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LZT0310 - Biotecnologia
Luiz Lehmann Coutinho
Laboratório de Biotecnologia
ESALQ – USP
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Organização do Curso
• Dois tópicos serão abordados durante o curso:
– Estratégias para identificação de genes de interesse
biotecnológico
– Aplicações da biotecnologia
• Conteúdo:
– Aulas
– Seminários (2)
– Trabalho de revisão (1)
– Aulas práticas (disciplina optativa LZT0693 Técnicas
experimentais em biotecnologia)
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Programa
• 02/08 Introdução
• 12/08* Estratégias: Gene candidato; Como elaborar uma revisão de literatura
• 16/08 Estratégias: Mapeamento de QTL; Entrega do tema da revisão (Seminário 2)
• 23/08 Estratégias: Transcriptoma;
• 02/09* Estratégias: Proteoma
• 06/09 Feriado Semana da Pátria (não haverá aula);
• 13/09 Estratégias: Genoma
• 20/09 Estratégias: Integração; Apresentação do levantamento bibliográfico
• 27/09 Seminário 1: Trabalhos de identificação de genes de interesse;
• 04/10 Seminário 1: Trabalhos de identificação de genes de interesse;
• 11/10 Aplicações: Reprodução
• 21/10* Aplicações: Conservação; Entrega da primeira versão da revisão
• 25/10 Bioinformática
• 01/11 Aplicações: Transgenese Animal
• 08/11 Aplicações: Transgenese Vegetal;
• 15/11 Feriado
• 22/11 Patente
• 29/11 Seminário 2: Aplicação da Biotecnologia;
• 06/12 Seminário 2: Aplicação da Biotecnologia;
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• Avaliação semanal sobre textos;
• Dois seminários e um trabalho: Seminário 1 - Apresentação de
seminário sobre identificação de genes de interesse. O tempo de
apresentação será de 15 minutos por grupo. Cada grupo com 3 alunos.
No dia da apresentação um aluno do grupo será sorteado para
apresentar o seminário.
• Trabalho e Seminário 2: Trabalho de revisão de literatura sobre
aplicação da biotecnologia. Cada grupo com 3 alunos. Etapas: Entrega
do tema da revisão (dia 16/8); Apresentação do levantamento
bibliográfico (20/09); Entrega da primeira versão (21/10); Entrega da
versão final e Apresentação oral (29/11 e 06/12).
• Monitora: Simone Pértile [email protected]
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Definição de Biotecnologia
• Ereky (1919): “A ciência e os métodos que permitem a
obtenção de produtos a partir da matéria-prima, mediante a
intervenção de organismos vivos”
• OECD - Organisation for Economic Co-Operation and
Development: A aplicação dos princípios da ciência e da
engenharia no tratamento de matérias por agentes
biológicos na produção de bens e serviços (1982).
• OTA – Office of Technology Assessment: Biotecnologia,
de uma forma abrangente, inclui qualquer técnica que
utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou
modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou
desenvolver microrganismos para usos específicos (1984).
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Definições de Biotecnologia
• EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioquímica, da microbiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, células cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indústria, na saúde e nos processos relativos ao meio ambiente (1988).
• E.H. Houwink: o uso controlado da informação biológica (1989).
• Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia é "bio" + "tecnologia", isto é o uso de processos biológicos para resolver problemas ou fazer produtos úteis (2003).
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Qual a sua definição?
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Campo da Biotecnologia
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Setores da Biotecnologia
• ENERGIA: Etanol, biogás e outros combustíveis (a partir de
biomassa)
• INDÚSTRIA: Butanol, acetona, glicerol, ácidos, vitaminas etc.
Numerosas enzimas para outras indústrias (têxtil, de
detergentes etc.)
• MEIO AMBIENTE: Recuperação de petróleo, biorremediação
(tratamento de águas servidas e de lixo, eliminação de
poluentes)
• AGRICULTURA: Adubo, silagem, biopesticidas,
biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenças, mudas de
árvores para reflorestamento. Seleção genética, plantas com
características novas incorporadas (transgênicas): maior valor
nutritivo, resistência a pragas e condições de cultivo adversas
(seca, salinidade, etc.)
