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ANGELINA MORAND BIANCHI BILATE
EXPRESSÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E PROGRESSÃO DIFERENCIAL DE MIOCARDITE AGUDA E
CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA CRÔNICA EXPERIMENTAL EM HAMSTER SÍRIO INFECTADO POR Trypanossoma cruzi
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ANGELINA MORAND BIANCHI BILATE
EXPRESSÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E PROGRESSÃO DIFERENCIAL DE MIOCARDITE AGUDA E CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA CRÔNICA EXPERIMENTAL EM HAMSTER SÍRIO
INFECTADO POR Trypanossoma cruzi
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências (Imunologia).
São Paulo
2006
ANGELINA MORAND BIANCHI BILATE
EXPRESSÃO DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS E PROGRESSÃO DIFERENCIAL DE MIOCARDITE AGUDA E CARDIOMIOPATIA CHAGÁSICA CRÔNICA EXPERIMENTAL EM HAMSTER SÍRIO
INFECTADO POR Trypanossoma cruzi
Tese (Doutorado) apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de concentração: Imunologia Orientador: Prof. Dr. Edecio Cunha Neto
São Paulo
2006
À minha mãe Elisabeth Bianchi
(in memoriam), pela alegria de viver...
AGRADECIMENTOS
Este trabalho representa não apenas um trabalho de tese mas uma trajetória de
amadurecimento científico e pessoal. Gostaria de expressar o meu agradecimento a
todas essas pessoas que, de uma forma ou de outra, participaram dessa trajetória.
AMIGOS ESPECIAIS Simone Fonseca
Kellen Faé Cristina Caldas Priscila Teixeira
Mônica S. Ferreira
Apoio Técnico Ana Maria Silva
D. Aurora Raimunda
Cardiologia - InCor Vera Maria Curi Salemi
Felix Ramires
FAMÍLIA Badezir Felipe Bilate
Marluce Bilate Analuce Bilate, João Sbano
Josemar, Mauro e Sylma Bilate Nonno, nonna
Laboratório do Prof. Momtchilo
Alexandre Keller Eliane G Nascimento
Biotério Daniel Mucida
Edilberto Postol Ernesto Luna
Luís Roberto Mundel
LAB IMUNOLOGIA Maria Lúcia Marin, Rosemeire Aparecida, Flávio Alcântara, Sandra Maria Monteiro, Adalberto Silva, Hélcio Rodrigues, Carlos Sérgio, Nicolas Panajotopoulos, Franscisco Monteiro, Ivete, Germano Preus, Jair Muro, Regiane, Neuzeti, Sandra Emiko, Georgia Mundin, Idania Marrero, Washington Silva, Samar, Raquel Alencar, Roberta Iolanda Oruê
SBI NA REDE Daniel Mucida
Daniel Ketelhuth Laudicéia Almeida
ESPECIAIS Thales de Brito
Momtchilo Russo Verônica Coelho
Jorge Kalil Luiza Guilherme
SUPER ESPECIAL Gabriel D. Victora
SUPER ESPECIAL Edecio Cunha Neto
GRUPO CHAGAS/HIV Andréia Kuramoto, Eliane Mairena, Susan Ribeiro
Kátia Françoso, Adriana Coutinho Natalie Müller, Bosco Cristiano Maciel, Sandra Moraes
Luciana Nogueira, Arlei Correia, Sandra Drigo, Leo Kei Iwai, Rajendranath Ramasawmy
“Research is a formalised curiosity. It is poking and prying with a reason”
Zora Neal Hurston 1891-1960
RESUMO
BILATE A. M. B. Expressão de mediadores inflamatórios e progressão diferencial de miocardite aguda e cardiomiopatia chagásica crônica experimental em hamster sírio infectado por T.cruzi. 2006. 196f. Dissertação (Doutorado em Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma causa significante de morbi-mortalidade em muitos países da América Latina, onde estima-se que 13 milhões de pessoas podem estar infectadas. Nossos resultados anteriores mostraram que com uma única combinação de parasita (cepa Y) e hospedeiro geneticamente heterogêneo (hamster sírio) foi possível recapitular o espectro da evolução da doença de Chagas humana. No presente estudo, testamos a hipótese de que o infiltrado inflamatório e seus mediadores produzidos localmente estão relacionados a morbi-mortalidade da fase aguda e gravidade da cardiomiopatia crônica no modelo de infecção por T. cruzi em hamster sírio. Hamsters infectados pela cepa Y de T. cruzi apresentaram diferentes padrões de evolução da doença tanto na fase aguda como na fase crônica, de maneira semelhante aos humanos. Na fase aguda, 30-50% dos animais apresentaram sintomas tais como caquexia, letargia, vômito e diarréia, que estiveram relacionados à morte nesta fase. A presença de parasitas circulantes no 13° dia pós-infecção (PI) esteve associada ao intenso parasitismo cardíaco na data da morte espontânea durante a fase aguda. O elevado parasitismo cardíaco, além de associado com a presença de sintomas, esteve associado também à elevada expressão de RNAm de IL-10 e TNF-α e genes ativados por citocinas inflamatórias (A20 e iNOS) no miocárdio. Na fase aguda, o tratamento com bloqueador de TNF-α (Etanercept), resultou em aumento de parasitismo sanguíneo e cardíaco e aumento da expressão de IL-10 no miocárdio de animais assintomáticos. Na fase crônica da infecção, embora a intensidade de miocardite estivesse correlacionada positivamente com a dilatação macroscópica do ventrículo esquerdo, nenhuma das duas variáveis esteve associada à morte durante a fase crônica. Nesta fase, houve predomínio de expressão de RNAm de IFN-γ no miocárdio em detrimento de TNF-α e IL-10, embora essas duas últimas também tenham sido detectadas em níveis aumentados. A morte durante a fase