luận văn - quỳ - hus.vnu.edu.vn (399).pdf · xác của xét nghiệm được tính dựa...

Luận văn tốt nghiệp Vũ Văn Quỳ

K17 – Sinh học 1

MỞ ĐẦU

Khoa học công nghệ đã phát triển vượt bậc ngay từ những năm đầu của thế

kỷ 21 với những nghiên cứu đột phá nhằm khám phá toàn bộ hệ gen của con người.

Con người như những cuốn sách được khám phá tới trang cuối cùng, được nghiên

cứu ở mức độ phân tử nhằm hiểu rõ hơn, làm sáng tỏ nhiều vấn đề trước con mắt

của các nhà khoa học.

Xã hội càng phát triển thì loài người càng phải đối mặt với những nguy cơ

mới đầy thách thức về mặt an toàn. Mỗi năm trên thế giới có hàng ngàn vụ thảm

họa thiên tai, hàng triệu vụ án mạng, mất tích, khủng bố quy mô rộng. Trong bất kỳ

một trường hợp nào, ở bất cứ quốc gia nào thì việc xác định rõ tung tích nạn nhân là

vấn đề đầu tiên đặt ra cần giải quyết. Khoa học hiện đại với công nghệ DNA làm

mũi nhọn đã tiến tới khả năng nhận biết truy nguyên đến mức độ cá thể bằng chính

những thông tin được mã hóa trong hệ gen của mỗi người. Trong vài năm gần đây,

thế giới đã chứng kiến những vụ thảm họa lớn xảy ra như vụ khủng bố vào tòa tháp

đôi ở Trung tâm thương mại thế giới tại New York ngày 11 tháng 9, vụ thảm họa

sóng thần ở khu vực Đông Nam Á, động đất ở Haiti, những vụ tai nạn máy bay,

những vụ đánh bom liều chết cướp đi sinh mạng của hàng trăm người…Tất cả đều

được trả lời dưới con mắt của khoa học và sự ra đời của hàng loạt những công nghệ

mới, và trong rất nhiều trường hợp DNA được coi như là dấu vết và bằng chứng

đưa đến những kết luận cuối cùng.

Việc ứng dụng kỹ thuật phân tích DNA đã giúp ích rất nhiều cho việc điều

tra phá án, đồng thời cho phép truy nguyên cá thể với độ chính xác cao hơn hẳn các

phương pháp nhận dạng truyền thống. Dấu vết sinh phẩm thu được ở hiện trường

của các vụ án thường là rất ít hoặc bị phân hủy nghiêm trọng nhưng thông qua phân

tích DNA có thể cho chúng ta những chứng cứ quan trọng giúp truy nguyên thủ

phạm của vụ án hoặc truy tìm tung tích nạn nhân một cách chính xác [25].

Một marker chỉ thị, hay một locus DNA nhân mang tính khoa học được sử

dụng (được coi là đặc trưng cá thể) nếu nó có nhiều alen khác nhau trong quần thể

(nhiều hơn 5 alen) và kiểu gen dị hợp của các cá thể trong quần thể lớn hơn 70%

[25, 26]. Do đó, càng nhiều vị trí DNA (locus DNA) được phân tích để tìm đặc



trưng DNA, thì khả năng xác định mẫu sinh học nào đó của một người càng cao. Vì

thế, việc xác định đặc trưng cá thể về phương diện DNA giữa mẫu sinh phẩm thu

được và mẫu sinh phẩm đối chứng của một cá thể nghi ngờ hoặc với ngân hàng dữ

liệu DNA (nếu có) là cực kỳ quan trọng.

Hiện nay, trên thế giới công tác giám định pháp y, đặc biệt là trong khoa học

hình sự chủ yếu sử dụng các marker STR (Short Tandem Repeat), đây là các đoạn

DNA có cấu trúc lặp lại từ 2-6bp, có tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ

và mang tính đặc trưng cá thể. Một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận

dạng và xác định cá thể phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao, có kích thước

ngắn từ 100-500bp và phải có tính di truyền độc lập. Trên thực tế, tần suất xuất hiện

các locus STR trong quần thể ở các nước khác nhau, các tộc người khác nhau cũng

có sự khác biệt. Có những locus chỉ thấy xuất hiện ở tộc người này nhưng lại không

thấy xuất hiện ở tộc người khác hoặc rất hiếm gặp. Vì thế, việc nghiên cứu tần suất

alen của các tộc người khác nhau có ý nghĩa quan trọng trong việc đánh giá và áp

dụng có hiệu quả thông qua phân tích các locus STR, giúp truy nguyên cá thể một

cách nhanh chóng, chính xác [22, 25, 26, 27].

Ở Việt Nam, Viện Khoa học Hình sự – Bộ Công an đang sử dụng bộ kit nhân

gen AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit của hãng Applied Biosystems

trong công tác giám định pháp y và Khoa học Hình sự. Đây là bộ kit nhân đồng thời

16 locus STR có độ chính xác cao đáp ứng các tiêu chuẩn hiện hành của Cộng đồng

hình sự Châu Âu và FBI. Tuy nhiên, để đánh giá chính xác độ chính xác hay mức

độ tin cậy của phương pháp này ở Việt Nam cần có các thống kê cụ thể về tần suất

alen, tần suất dị hợp tử của từng locus STR đối với người Việt Nam. Từ đó tính toán

khả năng phân biệt của từng locus, độ chính xác cũng như độ tin cậy của phép phân

tích. Trong những trường hợp cụ thể, DNA thu được ở hiện trường vụ án bị đứt gãy

hoặc biến tính dẫn đến không thể nhân được tất cả 16 locus STR, khi đó độ chính

xác của xét nghiệm được tính dựa trên các locus xuất hiện. Vì vậy việc thống kê tần

suất alen, tần suất dị hợp tử, khả năng phân biệt của từng locus STR có vai trò quan

trọng giúp đánh giá đúng mức độ tin cậy của phép phân tích trong từng trường hợp



cụ thể. Trước thực tế đó, chúng tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tần

suất alen của một số locus gen ở người Việt”, với các mục tiêu sau:

1. Hoàn thiện quy trình tổng thể bao gồm: tách chiết DNA, phân tích, xử lý

số liệu, tính toán tần suất alen dựa trên bộ kit nhân gen Identifiler của

hãng Applied Biosystems.

2. Xác định tần suất tương đối của các alen ở người Việt, so sánh với tần

suất tương ứng ở một số nước trong khu vực và trên thế giới. Đánh giá

khả năng phân biệt của chúng trong nhận dạng cá thể.



CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 . Các phương pháp kinh điển trong nhận dạng pháp y và khoa học hình sự

Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định cá thể người, các phương pháp

này khác nhau chủ yếu ở khả năng phân biệt cá thể và thời gian thu nhận kết quả.

Việc giám định nhận dạng đóng vai trò rất quan trọng, kết quả của nó có ý nghĩa to

lớn trong điều tra xét hỏi, có khi đóng vai trò quyết định. Nội dung cơ bản của công

tác nhận dạng là nhằm xác định chính xác các mẫu sinh phẩm thu được trên hiện

trường vụ án hay của những người mất tích thuộc về một cá thể xác định nào đó. Để

làm được việc này, ngoài trình độ chuyên môn của giám định viên, các trang thiết bị

hỗ trợ, phương pháp mà người giám định viên áp dụng, còn phụ thuộc vào đặc

điểm, tính chất, số lượng, thời gian và cách bảo quản của mỗi mẫu sinh phẩm thu

được.

1.1.1. Nhận dạng người bằng phương pháp hình thái

1.1.1.1. Nhận dạng thông qua mô tả

Việc nhận dạng người được tiến hành từ rất sớm. Trải qua thời gian các

phương pháp nhận dạng người bằng hình thái được sử dụng từ đơn giản đến phức

tạp, từ mô tả đến các đặc điểm đo đạc, từ thô sơ đến nhận dạng có phương tiện hỗ

trợ.

Đặc điểm nhân trắc của vùng đầu mặt được ứng dụng trong nhận dạng người

đã được áp dụng từ cuối thế kỷ XIX. Người đầu tiên tiến hành có tính chuyên

nghiệp và hệ thống là A. Bertillon (một cảnh sát người Pháp) đã áp dụng phương

pháp chụp ảnh can phạm để lưu giữ hình ảnh nhận dạng nhằm xác định các trường

hợp tái phạm. Ông còn đo đạc một số chỉ số sinh học như chiều cao cơ thể, chiều

dài các chi, chiều dài và chiều rộng của đầu, vòng ngực…Thông qua phương pháp

Bertillon đã giúp cho cảnh sát Pháp xác định chính xác các trường hợp tái phạm

đồng thời truy tìm tung tích tội phạm bỏ trốn khỏi nơi giam giữ hoặc giúp cho việc

quản lý các trường hợp đã từng gây án. Thời bấy giờ, phương pháp này được nhiều

nước châu Âu áp dụng và thu được nhiều kết quả [15].



1.1.1.2. Phương pháp vẽ lại đối tượng qua mô tả

Đây là phương pháp thể hiện một hình hình ảnh chân dung của đối tượng nào

đó bằng cách vẽ lại thông qua lời kể của nhân chứng. Quá trình nhận dạng này tốn

rất nhiều thời gian và công sức. Mặt khác để làm được điều đó những nhà chuyên

môn cần phải có cả trình độ về mặt hình thái và trình độ về mặt mỹ thuật để có thể

thể hiện hình thái khuôn mặt một cách gần giống nhất với khuôn mặt của đối tượng

qua mô tả. Phương pháp này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố chủ quan của người mô

tả cũng như trình độ thể hiện của người vẽ. Thông thường phương pháp vẽ lại đối

tượng qua mô tả phải chỉnh sửa rất nhiều lần và rất khó để thực hiện các nét chi tiết

phức tạp do trình độ mô tả và cách thể hiện nét vẽ. Phương pháp này đã được W.

Arnolt tiến hành và trình bày khá chi tiết trong cuốn “Hình ảnh tội phạm qua nhân

chứng”.

1.1.1.3. Phương pháp ghép ảnh

* Phương pháp ghép ảnh Identikit

Nhằm khắc phục nhược điểm của việc vẽ lại chân dung đối tượng qua mô tả,

Rolf Friedermann đưa ra một phương pháp khác mang tên là phương pháp “Ghép

ảnh Identikit”. Nội dung của phương pháp này là thành lập album có sẵn gồm các

mẫu vẽ về khuôn mặt, kiểu trán, kiểu mắt, kiểu lông mày, miệng, cằm, tai, kiểu

tóc…Mỗi ảnh được vẽ trên một tờ giấy bóng kính với các kích thước và vị trí xác

định, được phân loại và đánh dấu theo ký hiệu. Qua mô tả của nạn nhân và nhân

chứng, các chuyên gia bắt đầu tìm trong album những loại hình phù hợp rồi ghép

chúng lại với nhau để thành khuôn mặt hoàn chỉnh. Thứ tự ghép các phần theo trật

tự nhất định ban đầu là khuôn mặt, rồi kiểu tóc, tiếp đến các phần khác của khuôn

mặt như lông mày, mắt, mũi, môi…

* Phương pháp ghép ảnh Photofit

Phương pháp này được áp dụng bởi cảnh sát Anh, Mỹ, Canada vào những

năm 70 của thế kỷ XX. Nội dung của phương pháp này là: Các chuyên gia hình sự

tiến hành chụp ảnh của một lượng lớn ảnh chân dung ở tư thế thẳng, sau đó chọn lọc



các loại hình khuôn mặt và các bộ phận trên khuôn mặt đại diện cho các kiểu theo

phân loại. Đặc điểm khuôn mặt bao gồm các phần như sau:

1. Hình dạng khuôn mặt chung khi nhìn thẳng gồm: Hình vuông, hình

thang, hình tròn, hình oval, hình thoi, hình tam giác.

2. Hình dạng trán: Trán thấp, trán cao, trán rộng, trán hẹp, trán trung bình.

3. Hình mắt: Hình oval, hình tròn, hình bán nguyệt, hình tam giác, hình khe.

4. Chiều hướng của mắt: xiên trong, xiên ngoài, nằm ngang.

5. Dạng mắt: một mí, hai mí

6. Hình mũi: Mũi to, nhỏ, trung bình; Đầu mũi chúc xuống, đầu mũi ngang,

đầu mũi hếch.

7. Môi và miệng: miệng rộng, miệng nhỏ, trung bình; Môi mím, môi hở,

môi trễ; Hai môi dày, hai môi mỏng, dày mỏng môi trên hoặc môi dưới.

8. Hình dạng cằm: Cằm tròn, vuông, nhọn, oval.

Các phần này được phân loại chi tiết hơn nữa và được đánh dấu theo ký hiệu

riêng. Thông qua mô tả của nhân chứng và nạn nhân, các chuyên gia tiến hành chọn

các phần tương ứng và ghép thành một ảnh phù hợp.

* Phương pháp ghép ảnh bằng đồ họa vi tính

Nhờ có tiến bộ về công nghệ thông tin và việc áp dụng kỹ thuật số hóa trong

hình sự, cảnh sát nhiều nước trên thế giới đã áp dụng thành tựu này vào công tác

nhận dạng hình thái người. Các đặc điểm đầu mặt được phân loại theo từng nhóm

một cách chi tiết, được mã hóa và lưu trữ dưới dạng cở sở dữ liệu. Phần mềm nhận

dạng được viết thành chương trình riêng rất đơn giản trong thao tác và dễ dàng sử

dụng.

Phương pháp này cũng dựa trên nguyên lý ghép ảnh. Hình thái khuôn mặt

được chia thành các phần tương tự như những phương pháp nêu trên, chỉ khác là

được nhập vào máy tính: Dạng khuôn mặt, trán, tóc, mắt, lông mày, mũi, cằm

miệng nhưng chi tiết hơn nhiều và sự chi tiết này được nhận biết bằng hệ thống xử

lý dữ liệu vi tính. Phương pháp này có nhiều ưu điểm nên ngày nay nó đã thay thế

hoàn toàn phương pháp thủ công trước đây.



1.1.1.4. Phương pháp phục chế khuôn mặt từ xương hộp sọ

Đây là một phương pháp có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phục chế lại

hình ảnh khuôn mặt của người trước lúc chết giúp cho các nhà khoa học có thể xác

định được tung tích nạn nhân. Ngoài việc phục chế ảnh chân dung nạn nhân, xương

hộp sọ còn có thể cho ta biết các thông tin như độ tuổi, giới tính, chủng

tộc…Phương pháp phục chế khuôn mặt từ xương hộp sọ lần đầu tiên được sử dụng

trong khảo cổ đó là tái tạo khuôn mặt từ sọ người cổ đại Neanderthal và Cro-

Magnon, tiếp đó là tái tạo khuôn mặt của các xương sọ người đã hóa thạch. Ở Việt

Nam một số tác giả cũng đã nghiên cứu các đặc điểm nhân trắc trên người Việt như

P.Huard và Đỗ Xuân Hợp [15], Nguyễn Quang Quyền, Nguyễn Đình Khoa [5], Lê

Hữu Hưng [15], Vũ Xuân Khôi [7]…Gần đây Nguyễn Việt Vùng đã nghiên cứu

một số lượng lớn đặc điểm nhân trắc bằng đo đạc và mô tả trên 5.957 người Việt

Nam (trong đó 3.428 nam và 2.529 nữ) ứng dụng trong công tác nhận dạng pháp y.

Những nghiên cứu này đóng góp nhiều cho công tác nhận dạng cá thể từ hộp sọ.

Thông qua các đặc điểm này giúp cho giám định viên sàng lọc được những thông

tin cần thiết trong giám định. Phương pháp này bao gồm:

* Phương pháp nặn tượng

Phương pháp nặn tượng hay còn gọi là phương pháp đắp mặt trên nền xương

sọ do Geraximov tiến hành vào năm 1955. Giám định viên thông qua đặc điểm hình

thái xương sọ, đặc biệt là sọ mặt, các chỉ số, các mối tương quan giữa xương sọ và

phần mềm mà phục chế lại khuôn mặt trên nền xương sọ và xương mặt bằng các

chất liệu như đất sét, thạch cao, matit…Phương pháp này không chỉ được áp dụng

trong hình sự mà nó còn được áp dụng trong khảo cổ bởi vì nó giúp chúng ta phục

chế lại hình ảnh khuôn mặt của người hiện đại và cả khuôn mặt của những xương sọ

cổ đại.

* Phương pháp lồng phim

Căn cứ vào mối tương quan giữa phần mềm và sọ mặt, các chỉ số sọ,

mặt…các chuyên gia hình sự pháp y sẽ định hướng hình ảnh của một khuôn mặt



tương ứng với một hộp sọ. Dựa vào các đặc điểm này người ta đã đưa ra phương

pháp nhận dạng hộp sọ qua lồng phim, các bước tiến hành như sau:

Sử dụng một ảnh chân dung rõ nét nhất và phóng to lên. Sau đó đánh dấu các

điểm mốc tương ứng trên xương sọ mặt như lông mày tương ứng là cung mày của

sọ mặt, khóe ngoài của mắt tương ứng với góc ngoài ổ mắt, nhân trung, ụ trán, gò

má, điểm giữa cằm, góc hàm…Sau đó chụp lại ảnh bằng phim âm bản với một

khoảng cách nhất định nhưng độ mở ống kính khác nhau. Rồi rửa trên các tấm phim

có kích thước khác nhau 10x15cm, 12x18cm, 20x30cm…Trong trường hợp nạn

nhân có nhiều ảnh ở các tư thế khác nhau có thể tiến hành chụp nhiều ảnh để tăng

hiệu quả nhận dạng.

Đối với xương sọ, người ta cũng đánh dấu các vị trí tương ứng như trên rồi

đặt sọ phù hợp với tư thế ảnh chụp. Tiến hành chụp ảnh sọ trên phim âm bản với

cùng khoảng cách và độ mở ống kính khác nhau như với ảnh chân dung, rồi rửa

phim giống như trên. Sau khi thu được một loạt các phim với các kích cỡ khác nhau

của ảnh chân dung nạn nhân và hộp sọ, tiến hành lồng các phim với nhau theo các

mốc đã đánh dấu.

* Phương pháp nhận dạng bằng lồng ảnh qua gương bán mạ

Đây là phương pháp nhận dạng được sử dụng trong trường hợp xương sọ còn

nguyên vẹn và người mất tích có ảnh chân dung. Đây là phương pháp áp dụng có

nhiều điểm thuận lợi như so sánh đối chiếu trực tiếp, lồng ảnh và xương sọ khá dễ

dàng do việc điều chỉnh kích thước và tư thế của sọ theo ảnh chân dung [15].

Phương pháp này được tiến hành như sau:

1. Dùng ảnh chân dung phóng to lên kích thước 20x30cm, dán ảnh lên một

chiếc giá đỡ có thể quay và di chuyển lên xuống.

2. Đặt xương sọ vào một chiếc giá đỡ đặc biệt có trục quay ở các góc độ và

di chuyển cao thấp.

3. Đặt một máy ảnh thẳng trục với xương sọ và nhìn xương sọ qua gương

bán mạ



4. Đặt một gương phẳng hướng nhìn ảnh chân dung và phản chiếu lên

gương bán mạ.

Tiến hành đánh dấu các điểm trên xương hộp sọ: Nhân trung, lỗ ống tai

ngoài, cung mày, hai hốc mũi, góc xương hàm…Điều chỉnh xương sọ và ảnh chân

dung sao cho các điểm đánh dấu trùng khớp với nhau giữa ảnh và xương sọ bằng

cách quan sát gương bán mạ. Điểm chú ý cần quan tâm là hệ thống đèn chiếu phải

phù hợp sao cho nổi bật hình ảnh chân dung và xương sọ. Đồng thời sử dụng một

máy ảnh đặt thẳng hướng và nhìn thấy xương sọ qua gương bán mạ để có thể chụp

được những hình ảnh lồng ghép.