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Setores da Biotecnologia
• PECUÁRIA: Embriões, seleção genética, animais com
características novas (transgênicos), vacinas e
medicamentos para uso veterinário e humano
• ALIMENTAÇÃO: Panificação (pães e biscoitos),
laticínios (queijos, iogurtes e outras bebidas lácteas),
bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos
diversos (shoyu, monoglutamato de sódio, adoçantes etc.);
proteína de célula única (PUC) para rações, alimentos de
origem transgênica com propriedades novas
• SAÚDE: Antibióticos e medicamentos para diversas
doenças, hormônios, vacinas, reagentes e testes para
diagnóstico, tratamentos novos etc
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Biotecnologia: Um avanço ou um
atraso?
• A biotecnologia é uma tecnologia. O que
deve ser discutido é o uso que fazemos dela
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Marcos da Biotecnologia:
• Antiguidade: Preparação e conservação de
alimentos e bebidas por fermentação (pão,
queijo, cerveja, vinho e vinagre)
• cultivo de plantas (batata, milho, cevada,
trigo etc.), domesticação de animais
• tratamento de infecções (com produtos de
origem vegetal tais como pó de crisântemo
e derivados de soja com fungos).
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Marcos da Biotecnologia:
• Idade Moderna: Início da produção
comercial de cerveja; extração de metais
por ação microbiana na Espanha; cultivo de
fungos na França; Hooke descobre a
existência de células (1665).
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Marcos da Biotecnologia:
• Idade Contemporânea: Pasteur inventa um
processo para conservar alimentos sem alterar suas
propriedades organolépticas (Pasteurização,
1863), identifica a levedura como o agente
responsável pela fermentação alcoólica (1876),
usa microrganismos atenuados para obter vacinas
contra o antraz e a cólera (1881), faz os primeiros
testes de uma vacina contra a raiva (1881).
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Marcos da Biotecnologia:
• 1928 F. Griffith descobre a transformação, isto é a
transferência de informação genética de uma
linhagem bacteriana a outra
• 1944 Produção em grande escala da penicilina
(descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida
por Florey e Chain)
• 1951 Inseminação artificial de gado utilizando
sêmen congelado
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Marcos da Biotecnologia:
• 1953 Watson e Crick propõem um modelo da
estrutura do ADN
• 1973 Havendo desenvolvido técnicas de corte e
reunião do DNA, Cohen e Boyer transferem um
gene a um organismo de outra espécie. Lançado
no Brasil o programa de produção de álcool a
partir de biomassa (Pró-Álcool)
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Marcos da Biotecnologia:
• 1975 A Conferência de Asilomar pede ao National
Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas
normas para a regulação dos experimentos com
DNA-recombinante, o que acontecerá meses mais
tarde.
• 1976 Utilização da técnica de hibridização
molecular no diagnóstico pré-natal da alfa
talassemia.
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Marcos da Biotecnologia:
• 1978 Genentech, Inc., a primeira empresa
biotecnológica obtém a somatostatina (hormônio
de crescimento) mediante a tecnologia do DNA
recombinante
• 1980 A Suprema Corte de Justiça dos EUA aprova
o princípio de patentes para as formas de vida de
origem recombinante. As primeiras patentes são
de um microrganismo para biorremediação de
petróleo
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Marcos da Biotecnologia:
• 1980 Mullis inventa a técnica da Reação em
Cadeia de Polimerase (PCR) cuja patente será
obtida por Cetus, Inc. em 1985 e vendida em 1991
a Hoffman-LaRoche, Inc. por 300 milhões de
dólares.
• 1982 A insulina humana recombinante da
Genentech, Inc. é comercializada.
• 1982 A primeira vacina de DNA-recombinante
para o gado é comercializada na Europa.
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Marcos da Biotecnologia:
• 1987 FDA aprova o fator ativador de
plasminogênio recombinante para o tratamento de
ataques cardíacos.
• 1988 Harvard obtém patente de um rato
transgênico para o estudo do câncer
• 1989 Criação do National Center for Human
Genome Research e inicio do mapeamento do
genoma humano.
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Marcos da Biotecnologia:
• 1990 Primeira experiência de terapia gênica para
uma doença rara (ADA) em uma menina de quatro
anos
• Pfizer comercializa Chy-Max TM, enzima
recombinante para a preparação de queijos
• GenPharm International, Inc. consegue uma vaca
transgênica que produz no leite proteínas humanas
para alimentação infantil
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Marcos da Biotecnologia:
• 1993 Aprovada a utilização do hormônio de
crescimento bovino rBGH/rBST, para aumentar da
produção de leite (Monsanto)
• 1994 Lançamento no mercado do tomate
FlavSavr®, que, devido à inativação de um gene,
amadurece na planta
• 1995 Decifrado o primeiro genoma de uma
bactéria, Haemophilus influenzae.