crônica somente esteve associada à expressão de A20. Na fase crônica, o tratamento com Etanercept agravou a cardiomiopatia crônica pós-infecção por T. cruzi, evidenciado pela disfunção ventricular e dilatação do ventrículo esquerdo, e resultou em aumento da expressão miocárdica de RNAm de IL-10 e diminuição da expressão de iNOS. Em conjunto, na fase aguda, o parasitismo cardíaco parece determinar os níveis de expressão miocárdica de citocinas como TNF-α e IL-10 e genes ativados por TNF-α e IFN-γ, como iNOS. O baixo parasitismo e a menor expressão de citocinas no miocárdio dos animais assintomáticos sugere que estes foram capazes de controlar o parasitismo antes da sua disseminação pelos tecidos durante a fase aguda. Na fase crônica, embora níveis significativos de citocinas estejam presentes no miocárdio e a intensidade da inflamação local esteja envolvida na progressão da cardiomiopatia chagásica crônica para a forma dilatada, esses fatores parecem não ser determinantes para a morte dos animais cronicamente infectados. Isto indica que mecanismos inflamatórios têm importante papel patogênico na evolução da cardiomiopatia crônica pelo T. cruzi, porém não são suficientes para levar à morte. Palavras-chave: miocardite, hamsters, Trypanosoma cruzi, citocinas, miocardiopatia chagásica
ABSTRACT
BILATE A. M. B. Expressão de mediadores inflamatórios e progressão diferencial de miocardite aguda e cardiomiopatia chagásica crônica experimental em hamster sírio infectado por T.cruzi. 2006. 196f. Dissertação (Doutorado em Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
Chagas’ disease, caused by protozoan Trypanosoma cruzi, is a significant cause of mortality and morbidity in many Latin-American countries, where it is estimated that 13 million people may be infected. Previous results from our group show that, with a single combination of parasite (Strain Y) and genetically heterogeneous host (Syrian hamster), it is possible to reproduce the range of different outcomes of human Chagas’ disease. In the present study, we tested the hypothesis that the inflammatory infiltrate and its locally produced mediators may be related to morbidity and mortality in the acute phase and with the severity of chronic cardiomyopathy in the Syrian hamster model of T. cruzi infection using Strain Y. Like humans, hamsters infected by T. cruzi Strain Y show different patterns of evolution in both the acute and chronic phases. In the acute phase, 30-50% of animals showed symptoms such as cachexia, lethargy, vomiting, and diarrhea, which were related with mortality during this stage. The presence of circulating parasites on the 13th day post-infection (PI) was associated with intense cardiac parasitism on the date spontaneous death during the acute phase. High cardiac parasitism, in addition to its association with symptoms, was also associated with high expression of mRNA for IL-10, TNF-α, and genes activated by inflammatory cytokines (A20 and iNOS) in the myocardium. During the acute phase, blockade of TNF-α with Etanercept lead to increased parasitism in blood and heart and to increased expression of IL-10 in the myocardium of asymptomatic animals. In the chronic phase of infection, although the intensity of myocarditis was positively correlated with macroscopic dilation of the left ventricle, none of these variables were associated with death during the chronic phase. In this phase, there was a predominance of expression of mRNA for IFN-γ in the myocardium over that of TNF-α and IL-10, although the latter two were also detected at increased levels. Death during the chronic phase was associated only with the expression of A20. In the chronic phase, treatment with Etanercept worsened post-T. cruzi infection chronic cardiomyopathy, as measured by ventricular dysfunction and left ventricle dilation, and lead to increased expression of IL-10 and decreased expression of iNOS mRNAs in the myocardium. Overall, cardiac parasitism in the acute phase seems to determine the levels of expression of cytokines – such as TNF-α and IFN-γ – and genes activated by TNF-α and IFN-γ – such as iNOS. The low parasitism and cytokines in the myocardium of asymptomatic animals suggests that these animals were able to control parasitism before its dissemination to the tissues during the acute phase. In the chronic phase, although significant levels of cytokines were present in the myocardium and the intensity local inflammation is involved in the progression of Chagas’ disease cardiomyopathy to the dilated form, these factors seem not to be determinants of mortality in chronically infected animals. This indicates that inflammatory mechanisms play an important pathogenic role in the evolution of T. cruzi chronic cardiomyopathy, but are not sufficient to lead to death.
Key words: myocarditis, hamsters, Trypanosoma cruzi, cytokines, Chagasic cardiomyopathy
