lucrari practice la biochimie generala_biochimiei_2013
TRANSCRIPT
BIOCHIMIE GENERALĂ
LUCRĂRI PRACTICE
Biochimie I2012/2013
Aminoacizi si proteine/ Glucide
1
α-aminoacid
1. Carbon central (carbon α);2. Grupare amino;3. Grupare carboxil;4. Atom de hidrogen;5. Grupare R.
Aminoacizii din structuraproteinelor sunt α-aminoacizi.
Excepţie: Prolina (Pro) (iminoacid)
2
Proprietăţi
în soluţie la pH neutru – amfiioni grupareaamino = protonată / gruparea carboxil = disociată;
Majoritatea – punct de topire ~300° C;
Solubilitate crescută în solvenţi polaricomparativ cu solvenţii nepolari.
3
LP 1Reacţii de identificare a
aminoacizilor
4
Aminoacizi testaţi in cadrul L.P.
Reacţii de identificare
a aa.
5
Reacţii de identificare a aminoacizilor
Reacţia cu acid azotos;
Reacţia cu ninhidrină;
Reacţia xantoproteică;
Reacţia Millon;
Reacţia cu nitroprusiat.
Reacţii de culoare
6
Reacţia cu acidul azotos
Metoda van Slyke- aa. reacţionează cu acidul azotos latemperatura camerei cu degajare de azot.Cantitativ- un mol de aa. degajă 22,4 l azot.
Reactivi: - HCl 2M;- NaNO2 10%- aminoacizi de testat: Gly, Tyr
GlyHCl 2M
TyrHCl 2M HCl 2M
+ NaNO2 10%
degajare de N2 în primele 2 eprubete
7
Denumirea reacției Reactivul folosit Culoarea
rezultată
Tipul de aminoacid
identificat
Ninhidrinei ninhidrină albastru -
violet
caracteristică atît
pentru aminoacizi,
cît și pentru
proteine
Xantoproteică acid
azotic,hidroxid de
amoniu
galbenă/
portocalie
aminoacizii
aromatici (formează
nitroderivați)
Millon azotat de mercur
în acid azotic (acid
sulfuric)/azotit de
Na
colorație
roșie
aminoacizi ciclici cu
grupare hidroxil
(tirozina)
Nitroprusiatului
de sodiu
nitroprusiat de
sodiu în soluție
amoniacală
roșie aminoacizi cu
grupăre tiol (-SH)
liberă8
Reacţia cu ninhidrină
9
LP 2Determinarea proteinelor serice
cu reactiv Weichselbaum
10
Principiul metodei:
Compuşii cu legături peptidice reacţionează cuionii de Cu2+ în mediu alcalin, rezultând uncompus de culoare albastru-violet a căruiintensitate este direct proporţională cunumărul de legături peptidice.
Metoda poate fi folosită pentru determinareaconcentraţiei proteinelor din serul sanguin.
11
Reactivi:
• soluţie de NaOH 10%;
• reactiv Weichselbaum: tartrat dublu de Na + Na OH +sulfat de cupru cristalizat CuSO4 x 5 H2O;
• soluţie standard proteică cu concentraţia cunoscută (10mg/ml) de albumină serică bovină (BSA);
• proba de analizat reprezentată de ser sanguin diluatcorespunzător.
12
Pt. curba etalon:
BSA (10 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD
concentratie proteica diferita
Pt. proba
Ser sanguin
+ NaOH 10% + reactiv Weichselbaum
Repaus 15-20 de minute. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 546nm.
13
Spectrofotometrie – generalitati
Metoda spectrofotometrică se bazează pe proprietateasubstanţelor de a absorbi selectiv radiaţiile electromagneticeşi este folosită pentru identificare, determinarea purităţii şidozare.
Spectrele de absorbţie se obţin la trecerea unui fascicul deradiaţii continue prin substanţa de analizat care poate absorbio parte din energia acestuia. Cantitatea de energie absorbitădepindede structura şi de numărul moleculelor şi al atomilorsubstanţei cu care interacţionează fascicululde radiaţii.