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Marcos da Biotecnologia:
• 1997 Nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses
mais tarde, uma segunda ovelha, Polly, clonada e
geneticamente modificada.
• 2000 O rascunho do sequenciamento do genoma
humano é anunciado por Collins, do Consórcio do
Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc.
• Sequenciado o genoma de uma bactéria que ataca
os citros (Xylella fastidiosa).
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Marcos da Biotecnologia:
• 2003 A venda, como mascote, do GloFish, um
peixe transgênico que brilha na escuridão,
originalmente criado para detectar poluentes.
• 2008 Pesquisadores japoneses desenvolvem a
primeira rosa azul (OGM). Cultivam-se plantas
transgênicas em 25 países, incluídos sete da União
Européia.
• 2008 Yamanaka anuncia a obtenção de células
pluripotentes induzidas utilizando um plasmídeo
como vetor.
• 2010 Sequenciamento de nova geração
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Filme
Pontos de discussão 1) A situação relatada no filme é real?
2) No futuro?
3) Quais as fontes de material genéticos?
4) É possível sequenciar um genoma de um ser humano? E o custo?
5) Sequenciar o DNA resolve os problemas?
6) Qual o problema?
7) É possível predizer o futuro?
8) DNA determina o fenótipo?
9) Impacto no seguro saúde?
10) Qual a importância de biotecnologias da reprodução no filme?
11) Que outras aplicações poderiam surgir do sequenciamento de DNA
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• Como a biotecnologia pode
continuar a auxiliar o nosso
desenvolvimento?
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• Quais são os principais problemas?
• Qual é o fator limitante?
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Fator limitante
• Quais são os genes que controlam
as características de interesse?
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Aplicação
• Uma vez identificado o gene de
interesse, com utilizar esta
informação?
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O que poderia ser feito ?
• Testes genéticos
• Seleção assistida por marcadores
• Produção in vitro de proteínas de interesse comercial
• Organismos geneticamente modificados
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Como identificar os genes de
interesse ?
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Estratégias:
• Genes candidatos
• Procura em todo o genoma
• Expressão gênica
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Princípios
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Sequenciamento de DNA
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Atalho para 3D Animations - Disease Mutation Sickle Cell Dolan DNA Learning Center.lnk
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Gene candidato: Um exemplo de
sucesso
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Polimorfismo:
Cromossomo 5
ATAAC GCGC AAT CACACACA........ CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
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RFLP
Digestão com enzima que reconhece a seqüência GCGC:
Cromossomo 5
GC AAT CACACACA........ CTGACTGATATGTA
CGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
ATAAC G C
TATTGCG
Cromossomo 5’
ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
Cromossomo 5
ATAAC GCGC AAT CACACACA........ CTGACTGATATGTA
TATTGCGCGTTAGTGTGTGT........GACTGACTATACAT
Cromossomo 5’
ATAAC G T GC AAT CACACACA CACA CTGACTGATATGTA
TATTGCACGTTAGTGTGTGTGTGTGACTGACTATACAT
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Identificar genes responsáveis pela
prolificidade em suínos.
• Estratégia: Genes Candidatos
– Análise de genes conhecidos com base em
informações de fisiologia (hormônio ou
receptores ligados a reprodução).
– Mutações observadas em outras espécies.
– Resultados observados em animais
transgênicos.
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Prolificidade em suínos
• Animais da raça Meishan chinesa tem um
maior número de leitões por leitegada.
• Investigação de genes ligados ao sistema
reprodutivo, por exemplo: ESR1
• Detecção do polimorfismo por PCR e digestão
com enzima de restrição.
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1) Identificação da sequencia do gene.
2) Desenho de primers e amplificação do gene.
3) Sequenciamento em diversos indivíduos para detecção de
polimorfimsos.
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Detecção de SNP
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5. Estudo do efeito do polimorfismo na prolificidade.
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Bovino com fenótipo de musculatura dupla
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Efeito da ausência de expressão do gene da miostatina em camundongos (McPherron et al., 1997)
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McPherron et al., Nature e PNAS 1997
Musculatura dupla em bovinos
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Anemia Falciforme
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Resultados e limitações
• Esta estratégia tem gerado bons resultados.
• Pode gerar muitos falso positivos
• Depende de um conhecimento prévio do
gene de interesse.
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Implicações
• Desenvolvimento de testes genéticos para
diagnóstico
• Uso em seleção genética
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Exemplos com humanos
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