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO................................................................................................................................ 13 1.1 Considerações gerais e dados epidemiológicos.......................................................................... 13 1.2 Ciclo de vida e história natural da infecção por T. cruzi.............................................................. 13 1.3 Patogênese da cardiomiopatia chagásica crônica humana......................................................... 17 1.3.1 Aspectos anátomo-patológicos................................................................................................. 17 1.3.2 Aspectos imunológicos............................................................................................................. 18 1.3.2.1 Citocinas inflamatórias e modelos experimentais.................................................................. 19 1.3.2.2 Citocinas inflamatórias e estudos em humanos.................................................................... 23 1.4 Modelos animais para a cardiomiopatia da doença de Chagas.................................................. 28 2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................................. 30 3 OBJETIVOS....................................................................................................................................33 3.1 Objetivo Geral.............................................................................................................................. 33 3.2 Objetivos específicos................................................................................................................... 33 4 METODOLOGIA............................................................................................................................. 35 4.1 Desenho experimental................................................................................................................. 35 4.2 Obtenção, manutenção e manipulação dos animais................................................................... 40 4.3 Obtenção dos parasitas e infecção dos animais......................................................................... 40 4.4 Tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção ............................................................ 41 4.5 Avaliação da eficácia do tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção....................... 41 4.6 Tratamento com Etanercept na fase crônica da infecção ........................................................... 42 4.7 Avaliação da eficácia do tratamento com Etanercept na fase crônica da infecção..................... 43 4.8 Análise de sobrevida.................................................................................................................... 43 4.9 Coleta de sangue ........................................................................................................................ 44 4.10 Obtenção do soro ..................................................................................................................... 44 4.11 Detecção de parasitas circulantes ............................................................................................ 44 4.12 Análise ecocardiográfica da estrutura e função cardíaca.......................................................... 44 4.13 Análise histopatológica do tecido cardíaco .............................................................................. 45 4.13.1 Cálculo do índice de dilatação................................................................................................ 46 4.13.2 Quantificação da miocardite................................................................................................... 46 4.13.3 Detecção de antígenos de T. cruzi no tecido cardíaco........................................................... 47 4.13.4 Detecção de TNF-α no miocárdio .......................................................................................... 48 4.13.5 Detecção de imunocomplexos no miocárdio. ........................................................................ 49 4.14 Quantificação dos níveis de TNF bioativo................................................................................. 50 4.15 Determinação do efeito in vitro e in vivo do Etanercept sobre a atividade de TNF-α em hamster........................................................................................................................................ 51 4.16 Pesquisa de anticorpos séricos anti-T.cruzi.............................................................................. 52 4.17 Quantificação gênica por RT-PCR em tempo real..................................................................... 53 4.17.1 Extração de RNA ................................................................................................................... 53 4.17.2 Quantificação do RNA............................................................................................................ 54 4.17.3 Transcrição reversa ............................................................................................................... 