În funcţie de domeniile spectrale în care are loc absorbţialuminii se deosebesc: metodespectrofotometrice în ultraviolet(185-400nm), metode spectrofotometrice în vizibil (400-800nm)şi metode spectrofotometrice în infraroşu (peste800nm).
14
Spectrofotometrie - generalitati
Principiul spectrofotometriei se bazează pe determinareaconcentraţiei soluţiilor colorate latrecerea unui fascicul emisde o sursă luminoasă printr-o soluţie omogenă constituită dinsubstanţade analizat.
Astfel se determină absorbţia radiaţiei luminoase, care estedirect proporţională cuconcentraţia substanţei absorbante înconformitate cu legea Lambert-Beer: A= lg I0/I = -lg T = ε L C
A = absorbanţa;I0 = intensitatea luminii incidente;I = intensitatealuminii transmise;T = transmitanţa;L = grosimea stratului deabsorbţie (cm);C = concentraţia soluţiei absorbante (moli/l); ε =absorbtivitatea molară (constantă caracteristică fiecăreisubstanţe absorbante).
Lungimea de undă a luminii incidente este cea a culoriicomplementare a soluţiei de analizat.
15
Spectrofotometru UV-VIS
16
Curba etalon
Reprezentarea grafica a relatiei dintre doi parametri. In cazul nostruaabsorbantei (determinata prin citire la spectrofotometru) fata deconcentratie. Sunt utilizate dilutii ale unei solutii de concentratie cunoscutapentru determinarea unei concentratii necunoscute.
17
LP 3
Metoda biuretului
18
Reacţia este utilizată pentru determinareacantitativă a proteinelor. Asemănător compusuluinumit biuret, peptidele şi proteinele conţin grupări –CO-NH- care reacţionaeză cu o soluţie alcalină desulfat Cu (II) şi determină apariţia unei coloraţiialbastru-violet.
Intensitatea culorii este o măsură a numărului delegături peptidice prezente într-o proteină.
19
Reacţia nu este specifică pentru legaturile peptidice compusii cu doua grupari carbonil legate printr-un atom de C sau N dau reactie pozitiva.
Metoda este utilizata pt. determinarea unor cantitati mari de proteine (1-20 mg).
20
Reactivi:
•Reactiv biuret;
•soluţie standard proteică cu concentraţiacunoscută (5 mg/ml) de albumină sericăbovină (BSA);
•proba de analizat reprezentată extractproteic total.
21
Pt. curba etalon:
BSA (5 mg/ml) + A.D.Diferite volume BSA si AD
concentratie proteica diferita
Pt. proba
EPT diluat corespunzator
+ reactiv biuret
Incubare 10’/ 37°C. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 540nm. Citirea se face fata de A.D.
22
23
LP 4Reacţii de identificare a
glucidelor
24
Glucide testate in cadrul L.P.
Reacţii de identificare a glucidelor
Glucoza
Fructoza
25
Glucide testate in cadrul L.P.
Reacţii de identificare a glucidelor
Zaharoza
26
Reacţii de identificare a glucidelor
Reacţia Molisch;
Reacţia cu iodul;
Reacţia Benedict;
Reacţia Seliwanoff;
Reacţia Fehling.
Reacţii de culoare
27
Denumirea reacției Reactivul folosit Culoarea
rezultată
Specificitate
Molisch Alfa-naftol 5%
Acid sulfuric conc.
Rosu-
purpuriu.
Monozaharide,
oligozaharide,
polizaharide.
R. cu iodul Sol de iod 0,005 M
HCl 1M
Albastru pt.
amidon, rosu
brun pt.
glicogen si
amidon partial
hidrolizat
Amidon
glicogen
Benedict r. Benedict (citrat
de Na+ carbonat
de Na + sulfat de
Cu)
colorație
roșie
Glucide cu caracter
reducator
28
Denumirea reacției Reactivul folosit Culoarea
rezultată
Specificitate
Seliwanoff r. Seliwanoff
(rezorcina in HCl
3M).
rosu Cetoze
Fehling Reactiv F I
Reactiv FII
rosu Glucide cu caracter
reducator
29
Glucide cu caracter reducator - glucoza
Echilibrul intre forma piranozica si cea cu lant deschis este directionat catre aceasta din urma pentru a se produce reactia de oxidare.