* Phương pháp phục chế khuôn mặt từ hộp sọ bằng kỹ thuật vi tính

Công nghệ thông tin đã và đang hỗ trợ rất đắc lực trong hầu hết các lĩnh vực

của khoa học và đời sống xã hội trong đó có khoa học nhận dạng. Từ những năm

cuối thập niên 80 của thế kỷ XX, việc ứng dụng công nghệ thông tin nhằm phục chế

khuôn mặt từ hộp sọ đã được tiến hành. Trước khi đưa vào phục chế, các giám định

viên phải xác định tuổi, giới tính, chủng tộc, nghiên cứu các mốc tương quan, các

chỉ số phần mềm trên khuôn mặt của một lớp cá thể đặc trưng quần thể, phân loại

theo tứng lớp, lưu trữ trong máy tính, xây dựng phần mềm chuyên dụng…

Ứng dụng công nghệ này cảnh sát Úc đã sử dụng hệ thống nhận dạng tự

động có tên F.A.C.E.S (Facial Automated Composition And Editing System) để

phục chế lại hình ảnh khuôn mặt hoàn chỉnh một cách rất nhanh chóng và chính xác

đáp ứng tốt yêu cầu nhận dạng hình sự. Cảnh sát Canada sử dụng hệ thống nhận

dạng có tên C.A.R.E.S (Computer Assisted Recovery Enhancement System) cũng

đem lại kết quả rất khả quan [15]. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều nước đã mua

các phần mềm nhận dạng F.A.C.E.S với các phiên bản mới được nâng cấp làm tăng

khả năng nhận dạng và đơn giản hóa trong sử dụng.

1.1.2. Phương pháp nhận dạng qua răng

Nguyên lý của phương pháp này dựa trên sự so sánh đối chiếu các đặc điểm

răng của cá thể được lưu giữ trong hồ sơ sức khỏe với đặc điểm răng hiện tại của

người cần nhận dạng hoặc với các nạn nhân đã chết dựa trên số lượng các răng, tình



trạng của răng: sâu, hàn răng, các đặc điểm đặc biệt khác như răng khểnh, răng mọc

lệch, răng bị gãy… để nhận dạng. Giá trị truy nguyên của phương pháp này rất cao,

tuy nhiên yêu cầu phải có hồ sơ răng lưu trữ - điều này không dễ thực hiện nếu

không có ý thức thu thập và lưu giữ hồ sơ của từng cá thể vì những đặc điểm này rất

dễ bỏ qua. Phương pháp này đã được ủy ban giám định hỗn hợp Việt Mỹ tiến hành

thường xuyên trong giám định MIA tại Việt Nam và đem lại kết quả rất cao.

1.1.3. Nhận dạng bằng vân da

Đường vân da bàn tay xuất hiện sớm trong thời kỳ phôi thai. Ở người, đường

vân đầu tiên hình thành từ tháng thứ 3 của quá trình phát triển phôi thai, nhưng vào

khoảng tuần thứ 17-18 đường vân mới xuất hiện đầy đủ. Sự hình thành đường vân

liên quan đến các u nệm lòng bàn. U nệm lòng bàn là nơi lòng bàn tay dày lên bởi tổ

chức liên kết và mô mỡ dưới da. Nệm bắt đầu xuất hiện ở đầu ngón tay ở tuần thứ

6-7 của thời kỳ phát triển phôi. Trên bàn tay có 11 nệm lòng bàn chia thành 3 nhóm:

5 nệm đầu ngón tay, 4 nệm gian ngón, 2 nệm lớn ở vùng ô mô cái và ô mô út [8,

29]. Những nệm này không phát triển một lúc trong quá trình phôi thai. Các nệm

gian ngón II, III, IV hình thành đầu tiên và nổi rõ, rồi đến nệm gian ngón I, tiếp đó

là các nệm ô mô cái và ô mô út hình thành, các ngón tay dài dần và xuất hiện nệm

đầu ngón tay theo trình tự từ ngón cái đến ngón út. Chúng phát triển nhanh thành

những u tròn và choán hết cả phần đầu ngón (đốt 3). Sau đó nệm giảm dần kích

thước một cách tương đối so với kích thước lòng bàn, có trường hợp nó thoái hóa

gần như không còn thấy dấu tích vào tháng thứ 6. Đường vân hình thành khắp lòng

bàn tay và trên các nệm vẽ lên những hình đặc biệt gọi là hoa vân [8].



Hình 1.1. Vân da đầu ngón tay

Một số tác giả D.A.Dell và CS [8, 29]; S.Kimura và CS cho rằng vân da có

đặc tính không thay đổi về hình dạng, chỉ tăng về kích thước theo kích thước phát

triển của bàn tay trong suốt đời sống của cá thể. Vân da được quy định không phải

do một gen mà do một hệ đa gen di truyền. Mặt khác, vân da được hình thành trong

quá trình phát triển đời sống cá thể là kết quả của sự kết hợp các yếu tố đa gen di

truyền và không di truyền trong quá trình phát triển của bào thai. Vì vậy, ngay cả

hai anh em sinh đôi cùng trứng cũng có thể khác nhau. Điều này không gặp trong

xét nghiệm DNA bởi vì hai anh em sinh đôi cùng trứng có cấu trúc di truyền giống

hệt nhau. Căn cứ vào đặc điểm đặc trưng về các dạng (kiểu) di truyền dấu vân da

(như số lượng xác định đường vân và các chi tiết rất nhỏ về đường vân được phân

tích…) mà người ta ứng dụng trong nhận dạng, giám định hình sự.

Trải qua lịch sử hàng nghìn năm cho đến ngày nay đã chứng minh vị trí quan

trọng của vân da trong nhận dạng cá thể. Ngay từ thế kỷ thứ VII, người Trung Hoa

đã biết dùng ngón tay điểm chỉ vào các văn kiện mang tính chất hành chính, điều đó

chứng tỏ rằng lúc đó người ta đã nhận thức được sự khác biệt giữa các dấu vân tay

của mỗi người. Tuy nhiên, việc nghiên cứu dấu tay một cách khoa học thì mãi đến

cuối thế kỷ thứ XIX mới được thực hiện một cách nghiêm túc [10, 11, 12]. Vân da

được mô tả một cách có hệ thống đầu tiên vào đầu những năm 1900, nó được xem

là một trong những đặc tính không biến đổi của mỗi cá thể. Năm 1987, một viên



chức người Anh làm việc tại Ấn Độ đã lấy dấu vân tay của nhiều người thuộc các

thành phần xã hội khác nhau và đã phát hiện được những trường hợp man trá. Năm

1889, Hăng-Ri-Phon, một bác sỹ người Anh đã nghiên cứu dấu vân tay của nhiều

người và đi đến kết luận: “Dấu tay không có sự thay đổi trong suốt cuộc đời con

người” [10, 11]. Đến cuối thế kỷ thứ XIX, những nghiên cứu của Galton với hai

cuốn sách “Về các dấu tay” và “Cách sắp xếp và sử dụng dấu tay” [8] đã khẳng định

vị trí khoa học của vân tay với tư cách là một khoa học hình thái và vân tay học

trong vòng hàng trăm năm qua đã là trợ thủ đắc lực của ngành hình sự trên toàn thế

giới.

Ngày nay mọi người đều quen với khái niệm nhận dạng cá thể bằng vân da

và thừa nhận khả năng nhận dạng của chúng. Trong số các kỹ thuật nhận dạng các

cá thể, vân da thường được áp dụng rất có hiệu quả. Đây là phương pháp mà tất cả

các cơ quan cảnh sát hình sự trên thế giới cũng như ở Việt Nam vẫn đang sử dụng

[3]. Tính đa dạng của con người thể hiện một phần qua những vân tay riêng, cho

phép xác định từng người một cách chính xác. Trong lĩnh vực hình sự, việc nhận

dạng và xác định chính xác cá thể trở nên dễ dàng khi khi chúng ta có đầy đủ dấu

vân da của tất cả mười ngón tay và ngón chân. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có

những nhược điểm của nó là mất rất nhiều thời gian do phải tìm ra một người trong

hệ thống lưu giữ hàng triệu cá thể.

Ở Việt Nam, năm 1996 Bộ Công an đã nhập hệ thống nhận dạng vân da

“Morpho VAFIS” của Pháp, đến năm 2005 sản phẩm công nghệ nhận dạng dấu vân

da của Tổng cục kỹ thuật – Bộ Công an nghiên cứu và phát triển mang tên C@FRIS

ra đời đã thực sự giúp cho công việc so sánh vân da trở nên nhanh chóng và dễ dàng

hơn. Tốc độ tra cứu vân tay 10 ngón của một đối tượng chỉ mất khoảng 30 giây [3].

1.1.4. Nhận dạng cá thể bằng các yếu tố di truyền có bản chất Protein

Với dấu vết máu tìm thấy trên hiện trường vụ án thì điều quan trọng nhất

phải trả lời đó là vết máu của hung thủ hay của nạn nhân. Nếu dấu vết được tìm

thấy trên kẻ tình nghi thì điều quan trọng phải xác định đó có phải là máu của nạn

nhân không và dấu vết máu trên người nạn nhân có phải từ kẻ tình nghi hay không.

Vì vậy, trong xét nghiệm dấu vết sinh học phải tìm ra sự phù hợp giữa bằng chứng



ở hiện trường vụ án với một người trong nhóm đối tượng tình nghi. Sự phù hợp sinh

học giữa mẫu sinh phẩm ở hiện trường vụ án và mẫu sinh phẩm lấy của đối tượng

tình nghi sẽ thiết lập một mối quan hệ thông qua việc xác định những đặc điểm di

truyền nổi bật về mặt sinh học giữa người này và người khác trong quần thể.

1.1.4.1. Xác định nhóm máu

Xác định nhóm máu thông thường trong lĩnh vực hình sự được sử dụng để

trả lời phần lớn các câu hỏi thường gặp trong giám định các mẫu sinh học, đó là

mẫu máu này thuộc về ai trong số đối tượng nghi ngờ? Việc ứng dụng hệ thống

nhóm máu trong nhận dạng cá thể dựa trên sự khác biệt về hệ thống nhóm máu giữa

cá thể này so với cá thể khác. Năm 1900, Landsteiner đã phát hiện ra hệ thống

nhóm máu ABO. Đây là hệ thống nhóm máu cơ bản nhất trong lĩnh vực xét nghiệm

nhận dạng dấu vết sinh học.

Trên cơ sở phân tích hiện tượng ngưng kết của máu người khi trộn lẫn với

nhau, người ta đã xác định được sự tồn tại của các nhóm chất đặc hiệu trên màng

hồng cầu (ngưng kết nguyên) và những ngưng kết tố (agglutinin) nằm ở huyết thanh

của những người có nhóm máu khác nhau. Trong hệ nhóm máu ABO, có bốn kiểu

hình là A, B, O và AB. Trong huyết thanh của người mang nhóm máu A có ngưng

kết tố là β – làm ngưng kết hồng cầu nhóm B và ngược lại, ngưng kết tố nằm trong

huyết thanh của người mang nhóm máu B là α – làm ngưng kết hồng cầu nhóm máu

A. Những người mang nhóm máu O, trong huyết thanh của họ có cả hai loại ngưng

kết tố α và β làm ngưng kết cả hồng cầu nhóm A và hồng cầu nhóm B. Còn những

người mang nhóm máu AB, trong huyết thanh của họ không có ngưng kết tố [18,

20].

Kháng nguyên nhóm máu A, B hay O đó là những hợp chất đặc hiệu

glycoprotein tồn tại trên màng hồng cầu. Người ta cũng nhận thấy rằng di truyền

nhóm máu hệ ABO mang tính độc lập và không bị ảnh hưởng bởi môi trường. Gen

quy định nhóm máu ở người được truyền từ cha mẹ sang con ngay từ khi hình thành

hợp tử và nó bền vững trong suốt cả cuộc đời. Tỷ lệ xuất hiện mỗi nhóm máu trong

các quần thể khác nhau là khác nhau. Ví dụ người Anh ở Luân Đôn, tỷ lệ nhóm máu

O chiếm 44.4%, nhóm A chiếm 42.8%, nhóm B chiếm 9.6% và nhóm AB chiếm



3.2%. Người Bắc Kinh, Trung Quốc nhóm máu O chiếm 30.7%, nhóm A chiếm

25.1%, nhóm B chiếm 34.2% và nhóm AB chiếm 10% [18].

Sau khi phát hiện ra hệ nhóm máu ABO, các nhà khoa học còn tìm được

nhiều hệ nhóm máu khác như Rh, MN, Lewis, Duffy, hệ thống P… Các yếu tố di

truyền này được sử dụng trong xác định quan hệ huyết thống với 15 đến 17 chỉ tiêu

về máu hoặc trong hình sự nhằm phân tích loại trừ các cá thể liên quan giúp ích rất

nhiều trong công tác điều tra, phá án, xác định tội phạm trong một thời gian dài và

cho đến tận ngày nay.

1.1.4.2. Xác định một số nhóm protein trong huyết thanh

Sau khi phát hiện ra nhóm máu ABO, các nhóm máu khác cũng lần lượt

được tìm ra. Người ta cũng biết rằng yếu tố nhóm máu không chỉ có trong huyết

thanh mà còn có trong các tế bào khác của cơ thể và có trong dịch thể như nước bọt,

tinh dịch…và qua đó đã cho chúng ta những khái niệm rộng hơn về sự khác biệt cá

thể có tính di truyền nằm trong huyết thanh, trên tế bào máu (hồng cầu), trên các tế

bào trong các cơ quan và trong các chất tiết.

Trong số những protein trong huyết thanh của người, có một số loại từ lâu

người ta vẫn coi là giống nhau ở mọi cá thể. Nhưng từ sau năm 1955, nhờ sử dụng

kỹ thuật điện di trên gel tinh bột, Smithies đã mở rộng thêm khái niệm về nhóm đối

với protein trong huyết thanh. Bằng phương pháp điện di của Smithies, người ta đã

phát hiện ra rằng có những loại protein biểu hiện dưới cấu trúc đa dạng trong cùng

một loài, đặc tính này cho phép phân loại các cá thể theo những nhóm huyết thanh

khác nhau. Những marker nhóm huyết thanh đã được phát hiện bằng điện di trên gel

tinh bột đó là hệ thống haptoglobin (Hp), hệ thống transferrin, hệ thống α2 globulin,

hệ thống Group Specific.

Bên cạnh các nhóm huyết thanh được phát hiện bằng kỹ thuật điện di còn có

những hệ thống nhóm huyết thanh khác được phát hiện bằng kỹ thuật kết tủa trên

thạch với huyết thanh miễn dịch đặc hiệu như hệ thống nhóm γ-globulin, hệ thống

nhóm β-lipoprotein… Hệ thống nhóm máu cũng như hệ thống các marker enzyme

và protein được tìm ra đã trở thành công cụ hữu ích cho công tác nhận dạng dấu vết

sinh học.



1.1.4.3. Xác định nhóm enzyme

Enzyme có trong mọi tế bào sống, có bản chất protein, xúc tác cho hầu hết

các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, nó còn được gọi là chất xúc tác sinh

học. Những thành tựu đạt được trong nghiên cứu về enzyme đã cho phép người ta

xác định được tính đa hình của chúng và nhận thấy enzyme đa hình không những có

vai trò lớn trong chẩn đoán và điều trị bệnh tật mà nó còn có giá trị trong nhận dạng.

Các enzyme có giá trị trong nhận dạng có thể kể đến như: Gen mã hóa cho

phosphatase acid trên màng hồng cầu gồm 3 alen khác nhau với số cá thể dị hợp tử

chiếm tới 98%, hay các enzyme như adenylate kinase (AK), lactatdehydrogenase, 6-

phosphoglucomutase (PGM) cũng là những enzyme được sử dụng thông qua kỹ

thuật điện di để xác định cá thể. Cũng giống như hệ thống nhóm máu hay hệ thống

protein huyết thanh, các enzyme cũng có tần suất phân bố nhất định trong quần thể.

Những tần suất này mang tính đặc trưng quần thể.

1.2. DNA trong nhận dạng pháp y, khoa học hình sự

Vai trò của DNA (vật chất di truyền) được ứng dụng ngày một nhiều trên các

lĩnh vực trong đó có điều tra hình sự, giám định pháp y. DNA đã thực sự là công cụ

không thể thiếu được trong điều tra phá án. Ứng dụng cụ thể của nó trong việc truy

nguyên thủ phạm của một vụ án thông qua các dấu vết thu được ở hiện trường, nhận

dạng nạn nhân trong mất tích, thảm họa hay xác định mối quan hệ huyết thống…

Các phòng thí nghiệm sử dụng kỹ thuật DNA trong nhận dạng đều thông qua các

đặc điểm đặc trưng của DNA như tính đa hình về chiều dài của các đoạn DNA nhân

hay tính đa hình về trình tự D-loop của DNA ty thể.

1.2.1. Cơ sở khoa học của phân tích DNA nhân trong nhận dạng cá thể

Người đầu tiên đặt nền móng cho ngành di truyền học là Mendel. Ông là

người đầu tiên phát hiện ra các quy luật di truyền. Mendel đã gọi những đặc điểm

được truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác là “nhân tố di truyền”, mà sau này được

gọi là gen. Các công bố của ông thể hiện ở bài viết “Các thí nghiệm lai ở thực vật”

năm 1865. Ngược với những quan điểm trước đây, người ta cho rằng các đặc điểm

của bố mẹ hòa lẫn với nhau ở đời con [4].



Đối với tế bào của người, DNA nằm trên những nhiễm sắc thể trong nhân

(gọi là DNA nhân). Bộ gen của con nguời có 23 cặp NST trong đó có 22 cặp NST

thường và 1 cặp NST giới tính. Nam giới có cặp NST giới tính XY liên kết với

nhau, còn ở nữ giới là XX. Xét nghiệm nhận dạng cá thể người chủ yếu được thực

hiện bằng cách sử dụng các marker DNA nằm trên các NST trong nhân tế bào và

trên NST Y (di truyền theo dòng cha). Còn xác định giới tính bằng cách sử dụng các

marker trên NST giới tính. Các gen trên DNA trong cặp NST quy định các tính

trạng khác nhau của cơ thể. Nó được duy trì trong mỗi thế hệ và được di truyền từ

thế hệ này sang thế hệ khác. Con cái bao giờ cũng thừa hưởng các đặc tính di truyền

thông qua 23 NST từ tinh trùng của bố và 23 NST từ tế bào trứng của mẹ [25, 26].

Đó là cơ sở để xác định quan hệ huyết thống ở người.

Ngày nay, các nhà khoa học đã tìm thấy sự khác biệt trên phân tử DNA dùng

để phân biệt người này với người khác (xác định đặc trưng cá thể). Phương pháp

“dấu ấn điểm chỉ DNA” (DNA fingerprinting) đầu tiên được phát triển bởi Alec

Jeffreys, ông đã tiến hành kiểm tra rất nhiều vùng DNA của bộ gen người cùng một

lúc. Kết quả thu được là dạng DNA có rất nhiều băng. Sự phức tạp và đa dạng của

nó làm người ta liên tưởng đến một dấu ấn điểm chỉ và nó chỉ có thể duy nhất đối

với một cá thể (trừ hai anh em sinh đôi cùng trứng). Vì tính phức tạp của các băng

DNA, người ta đã quyết định chỉ tiến hành xét nghiệm theo các vùng (locus) di

truyền nhất định.