55 4.17.4 Reação de RT-PCR em tempo real........................................................................................ 56 4.17.5 Especificidade e adequação dos primers .............................................................................. 57 4.17.6 Cálculo da eficiência de amplificação dos primers utilizados................................................. 58 4.18 Análise estatística ..................................................................................................................... 65 5 RESULTADOS............................................................................................................................... 66 5.1 Fase aguda da infecção pelo T. cruzi.......................................................................................... 66 5.1.1 Sinais e sintomas...................................................................................................................... 66 5.1.2 Parasitemia............................................................................................................................... 66 5.1.3 Análise anátomo-patológica...................................................................................................... 67 5.1.4 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio............................................................ 71 5.2 Efeito do Etanercept in vitro e in vivo sobre o bloqueio de TNF-α de hamster............................ 77 5.3 Efeito do tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção por T. cruzi ........................... 80 5.3.1 Parasitismo sanguíneo e cardíaco............................................................................................ 80 5.3.2 Detecção de TNF-α no miocárdio ............................................................................................ 85
5.3.3 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio ........................................................... 88 5.4 Evolução da infecção por T. cruzi em hamsters: Fase aguda e Fase crônica ........................... 95 5.4.1 Fase aguda............................................................................................................................... 95 5.4.2 Fase crônica ............................................................................................................................ 103 5.4.3 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio: fase aguda X fase crônica ................ 124 5.5 Efeito do tratamento com Etanercept na fase crônica da infecção pelo T. cruzi ........................ 125 5.5.1 Mortalidade............................................................................................................................... 125 5.5.2 Análise ecocardiográfica........................................................................................................... 126 5.5.3 Análise histopatológica ............................................................................................................ 130 5.5.4 Investigação das causas do agravamento da cardiomiopatia.................................................. 133 5.5.5 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio............................................................ 136 6 DISCUSSÃO....................................................................................................................................141 7 CONCLUSÕES ...............................................................................................................................171 REFERÊNCIAS...................................................................................................................................173 ANEXOS............................................................................................................................................ 188
Introdução
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais e dados epidemiológicos
A Doença de Chagas (Tripanosomíase Americana) ocasionada pela infecção
pelo protozoário Trypanosoma cruzi é uma causa significante de morbidade e
mortalidade em muitos países da América do Sul e Central, onde estima-se que 13
milhões de pessoas podem estar infectadas (MOUL e LAZDINS, 2003). Somente no
Brasil, 17.000 mortes foram atribuídas à doença de Chagas em 1995 (AKHAVAN,
1996), e dados recentes da Organização Mundial de Saúde (WHO, 2002) mostram a
incidência de aproximadamente 300.000 novos casos por ano. Apesar do eficiente
controle da transmissão vetorial e em bancos de sangue (MONCAYO, 2003),
responsável pela redução da morbidade e mortalidade decorrente da forma crônica,
ainda existem milhões de pacientes portadores da doença de Chagas que
continuam sob risco de vida na América Latina e no Brasil, necessitando de
tratamento adequado. Além disso, mesmo que se bloqueie completamente a
transmissão vetorial, persistirá o problema nos indivíduos já infectados sob potencial
risco de desenvolver a cardiomiopatia chagásica crônica (CCC), a principal causa de
morbidade e mortalidade.
