)

Cuando masas alcancen más de 1 cm de diámetro MSD20M500H40-SO ó K 150

(1 m-)

* A este nivel, si los embriones o en medio de selección con el antibi6tico, puede eliminarse y crecer loa embriones en

DIFERENCIACION DE WNEAS iMSM6 Carbón QCW

(24 semanas) - . - 4 - .y

M5n4i6 + Mef 500 (24 semanas)

Mefixin sóio si es necesario

(Caja de Petri con trozo de medio)

WD2O Ma50 ó K? Germinacibn y enraizamiento Gcxmhaddn:

% MSO +0.8 uM&BA+O.luMNAA y10 NISM6+2ug6BA+0.1 uMNAA Ermirramim:

H MSO + 1 % 6 H % sucrosa y/o % MSO + 0.2 mgA IBA y/o %USO+ 31uMn'boñavina+10uMIBA

1 INVERNADERO 1

*= Caja de Pebi pequeña de 25 x 10 **= Caja de Petri grande de 100 x 15 ***= Se considerará el n;ámero de masas

d e 1 c m d e ~ c o m o m e d i d a d e p e s o . Elpesopromediodeunamasitadelcmde ~ s e ~ c o n ~ o r i d a d .

Verifiieaebn transformación plantitri E R

I N O C U L A C I O N ~ C A N I ~ VIRUS ****=La amm&db de Knnnmiciiili se deberá Wennimu.

APENDICE 4: POLINIZACION

J.'

.*S

APENDICE No. 5. TABLAS DE PAPAYAS TRANSFORMADAS Y POLINIZADAS QUE SE ENCUENTRAN EN INVERNADERO

1. Plantas Transformadas.

A amümmión se una tabla con los datos rnoifo6gicos correspoodientes a las plantas trandommdasqueseencuentranenel~& Jocotillo.

2. Plantas Polinizadas.

A contimiacón se presenta una tabla con los datos recientes sobre las plairtas no transformadas (tanto hembrascomohem&oditas)qnese seenelimmnaderodeJoootillo.

E J E C U C I ~ N FINANCIERA

a. PRESUPUESTO APROBADO.

b. EJEcuCI~N FINANCIERA.

Nombm del girsto - T r a n s S e P--

Servicios Q. 36,000.00 pdésiooales

Documentación e Q. 0.00 i1dbmw56n

Publicación de Q- 0.00 rewiltadoB

Registros de Q. 0.00 Pat.=-

I 1

TOTAL I I I

Se hiz~ reintegro con cheque No. 79, BANCAFÉ *