1.2.2. Đa hình trong trình tự DNA

Trình tự DNA có hai loại đa hình [2, 25, 27]:

* Đa hình theo trình tự: Các gốc nucleotide trong đoạn DNA được sắp xếp

một cách ngẫu nhiên không theo quy luật.

Ví dụ: tại locus A ta có trình tự:

Ở cá thể thứ nhất: - AGACTGCTAG -

Ở cá thể thứ hai: - AGCCTGCGAG -

Tại vị trí số 3 và vị trí số 8 của hai cá thể có sự khác nhau.

* Đa hình theo chiều dài:



- Đa hình theo chiều dài do khác nhau số lần lặp lại: Một số gốc nucleotide

được lặp đi lặp lại nhiều lần trên chiều dài của đoạn DNA (Variable number tandem

repeat – VNTRs). Ví dụ:

Cá thể thứ nhất: - ATAT ATAT ATAT - à 3 đoạn lặp ATAT.

Cá thể thứ hai: - ATAT ATAT ATAT ATAT - à 4 đoạn lặp ATAT.

- Đa hình theo chiều dài do khác nhau vị trí cắt bởi enzyme giới hạn

(Restriction fragment length polymorphism – RFLP): Các enzyme giới hạn cắt

DNA tại các vị trí nhận biết đặc trưng nhất định. Các vị trí này là các trình tự

nucleotide đặc trưng, thường từ 4 – 8 nucleotide. Điểm đặc biệt của trình tự nhận

biết là hoàn toàn giống nhau trên hai sợi bổ sung khi chúng được đọc theo chiều 5’-

3’. Việc cắt bằng các enzyme giới hạn tạo ra các đoạn dài ngắn khác nhau và được

phân tích thông qua kỹ thuật RFLP.

Những trạng thái khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus được gọi là alen.

Mỗi cá thể lưỡng bội đều nhận được 2 alen, một alen từ bố và một alen từ mẹ. Tuy

nhiên, trong quá trình hình thành và phát triển của loài và cá thể, sự biến đổi trình tự

nucleotide trên sợi kép DNA đã xảy ra, do vậy đối với mỗi locus gen người ta đã

xác định được rất nhiều alen [4, 9, 21, 22, 23]. Công thức chung để tính số lượng

kiểu gen trong quần thể như sau:

X = n(n+1)

2

X: số kiểu gen có trong quần thể; n: số lượng alen của locus.

Đối với locus có 10 alen, số lượng kiểu gen của các cá thể theo lý thuyết là:

10(10+1)/2 = 55. Trong đó có 10 kiểu gen đồng hợp tử và 45 kiểu gen dị hợp tử,

Tổ hợp của 2 locus gen có 7 alen và 10 alen, số lượng kiểu gen thu được là:

- Locus 7 alen, số kiểu gen: X1 = 7x8/2 = 28

- Locus 10 alen, số kiểu gen: X2 = 10x11/2 = 55

- Tổ hợp 2 locus X1 x X2 = 28 x 55 = 1540 kiểu gen.

Theo cách tính toán như trên, tổ hợp của 10 locus, khả năng hàng tỷ cá thể

mới có hai cá thể có kiểu gen giống nhau. Chính cơ sở của sự khác nhau trong trình



tự nucleotide của các alen trong cùng locus của các phân tử DNA trên các NST là

cơ sở cho giám định gen hình sự để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống.

1.2.3. Phương pháp phân tích DNA trong nhận dạng pháp y

1.2.3.1. Phương pháp lai DNA – DNA

Đây là phương pháp mà đoạn DNA trong mẫu xét nghiệm có thể được nhận

biết bằng đoạn DNA nhân tạo gọi là đầu dò DNA (DNA probe) có trình tự bổ sung.

Thông thường đoạn đầu dò có chiều dài 30-100bp. DNA sợi kép của mẫu cần xét

nghiệm được biến tính thành hai sợi đơn bằng nhiệt hoặc kiềm – liên kết hydro bị

đứt nhưng các liên kết phosphodiester của khung DNA không bị ảnh hưởng. Mẫu

sau khi biến tính được làm lạnh nhanh để phân tử DNA không hồi tính mà vẫn giữ ở

trạng thái sợi đơn. DNA này được gắn vào màng (màng nitrocellulose hoặc nylon) ở

nhiệt độ cao. Sau đó, mẫu được ủ với đầu dò DNA đã biết trình tự và được đánh dấu

phóng xạ hoặc huỳnh quang. Nếu trình tự nucleotide của DNA của mẫu cần xét

nghiệm bổ sung với trình tự của đầu dò thì chúng sẽ liên kết với nhau. Sản phẩm lai

có thể được phát hiện bằng máy chụp X – quang hoặc có thể nhìn thấy trực tiếp qua

film [1, 2, 25].

1.2.3.2. Phương pháp RFLP

Những nghiên cứu trong lĩnh vực di truyền cá thể đã chứng minh rằng, phân

tử DNA có các đoạn trình tự nucleotide mang tính đặc trưng cá thể. Khi sử dụng

enzyme giới hạn cắt DNA của từng cá thể thành những đoạn có kích thước phân tử

nhỏ hơn, sau đó so sánh chúng với nhau trên gel điện di người ta thấy rằng những cá

thể khác nhau thu được những băng dài ngắn khác nhau [23]. Sản phẩm DNA sau

điện di được chuyển lên màng nylon và lai với các đầu dò khác nhau, kết quả lai

được hiện lên trên film cho thấy những đặc trưng của mỗi cá thể khác nhau. Phương

pháp này được gọi là phân tích đa hình độ dài đoạn DNA được cắt bằng enzyme

giới hạn – RFLP.

Năm 1975, Southern E.M. [2] là người đầu tiên đã chuyển DNA từ gel lên

màng lai nitrocellulose từ đó có thể nhận biết các đoạn DNA khác nhau của bộ gen

được cắt bởi các enzyme giới hạn. Năm 1980, Wyman và White đã phát hiện ra các



đoạn lặp và đến những năm 1990 của thế kỷ XX người ta đã phát hiện ra trên 3000

đoạn DNA đa hình trong bộ gen của người. Một số đoạn DNA đa hình trong số đó

đã được sử dụng cho khoa học hình sự để xác định huyết thống và nhận dạng cá thể

người. Phương pháp RFLP lần đầu tiên được áp dụng thành công trong lĩnh vực

hình sự vào năm 1983 ở Anh để phân tích mẫu DNA tinh dịch của tội phạm trong

một vụ án [23].

Tuy nhiên, phương pháp này có những hạn chế khi áp dụng trong lĩnh vực

khoa học hình sự do:

1. Phương pháp RFLP đòi hỏi mẫu DNA phải nguyên vẹn với một lượng

mẫu lớn (ít nhất là 50ng)

2. Phóng xạ là một yếu tố độc hại mà không phải bất kỳ một phòng thí

nghiệm nào cũng có đủ cơ sở vật chất để tiến hành.

3. Phân tích RFLP rất phức tạp và mất nhiều thời gian (từ 4 – 8 tuần mới

đọc được kết quả của 4 locus gen VNTR khác nhau).

4. Phương pháp RFLP không phân tích được toàn bộ các alen của các locus

gen VNTR.

1.2.3.3. Các phương pháp phân tích DNA dựa trên kỹ thuật PCR

Phương pháp AFLP:

Phương pháp AFLP [2, 25] là một kỹ thuật sử dụng enzyme giới hạn cắt sản

phẩm PCR thành các đoạn dài, ngắn khác nhau, sau đó điện di trên gel agarose và

nhuộm bằng ethidium bromide, sự khác biệt về kích thước các đoạn DNA của hệ

gen được phát hiện một cách dễ dàng hơn. Phương pháp này khắc phục được nhược

điểm của phương pháp RFLP bởi vì chỉ cần một lượng DNA rất nhỏ ban đầu

(nanogram) chúng ta có thể xác định đa hình bằng cách nhân bội đoạn đó lên bằng

PCR sau đó cắt bằng các enzyme giới hạn thích hợp. Sử dụng phương pháp này,

người ta đã xác định một cách dễ dàng 6 kiểu gen trong hệ thống nhóm máu ABO

là: AA, AB, OO, AO, BO, BB [25].

Kỹ thuật giải trình tự gen: Có hai phương pháp giải trình tự gen:

- Giải trình tự theo phương pháp hóa học



Năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh phương pháp giải trình

tự DNA theo phương pháp hóa học [2]. Nguyên lý của phương pháp dựa trên sự

biến tính DNA thành các mạch đơn và xử lý bằng các hóa chất hóa học nhằm phân

hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch DNA đã đánh dấu bằng đồng vị phóng

xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide. Sau đó,

các đoạn này được phát hiện bằng cách điện di trên gel polyacrylamide, đọc kết quả

điện di bằng máy đọc phóng xạ.

- Giải trình tự theo phương pháp enzyme

Cũng vào năm 1977, Sanger và cs đã công bố phương pháp giải trình tự

DNA khác với phương pháp của Maxam và Gilbert. Đó là phương pháp sử dụng

enzyme hay phương pháp dideoxynucleotide [2]. Đặc trưng của phương pháp này là

sử dụng dideoxynucleotide để làm ngừng tổng hợp các mạch đơn DNA một cách

ngẫu nhiên. Trong phản ứng sử dụng các thành phần như PCR bình thường nhưng

có bổ sung khoảng 1% một trong bốn loại dideoxynucleotide – ddNTP (ddATP,

ddGTP, ddCTP, ddTTP) cho mỗi loại phản ứng. Các dideoxynucleotide mất nhóm

OH ở vị trí 3’, do đó khi mạch đơn DNA đang tổng hợp được gắn một ddNTP

không có gốc oxy ở vị trí 3’ sẽ làm cho mạch DNA đang tổng hợp bị ngừng lại.

Mỗi loại phản ứng được thực hiện trong một ống riêng rẽ. Tỷ lệ giữa hàm

lượng dNTP và ddNTP làm cho quá trình tổng hợp DNA thỉnh thoảng mới có 1

ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên, làm phản ứng tổng hợp đoạn DNA đó bị dừng lại.

Kết quả đã tạo ra các đoạn oligonucleotide hơn kém nhau 1 nucleotide và được

phát hiện trên gel polyacrylamide [2].

1.3. STR sử dụng trong nhận dạng cá thể người

1.3.1. Khái niệm các đoạn lặp và STR

Khi nghiên cứu về cấu trúc DNA, người ta phát hiện thấy nhiều gen của sinh

vật nhân chuẩn và một số sinh vật nhân sơ mang các đoạn không mã hóa xen giữa

các đoạn mã hóa. Đoạn mã hóa được gọi là exon, đoạn không mã hóa được gọi là

intron. Thông thường, các đoạn intron chứa các trình tự lặp lại. Các trình tự DNA

lặp lại này khác nhau về kích thước và mang tính đặc trưng về chiều dài các đơn vị



lặp lại, số lượng các đơn vị lặp lại liên tục hoặc trên toàn bộ chiều dài của vùng lặp

[2, 25]. Các trình tự lặp này được chia làm 3 loại:

1. Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10 – 15% bộ gen người. Đó là những

trình tự lặp lại có kích thước khoảng 10 – 20kb, thường tập trung ở vùng

tâm động hoặc ở đầu NST.

2. Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25 – 40% bộ gen

người. Chúng có kích thước lớn hơn (100 – 1000kb) và đa dạng hơn

những trình tự lặp lại nhiều lần, các trình tự này không tập trung mà phân

tán trên toàn bộ hệ gen.

3. Các trình tự duy nhất: Đó là các trình tự mã hóa cho các protein, có trình

tự đặc trưng cho từng gen.

Các đoạn DNA có cấu trúc lặp lại từ 2 – 6bp được gọi là các đoạn lặp lại

ngắn (STR). Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di

truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể. Đó là nền tảng cho giám định

DNA hình sự. Các marker DNA STR rất đa dạng và có thể được nhân bội dễ dàng

bằng phản ứng PCR. Số lần các đoạn lặp có thể khác nhau rất nhiều giữa các cá thể

khác nhau, điều này làm cho chúng có giá trị cao trong công tác nhận dạng cá thể.

Theo nghiên cứu của Broman [21, 22] và trung tâm nghiên cứu y học Marshfield

[25] đã thu được dữ liệu kiểu gen của 8.000 STR trên khắp 23 cặp NST người với

mục đích để lập bản đồ di truyền người.

Tuy nhiên, để một locus STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác

định cá thể thì nó phải thỏa mãn những yêu cầu bắt buộc sau [22, 25, 26, 27]: Thứ

nhất, locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao, điều này giúp các nhà

phân tích sử dụng một hệ thống STR có thể phân biệt cá thể một cách tốt nhất. Thứ

hai, các STR có kích thước ngắn từ 100 – 500bp, do các đoạn DNA ngắn có tính

bền vững cao hơn, ít bị đứt gãy hơn khi có tác động của điều kiện tự nhiên và quá

trình nhân gen PCR có thể được thực hiện dễ dàng và hiệu quả hơn. Đối với những

đoạn DNA có tính đa hình cao nhưng kích thước lớn, trong thực tế chỉ có thể thực

hiện phản ứng PCR với những mẫu sinh phẩm còn tươi, mới hoặc được bảo quản

trong những điều kiện tốt. Thứ 3, các locus dùng trong hình sự phải có tính di



truyền độc lập. Như vậy chúng phải nằm trên các NST khác nhau, điều này đảm bảo

cho tính độc lập của từng locus.

Vì những lý do trên, những trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại gồm 4

nucleotide, ví dụ (AGTA)n được ứng dụng nhiều hơn so với các đoạn lặp hình thành

từ hai hoặc ba nucleotide, ví dụ (CAA)n, (CA)n hoặc những đoạn đa hình hình thành

từ các đoạn lặp chứa các đơn vị lặp lại gồm 5 nucleotide ví dụ (CCAAG)n hoặc 6

nucleotide như (CCAACA)n. Ngày nay, nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại bộ 4

đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhận dạng do nó đáp ứng được những yêu

cầu của ngành hình sự [23].

Theo Gill và CS (1996), Carracedo và Lareu (1998) [27] các STR ứng dụng

trong nhận dạng cá thể người phải đáp ứng được những tiêu chuẩn như sau:

1. Khả năng phân biệt cao (thường lớn hơn 0,9) và các dạng dị hợp tử quan

sát được lớn hơn 70%

2. Nằm trên vùng nhiễm sắc thể riêng biệt và không lựa chọn những vị trí

liên kết gần

3. Dễ dàng nhân bội bằng phản ứng PCR

4. Đặc tính Stutter thấp

5. Chiều dài đoạn (locus) DNA được nhân bội trong khoảng 90 – 500bp, với

kích thước đoạn DNA ngắn phù hợp cho việc phân tích những mẫu sinh

phẩm bị suy giảm chất lượng thường gặp trong lĩnh vực hình sự.

1.3.2. Danh pháp đối với marker DNA

Tên các locus marker DNA được đặt theo tên của gen nếu locus này nằm một

phần hoặc nằm toàn bộ trong gen [25]. Ví dụ marker STR TH01 từ gen tyrosine

hydroxylase của người nằm trên NST số 11. Chữ “TH” xuất phát từ chữ cái đầu

tyrosine hydroxylase. Phần “01” của ký hiệu “TH01” xuất phát từ vùng intron 1

(vùng không mã hóa protein) của gen tyrosine hydroxylase. Đôi khi tiếp đầu ngữ

HUM được thêm vào đầu danh pháp của marker này để xác định đó là từ bộ gen

người (Human). Vì vậy, locus STR này sẽ được gọi chính là HUM TH01 hay TH01.

Các marker DNA mà nằm ngoài vùng gen thì được xác định bởi vị trí của

chúng trên NST. Ví dụ, STR locus D5S818 và DYS19 đó là những marker không



nằm trong vùng gen. Trong trường hợp này chữ D có nghĩa là DNA. Con số tiếp

theo là số thứ tự của NST. Chữ “S” thực chất là trình tự đơn lẻ của DNA marker.

Con số cuối cùng là vị trí marker nằm trên mỗi NST riêng biệt. Con số này là duy

nhất đối với marker DNA nhận dạng cá thể. Ví dụ, marker DNA D16S539 có nghĩa

là D: DNA, 16: chromosome số 16, S: single copy sequence, 539: vị trí thứ 539 xác

định trên NST số 16.

Hình 1.2. Một số locus đa hình sử dụng trong nhận dạng cá thể

Các số thứ tự 1 – 22 và các chữ cái X, Y là ký hiệu của các NST; các locus được trình bày

trên các NST tương ứng.

1.4. Các bộ kit thương mại sử dụng locus STR trong nhận dạng cá thể người

Các marker STR đầu tiên được sử dụng và phát triển trong labo của tiến sỹ

Thomas Laskey tại Đại học Y khoa Baylor và Ttrung tâm Khoa học Hình sự của

Anh (Forensic Science Service). Từ những locus này, nhiều công ty đã tiến hành

thương mại hóa các marker tiêu chuẩn đồng thời phát triển thêm một số các marker

mới. Hệ thống locus STR hình sự được chia làm bốn loại sau:

- Loại thứ nhất: Trình tự lặp lại đơn giản gồm một loại trình tự lặp, ví dụ:

TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539

- Loại thứ hai: Trình tự lặp lại đơn giản nhưng số alen không thực sự đồng

nhất, ví dụ: TH01, D18S51, D7S820



- Loại thứ 3: Trình tự lặp lại kết hợp với các alen không đồng nhất, ví dụ:

vWA, FGA, D3S1358, D8S1179

- Loại thứ tư: Trình tự lặp lại phức tạp, ví dụ: D21S11, LPL

Năm 1993, Hãng Promega đưa ra bộ kit đầu tiên gồm 3 locus STR là

CSF1PO, TPOX, TH01 (thường được gọi là CTT) phát hiện bằng nhuộm bạc. Bộ

CTT cho xác suất trùng lặp là 1/500 song rất dễ sử dụng nên được dùng nhiều tại

Mỹ và nhiều nước khác trên thể giới.

Bộ STR phục vụ cho ngành pháp lý được đánh dấu huỳnh quang đầu tiên là:

TH01, FES/FPS, vWA và F13A01. Đây là bộ đánh dấu thế hệ thứ nhất, xác suất hai

cá thể trùng nhau khi sử dụng bốn locus này khoảng 1/10000. Bộ kit thế hệ thứ hai

gồm có 6 locus là TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51 và D21S11 với xác suất

hai cá thể trùng nhau là 1/5000000. Những locus nêu trên đều sử dụng các phương

pháp huỳnh quang để phát hiện nên đòi hỏi kinh phí và trang bị tương đối lớn và

đồng bộ.

Ngày nay với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều công ty thương mại

đã phát triển các bộ kít nhận dạng có thể phân tích hàng chục locus trong một phản

ứng giúp cho việc nhận dạng cá thể có độ chính xác gần như tuyệt đối [25].