1. 2 Ciclo de vida e história natural da infecção por T. cruzi
O ciclo de vida do T. cruzi envolve dois hospedeiros intermediários – inseto
triatomíneo hematófago e mamífero – e quatro estágios de desenvolvimento – dois
no hospedeiro invertebrado, epimastigota e tripomastigota metacíclico, e dois no
hospedeiro mamífero, amastigota e tripomastigota sanguíneo. Os epimastigotas se
replicam extracelularmente no intestino médio do triatomíneo e se diferenciam em
tripomastigotas metacíclicos no reto. No momento do repasto sanguíneo, são
Introdução
14
eliminados pelas fezes, contaminando o hospedeiro mamífero. As formas
metacíclicas invadem o citoplasma de diversos tipos de células do hospedeiro
mamífero e se diferenciam em amastigotas replicativas. Após intensa replicação, os
amastigotas se diferenciam em tripomastigotas que, após a ruptura da célula,
ganham a circulação, onde infectam novas células, dando continuidade ao ciclo de
replicação. Após vários ciclos de invasão-replicação, os parasitas se disseminam no
sangue e em diferentes tecidos (NEIVA, 1910).
A doença de Chagas é caracterizada por duas fases distintas: fase aguda e
fase crônica. A fase aguda no homem, em geral, é de quadro clínico benigno e
autolimitado, durando em torno de 60 a 90 dias. É caracterizada pelo elevado
parasitismo sanguíneo e tecidual, e pode cursar de forma oligosintomática ou
assintomática na grande maioria dos indivíduos infectados. Apenas 10% dos
indivíduos infectados por T. cruzi, especialmente crianças, apresentam alguma
manifestação clínica na fase aguda onde a miocardite e parasitismo cardíaco
evidente estão presentes na grande maioria dos casos (Figura 1), dos quais apenas
2-7% são fatais (PAEADA et al., 1997; ANDRADE, 1999). Após a fase aguda,
interpõe-se longo período de parasitemia controlada e ausência de manifestações
clínicas, que pode variar de duas a três décadas ou perdurar durante toda a vida do
indivíduo (DIAS et al., 1956). Esta fase chama-se forma indeterminada (IND) e
estima-se que mais de 70% dos indivíduos infectados permanecem nesta forma
(BRASIL, 1965). De acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde
(WHO, 2002) e de Belo Horizonte (ROCHA et al., 2003), pacientes da forma
indeterminada não apresentam alterações de eletrocardiograma, de raio X ou de
ecocardiograma. Uma pequena parcela dos indivíduos infectados (5-10%) pode
Introdução
15
desenvolver denervação da musculatura lisa parietal no tubo digestivo por motivos
ainda desconhecidos.