30
LP 5Dozarea zaharurilor
reducatoare din extractul de portocala cu o-toludina
31
Principiul metodei:
In prezenta acidului acetic, la cald,zaharurile reducatoare formeaza cu o-toluidina un complex colorat careprezinta un maxim de absorbtie la 630nm.
Metoda poate fi folosită pentrudeterminarea concentraţiei glucozei dinserul sanguin.
32
Reactivi:
•Reactiv o-toluidina;
•Solutie standrad de glucoza 100 mg%;
•proba de analizat reprezentată de extractde portocala diluat corespunzător.
33
Pt. curba etalon:
Sol. Standard de glucoza (100 mg%) + A.D.
Diferite volume sol. st. glucoza si AD
concentratie diferita
Pt. proba
Extract de portocala
+ r. o-toluidina
Incubare 10’/ baie de apa la fierbere. Citire la spectrofotometru în cuva cu drum optic de 1 cm la lungimea de undă 630 nm fata de blanc.
34
Reactia glucozei cu o-toluidina
35
LP 5Dozarea lactozei din lapte
36
Lactoza – dizaharid cu caracter reducator, 4-6% din laptele de vacă şi 2-3% din laptele uman.
37
Principiul metodei:
Concentraţia lactozei poate fi determinată prinorice metodă caracteristică pentru zaharurireducătoare, după deproteinizarea laptelui.
În cazul acestui experiment, se realizeazădeproteinizarea laptelui cu o soluţie dewolframat de sodiu, dozarea efectivărealizându-se prin metoda Nelson. În cazulacestei metode, ionii de Cu (II) sunt reduşi laioni de Cu (I), care la rândul lor reduc acidulfosfomolibdenic la un produs de reacţiealbastru.
38
Reactivi:
• reactiv alcalin de cupru;
• reactiv fosfomolibdenic;
• soluţie 10% de wolframat de sodiu;
• soluţie M/3 de H2SO4;
• soluţie stoc de lactoză 1%;
39
La 1 ml de lapte degresat prin centrifugare se adaugă 2 ml desoluţie de wolframat de sodiu 10% şi, încet, sub agitareconstantă, 2 ml M/3 soluţie de acid sulfuric. Amestecul este adusla un volum final de 100 ml, iar după 5 minute de staţionare estefiltrat printr-o hârtie de filtru.
E1 E2 E3
Filtrat 1 ml -
Apa distilata 1 ml - 2 ml
Soluţie standard de lactoză* - 2ml -
Reactiv alcalin de cupru 2 ml 2 ml 2 ml
Se incubează timp de 8 minute pe baie
de apă la fierbere; ulterior eprubetele se
răcesc şi se adugă în fiecare eprubetă
reactiv fosfomolibdenic.
Reactiv fosfomolibdenic 4 ml 4 ml 4 ml
Dupa 1 min. de staţionare, amestecurile de reacţie se diluează la un volum final de 25 ml
cu reactiv fosfomolibdenic diluat 1:4.
Se citeşte densitatea optică a probelor E1 şi E2 faţă de blanc E3, la 630 nm.40
Calculul rezultatelor
Densităţile optice fiind proporţionale cu concentraţiile este valabilă relaţia:
D.O.proba 1/ D.O.proba 2 = C1/C2, unde C1 este concentraţia lactozei din 0,01 ml lapte, iar C2 este concentraţia lactozei dinm standard (0,6 mg).
Concentraţia lactozei din lapte, exprimă în g/100 ml este dată de relaţia:
(D.O.proba 1/ D.O.proba 2) X ( 0,6/1000) X (100/0,01)
41