Bảng 1.1 Các bộ kit thương mại và các marker STR phổ biến [25]

Tên kit Hãng sản xuất

Năm Sản xuất

Các loci STR

TH01, TPOX, CSF1PO Monoplexes (silver stain)

Promega 1993 TH01, TPOX, CSF1PO

AmpFlSTR® Blue Applied Biosystems

1996 D3S1358, VWA, FGA

AmpFlSTR® Green I Applied Biosystems

1997 Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO

CTTv Promega 1997 CSF1PO, TPOX, TH01, VWA (vWF) FFFL Promega 1997 F13A1, FES/FPS, F13B, LPL GammaSTR Promega 1997 D16S539, D13S317, D7S820, D5S818 PowerPlexTM (version 1.1 and 1.2 later)

Promega 1997 1998

CSF1PO, TPOX, TH01, VWA, D16S539, D13S317, D7S820, D5S818

AmpFlSTR® ProfilerTM Applied Biosystems

1997 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820

AmpFlSTR® Profiler Applied 1997 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin,



PlusTM Biosystems D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820

AmpFlSTR® COfilerTM Applied Biosystems

1998 D3S1358, D16S539, Amelogenin, TH01, TPOX, CSF1PO, D7S820

AmpFlSTR® SGM PlusTM Applied Biosystems

1999 D3S1358, VWA, D16S539, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA

PowerPlex® 2.1 (for Hitachi FMBIO users)

Promega 1999 D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, VWA, D8S1179, TPOX, FGA, Penta E

PowerPlex® 16 Promega 2000 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, Amelogenin

PowerPlex® 16 BIO (for Hitachi FMBIO users)

Promega 2001 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, Penta D, Penta E, Amelogenin

AmpFlSTR® IdentifilerTM Applied Biosystems

2001 CSF1PO, FGA, TPOX, TH01, VWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, Amelogenin

AmpFlSTR® Profiler PlusTM ID (extra unlabeled D8-R primer)

Applied Biosystems

2001 D3S1358, VWA, FGA, Amelogenin, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, D7S820

PowerPlex® ES Promega 2002 FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D18S51, D21S11, SE33, Amelogenin

AmpFlSTR® SEfilerTM Applied Biosystems

2002 FGA, TH01, VWA, D3S1358, D8S1179, D16S539, D18S51, D21S11, D2S1338, D19S433, SE33, Amelogenin

Hiện nay, các bộ kit thương mại ngày càng được cải tiến cho kết quả chính

xác hơn gấp nhiều lần so với trước kia. Đồng thời quy trình phân tích và thời gian

thu nhận kết quả cũng được rút ngắn đi rất nhiều. Hai bộ kit được sử dụng phổ biến

nhất trên thế giới là PowerPlex® 16 của hãng Promega và AmpFlSTR® IdentifilerTM

của hãng Applied Biosystems, hai bộ kit này đều nhân đồng thời 16 locus trong một

phản ứng vì vậy độ chính xác cao [41, 43].



Hình 1.3. Hai bộ kit sử dụng phổ biến trong nhận dạng pháp y



Bảng 1.2. So sánh các alen có trong một số bộ kit thương mại phổ biến [25]

Loci/Kit

Promega Corporation STR Kits Applied Biosystems AmpFlSTR Kits

PP1.1

Alleles #

PP2.1

Alleles #

PP16

Alleles #

PP ES

Alleles #

ProfilerPlus

Alleles #

COfiler

Alleles #

SGM Plus

Alleles #

Identifiler

Alleles #

SEfiler

Alleles #

CSF1PO 6-15 10 6-15 10 6-15 10 6-15 10

FGA 17-46.2 19 16-46.2 28 16-46.2 28 17-30 14 17-51.2 28 17-51.2 28 17-51.2 28

TH01 5-11 7 4-13.3 10 4-13.3 10 4-13.3 10 5-9.3,10 7 4-13.3 10 4-13.3 10 4-13.3 10

TPOX 6-13 8 6-13 8 6-13 8 6-13 8 6-13 8

VWA 10-22 13 10-22 13 10-22 13 10-22 13 11-21 11 11-24 14 11-24 14 11-24 14

D3S138 12-20 9 12-20 9 12-20 9 12-19 8 12-19 8 12-19 8 12-19 8 12-19 8

D5S818 7-15 9 7-16 10 7-16 10 7-16 10

D7S820 6-14 9 6-14 9 6-15 10 6-15 10 6-15 10

D8S1179 7-18 12 7-18 12 7-18 12 8-19 12 8-19 12 8-19 12 8-19 12

D13S317 7-15 9 7-15 9 8-15 8 8-15 8

D16S539 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9 5.8-15 9

D18S51 8-27 22 8-27 22 8-27 22 9-26 21 7.9-27 23 7.9-27 23 7.9-27 23

D21S11 24-38 24 24-38 24 24-38 24 24.2-38 22 24-38 24 24-38 24 24-38 24

D2S1338 15-28 14 15-28 14 15-28 14

D19S433 9-17.2 15 9-17.2 15 9-17.2 15

Penta D 2.2-17 14

Penta E 5-24 20 5-24 20



SE33 4.2-37 35 4.2-37 35

Amelogenin X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2 X,Y 2

Total Alleles 76 137 209 155 118 54 159 205 194



1.5. Bộ kit nhận dạng AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit

Hiện nay, đa số các phòng thí nghiệm trên thế giới đều sử dụng bộ kít

AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit của hãng Applied Biosystems –

Mỹ cho mục đích xét nghiệm huyết thống, khoa học hình sự. Đây là bộ kit chuyên

dụng cho nhận dạng cá thể sử dụng 15 locus STR và một marker xác định giới tính

gồm có: CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539,

D18S51, D21S11, FGA, TH01, TPOX, VWA và 2 locus gen dạng tetranucleotide:

D2S1338 và D19S433 (13 locus gen tiêu chuẩn theo hệ thống CODIS và 2 locus

đặc trưng bổ sung: D2S1338 và D19S433) [41]. Bộ kit phân tích sử dụng kỹ thuật

huỳnh quang 5 màu, tương thích hoàn toàn với phần mềm phân tích STR chuyên

dụng GeneMapper ID, đồng thời có thể tự động hóa toàn bộ quá trình từ chuẩn bị

mẫu đến phân tích kết quả vì vậy cho kết quả phân tích chính xác và nhanh hơn rất

nhiều so với các phương pháp khác. Ở Việt Nam, các trung tâm xét nghiệm hàng

đầu như Học viện Quân Y, Viện Khoa học Hình sự… cũng đã và đang sử dụng bộ

kit này phục vụ công tác giám định gen, nhận dạng pháp y. Viện Khoa học Hình sự

cũng đang bắt đầu triển khai hệ thống robot tách chiết tự động (3 hệ thống robot của

hãng Tecan – Thụy Sỹ) kết hợp với sử dụng bộ kit Identifiler nhằm nâng cao hiệu

quả giám định gen pháp y.

Hình 1.4. Bộ kit thương mại Identifiler của hãng Applied Biosystems



Một bộ AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (200 phản ứng) bao

gồm:

- AmpFlSTR PCR Reaction Mix: gồm có 2 ống MgCl2, deoxynucleotide

triphosphates, và bovine serum albumin in buffer with 0.05% sodium azide,

dung tích: 1.1 ml/tube

- AmpFlSTR Identifiler™ Primer Set: Bộ primer chuẩn gồm 01 ống dung tích

1.1 ml chứa các primer gắn huỳnh quang và các primer không gắn huỳnh

quang (fluorescently labeled primers and non-labeled primers).

- AmpliTaq Gold DNA Polymerase: Enzyme sử dụng nhân bộ DNA trong bộ

kit là 02 lọ AmpliTaq Gold DNA Polymerase với nồng độ 5 U/µl, thể tích:

50 µL/lọ

- AmpFlSTR Control DNA 9947A: 01 ống chứa 0.10 ng/µl human female cell

line DNA in 0.05% sodium azide and buffer , 0.3 ml

- AmpFlSTR Identifiler™ Allelic Ladder: Bộ thang DNA chuẩn gồm 01 ống

dung tích 50µl chứa AmpFlSTR Identifiler Allelic Ladder của các amplified

alleles.

Bảng 1.3. Vị trí các locus trên NST và Dye label tương ứng [25]

Locus Vị trí trên NST Genbank Dye label

CSF1PO 5q33.1

c-fms proto-oncogene, 6th intron

X14720

6-FAM D8S1179 8q24.13 G08710

D21S11 21q21.1 AP000433

D7S820 7q21.11 G08616

D3S1358 3p21.31 NT_005997

VIC

TH01 11p15.5

Tyrosine hydroxylase, 1st intron

D00269

D13S317 13q31.1 G09017

D16S539 16q24.1 G07925

D2S1338 2q35-37.1 G08202



D19S433 19q12-13.1 G08036

NED

VWA 12p13.31

Von Willebrand Factor, 40th intron

M25858

TPOX 2p25.3

Thyroid peroxidase, 10th intron

M68651

D18S51 18q21.33 L18333

D5S818 5q23.2 G08446

PET FGA 4q31.3

Alpha fibrinogen, 3rd intron

M64982

Amelogenin X: p22.1-22.3/ Y: p11.2

Sử dụng bộ kít AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit cho kết quả có

độ chính xác rất cao, khả năng phân biệt giữa các cá thể khác nhau được thể hiện rõ

như trong hình 1.5.

Hình 1.5. Khả năng phân biệt của các loci trong bộ kit Identifiler



CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu DNA khuôn: Chúng tôi sử dụng mẫu DNA khuôn được tách chiết từ

nhiều nguồn khác nhau như máu, tóc, mô, niêm mạc miệng… của 402 đối tượng

thuộc dân tộc Kinh. Trong đó có 350 mẫu máu lấy vào thẻ FTA, 10 mẫu niêm mạc

miệng, 10 mẫu nước bọt, 13 mẫu móng tay, 8 mẫu tóc có chân và 21 mẫu máu tổng

số (có đối tượng lấy nhiều loại mẫu).

2.1.2. Hóa chất

Nhóm hóa chất dùng cho tách chiết DNA

Ø Chelex® 100 Resin (Bio-rad/Mỹ)

Ø PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit (P/N 4392852)

Ø QIAamp DNA Investigator Kit (50) (QIAGEN – Mỹ)

Ø FTA card và FTA purification kit

Nhóm hóa chất dùng cho PCR

Ø Đệm enzyme Taq polymerase 10X

Ø MgCl2 25mM

Ø dNTPs 5mM

Ø Taq polymerase 5U/µl

Ø Nước cất khử ion và khử trùng

Nhóm hóa chất dùng cho điện di

Ø Agarose

Ø Đệm TBE

Ø Ethidium bromide

Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng nhân gen và phân tích gen



Ø AmpFℓSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit (P/N 4322288)

Ø GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (P/N 4322682)

Ø POP-4™ Polymer (P/N 4352755)

Ø Hi-DiTM Formamide (P/N 4311320)

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị

Ø Máy ly tâm (Mikro 200 – Hittich/Đức)

Ø Máy PCR 9700 (ABI – Mỹ)

Ø Máy PCR iCycler (Biorad – Mỹ)

Ø Bộ điện di Agarose: Nguồn 300V, bể điện di (biorad – Mỹ)

Ø Lò vi sóng

Ø Tủ hút

Ø Buồng thao tác PCR

Ø Block gia nhiệt

Ø Máy khuấy từ

Ø Máy cất nước 2 lần

Ø Máy định lượng acid nucleic: Nanodrop

Ø Máy điện di mao quản: sequnencer 3130XL

Dụng cụ

Ø Pipet các loại

Ø Ống Eppendorf các loại

Ø Plate 96 giếng

Ø Đầu côn các loại

Ø Găng tay cao su



2.2. Phương pháp nghiên cứu

(1) Thu mẫu (máu, tóc, mô…)

(2) Tách chiết DNA

(3) Định lượng DNA bằng máy quang phổ, Nanodrop

(4) PCR nhân gen bằng bộ kít Indentifiler

(5) Chạy Fragment trên máy ABI 3130XL

(6) Phân tích kết quả và xử lý số liệu

Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu 2.2.1. Các phương pháp tách chiết DNA

2.2.1.1. Phương pháp tách DNA bằng Chelex

Chelex® 100 Resin có khả năng loại bỏ các chất ức chế kim loại mà không

làm thay đổi nồng độ các ion không kim loại của dung dịch tinh sạch. Resin được

tạo thành bởi hai polymer styrene và divinylbenzene chứa các liên kết imino vì vậy

có khả năng bám các kim loại cao. Phương pháp tách DNA bằng chelex 100 đơn

giản, cho hiệu quả cao và có thể áp dụng với nhiều đối tượng mẫu khác nhau.

Chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết DNA bằng chelex 100 để tách DNA trên

các mẫu máu thu bằng thẻ thu mẫu FTA card.

Quy trình tách chiết bằng chelex 100 như sau:

1. Cắt khoảng 3x3 mm mẫu trên thẻ FTA card cho vào ống ly tâm 1,5 ml

2. Cho 1 ml nước tinh khiết đã khử ion vào ống

3. Trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 – 30 phút để rửa mẫu

4. Chuẩn bị dung dịch chelex 100 5% bằng cách pha 5 g chelex vào 100 ml

nước khử ion

5. Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút

6. Hút loại bỏ toàn bộ dịch nổi

7. Thêm 200 µl dung dịch chelex 5% vào ống đựng mẫu

8. Ủ hỗn hợp ở 56oC trong vòng 30 phút

9. Trộn bằng vortex trong 5 giây

10. Ủ hỗn hợp ở 100oC trong khoảng 8 phút

11. Trộn bằng vortex trong 5 giây



12. Ly tâm mẫu với tốc độ 12000 vòng/phút trong 3 phút

13. Thu dịch nổi cho sang ống mới.

2.2.1.2. Phương pháp tách chiết bằng PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit

PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit là bộ kit chuyên dụng, dùng để

tách các mẫu khó thu DNA hoặc các mẫu có hàm lượng DNA thấp như mẫu tóc,

mẫu nước bọt, mẫu kẹo cao su, mẫu móng chân, móng tay…Một bộ kít hoàn chỉnh

(100 phản ứng) bao gồm các thành phần như sau [40, 42]:

PrepFiler TM Lysis Buffer 50 ml

PrepFiler TM Isopropanol Chai 60 ml

PrepFiler TM Magnetic

Particles

1.5 ml

PrepFiler TM Wash Buffer

Concentrate

2x26 ml

PrepFiler TM Elution Buffer 12.5 ml

PrepFiler TM Filter Columns 100

PrepFiler TM Spin Tubes 300

Hình 2.2. Bộ kít tách DNA PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit

Quy trình tách chiết DNA bằng DNA PrepFiler™ Forensic DNA Extraction Kit gồm

các bước cơ bản sau:

Hình 2.3. Quy trình tách chiết DNA bằng PrepFiler extraction kit



Đầu tiên các mẫu được ủ với dung dịch PrepFiler Lysis buffer để phá vỡ màng

tế bào giải phóng DNA ra ngoài môi trường. Tiếp theo tiến hành loại bỏ xác tế bào

và thêm hạt từ tính, isopropanol vào dung dịch. Các DNA sẽ bị tủa và bám vào hạt

từ tính bằng lực hút tĩnh điện. Tiến hành rửa nhiều lần bằng PrepFiler Wash buffer,

sau đó thêm PrepFiler Elution buffer để tách DNA ra khỏi hạt từ tính. Cuối cùng là

bước tinh sạch và thu DNA.

Tùy theo từng loại mẫu khác nhau mà chúng ta có thể tăng hoặc giảm thể tích

Lysis buffer cũng như thời gian ủ thích hợp. Đối với các mẫu thông thường như

mẫu máu, mẫu tóc…thì thời gian ủ thường từ 30 – 60 phút. Với các mẫu đặc biệt

như mẫu răng, xương…thì đòi hỏi thời gian ử lâu hơn, có thể lên đến 12-18 tiếng.

2.2.1.3. Phương pháp tách chiết DNA bằng QIAamp DNA Investigator Kit

Bộ QIAamp DNA Investigator kit (50 phản ứng) bao gồm [44]:

QIAamp MinElute®

Columns

50

Collection Tubes (2 ml) 200

Buffer ALT 50 ml

Buffer AL 33 ml

Buffer AW1 19 ml

Buffer AW2 13 ml

Buffer ATE 12 ml

Carrier RNA (red cap) 310 µg

Proteinase K 1.25 ml

Hình 2.4. Thành phần và các bước tách DNA cơ bản của bộ QIAamp DNA Investigator kit



Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu, nước bọt, tóc, móng tay:

Chuẩn bị buffer AW1 và AW2

- Thêm 25 ml ethanol (96 – 100%) vào ống chứa 19 ml Buffer AW1

- Thêm 30 ml ethanol (96 – 100%) vào ống chứa 13 ml Buffer AW2

Quy trình tách chiết mẫu máu, nước bọt:

1. Hút 50 µl máu tổng số hoặc nước bọt vào ống ly tâm 1.5ml

2. Thêm 50 µl buffer ALT

3. Thêm 10 µl proteinase K

4. Thêm 100 µl buffer AL, đóng nắp và lắc nhẹ trong vòng 15 giây

5. Ủ và lắc nhẹ ở 56oC trong vòng 10 phút

6. Ly tâm nhẹ để loại bỏ dung dịch dính trên nắp ống

7. Thêm 50 µl ethanol (96-100%), đóng nắp và lắc đều trong vòng 15 giây. Ủ ở

nhiệt độ phòng trong 3 phút

8. Ly tâm nhẹ để loại bỏ dung dịch dính trên nắp ống

9. Đặt ống QIAamp MinElute vào trong ống 2 ml collection tube, chuyển toàn

bộ dung dịch trong ống ly tâm 1.5 ml sang ống MinElute, đóng nắp và ly tâm

ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã dùng và dung

dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection mới.

10. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 500 µl buffer AW1. Đóng

nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã

dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection

mới.

11. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 700 µl buffer AW2. Đóng

nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống collection đã

dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào ống collection

mới.

12. Cẩn thận mở nắp ống QIAamp MinElute và thêm 700 µl ethanol (96-100%).

Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong vòng 1 phút. Loại bỏ ống



collection đã dùng và dung dịch trong đó, đặt ống QIAamp MinElute vào

ống collection mới.

13. Ly tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng/phút trong vòng 3 phút để làm khô và loại

bỏ hoàn toàn ethanol

14. Đặt ống QIAamp MinElute vào ống ly tâm 1.5 ml sạch, cẩn thận mở nắp và

để ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút hoặc ủ ở 56oC trong vòng 3 phút.

15. Thêm 40 µl buffer ATE hoặc nước cất vào giữa màng của ống QIAamp

MinElute

16. Đóng nắp và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở 14000 vòng/phút

trong vòng 1 phút.

2.2.1.4. Quy trình tách chiết bằng hạt từ tính

Hạt từ tính có gắn Sitica tích điện (+) trên bề mặt sẽ gắn với DNA và một số

thành phần tích điện (-) nên tách được DNA ra khỏi các tạp chất tích điện (+) khác.

Sau khi thu được phức hợp "hạt từ tính - thành phần mang điện tích (-)”, sử

dụng Wash Buffer rửa nhiều lần, để lại phức hợp "hạt từ tính - DNA".

Cụ thể các bước như sau:

+ Bước 1: Cắt nhỏ phần chân tóc cho vào ống nghiệm.

+ Bước 2: Thêm Lysis Buffer, ủ 70oC trong 30 phút để hoà tan mẫu.

+ Bước 3: Ly tâm để loại bỏ bớt tạp chất.

+ Bước 4: Thêm hạt từ tính để tạo phức hợp "hạt từ tính-thành phần tích điện

(-)".

+ Bước 5: Đặt ống nghiệm vào giá từ tính để lọc lấy phức hợp.

+ Bước 6: Rửa nhiều lần bằng Wash Buffer để thu phức hợp "hạt từ tính -

DNA"

+ Bước 7: Để khô ở nhiệt độ phòng để loại bớt nước.

+ Bước 8: Thêm Elution Buffer và ủ ở 650C trong 5 phút để tách DNA ra khỏi

hạt từ tính.

+ Bước 9: Thu dung dịch DNA.



Sau khi thu được mẫu DNA, chúng tôi tiến hành định lượng và kiểm tra độ

tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp định lượng trên máy đo quang phổ

Nanodrop.