Figura 1. Miocardite aguda humana. Em (A) fotomicrografia em pequeno aumento (100X) de tecido cardíaco de um paciente com miocardite aguda. Em (B), maior aumento (400X). As setas apontam para o infiltrado inflamatório. Cortesia do Prof. Dr. Thales de Brito, Instituto de Medicina Tropical, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Ao longo de 5-30 anos após a primoinfecção, cerca de 30% do total de
indivíduos infectados previamente assintomáticos desenvolvem, em graus clínicos
variados, a forma cardíaca da doença de Chagas – a cardiomiopatia chagásica
crônica (CCC). Os graus clínicos de CCC variam desde discretas alterações de
eletrocardiograma (ECG) mas não de exames mais sensíveis, como o
ecocardiograma (CCC leve), a significativas alterações de ECG, como distúrbios de
condução e arritmia ventricular (CCC moderada), e ainda, alterações de ECG, raio X
e/ou de ecocardiograma, com ou sem sinais de dilatação das câmaras cardíacas
(CCC grave) (WHO, 2002; ROCHA et al., 2003). Dos 30% dos pacientes que
evoluem para CCC, apenas 1/3 desenvolvem a CCC grave, com distúrbios de
condução e arritmias que exigem a implantação de marcapasso. Essa parcela de
pacientes (equivalente a 1 milhão dos pacientes) freqüentemente desenvolve
significativa disfunção do ventrículo esquerdo (VE), que pode ser global ou difusa,
e/ou dilatação das câmaras cardíacas e insuficiência cardíaca congestiva (ICC)
Introdução
16
refratária cuja a única alternativa terapêutica é o transplante cardíaco (MACÊDO,
1982; ROSSI, 1991; DIAS et al., 2000). A disfunção do VE é o substrato para a
instalação da síndrome de insuficiência cardíaca congestiva (ICC). A disfunção do
VE ocorre quando o coração é incapaz de manter seu desempenho normal frente a
uma agressão como, perda de massa muscular, diminuição da capacidade contrátil,
sobrecarga de pressão ou de volume e restrição ao enchimento ventricular
(MATSUBARA et al., 1990). Diante de uma agressão, o volume de sangue ejetado
pelo VE diminui e, conseqüentemente, mecanismos reativos ou compensatórios são
ativados para restaurar o fluxo sanguíneo normal. A diminuição do volume ejetado
desencadeia a dilatação ventricular devido ao maior acúmulo de sangue dentro da
cavidade durante a diástole.
Alguns trabalhos sugerem que a insuficiência cardíaca de etiologia chagásica
possa ter pior prognóstico com sobrevida após estabelecimento dos sintomas de 2-4
vezes menor do que a de outras etiologias, como a doença isquêmica e
cardiomiopatia dilatada idiopática (CDI) (MADY et al., 1994; PEREIRA-BARRETO,
1995; BESTETTI e MUCCILLO, 1997; FREITAS et al., 2005). A elevada mortalidade
da CCC está relacionada ao fato de não existir terapia específica eficiente. Uma vez
que os agentes quimioterápicos anti-T. cruzi são pouco eficazes em evitar a
progressão das lesões cardíacas características da CCC (LAURIA-PIRES et al.,
2000; URBINA, 2001; CERECETTO e GONZALEZ, 2002), o tratamento disponível
atualmente é apenas sintomático com drogas cardiovasculares direcionadas para
combater as conseqüências da agressão miocárdica. A ausência de alternativas de
tratamento está relacionada ao conhecimento limitado que se tem da patogênese
das lesões crônicas e da biologia do parasita. Como exemplo, o conhecimento dos
mecanismos imunológicos envolvidos no controle da replicação do parasita e os
Introdução
17
fatores de suscetibilidade que levam 30% dos indivíduos a desenvolver a CCC após
a infecção pelo T. cruzi poderiam auxiliar no desenvolvimento de terapias
específicas.