2.2.2. Phương pháp định lượng DNA

Sản phẩm DNA thu được sau quá trình tách chiết được định lượng trên máy

Nanodrop ở bước sóng 260 và 280 nm để định lượng và kiểm tra độ tinh sạch.

Nguyên tắc:

Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm

của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260nm của các

mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu đo. Độ tinh sạch của dung dịch

dựa vào tỷ số OD 260nm/280nm. Một dung dịch axit nucleic được coi là sạch khi tỷ

số OD là 1,8-2,0.

Cách tiến hành

- Lấy 1µl nước cất cho vào mắt đọc của máy để chuẩn máy trước khi đo DNA

- Sau đó lấy 1µl dung dịch có chứa DNA đã được tách chiết cho vào mắt đọc

và đo ở các bước sóng 260nm và 280nm. Đọc kết quả trên màn hiển thị nồng độ

DNA tính bằng ng/µl và giá trị OD (260/280).

2.2.3. Phương pháp PCR

Đại cương về phương pháp PCR.

Kỹ thuật PCR do Karry Mullis phát minh vào năm 1985 đã đánh dấu những

bước đột phá trong công nghệ sinh học bởi khả năng áp dụng của nó trong phân tích

DNA. Nhờ có PCR người ta có thể nhân một đoạn DNA đích ban đầu lên hàng triệu

bản sao chỉ trong vài giờ. Lượng DNA sau nhân bội đủ lớn để có thể phát hiện được

bằng các phương pháp thông thường. Với những ưu điểm nổi bật, PCR đã nhanh

chóng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực khoa học hình sự.

Kỹ thuật này đã thay thế kỹ thuật RFLP vì những lý do sau:

1. Độ nhạy và tính đặc hiệu cao

2. Tiết kiệm thời gian và dễ dàng trong công tác giám định



3. Có thể xác định được đối với cả những mẫu có số lượng ít, chất lượng bị

suy giảm

4. Có thể đồng thời xác định được nhiều locus khác nhau và tự động hóa

được quy trình phân tích

Thành phần và điều kiện PCR bao gồm:

Đoạn DNA khuôn

Đó là các đoạn DNA sau tách chiết từ các mẫu xét nghiệm. DNA mạch đơn

hay mạch đôi đều có thể sử dụng được trong phản ứng PCR. Nguồn DNA khuôn có

thể được lấy từ các mô hoặc các tổ chức khác nhau của cơ thể., hàm lượng DNA

nhân thu được sau tách cũng khác nhau tùy thuộc vào từng mô, tổ chức cụ thể.

Bảng 2.1. Hàm lượng DNA trong các loại mô khác nhau [25]

Dạng mẫu Hàm lượng DNA/ số lượng mẫu

Nhung mao màng đệm (phôi) 1-3 µg/ 5 mg

Mẫu dịch âm đạo sau khi giao hợp 10 – 3000 ng/mẫu

Tế bào niêm mạc miệng 0.5 – 1 µg/ 1 lần súc miệng

Tóc bị đứt còn chân 1 – 750 ng/ chân tóc

Tóc rụng còn chân 1 – 10 ng/ chân tóc

Máu toàn phần 20000 – 40000 ng/ml

Vết máu 250 – 500 ng/cm2

Tinh dịch 150000 – 300000 ng/ml

Nước bọt 1000 – 10000 ng/ml

Nước tiểu 1 – 20 ng/mg

Xương 3 – 10 ng/mg

Mảnh tổ chức 50 – 500 ng/mg

Một phản ứng PCR thông thường sử dụng lượng DNA khuôn trong khoảng

từ 10ng đến 1µg

Mồi (primer)

Mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn dài 15 – 30bp có trình tự bổ

sung với trình tự bazơ của hai đầu đoạn (locus) DNA để khởi đầu quá trình tổng



hợp DNA. Mồi được thiết kế để chỉ gắn vào vị trí duy nhất trên DNA. Mồi càng dài

thì khả năng tổng hợp chính xác đoạn DNA đích càng lớn.

Các nucleotide (dNTPs)

dNTPs là nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. Chúng gồm hỗn hợp của

bốn loại nu dATP, dTTP, dCTP và dGTP. Ngoài bốn loại nêu trên người ta có thể

sử dụng một số nucleotide được gắn thêm biotin hoặc dioxygenin tùy theo mục đích

sử dụng và nghiên cứu. Nồng độ dNTPs thường dùng cho phản ứng PCR cơ bản từ

10 - 200µM cho mỗi loại nucleotide.

Taq – DNA polymerase

Taq-DNA polymerase là enzyme chịu nhiệt được chiết xuất từ vi khuẩn suối

nước nóng có tên khoa học là Thermus aquaticus. Đặc điểm nổi bật của loại enzyme

này là không bị bất hoạt ở nhiệt độ cao và có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp

DNA. Taq-DNA polymerase có trọng lượng phân tử 94kDa, có hoạt tính 5’-3’

exonuclease và hoạt động tốt nhất ở 70 – 80oC. Tốc độ tổng hợp trung bình đạt 75

nucleotide trong 1 giây. Nồng độ Taq- DNA polymerase trong phản ứng PCR cơ

bản là 1 – 1.5UI.

Dung dịch đệm (buffer)

Thành phần dung dịch đệm thay đổi tùy theo loại enzyme được sử dụng

trong phản ứng PCR, nhưng quan trọng nhất là ion Mg2+. Bởi vì, ion Mg2+ rất cần

thiết cho quá trình liên kết các dNTPs và hoạt tính enzyme Taq-DNA polymerase.

Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng PCR cơ bản thay đổi từ 0.5 – 5.0mM.

Một quá trình PCR đặc trưng bao gồm một số chu kỳ để nhân bội một trình tự

DNA đặc hiệu. Trước chu kỳ đầu tiên thường có một bước khởi động nóng ở 94oC

trong vòng 4 – 5 phút để làm biến tính hoàn toàn DNA khuôn. Mỗi chu kỳ gồm 3

bước lặp lại sau:

1. Bước 1 (biến tính): DNA sợi khuôn được biến tính ở nhiệt độ 94 – 95oC

trong khoảng 30 giây – 1 phút. Khi đó các liên kết Hydro trong phân tử bị bẻ gãy và

DNA sợi kép bị tách thành hai sợi đơn.



2. Bước 2 (gắn mồi): Mồi là các đoạn oligonucleotide dài từ 15 – 30 nucluotide

có trình tự bổ sung với DNA khuôn. Nhiệt độ gắn mồi khoảng 40 – 70oC (tùy

thuộc Tm của mồi) và kéo dài khoảng 1 phút.

3.Bước 3 (kéo dài chuỗi): Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC là nhiệt độ thích hợp

để cho DNA polymerase kéo dài chuỗi. Thời gian phản ứng tùy thuộc độ dài của

đoạn DNA cần nhân bản, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút.

Sau khi thu được các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn, chúng tôi tiến hành phản ứng

PCR khuếch đại các mẫu bằng bộ kit AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification

Kit. Đây là bộ kit đặc hiệu nhân cùng lúc 15 locus STR và 1 marker giới tính, thành

phần của mỗi một phản ứng theo gồm có:

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR

Thành phần Thể tích

AmpFlSTR PCR Reaction Mix 5,25 µl

AmpliTaq Gold DNA Polymarase 0,25 µl

AmpFlSTR Identifiler Primer Set 2,75 µl

Mẫu -

Nước -

Tổng 12,5 µl

Hỗn hợp phản ứng được chạy trên máy PCR 9700 với chu trình nhiệt như sau:

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

95oC 11 phút 1 chu kỳ

94oC 1 phút

28 chu kỳ 59oC 1 phút

72oC 1 phút

60oC 60 phút 1 chu kỳ

4oC ∞ 1 chu kỳ



2.2.4. Phương pháp điện di huỳnh quang

Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định kiểu gen của

các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp điện di huỳnh quang (hay còn gọi là điện di

mao quản) trên máy giải trình tự gen 3130XL của hãng Applied Biosystems. Các

cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sau

quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chất nhuộm huỳnh quang tương

ứng. Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang.

Màu xanh (blue), xanh lá cây (green), vàng (yellow), đỏ (red) và cam (orange)

tương ứng với các dye 6-FAM, VIC, NED, PET và LIZ. Nguyên tắc của kỹ thuật

dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chất nhuộm màu huỳnh quang. Các hạt

huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở

mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng

để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó.

Bảng 2.3. Đặc điểm của các chất nhuộm màu huỳnh quang sử dụng trong bộ kit Identifiler

Dye Chemical name Excitation

Maximum nm

Emission

Maximum nm

6-FAM 6-carboxy fluorescein 493 522

VIC Proprietary to Applied Biosystems 538 554

NED Proprietary to Applied Biosystems 546 575

PET Proprietary to Applied Biosystems 558 595

LIZ Proprietary to Applied Biosystems 638 655

Các dye VIC, NED, PET, LIZ là các dye được đăng ký độc quyền của hãng

Applied Biosystems.



Hình 2.5. Các dye trong kỹ thuật điện di huỳnh quang 5 màu

Với kỹ thuật điện di huỳnh quang 5 màu, các băng có kích thước tương tự

nhau được chia ra ở các màu khác nhau vì vậy có thể dễ dàng xác định được kích

thước chính xác của từng locus sau quá trình hiện băng. Các băng màu xanh (blue)

gồm các locus D8S1179, D21S11, D7S820 và CSF1PO phát xạ mạnh nhất ở bước

sóng 522nm. Băng màu xanh (green) gồm các locus D3S1358, TH01, D13S317,

D16S539 và D2S1338 phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 554nm. Băng màu vàng gồm

các locus D19S433, vWA, TPOX và D18S51 phát xạ mạnh nhất ở bước sóng

575nm. Băng màu đỏ gồm 2 locus D5S818, FGA và một marker giới tính

Amelogenin được đo ở bước sóng 595nm. Còn lại các băng màu cam là đại diện

cho thang alen chuẩn phát xạ mạnh nhất ở bước sóng 655nm.

Hình 2.6. Các locus tương ứng với các màu trong kỹ thuật điện di huỳnh quang



Sau quá trình điện di, các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm

Genemapper ID 3.2 để xác định các alen của mỗi locus.

Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Ngoài các mẫu nghiên cứu, chúng tôi chuẩn

bị thêm hỗn hợp phản ứng cho thang alen chuẩn. Thành phần và tỷ lệ thể tích từng

hỗn hợp phản ứng như sau:

Thành phần Thể tích

Hi-DiTM Formamide 8,7 µl

GeneScan™ 500 LIZ® 0,3 µl

Mẫu (Thang alen) 1,5 µl

Tổng 10,5 µl

Hỗn hợp phản ứng được biến tính trên máy PCR 9700 ở 95oC trong vòng 4 –

5 phút, sau đó lấy ra và ủ ngay vào đá lạnh trong 3 phút. Quá trình biến tính và làm

lạnh đột ngột này đảm bảo hầu hết DNA từ dạng mạch đôi sẽ chuyển sang dạng

mạch đơn hoàn toàn.

2.2.5. Phương pháp phân tích và tính tần suất alen

2.2.5.1. Phương pháp phân tích alen

Sau quá trình điện di huỳnh quang, chúng tôi thu được các băng DNA khác

nhau. Để xác định chính xác kiểu gen của mỗi locus chúng tôi tiến hành so sánh

băng thu được với băng chuẩn của thang alen AmpFlSTR Identifiler™ Allelic

Ladder . Thang alen chuẩn này chứa toàn bộ các alen chuẩn của từng locus như trên

hình 11.



Hình 2.7. Các alen trong thang alen chuẩn AmpFlSTR Identifiler™ Allelic Ladder

Có 3 trường hợp sau:

1. Nếu locus nghiên cứu thu được hai băng khác nhau thì kiểu gen của locus đó

là dị hợp tử

2. Nếu locus nghiên cứu thu được một băng duy nhất thì kiểu gen của locus đó

là đồng hợp tử

3. Trường hợp băng thu được không có trong thang alen chuẩn, có thể đó là

alen hiếm gặp trong quần thể. Khi đó việc xác định kiểu gen của locus sẽ dựa

vào kích thước băng thu được, các alen hiếm sẽ được gọi tên theo kích thước

của chúng.

2.2.5.2. Phương pháp tính tần suất alen

Sau khi thu được kiểu gen của từng locus, chúng tôi tiến hành tính toán tần

suất alen, tần số dị hợp tử thực tế, tần số dị hợp tử lý thuyết và khả năng phân biệt

của từng locus theo các công thức sau:

Tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity)



Tần số dị hợp tử quan sát H(ob) là tổng tần số các kiểu gen dị hợp tử quan sát

được trong toàn bộ mẫu nghiên cứu. Tần số này được tính theo công thức:

H(ob) = Số cá thể dị hợp tử

Tổng số cá thể quan sát

Tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity)

Tần số dị hợp tử lý thuyết H(ex) được tính theo công thức:

H(ex) = 1 - åi=1

k P2

i

Trong đó: k là tổng số alen nghiên cứu

Pi là tần số của alen thứ i trong k alen

Khả năng phân biệt (Power of Discrimination)

Khả năng phân biệt Pd được tính theo công thức:

Pd = 1 – Pi

Trong đó: Pi là khả năng trùng lặp (Power of Inclusion), nghĩa là khả năng nếu

2 cá thể được chọn một cách ngẫu nhiên trong quần thể sẽ có cùng một kiểu gen. Pi

được tính bằng tổng bình phương tần số các kiểu gen theo lý thuyết trong quần thể.

Ví dụ: Quần thể A có tần số các kiểu gen như sau:

Genotype Expected Frenquency

AA 0.053

AB 0.136

AC 0.218

BB 0.087

BC 0.280

CC 0.226

Xác xuất để hai cá thể được lấy ngẫu nhiên từ quần thể A có kiểu gen giống

nhau là:



Pi = (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AA)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AB)2

+ (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AC)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của BB)2 +

(Tần suất dị hợp tử lý thuyết của AC)2 + (Tần suất dị hợp tử lý thuyết của CC)2

= (0,053)2 + (0,136)2 + (0,218)2 + (0,087)2 + (0,280)2 + (0,226)2 = 0,206

Khả năng phân biệt: Pd = 1 - Pi = 1 – 0,206 = 0,794

Tần số Pi càng thấp thì tần số Pd càng cao, chứng tỏ khả năng phân biệt các cá

thể khác nhau trong quần thể càng lớn.



CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Với mục đích nghiên cứu đa hình các locus STR ở người Việt Nam, chúng

tôi tiến hành thu mẫu và tách DNA của 402 mẫu nghiên cứu, trong đó có 350 mẫu

máu khô được bảo quản bằng thẻ thu mẫu FTA card, 10 mẫu niêm mạc miệng, 10

mẫu nước bọt, 8 mẫu tóc, 8 mẫu xương, 5 mẫu móng tay, còn lại là 21 mẫu máu

tổng số thu trực tiếp từ đối tượng. Với mỗi một loại mẫu khác nhau, chúng tôi sử

dụng các phương pháp tách chiết DNA khác nhau, phù hợp với từng đối tượng cụ

thể. Sau khi thu được DNA, chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch của DNA

bằng cách đo nồng độ DNA trên máy Nanodrop, các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn được

dùng làm khuôn cho phản ứng PCR multiplex nhân đồng thời 16 locus STR bằng

bộ kít AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit. Sản phẩm sau PCR tiếp tục

phân tích bằng phương pháp điện di huỳnh quang trên máy 3130xl. Các kết quả

cuối cùng được thu nhận và xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2.

Bằng cách áp dụng các phương pháp đã trình bày ở chương 2, chúng tôi thu

được một số kết quả sau:

3.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu nghiên cứu

Hầu hết các nghiên cứu sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc tách chiết và

tinh sạch một lượng DNA đủ lớn và ở trạng thái tương đối nguyên vẹn. Trong quá

trình tách chiết các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do các tác nhân cơ

học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát

ra môi trường khi phá vỡ màng tế bào). Vì vậy việc lựa chọn một phương pháp tách

chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng.

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi phân tích một lượng mẫu khá lớn, các mẫu

được lấy từ nhiều nguồn khác nhau (mẫu máu, niêm mạc, chân tóc…) vì vậy để đạt

hiệu quả cao nhất, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA bằng nhiều phương pháp

khác nhau. Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng, phù hợp với từng

loại mẫu, từng loại đối tượng cụ thể.

Sau khi tách chiết thành công DNA, nồng độ của dung dịch axit nucleic được

xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260nm (A260) tương đương với



nồng độ 50µg/ml của DNA. Nếu giá trị hấp thụ bước sóng 280nm (A280) được xác

định là bước sóng ở đó có các protein có mức hấp thụ cao nhất, thì tỷ số A260/A280 là

chỉ số cho thấy độ nhiễm của các chất như phenol hoặc protein. Tỷ lệ A260/A280 là

1,8 - 2,0 là DNA đạt độ tinh khiết theo tiêu chuẩn quốc tế (Lê Đình Lương, 2004).

3.1.1. Phương pháp tách chiết bằng Chelex

Phương pháp tách bằng Chelex 100 resin là phương pháp đơn giản, có hiệu

quả cao và được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm giám định gen. Chúng

tôi sử dụng phương pháp này để tách toàn bộ 350 mẫu máu khô trên thẻ FTA. Ưu

điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, ít bước vì vậy rút ngắn được thời

gian tách mẫu cũng như hạn chế được tối đa các chất ức chế hoặc sai sót trong quá

trình thao tác. Những ion kim loại trong chelex 100 đóng vai trò xúc tác trong quá

trình phá vỡ màng tế bào và làm biến tính DNA trong dung dịch có nồng độ ion

thấp ở nhiệt độ cao. Ngoài ra chelex 100 còn có tác dụng bảo vệ mẫu ở nhiệt độ cao,

nếu không có sự có mặt của chelex 100 thì các DNA khi được đun sôi ở nhiệt độ

100oC sẽ bị bất hoạt trong phản ứng PCR. Sauk hi tách được DNA chúng tôi tiến

hành kiểm tra nồng độ trên máy đo quang phổ, DNA thu được đều đảm bảo nồng độ

và độ sạch cho các công đoạn tiếp theo.

Hình 3.1. Ảnh kiểm tra nồng độ DNA tách bằng Chelex 100 trên máy quang phổ

3.1.2. Phương pháp tách DNA bằng PrepFilerTM Forensic DNA Extraction Kit

Phương pháp tách DNA bằng bộ kít PrepFilerTM Forensic DNA Extraction

Kit có ưu điểm nổi bật là khả năng tách tốt DNA từ các mẫu khó như mẫu máu trên



vải, mẫu răng, mẫu kẹo cao su…Chúng tôi sử dụng phương pháp này để tách 13

mẫu móng tay khác nhau. Các mẫu này có hàm lượng DNA thấp và thường chứa

nhiều tạp chất cũng như các chất ức chế khác. Nguyên tắc của phương pháp này dựa

trên sự bám dính của các hạt DNA vào hạt từ tĩnh điện. Ban đầu, các mẫu được ủ

với dung dịch lysis có tác dụng phá vỡ màng tế bào, giải phóng DNA vào môi

trường. Bổ sung thêm một lượng hạt từ vào dung dịch, các phân tử DNA sẽ bám

vào hạt từ. Hỗn hợp phản ứng sau đó được đưa vào một giá từ trường có tác dụng

làm cho các hạt từ có bám DNA tập trung tại một vị trí cố định trên ống nghiệm.

Tiếp theo là bước loại bỏ các chất ức chế PCR ra khỏi dung dịch. Cuối cùng là bước

rửa và tinh sạch DNA. Phương pháp này cho hiệu quả tách DNA rất cao và loại

được hầu hết các chất ức chế vì vậy nó được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực Khoa

học Hình sự, đặc biệt là để phân tích các mẫu thu được ở hiện trường vụ án có hàm

lượng DNA thấp. Một đặc điểm nổi bật nữa của phương pháp này là khả năng tự

động hóa, toàn bộ quá trình tách chiết từ sau bước lysis có thể được thực hiện tự

động hoàn toàn bằng robot cho khả năng tách chiết nhiều mẫu khác nhau cùng một

lúc, có ý nghĩa trong công tác xây dựng tàng thư gen. Sản phẩm thu được chúng tôi

tiến hành kiểm tra nồng độ bằng cách đo nồng độ DNA trên máy quang phổ.

Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra nồng độ DNA của 8 mẫu nghiên cứu được tách bằng bộ

PrepFilerTM Forensic DNA Extraction Kit

Mẫu Nồng độ DNA

(ng/µL) A260/A280 Mẫu

Nồng độ DNA (ng/µL)

A260/A280

1 17,42 1,82 5 15,51 2,0

2 25,62 1,80 6 14,1 1,91

3 19,49 1,87 7 20,98 1,95

4 21,02 1,98 8 15,32 2,0

Nồng độ DNA chúng tôi thu được nằm trong khoảng từ 14,1 đến 25,62 ng/µl

và tỷ lệ A260/A280 từ 1,80 đến 2,0. Như vậy có thể khẳng định các DNA chúng tôi

thu được đều đạt tiêu chuẩn để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.



3.1.3. Phương pháp tách DNA QIAamp® DNA Investigator Kit

Phương pháp tách DNA bằng bộ kít QIAamp® DNA Investigator Kit cũng có

nhiều điểm tương đồng với phương pháp tách bằng PrepFilerTM ở khả năng tách các

mẫu khó và hiệu quả tách DNA rất cao. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp này để

tách 10 mẫu niêm mạc miệng, 10 mẫu nước bọt và 21 mẫu máu tổng số thu được từ

các đối tượng nghiên cứu. Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự bám DNA

vào màng MinElute®. Ban đầu, các mẫu cũng phải trải qua quá trình lyse để phá vỡ

màng tế bào, giải phóng DNA vào môi trường. Sau đó, tiến hành thêm một dung

dịch có tác dụng tủa DNA và chuyển toàn bộ hỗn hợp này lên một ống gọi là

MinElute® Column. Ống này có một màng Membrane ở phía dưới có tác dụng thu

giữ DNA và một lỗ ở đáy cho các chất khác đi qua trong quá trình ly tâm. DNA

bám trên màng sau đó được rửa sạch và thu lại bằng nước hoặc TE. Phương pháp

này cũng có thể được tự động hóa trên hệ thống QIAcube của hãng QIAGEN®.

Đối với mẫu máu, do hàm lượng DNA lớn nên khi tách xong chúng tôi tiến

hành kiểm tra nồng độ DNA bằng cách điện di trên gel Agarose 0.8%. Sản phẩm

điện di được ngâm trong dung dịch EtBr 10 µg/ml trong khoảng 10 – 15 phút, sau

đó được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm.

Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra DNA trên gel Agarose 0.8% với các mẫu máu tổng số tách

bằng QIAamp® DNA Investigator Kit

Theo hình 3.2 chúng tôi thấy các băng DNA thu được đều sáng tập trung và

tương đối rõ nét cho thấy nồng độ DNA thu được tương đối cao và ít bị phân hủy.

Vị trí các giếng tra mẫu không có vệt sáng trắng chứng tỏ protein đã được loại hầu

như hoàn toàn khỏi dung dịch DNA tổng số. Như vậy có thế đánh giá DNA thu

được đạt tiêu chuẩn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.



3.1.4. Phương pháp tách chiết bằng hạt từ tính

Phương pháp tách chiết bằng hạt từ tính cũng tương tự như phương pháp

tách chiết bằng PrepFiler. Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào ái lực cao của

phức hợp hạt từ tính (tích điện dương) và DNA (tích điện âm) để tách DNA ra khỏi

các tạp chất khác. Đây là phương pháp đơn giản và có hiệu quả cao với các mẫu

chân tóc, chúng tôi sử dụng phương pháp này để thu DNA từ 8 mẫu chân tóc khác

nhau. Các kết quả thu được đều đạt tiêu chuẩn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo

như thể hiện trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch DNA được tách chiết từ 8 mẫu chân tóc

bằng hạt từ tính

Mẫu Nồng độ DNA

(µg/µL) A260/A280 Mẫu

Nồng độ DNA

(µg/µL) A260/A280

1 10,25 1,86 5 14,07 1,91

2 7,90 2,0 6 11,06 1,82

3 8,24 1,89 7 11,58 1,87

4 15,6 1,97 8 10,86 1,93

Từ các kết quả thu được có thể thấy các mẫu DNA chúng tôi tách và tinh

sạch đạt tiêu chuẩn để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo. Với các mẫu đơn

giản như mẫu máu khô trên thẻ FTA card nên sử dụng phương pháp tách chiết bằng

Chelex vì phương pháp này đơn giản, hiệu quả cao mà lại tiết kiệm được chi phí.

Các mẫu có hàm lượng DNA thấp hơn như mẫu xương, mẫu tóc, móng tay hoặc các

mẫu niêm mạc miệng hay các dịch cơ thể khác thì nên sử dụng các phương pháp

tách chiết bằng hạt từ tính hoặc sử dụng các kit tách PrepFilerTM Forensic DNA

Extraction Kit và QIAamp® DNA Investigator Kit sẽ cho hiệu quả tách chiết cao

hơn.

Đối với phương pháp tách chiết bằng Chelex, DNA thu được ở dạng mạch

đơn vì vậy chỉ có ứng dụng trong các xét nghiệm dựa trên phản ứng PCR.



3.2. Xác định kiểu gen của các locus STR

Sau khi thu được các mẫu DNA đạt tiêu chuẩn, chúng tôi tiến hành phản ứng

nhân gen để xác định đa hình các locus STR nghiên cứu. Để nghiên cứu đồng thời

các locus, chúng tôi sử dụng bộ kít nhân gen AmpFlSTR® Identifiler® PCR

Amplification Kit của hãng Applied Biosystems. Đặc điểm của bộ kít này là nhân

đồng thời 15 locus STR và một marker chỉ thị giới tính, sau đó xác định kiểu gen

của từng locus thông qua thang alen chuẩn AmpFlSTR® IdentifilerTM Allelic

Ladder. Thang alen này có chứa hầu hết các alen phổ biến cho từng locus. Các kiểu

gen được xác định bằng cách so sánh kích thước băng thu được của mẫu phân tích

với kích thước tương ứng của thang alen. Mỗi thang alen đặc trưng cho từng locus ở

từng dye khác nhau.

Hình 3.3. Ảnh điện di thang alen ứng với các locus D8S1179, D21S11, D7S820 và

CSF1PO (Dye 6-FAM)



Hình 3.4. Ảnh điện di thang alen ứng với các locus D3S1358, TH01, D13S317, D16S539

và D2S1338 (Dye VIC)

Hình 3.5. Ảnh điện di thang alen ứng với các locus D19S433, vWA, TPOX và D18S51

(Dye NED)



Hình 3.6. Ảnh điện di thang alen ứng với các locus Amelogenin, D5S818 và FGA (Dye

PET)

Đối với các mẫu nghiên cứu, sau khi chạy điện đi kết quả thu được sẽ được

xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2. Phần mềm này sẽ so sánh kích thước các

băng DNA thu được ở mẫu nghiên cứu với các băng tương ứng trên thang alen

chuẩn và cho ra kết quả chi tiết về kiểu gen của từng locus như minh họa ở hình 3.7.



Hình 3.7. Kiểu gen của 16 locus STR (mẫu HN00254)

Các locus có kiểu gen dị hợp tử sẽ thu được hai băng có kích thước khác

nhau, còn locus đồng hợp tử thì thu được một băng duy nhất. Nhìn vào hình 3.7

chúng ta có thể thấy được kiểu gen của mẫu HN00254 là:

Bảng 3.3. Kiểu gen của 16 Locus STR (mẫu HN00254)

Locus Kiểu gen

Locus Kiểu gen

Alen 1 Alen 2 Alen 1 Alen 2 D8S1179 11 12 D2S1338 18 22 D21S11 30 33.2 D19S433 13 13 D7S820 10 11 vWA 16 18 CSF1PO 10 12 TPOX 8 12 D3S1358 15 18 D18S51 16 17 TH01 7 7 AM. X Y D13S317 12 13 D5S818 10 11 D16S539 12 13 FGA 21 22

Tiến hành tương tự với toàn bộ mẫu nghiên cứu, chúng tôi thu được kiểu gen

của 402 mẫu nghiên cứu chi tiết như trong bảng phụ lục 5 và 6 của luận văn này.



Tần suất xuất hiện của các alen trong toàn bộ mẫu nghiên cứu được thể hiện cụ thể

như trong bảng 10 (mỗi locus gồm 804 alen).

Bảng 3.4. Tần suất xuất hiện các alen trong quần thể nghiên cứu

Locus D8S 1179

D21 S11

D7S 820

CSF 1PO

D3S 1358

TH 01

D13S 317

D16S 539

D21S 1338

D19S 433 vWA TPOX D18

S51 D5S 818 FGA

Alen 1 - - - - - - - 1 - - - - - - - 2 - - - - 1 - - - - - - - - - - 3 - - - - - 1 - - - - - - - - - 4 - - - - - 3 - - - - - - - - - 5 - - 1 - - - - 1 - - - - - - - 6 - - 2 - - 104 - - - - - 9 - 1 - 7 1 - 19 9 2 258 2 - 1 - - 30 - 40 - 8 12 - 122 2 - 51 286 15 - - - 396 - 3 -

8,3 - - - - - 1 - - - - - - - - - 9 12 - 54 19 - 277 111 181 - 11 1 86 3 53 -

9,3 - - - - - 28 - - - - - - - - - 10 129 - 154 180 - 67 106 132 1 5 - 33 1 172 -

10,2 - - - - - - - - - - - - 1 - - 11 122 - 281 210 - 9 154 193 - 13 - 206 5 213 -

11,2 - - - - - - - - - 3 - - 1 - - 12 103 - 149 323 2 - 113 188 - 57 2 41 37 191 -

12,2 - - - - - - - - - 9 - - - - - 13 130 - 19 45 5 3 25 70 - 198 19 2 123 119 -

13,2 - - - - - - - - 1 38 - - 9 - - 13,3 - - - - - 2 - - - - - - - - - 14 117 - 3 12 42 - 6 21 2 186 199 - 152 8 -

14,2 - - - - - - - - - 84 - - 13 - - 15 114 - - 3 237 - 1 2 5 49 34 - 149 2 -

15,2 - - - - - - - - - 107 - - - - - 16 49 - - 1 256 - - - 17 12 137 - 117 - -

16,2 - - - - - - - - - 29 - - 2 - - 17 13 - - - 211 - - - 88 - 174 - 55 - 1

17,2 - - - - - - - - - 2 - - 2 - 2 18 1 - - - 43 - - - 54 - 150 1 36 - 21

18,2 - - - - - - - - - - - - 2 - - 19 1 1 - - 4 - - - 163 1 64 - 21 - 81

19,2 - - - - - - - - - - - - - - 1 20 - 1 - - 1 - - - 76 - 19 - 23 - 45 21 - - - - - - - - 48 - - - 15 - 118

21,2 - - - - - - - - - - - - - - 5 22 - - - - - - - - 45 - 3 - 8 - 147

22,2 - - - - - - - - - - - - - - 6 23 - - - - - - - - 136 - 2 - 7 2 124

23,2 - - - - - - - - - - - - - - 9 24 - 1 - - - - - - 111 - - - 3 - 112

24,2 - - - - - - - - - - - - - - 11 25 - - - - - - - - 49 - - - 3 - 59

25,2 - - - - - - - - - - - - - - 6 26 - 1 - - - - - - 6 - - - 16 - 37

26,2 - 1 - - - - - - - - - - - - 2 27 - 7 - - - - - - - - - - - - 6



28 - 47 - - - - - - - - - - - - 5 28,2 - 8 - - - - - - - - - - - - - 29 - 183 - - - - - - 1 - - - - - -

29,2 - 3 - - - - - - - - - - - - - 30 - 219 - - - - - - - - - - - - 1

30,2 - 15 - - - - - - - - - - - - - 31 - 53 - - - - - - - - - - - - -

31,2 - 71 - - - - - - - - - - - - - 32 - 22 - - - - - - - - - - - - -

32,2 - 119 - - - - - - - - - - - - - 32,3 - 1 - - - - - - - - - - - - - 33 - 5 - - - - - - - - - - - - -

33,2 - 37 - - - - - - - - - - - - - 34 - 3 - - - - - - - - - - - - -

34,2 - 5 - - - - - - - - - - - - - 35,2 - - - - - - - - - - - - - - - 37 - 1 - - - - - - - - - - - - -

42,2 - - - - - - - - - - - - - - 2 48,2 - - - - - - - - - - - - - - 2

Sau khi thu được bảng số liệu thô gồm kiểu gen các alen của từng locus,

chúng tôi tiến hành tính toán các chỉ số di truyền đặc trưng cho quần thể mẫu

nghiên cứu. Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm chủ yếu đến

ba chỉ số là tần suất dị hợp tử quan sát, tần suất dị hợp tử lý thuyết và khả năng phân

biệt của từng locus.

3.3. So sánh tần suất tương đối của các alen trong nghiên cứu của chúng tôi với

một số nghiên cứu khác nhau

Sau khi thu được bảng số liệu thô kiểu gen của các mẫu nghiên cứu, áp dụng

các phương pháp đã trình bày ở trên, chúng tôi tiến hành tính toán các chỉ số di

truyền đặc trưng là tần suất dị hợp tử quan sát, tần suất dị hợp tử lý thuyết và khả

năng phân biệt của từng locus. Khả năng phân biệt có ý nghĩa quan trọng, là cơ sở

để tính toán độ tin cậy trong công tác giám định pháp y, khoa học hình sự. Khả

năng phân biệt càng cao chứng tỏ độ tin cậy của phương pháp sử dụng càng lớn và

ngược lại. Chúng tôi tiến hành so sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi trên quần

thể người nghiên cứu với các kết quả nghiên cứu của các tác giả khác trên bốn quần

thể khác nhau là người Thái Lan, Hàn Quốc, Tây Ban Nha và Uganda. Tất cả các

nghiên cứu này đều sử dụng bộ AmpFlSTR® Identifiler® PCR Amplification Kit để



phân tích và tính toán tần suất alen tương tự như trong nghiên cứu của chúng tôi.

Kết quả cụ thể như sau:

3.3.1. Locus D8S1179

Bảng 3.5. Tần suất alen của locus D8S1179 trong nghiên cứu của chúng tôi và một số

nước trên thế giới

N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda

Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218)

7(*) 0,12

8 1,49 1,5

9 1,49 0,2 1,6 1,8

10 16,04 14,8 15,2 11,1 1,2

11 15,17 11,7 8,4 8,4 4,8

12 12,81 12,6 18 11,9 15,4

13 16,17 16,7 21,9 28,3 18,1

14 14,55 16,9 16 22,4 31,4

15 14,18 16,7 14,1 12,3 18,1

16 6,09 8,3 4,5 2,5 6,6

17 1,62 1,7 1,7 1,8

18 0,12 0,7 0,5

19 0,12 0,2

H(ob) 0,9415 0,8571 0,8400 0,8060 0,8260

H(ex) 0,8630 0,8593 0,8400 0,4260 0,8060

Pd 0,9655 0,9610 0,9540 0,9310 0,9310

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus D8S1179 có 12 alen khác nhau. Chúng tôi đã

phát hiện được tất cả các alen này trong quần thể nghiên cứu, các quần thể so sánh

không có quần thể nào xuất hiện đầy đủ các alen. Ngoài ra, chúng tôi cũng thấy xuất

hiện thêm một alen hiếm là alen số 7 với tần suất xuất hiện là 0,12%. Alen này

không có trong thang alen chuẩn và cũng không thấy xuất hiện trong các nghiên cứu

khác. Có thể đây là một alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt.



3.3.2. Locus D21S11

Bảng 3.6. Tần suất alen của locus D21S11 trong nghiên cứu của chúng tôi và một số nước

trên thế giới

N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 19(*) 0,12 20(*) 0,12 24 0,12 24,2 0,4 24,3(*) 0,5 25 0,2 26 0,12 0,2 26,2(*) 0,12 27 0,87 0,5 2,2 3,2 28 5,85 6,4 3,7 13,1 21,1 28,2 1,00 0,9 29 22,76 25,0 25,1 23,6 24,8 29,2 0,37 0,1 30 27,24 25,2 37,4 27,0 23,4 30,2 1,87 4,8 0,4 3,1 31 6,59 7,9 9,7 5,8 5,5 31,2 8,83 7,1 7,1 9,2 3,7 32 2,74 2,6 2,4 0,7 2,0 32,2 14,80 12,4 7,6 8,9 3,4 33 0,62 0,6 0,2 0,5 33,2 4,6 6,4 4,1 4,7 3,9 34 0,37 0,2 1,2 34,2 0,62 1,7 0,4 0,6 2,1 35 0,2 3,7 35,2 0,2 36 0,2 37 0,12 0,7 38 H(ob) 0,9092 0,8238 0,8230 0,8430 0,8170 H(ex) 0,8330 0,8377 0,7750 0,9320 0,8310 Pd 0,9531 0,9500 0,9170 0,9490 0,9460

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus D21S11 có 24 alen khác nhau. Trong đó có sáu

alen không thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi đó là các alen số 24,2, 25,

35, 35,2, 36 và 38. Alen 38 không thấy xuất hiện trong cả năm nghiên cứu so sánh,



có thể đây là một alen hiếm gặp ở locus D21S11. Chúng tôi cũng phát hiện được ba

alen hiếm là alen 19, 20 và 26,2 với tần suất xuất hiện đều là 0,12%. Các alen hiếm

này không có trong thang alen tiêu chuẩn và cũng không thấy xuất hiện trong các

nghiên cứu khác, có thể đây là các alen đặc trưng riêng của người Việt. Alen 30 có

tần suất xuất hiện cao nhất (27,24%), có thể đây là alen phổ biến trong quần thể

người Việt.

Ở quần thể người Uganda xuất hiện một alen hiếm là alen 24,3 với tần suất

xuất hiện là 0,5%. Alen này không thấy xuất hiện trong các quần thể so sánh khác vì

thế đây có thể là alen đặc trưng riêng của quần thể người Uganda.

3.3.3. Locus D7S820

Bảng 3.7. Tần suất alen của locus D7S820 trong nghiên cứu của chúng tôi và một số nước

trên thế giới

N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 5(*) 0,12 6 0,25 6,3(*) 0,2 7 2,36 1,0 0,2 2,1 2,5 8 15,17 16,2 11,9 14,4 24,5 9 6,72 5,5 3,7 14,0 10,6 9,2(*) 0,2 9,3(*) 0,2 10 19,15 19,3 15,2 29,5 29,4 11 34,95 33,8 40 18,4 20,4 12 18,53 20,5 21,9 18,2 10,6 13 2,36 3,6 6,5 3,2 1,6 14 0,37 0,2 0,6 15 H(ob) 0,8806 0,7857 0,7270 0,8150 0,8260 H(ex) 0,7781 0,7778 0,7510 0,8060 0,7910 Pd 0,9197 0,9170 0,9030 0,9310 0,9140

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus D7S820 có 10 alen khác nhau. Trong nghiên

cứu của chúng tôi thấy xuất hiện chín alen tiêu chuẩn và một alen hiếm là alen 5 với

tần suất xuất hiện là 0,12%. Alen này không có trong thang alen chuẩn và không



thấy xuất hiện trong các nghiên cứu khác, có thể đây là alen đặc trưng riêng của

quần thể người Việt. Alen 15 không thấy xuất hiện trong toàn bộ mẫu nghiên cứu.

và cả trong các nghiên cứu so sánh khác, có thể đây là một trong những alen hiếm

gặp ở locus D7S820. Alen 11 có tần suất xuất hiện cao nhất (34,95%), có thể đây là

alen phổ biến trong quần thể người Việt.

Quần thể người Tây Ba Nha thấy xuất hiện một alen hiếm là alen 9,2 với tần

suất xuất hiện là 0,2%, quần thể Uganda có hai alen hiếm là alen 6,3 và 9,3 với tần

suất xuất hiện đều bằng 0,2%. Đây có thể là các alen đặc trưng riêng của các quần

thể này. Hai quần thể người Thái Lan và Hàn Quốc không thấy xuất hiện alen hiếm.

3.3.4. Locus CSF1PO

Bảng 3.8. Tần suất alen của locus CSF1PO trong nghiên cứu của chúng tôi và một số


N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 6 0,2 0,2 7 1,12 0,4 4,4 8 0,25 0,2 0,3 3,7 9 2,36 1,9 4,8 1,3 6,9 10 22,39 21,4 24,2 25,6 30,3 11 26,12 29,8 23,6 33,0 17,0 12 40,17 37,6 38,1 32,6 32,1 13 5,60 7,9 7,4 6,1 4,8 14 1,49 1,0 0,9 0,9 0,7 15 0,37 0,2 0,6 16(*) 0,12 H(ob) 0,8545 0,7476 0,7360 0,6130 0,6970 H(ex) 0,7162 0,7191 0,7340 0,7170 0,7680 Pd 0,8721 0,8690 0,8860 0,8690 0,9060

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus CSF1PO có 10 alen khác nhau. Trong nghiên

cứu của chúng tôi không thấy xuất hiện alen số 6, alen này cũng không thấy xuất

hiện ở các quần thể người Thái Lan và Hàn Quốc. Tuy nhiên, ở quần thể nghiên cứu

chúng tôi phát hiện được một alen hiếm là alen số 16 với tần suất xuất hiện là



0,12%. Alen này không có trong thang alen chuẩn và không thấy xuất hiện trong

các nghiên cứu khác, có thể đây là alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt.

Alen số 12 có tần suất xuất hiện cao nhất là 40,17%, trong các quần thể so sánh

khác tần suất alen này cũng cao hơn so với các alen khác, có thể đây là alen phổ

biến trong locus CSF1PO.

3.3.5. Locus D3S1358



N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 2(*) 0,12 7(*) 0,25 11(*) 0,2 12 0,25 0,2 0,2 0,2 13 0,62 0,5 0,6 14 5,22 3,1 3,5 9,6 3,7 15 29,48 28,6 35,1 25,6 28,7 16 31,84 37,6 33,1 26,0 29,4 17 26,24 21,7 18,4 18,1 30,7 18 5,35 7,9 8,9 18,0 6,9 19 0,50 0,7 0,9 1,7 0,2 20(*) 0,12 0,2 H(ob) 0,8619 0,7857 0,6970 0,7750 0,7060 H(ex) 0,7372 0,7244 0,7260 0,6990 0,7330 Pd 0,8840 0,8660 0,8770 0,9250 0,8830

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus D3S1358 có tám alen khác nhau. Các alen này

đều thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi, trong đó các alen 15, 16 và 17

xuất hiện với tần suất cao. Trong các nghiên cứu khác, tuần suất của ba alen này

cũng cao hơn so với các alen khác, có thể đây là các alen phổ biến trong locus

D3S1358. Ở quần thể nghiên cứu, chúng tôi phát hiện được ba alen hiếm là các alen

số 2, 7 và 20 với tần suất xuất hiện tương ứng là 0,12%, 0,25% và 0,12%. Alen 2 và

7 không có trong thang alen chuẩn và không thấy xuất hiện ở các nghiên cứu khác,



đây có thể là alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt. Alen 20 xuất hiện trong

quần thể người Tây Ba Nha với tần suất là 0,2%.

Các quần thể người Thái Lan, Hàn Quốc và Uganda không thấy xuất hiện

thêm alen hiếm nào khác.

3.3.6. Locus TH01

Bảng 3.10. Tần suất alen của locus TH01 trong nghiên cứu của chúng tôi và một số nước

trên thế giới


Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218)

3(*) 0,12

4 0,37

5

6 12,94 10,7 17,3 20,4 17,2

7 32,09 31,0 24,7 18,6 46,3

7,1(*) 0,2

8 6,34 5,2 3,7 12,5 13,8

8,3(*) 0,12

9 34,45 35,5 48,9 21,5 10,1

9,3 3,48 8,1 5,4 26,1 7,6

10 8,33 9,5 0,9 4,6

11 1,12

12(*) 0,2

13(*) 0,37

13,3 0,25

H(ob) 0,8657 0,7952 0,6710 0,7860 0,7520

H(ex) 0,7493 0,7503 0,6690 0,7950 0,7200

Pd 0,9003 0,8930 0,8360 0,9240 0,8890

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus TH01 có 10 alen khác nhau. Trong nghiên cứu

của chúng tôi thấy xuất hiện chín alen, trong đó alen 7 và alen 9 là hai alen có tần

suất xuất hiện cao nhất với tần suất tương ứng là 30,09% và 34,45%. Có thể đây là

hai alen phổ biến trong locus TH01 ở quần thể người Việt. Alen 5 không thấy xuất

hiện trong nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên cứu khác, có thể đây là một alen



hiếm gặp ở locus TH01. Các alen hiếm chúng tôi phát hiện được là alen số 3, 8,3 và

13 với tần suất xuất hiện tương ứng là 0,12%, 0,12% và 0,37%. Các alen này không

có trong thang alen chuẩn và không thấy xuất hiện trong các nghiên cứu khác, có

thể đây là các alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt. Quần thể người Uganda

xuất hiện thêm hai alen hiếm là alen 7,1 và 12 với tần suất xuất hiện đều bằng 0,2%.

Ba quần thể Thái Lan, Hàn Quốc và Tây Ba Nha không thấy xuất hiện alen hiếm

nào khác.

3.3.7. Locus D13S317



N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 7(*) 0,25 0,2 0,2 8 35,57 29,3 22,3 14,7 5,0 9 13,81 16,7 16,5 5,3 2,3 10 13,18 12,9 14,1 5,5 2,3 11 19,15 22,9 23,6 29,4 31,0 12 14,05 13,3 19,9 29,8 42,9 13 3,11 3,8 2,2 11 12,6 14 0,75 1,0 1,3 4,1 3,9 15 0,12 0,2 H(ob) 0,8781 0,7952 0,7880 0,7920 0,6700 H(ex) 0,7795 0,8003 0,8090 0,7850 0,7010 Pd 0,9210 0,9290 0,9340 0,9180 0,8670

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus D13S317 có tám alen khác nhau. Các

alen này đều phát hiện được trong quần thể nghiên cứu, trong đó alen 8 có tần suất

lớn nhất là 35,57%, có thể đây là alen phổ biến trong locus D13S317 ở quần thể

người Việt. Ngoài các alen tiêu chuẩn, chúng tôi phát hiện được thêm một alen

hiếm là alen số 7 với tần suất xuất hiện là 0,25%, alen này cũng thấy xuất hiện ở

quần thể người Thái Lan và Hàn Quốc với tần suất đều bằng 0,2%. Các quần thể

người Tây Ba Nha và Uganda không thấy xuất hiện alen hiếm nào.



3.3.8. Locus D16S539




Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218)

1(*) 0,12

5 0,12 0,2

8 18,7 0,7 2,2 4,4

9 22,51 21,7 30,1 10,5 16,7

10 16,42 17,1 17,7 2,5 12,2

10,1(*) 0,2

11 24 29,8 27,3 26,6 27,3

12 23,38 19,0 17,1 32,5 24,5

13 8,71 10,5 7,6 21,8 11,7

14 2,61 1,2 3,9 2,5

15 0,25 0,2 0,2

25,2(*) 0,2

H(ob) 0,8918 0,8476 0,7580 0,6680 0,7980

H(ex) 0,7989 0,7895 0,7710 0,7640 0,8080

Pd 0,9308 0,9130 0,9090 0,9090 0,9280

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus D16S539 có chín alen khác nhau. Tất cả các

alen này đều thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi, trong đó hai alen 9 và

12 là hai alen có tần suất cao nhất là 22,51% và 23,38%. Có thể đây là hai alen phổ

biến trong locus D16S539 ở quần thể người Việt. Ngoài ra, chúng tôi cũng phát hiện

được một alen hiếm là alen số 1 với tần suất xuất hiện là 0,12%. Alen này không có

trong thang alen chuẩn và không thấy xuất hiện trong các nghiên cứu khác, vì thế

đây có thể là một alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt. Ở quần thể người

Hàn Quốc thấy xuất hiện một alen hiếm là alen 25,2 với tần suất là 0,2%, quần thể



người Uganda thấy xuất hiện alen hiếm là alen 10,1 với tần suất là 0,2%. Hai quần

thể người Thái Lan và Tây Ba Nha không thấy xuất hiện alen hiếm nào.

3.3.9. Locus D2S1338



N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 7(*) 0,12 10(*) 0,12 12(*) 0,2 13,2(*) 0,12 14(*) 0,25 0,2 15 0,62 0,7 16 2,11 2,1 0,6 5,0 2,5 17 10,95 8,6 10,2 27,6 6,9 18 6,72 6,9 14,7 5,6 5,3 19 20,27 22,6 18,2 11,9 22,9 19,2(*) 0,2 20 9,45 13,6 11,3 16,0 11,2 21 5,97 6,2 1,9 3,3 16,5 22 5,60 3,8 2,8 1,9 12,4 23 16,92 16,4 17,5 10,4 10,6 24 13,81 15,0 13,4 9,0 5,7 25 6,09 4,3 6,9 8,3 2,3 26 0,75 0,5 1,5 0,6 2,3 27 0,4 0,5 28 29(*) 0,12 0,2 0,2 H(ob) 0,9266 0,8810 0,8530 0,8310 0,8670 H(ex) 0,8748 0,8633 0,8690 0,8530 0,8700 Pd 0,9717 0,9630 0,9650 0,9630 0,9660

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus D2S1338 có 14 alen khác nhau, trong đó có hai

alen tiêu chuẩn không thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi là alen 27 và

28. Alen 19 có tần suất xuất hiện cao nhất là 20,27%, có thể đây là alen phổ biến

trong quần thể người Việt. Chúng tôi cũng phát hiện được năm alen hiếm là alen 7,



10, 13,2, 14 và 29 với tần suất xuất hiện tương ứng lần lượt là là 0,12%, 0,12%,

0,12%, 0,25% và 0,12%. Trong đó alen 7, 10, 13,2 là ba alen không có trong thang

alen chuẩn và cũng không thấy xuất hiện trong các nghiên cứu khác, có thể đây là

các alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt.

Quần thể người Hàn Quốc thấy xuất hiện hai alen hiếm là 19,2 và 29 với tần

suất đều bằng 0,2%, quần thể người Tây Ba Nha có hai alen hiếm là 12 và 14 với

tần suất đều bằng 0,2%, quần thể Uganda có một alen hiếm là alen 29 với tuần suất

xuất hiện bằng 0,2%. Trong các quần thể so sánh chỉ có quần thể người Thái Lan là

không thấy xuất hiện alen hiếm nào ở locus D2S1338.

3.3.10. Locus D19S433



N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 9 1,37 1,7 0,2 10 0,62 3,7 11 1,62 0,2 0,6 3,9 11,2(*) 0,37 0,2 0,5 12 7,09 3,6 2,8 10,5 8,3 12,2 1,12 0,2 0,4 2,3 13 24,63 28,1 32,7 24,0 20,0 13,2 4,73 3,6 2,6 0,7 6,2 14 23,13 21,7 26,8 33,8 31,6 14,2 10,45 9,3 10,2 2,3 3,9 15 6,09 9,8 5,4 17,3 11,2 15,2 13,31 17,4 15,2 4,7 4,6 16 1,49 1,4 4,2 1,2 16,2 3,61 3,1 3,2 1,2 2,3 17 0,4 0,2 17,2 0,25 0,2 0,2 0,3 19(*) 0,12 H(ob) 0,9328 0,8190 0,7880 0,7920 0,8170 H(ex) 0,8441 0,8237 0,7840 0,7840 0,8310 Pd 0,9586 0,9440 0,9160 0,9220 0,9500

(*) : Alen hiếm



Theo thang alen chuẩn, locus D19S433 có 15 alen khác nhau, trong đó alen

17 không thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi. Alen số 13 và 14 là hai

alen có tần suất xuất hiện cao nhất tương ứng là 24,63% và 23,13%, đây cũng là hai

alen có tần suất xuất hiện cao hơn so với các alen khác ở các quần thể so sánh. Có

thể hai alen này là hai alen phổ biến trong locus D19S433. Ở quần thể nghiên cứu,

chúng tôi cũng phát hiện được thêm hai alen hiếm là alen 11,2 và alen 19 với tần

suất xuất hiện lần lượt là 0,37% và 0,12%. Alen 19 không thấy có trong thang alen

chuẩn và cũng không xuất hiện ở các nghiên cứu khác, có thể đây là alen đặc trưng

riêng của quần thể người Việt. Alen 11,2 cũng thấy xuất hiện ở hai quần thể người

Hàn Quốc và Uganda.

3.3.11. Locus vWA

Bảng 3.22. Tần suất alen của locus vWA trong nghiên cứu của chúng tôi và một số nước

trên thế giới

N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 9(*) 0,12 11 12 0,25 13 2,36 1,4 14 24,75 25,7 20,6 9,7 9,9 15 4,23 2,6 2,2 12,1 8,0 16 17,04 14,5 18,2 25,4 34,9 17 21,64 24,0 30,3 26,6 19,3 18 18,66 20,7 18,2 17,2 12,4 19 7,96 11,4 8,9 7,5 9,9 20 2,36 1,0 1,7 1,5 3,4 21 0,9 22 0,37 23 0,25 24 H(ob) 0,9129 0,7857 0,7790 0,7840 0,8120 H(ex) 0,8188 0,8001 0,7930 0,8060 0,8000 Pd 0,9424 0,9290 0,9160 0,9330 0,9330

(*) : Alen hiếm



Theo thang alen chuẩn, locus vWA có 14 alen khác nhau, trong đó có ba alen

không thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi là alen 11, 21 và 24. Alen 14

xuất hiện với tần suất cao nhất là 24,75%, có thể đây là alen phổ biến trong quần thể

người Việt. Chúng tôi cũng phát hiện được một alen hiếm ở locus này đó là alen 9

với tần suất xuất hiện 0,12%. Alen này không có trong thang alen chuẩn và cũng

không xuất hiện trong các nghiên cứu khác, có thể đây là một alen đặc trưng riêng

của quần thể người Việt. Các quần thể so sánh khác không thấy xuất hiện thêm alen

hiếm nào.

3.3.12. Locus TPOX

Bảng 3.23 Tần suất alen của locus TPOX trong nghiên cứu của chúng tôi và một số nước

trên thế giới

N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 6 1,12 4,8 7 3,73 0,1 1,4 8 49,25 56,4 47,8 53,4 33,7 9 10,70 13,1 12,8 10,3 34,9 10 4,10 3,1 3,7 7,2 8,3 11 25,62 24,8 32,9 25,5 13,5 12 5,10 2,4 2,6 3,2 3,0 13 0,25 0,2 0,3 0,5 14(*) 0,2 18(*) 0,12 H(ob) 0,8209 0,5952 0,6060 0,6390 0,7570 H(ex) 0,6745 0,6030 0,6460 0,6360 0,7380 Pd 0,8519 0,7880 0,8180 0,8200 0,8820

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus TPOX có 8 alen khác nhau, tất cả các alen này

đều đươc phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi. Trong đó, alen 8 có tần suất

xuất hiện cao nhất là 49,25%, alen này cũng xuất hiện với tần suất cao trong các

nghiên cứu khác, có thể đây là alen phổ biến trong locus TPOX. Nghiên cứu của

chúng tôi cũng phát hiện được một alen hiếm là alen 18, với tần suất xuất hiện là

0,12%. Alen này không có trong thang alen chuẩn và cũng không thấy xuất hiện



trong các nghiên cứu khác, có thể đây là alen đặc trưng riêng của người Việt. Quần

thể người Thái Lan có thêm một alen hiếm là alen 14 với tần suất xuất hiện là 0,2%,

các quần thể khác không có thêm alen hiếm nào.

3.3.13. Locus D18S51



N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 7 8(*) 0,2 9 0,37 10 0,12 0,2 1,9 10,2 0,12 0,7 11 0,62 1,2 1,5 1,9 0,2 11,2(*) 0,12 12 4,60 6,9 5,0 16,5 1,4 13 15,30 13,3 18,4 10,5 4,1 13,2 1,12 0,2 14 18,91 17,9 25,1 16,6 5,0 14,2 1,62 15 18,53 22,4 18,0 16,8 10,8 16 14,55 19,5 8,7 14,0 15,8 16,2(*) 0,25 17 6,84 8,1 6,7 9,9 18,1 17,2(*) 0,25 18 4,48 3,3 4,5 4,8 18,6 18,2(*) 0,25 19 2,61 3,1 5,4 3,4 12,8 20 2,86 1,0 2,8 2,2 6,6 21 1,87 2,1 2,6 1,0 4,6 22 1,0 0,7 0,4 0,3 0,7 23 0,87 0,5 0,4 0,2 24 0,37 25 0,37 0,2 26 1,99 27 H(ob) 0,9241 0,8571 0,8740 0,8550 0,8580 H(ex) 0,8736 0,8500 0,8520 0,8730 0,8700 Pd 0,9713 0,9550 0,9570 0,9680 0,9640

(*) : Alen hiếm



Theo thang alen chuẩn, locus D18S51 có 23 alen khác nhau, trong đó có hai

alen không thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi là alen 7 và 27, hai alen

này cũng không thấy xuất hiện trong các nghiên cứu so sánh khác, có thể đây là các

alen hiếm gặp của locus D18S51. Hai alen 14 và 15 xuất hiện với tần suất cao nhất

tương ứng là 18,91% và 18,53%, có thể đây là hai alen phổ biến trong quần thể

người Việt. Chúng tôi cũng phát hiện được bốn alen hiếm ở locus D18S51 là các

alen 11,2, 14,2, 16,2 và 17,2 với tần suất xuất hiện tương ứng trong nghiên cứu của

chúng tôi là 0,12%, 0,25%, 0,25% và 0,25%. Cả bốn alen này đều không có trong

thang alen chuẩn và không xuất hiện trong các nghiên cứu khác, có thể đây là các

alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt.

Quần thể người Hàn Quốc thấy xuất hiện thêm một alen hiếm là alen 8 với

tần suất là 0,2%, các quần thể khác không thấy xuất hiện alen hiếm nào.

3.3.14. Locus D5S818



N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 6(*) 0,12 7 4,98 2,6 1,3 8 0,37 1,1 0,6 6,9 9 6,59 6,9 11,5 3,1 3,7 10 21,39 21,4 17,7 7,6 5,3 11 26,49 27,1 29,4 36,4 19,5 12 23,76 23,6 25,3 37,9 39,4 13 14,80 16,7 12,1 13,7 24,1 14 1,0 1,7 1,5 0,7 0,9 15 0,25 0,2 16 23(*) 0,25 H(ob) 0,8980 0,7810 0,7920 0,6780 0,7480 H(ex) 0,7988 0,7932 0,7910 0,6990 0,7410 Pd 0,9297 0,9210 0,9230 0,8630 0,8890

(*) : Alen hiếm



Theo thang alen chuẩn, locus D5S818 có 10 alen khác nhau, trong đó alen 16

không thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi và cũng không thấy có trong

các nghiên cứu so sánh khác, có thể đây là một alen hiếm gặp trong locus D5S818.

Alen 11 xuất hiện với tần suất cao nhất là 26,49%, có thể đây là alen phổ biến trong

quần thể người Việt. Chúng tôi cũng phát hiện được hai alen hiếm trong locus

D5S818 là alen 6 và 23 với tần suất xuất hiện tương ứng là 0,12% và 0,25%. Hai

alen này đều không có trong thang alen chuẩn và cũng không thấy xuất hiện trong

các nghiên cứu khác, đây có thể là hai alen đặt trưng riêng của quần thể người Việt.

3.3.15. Locus FGA

Bảng 3.26.. Tần suất alen của locus FGA trong nghiên cứu của chúng tôi và một số nước

trên thế giới

N/c của chúng tôi Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda Alen (N = 402) (N = 210) (N = 231) (N = 342) (N = 218) 13(*) 0,12 16(*) 0,2 17 0,12 0,2 0,4 0,4 0,7 17,2(*) 0,25 18 2,61 2,6 3,5 2,0 1,6 18,2(*) 0,2 19 10,07 5,0 6,9 8,0 2,5 19,2(*) 0,12 20 5,60 7,9 4,5 11,6 4,1 20,2(*) 0,2 0,2 0,3 21 14,68 12,9 14,1 20,8 6,9 21,2(*) 0,62 2,1 0,4 22 18,28 20,7 16,9 16,3 20,0 22,2(*) 0,75 1,2 0,6 23 15,42 18,6 22,5 14,9 21,3 23,2(*) 1,12 0,7 0,2 0,3 24 13,93 11,0 18,0 12,2 14,2 24,2(*) 1,37 0,5 25 7,34 9,3 9,8 9,0 6,0 25,2(*) 0,75 1,2 26 4,60 4,0 3,0 2,6 4,1 26,2 0,25 0,5 27 0,75 1,0 0,4 4,1



28 0,62 0,5 6,4 29 4,6 30 0,12 1,4 30,2 0,5 30,3(*) 0,2 31(*) 0,7 31,2 0,5 32,2 33,2 42,2 0,25 43,2 44,2 45,2 46,2 47,2 48,2 0,25 50,2 51,2 H(ob) 0,9192 0,8667 0,8310 0,8220 0,8490 H(ex) 0,8798 0,8756 0,8540 0,8650 0,8760 Pd 0,9738 0,9670 0,9580 0,9660 0,9690

(*) : Alen hiếm

Theo thang alen chuẩn, locus FGA có 28 alen khác nhau. Trong nghiên cứu

của chúng tôi thấy xuất hiện 16 alen tiêu chuẩn, 12 alen khác không xuất hiện là các

alen: 29, 30,2, 31,2, 32,2, 33,2, 43,2, 44,2, 45,2, 46,2, 47,2, 50,2 và 51,2. Alen 22

xuất hiện với tần suất cao nhất là 18,28%, có thể đây là alen phổ biến của quần thể

người Việt. Chúng tôi cũng phát hiện được tám alen hiếm ở locus FGA trong các

mẫu nghiên cứu là các alen: 13, 17,2, 19,2, 21,2, 22,2, 23,2, 24,2 và 25,2 với tần

suất xuất hiện tương ứng lần lượt là 0,12%, 0,25%, 0,12%, 0,62%, 0,75%, 1,12%,

1,37% và 0,75%. Các alen 13, 17,2 và 19,2 là các alen không có trong thang alen

chuẩn và cũng không thấy xuất hiện trong các nghiên cứu khác, có thể đây là ba

alen đặc trưng riêng của quần thể người Việt.

Quần thể người Thái Lan thấy xuất hiện năm alen hiếm là alen: 20,2, 21,2,

22,2, 23,2 và 24,2 với tần suất xuất hiện lần lượt là: 0,2%, 2,1%, 1,2%, 0,7% và

0,5%.



Quần thể người Hàn Quốc thấy xuất hiện hai alen hiếm là alen 20,2 và 23,2

với tần suất đều bằng 0,2%.

Quần thể người Tây Ba Nha thấy xuất hiện năm alen hiếm là các alen: 16,

20,2, 21,2, 22,2 và 23,2 với tần suất xuất hiện tương ứng là 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,6%

và 0,3%.

Quần thể người Uganda thấy xuất hiện hai alen hiếm là alen 30,3 và 31 với

tần suất xuất hiện là 0,2% và 0,7%.

Các alen: 32,2, 33,2, 43,2, 44,2, 45,2, 46,2, 47,2, 50,2 và 51,2 đều không

thấy xuất hiện trong nghiên cứu của chúng tôi và trong các nghiên cứu so sánh

khác, có thể đây là những alen hiếm gặp ở locus FGA.

Trong công tác giám định DNA hình sự, việc quan trọng nhất là tìm được

đúng thủ phạm gây ra vụ án, để làm được việc này đòi hỏi phải áp dụng các biện

pháp hiện đại có độ chính xác cao. Nếu một mẫu DNA thu được ở hiện trường cho

kết quả kiểm tra giống với mẫu DNA của đối tượng khả nghi thì câu hỏi đặt ra là

liệu hai mẫu đó có phải từ cùng một người không? Việc khẳng định chính xác hay

không phụ thuộc vào độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu và khả năng phân biệt

của các locus nghiên cứu. Trong những trường hợp đặc biệt khi mẫu DNA thu được

ở hiện trường bị đứt gãy dẫn đến không thể nhân được toàn bộ 16 locus STR, khi đó

độ chính xác của phương pháp được tính bằng độ chính xác của các locus phát hiện

được trong mẫu nghiên cứu. Vì thế, việc xác định khả năng phân biệt của từng locus

giúp ta tính toán được độ chính xác của phương pháp trong mọi trường hợp cụ thể,

hạn chế tối đa sai sót trong quá trình điều tra. Trong trường hợp đòi hỏi phải có độ

chính xác cao hơn thì cần nghiên cứu thêm các locus STR khác hoặc phối hợp các

biện pháp nghiên cứu khác nhau để cho kết quả chính xác nhất.



Bảng 3.27. Bảng tổng hợp khả năng phân biệt của tất cả các locus trong nghiên cứu của

chúng tôi và một số nghiên cứu khác

N/c của

chúng tôi

Thái Lan Hàn Quốc Tây Ban Nha Uganda

Locus

D8S1179 0,9655 0,9610 0,9540 0,9310 0,9310

D21S11 0,9531 0,9500 0,9170 0,9490 0,9460

D7S820 0,9197 0,9170 0,9030 0,9310 0,9140

CSF1PO 0,8721 0,8690 0,8860 0,8690 0,9060

D3S1358 0,8840 0,8660 0,8770 0,9250 0,8830

TH01 0,9003 0,8930 0,8360 0,9240 0,8890

D13S317 0,9210 0,9290 0,9340 0,9180 0,8670

D16S539 0,9308 0,9130 0,9090 0,9090 0,9280

D2S1338 0,9717 0,9630 0,9650 0,9630 0,9660

D19S433 0,9586 0,9440 0,9160 0,9220 0,9500

vWA 0,9424 0,9290 0,9160 0,9330 0,9330

TPOX 0,8519 0,7880 0,8180 0,8200 0,8820

D18S51 0,9713 0,9550 0,9570 0,9680 0,9640

D5S818 0,9297 0,9210 0,9230 0,8630 0,8890

FGA 0,9738 0,9670 0,9580 0,9660 0,9690

Đánh giá theo khả năng phân biệt từ cao đến thấp của các locus trong quần

thể nghiên cứu chúng tôi thấy locus FGA có khả năng phân biệt cao nhất là 0,9738,

locus TPOX có khả năng phân biệt thấp nhất là 0,8519. Sắp xếp theo thứ tự khả

năng phân biệt từ cao đến thấp của tất cả các locus nghiên cứu lần lượt là: FGA,

D2S1338, D18S51, D8S1179, D19S433, D21S11, vWA, D16S539, D5S818,

D13S317, D7S820, TH01, D3S1358, TPOX. Mỗi một locus có khả năng phân biệt

khác nhau vì vậy sẽ đóng vai trò quan trọng khác nhau trong việc tính toán độ tin

cậy của phương pháp nghiên cứu. Locus càng có khả năng phân biệt cao thì càng có

ý nghĩa trong giám định vì vậy khi xây dựng những bộ kít xét nghiệm riêng cho

từng nhóm người cụ thể cần quan tâm nhiều hơn đến các locus này.



KẾT LUẬN

Với mục tiêu nghiên cứu tần suất alen của một số locus gen ở người Việt, áp

dụng các phương pháp nghiên cứu khoa học như đã trình bày ở chương 2, chúng tôi

đã xác định được tần suất tương đối của 15 locus STR và tính được khả năng phân

biệt từ 402 mẫu nghiên cứu. Trên cơ sở đó, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:

1. Đã hoàn thiện được quy trình phân tích nhận dạng cá thể với nhiều phương

pháp tách chiết DNA thích hợp với nhiều đối tượng mẫu khác nhau, các

phương pháp này đều đạt kết quả tốt.

2. Xác định được tần suất alen, tần suất dị hợp tử, đánh giá được khả năng phân

biệt của các locus STR trong quần thể nghiên cứu.

3. Phát hiện được 37 alen hiếm trên tổng số 402 mẫu nghiên cứu, các alen này

đều không có trong thang alen chuẩn. Số alen hiếm trong từng locus cụ thể

như sau:

Locus Số alen hiếm Locus Số alen hiếm D8S1179 01 D2S1338 05 D21S11 03 D19S433 02 D7S820 01 vWA 01 CSF1PO 01 TPOX 01 D3S1358 03 D18S51 04 TH01 03 D5S818 02 D13S317 01 FGA 08 D16S539 01

4. Một số locus có khả năng phân biệt cao như: FGA, D2S1338, D18S51,

D8S1179, D19S433, D21S11 có thể được ứng dụng để chế tạo các bộ kit xét

nghiệm đạt độ chính xác cao trong quần thể người Việt.



KIẾN NGHỊ

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu số lượng mẫu

khá lớn thuộc dân tộc Kinh. Tuy nhiên, để có kết quả toàn diện hơn về tần suất các

alen trên quần thể người Việt, chúng tôi có một số kiến nghị sau:

1. Mở rộng quy mô thống kê trên số lượng mẫu lớn hơn và trên các dân tộc

khác nhau ở Việt Nam.

2. Một số alen hiếm đặc trưng cho người Việt cần tiếp tục được khảo sát.

3. Các locus: FGA, D2S1338, D18S51, D8S1179, D19S433, D21S11 cần được

lưu ý trong giám định pháp y vì đây là các locus có khả năng phân biệt và độ

tin cậy cao hơn các locus khác.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt:

1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang

Huấn (2003), Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh

vật Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001), Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Y học.

3. Nguyễn Ngọc Hải (2002), Gen và những bước tiến của sinh học hiện đại.

NXB trẻ.

4. Phạm Thành Hổ (2001), Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo dục.

5. Nguyễn Đình Khoa (1969), “Nguồn gốc người Việt”, khảo cổ học số 3 – 4

tháng 12, trang 22-27.

6. Nguyễn Đình Khoa (1984), Nhân chủng học Đông Nam Á. Nhà xuất bản

Khoa học Xã hội, trang 67-72.

7. Vũ Xuân Khôi (1996), Cơ sở sinh thái học và nhân trắc học xây dựng kích

cỡ mặt nạ của người Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ khoa học Sinh thái học,

Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, TP Hồ Chí Minh.

8. Hoàng Văn Lương (1998), Đặc điểm hình thái, vân da bàn tay của một số tộc

người Việt Nam và bệnh nhân tâm thần phân liệt, Luận án tiến sỹ y dược,

Học viện Quân Y.

9. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (2003), Cơ sở di truyền học. Nhà xuất bản

Giáo dục

10. Hoàng Văn Mẫn, Ngô Tiến Quý (1993), Đường vân da. Viện Kỹ thuật Hình

sự - Bộ Công an.

11. Phạm Văn Phùng (1996), “Nghiên cứu phân loại nếp vân tay và các phương

pháp thuận tiện cho việc xác định cá thể trong quần thể có số dân lớn”, Tạp

chí di truyền và ứng dụng số 2, Tổng hội y học Việt Nam, trang 7-9.

12. Ngô Gia Trạch, Trịnh Hùng (1989), Nếp vân da. Nhà xuất bản Y học.

13. Lê Gia Vinh (1994), “Nghiên cứu các kích thước của một số bộ phận trên

mặt người Việt Nam”, Y học Việt Nam 126 – Hà nội, trang 10-15.



14. Lê Gia Vinh, Nguyễn Việt Vùng (2000), “Nghiên cứu đặc điểm nhân trắc

đầu mặt ứng dụng trong nhận dạng người”, Tập san hội Hình thái học Việt

Nam, tập 10, số đặc biệt, Nhà xuất bản y học – TP. Hồ Chí Minh, trang 63-

68.

15. Nguyễn Việt Vùng (2005), Nghiên cứu đặc điểm hình thái nhân trắc đầu mặt

người Việt trưởng thành, ứng dụng trong giám định pháp y, Luận án tiến sỹ y

học, Học viện Quân Y

Tài liệu tiếng Anh:

16. A. Gorostiza, A. Gonzalez-Martin, C. Lopez Ramirez, C. Sanchez, C. Barrot,

M. Ortega, E. Huguet, J. Corbella, M. Gene, “Allele frequencies of the 15

AmpF/Str Identifiler loci in the population of Metztitlan (Estado de Hidalgo),

Mexico”, Forensic Science International 166 (2007), pp.230-232.

17. Baiquan Yang, Gang Wang, Yichun Liu, Wensheng Yang, “Population data

for the AmpF/STR® IdentifilerTM PCR Amplification Kit in China Han in

Jilin Province, China”, Forensic Science International 151 (2005), pp. 293-

297.

18. Bernard K. (1960), Blood identification and other genetic marker. Ann.Hum.

Biol. 26, pp. 811-817.

19. Bonnevie K.b (1973), Study on papillary pattern of human fingers. J. Genet.,

pp. 15-25.

20. Boorman K.E and Dodd B.E (1966), An introduction to blood group

serology, 3rd Edition. London, J. & A. Churchill Ltd.

21. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. (1980) Construction of a

genetic linkage map in man using restriction fragment length

polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32, pp. 314-318.

22. Brinkmann B., In: Promega Corp. (Ed.) (1992), Proceeding from the Third

Int. Symposium on Human Identification. Promega Corporation, Madison,

pp. 357-373.



23. Budowle B., Adams D.E., and Allen R.C. (1994), “Fragment-length

polymorphisms for forensic science applications”, Methods in nucleic acids

research, pp. 181-202.

24. Budsaba Rerkamnuaychoke, Tawat Rinthachai, Jeattima Shotivaranon,

Ubonrat Jomsawat, Teerapong Siriboonpiputtana, Kanyanuch

Chaiatchanarat, Ekawat Pasomsub, Wasun Chantratita, “Thai population data

on 15 tetrameric STR loci-D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358,

TH01, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51,

D5S818 and FGA”, Forensic Science International 158 (2006), pp. 234-237

25. Butler J.M (2001), Forensic DNA Typing: Biology and Technology behind

STR marker. Academic Press, London.

26. Butler J.M., Ruitberg C.M. and Reeder D.J. (1997), Proceedings of the

Eighth International Symposium on Human Identification. Madison WI:

Promega corporation, pp 73-88.

27. Carracedo A. and Lareu MV. (1998), Proceedings of the ninth international

Symposium on Human indentification. Madison WI: Promega corporation,

pp. 89-107

28. Catalin Marian, Andrei anghel, Simona Maria Bel, Beatrix Katalin Ferencz,

sorin Ursoniu, Milan Dressler, Octavian Popescu, Bruce Budowle, “STR

data for the 15 AmpF/STR Identifiler loci in the Western Romanian

population”, Forensic Science International 170 (2007), pp.73-75

29. Dell D.A., Munger B.L. (1986), The early embryogenesis of papillary ridges

in primate glabrous skin, the dermatotopic map of cutaneous

mechanoreceptors and dermatoglyphics. J. Comp. Neurol. 244, pp.511-2

30. Frank H. Stephenson, Calculations in Molecular Biology and Biotechnology:

A Guide to Mathematics in the Laboratory (2003), Academic Press, London,

pp. 278-295.

31. G. Hima Bindu, R. Trivedi, V.K. Kashyap, “Allele frequencies distribution

based on 17 STR markers in three major Dravidian linguistic population of



Andhra Pradesh, India”, Forensic Science International 170 (2007), pp. 76-

85.

32. John M. Butler (2005), Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and

Genetics of STR Markers, second edition. Academic Press, London.

33. K.M. Chan, C.T. Chiu, P. Tsui, D.M. Wong, W.K. Fung, “Population data

for the IdentifilerTM 15 STR loci in Hong Kong Chinese”, Forensic Science

International 152 (2005), pp. 307-309.

34. Manuel V. Camacho, Cesar Benito, Ana M. Figueiras, “Allelic frequencies

of the 15 STR loci included in the AmpF/STR® IdentifilerTM PCR

Amplification Kit in an autochthonous sample from Spain”, Forensic

Science International 173 (2007), pp. 241-245.

35. Matthew B. Hamilton, Population Genetics (2009), Wiley-Blackwell, pp. 9-

49.

36. Lay Hong Seah, N. Hithaya Jeevan, Mohd Izuan Othman, Primulapathi Jaya,

Yaw Shin Ooi, Pui Cheng Wong, sue Sing Kee, “ STR Data for the

AmpFlSTR Identifiler loci in three ethnic groups (Malay, Chinese, Indian) of

the Malaysian popµlation”, Forensic Science International 138 (2003), pp.

134-137.

37. S. Beleza, C. Alves, F. Reis, A. Amorim, A. Carracedo, L. Gusmao, “17 STR

data (AmpF/STR Identifiler and Powerplex 16 System) from Cabinda

(Angola)”, Forensic Science International 141 (2004), pp.193-196.

38. Veronica Gomes, Paula Sanchez-Diz, Cintia Alves, Iva Gomes, Antonio

Amorim, Angel Carracedo, Leonor Gusmao, “Popµlation data defined by 15

autosomal STR loci in Karamoja popµlation (Uganda) using AmpF/STR

Identifiler kit”, Forensic Science International: Genetics 3 (2009) e55-e58.

39. Yoo-Li Kim, Ji-Yeon Hwang, Yoo-Jin Kim, Seok Lee, Nak-Gyun Chung,

Hyun-Gyung Goh, Chun-Choo Kim, Dong-Wook Kim, “Allele frequencies

of 15 STR loci using AmpF/STR Identifiler kit in a0 Korean population”,

Forensic Science International 136 (2003), pp.92-95.

Các trang web tham khảo:



40. http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/applied_markets_support/d

ocuments/generaldocuments/cms_053966.pdf

41. http://www3.appliedbiosystems.com/sup/URLRedirect/index.htm?xDoD=43

23291

42. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNaviga

te2&catID=605862&tab=DetailInfo

43. http://www.promega.com/tbs/tmd022/tmd022.html

44. http://www.qiagen.com/literature/render.aspx?id=23730

luận văn - quỳ - hus.vnu.edu.vn (399).pdf · xác của xét nghiệm được tính dựa...

Documents