1. 3 Patogênese da cardiomiopatia chagásica crônica humana
1.3.1 Aspectos anatomo-patológicos
As principais características anatomo-patológicas da CCC são a dilatação das
câmaras cardíacas, aumento acentuado do peso do coração, aneurisma apical e
trombose mural em pacientes chagásicos crônicos que faleceram pela insuficiência
cardíaca (KÖBERLE, 1968; OLIVEIRA et al., 1981; SAMUEL et al., 1983). O
principal achado histopatológico de biópsias endomiocárdicas de pacientes com
CCC grave, que diferencia das outras cardiomiopatias, é uma miocardite crônica
focal e/ou difusa, responsável pela destruição progressiva das fibras cardíacas,
hipertrofia de cardiomiócitos e intensa fibrose (CARRASCO-GUERRA et al., 1987;
HIGUCHI et al., 1987; ROSSI, 1991). O infiltrado inflamatório é composto por
macrófagos (50%), células B (10%), células T (40%) (MILEI et al., 1992), com uma
predominância de 2:1 de células T CD8+ sobre células T CD4+ (HIGUCHI et al.,
1993; TOSTES et al., 1994). Histiócitos e células endoteliais do tecido cardíaco de
CCC apresentam expressão aumentada de moléculas HLA de classe I e de classe II,
ICAM-1 (do inglês, intercellular adhesion molecule – 1) e selectina-E, enquanto que
os cardiomiócitos expressam níveis elevados de HLA de classe I, provavelmente em
resposta à produção local de citocinas inflamatórias (HIGUCHI et al., 1987; REIS et
al., 1993; ABEL et al., 2001).
Estudo realizado com biópsias endomiocárdicas de pacientes portadores da
doença de Chagas mostrou que apenas 15% dos pacientes na forma indeterminada
Introdução
18
apresentaram miocardite, enquanto que 62% dos pacientes com alterações
eletrocardiográficas mas sem dilatação ou ICC apresentaram miocardite. No grupo
de pacientes portadores de CCC com dilatação e ICC, 92% apresentou miocardite
(HIGUCHI et al., 1987), ilustrando o papel da miocardite na progressão para as
formas graves de CCC. A Figura 2 mostra um corte histológico de tecido cardíaco de
um paciente com CCC grave com intenso infiltrado inflamatório. A fibrose, mais
intensa na CCC do que em outras cardiomiopatias (ROSSI, 1991; HIGUCHI et al.,
1999), destaca-se como componente fundamental do processo de desorganização
funcional e estrutural do coração, que culmina na falência do órgão.
Figura 2. Miocardite da cardiomiopatia chagásica humana. Em (A) fotomicrografia em
pequeno aumento (100X) de tecido cardíaco de um paciente com CCC grave.
Em (B), maior aumento (400X). As setas apontam para o infiltrado inflamatório.
Cortesia do Prof. Dr. Thales de Brito, Instituto de Medicina Tropical, Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
1. 3. 2 Aspectos imunológicos
Os mecanismos determinantes da progressão da miocardite crônica focal de
baixa intensidade observada na forma indeterminada para o dano miocárdico
extenso e progressivo típico da CCC ainda não foram completamente elucidados.
Introdução
19
Entretanto, mecanismos inflamatórios parecem desempenhar um papel importante
na patogenia da CCC. Dados da literatura apóiam a hipótese que a resposta imune
disparada pela persistência do parasita ou por antígenos próprios do hospedeiro, ou
ambas, participa da geração e/ou manutenção das lesões cardíacas típicas da CCC
(CUNHA-NETO et al., 2006; DOS REIS et al., 2005). A elevada carga parasitária
desencadeia respostas celular e humoral anti-T. cruzi capazes de controlar, mas não
de eliminar completamente o parasita. Assim, uma infecção persistente de baixo
grau se estabelece, podendo ser reativada em condições de imunossupressão
(ALMEIDA et al., 1996; BOCCHI et al., 1998). A progressão diferencial para a CCC
ou para a forma indeterminada ocorre na presença de infecção persistente no
miocárdio em ambas as formas clínicas (JONES et al., 1993; ANEZ et al., 1999) e o
fato de apenas 30% desenvolver a CCC sugere o envolvimento de mecanismos
genéticos de suscetibilidade. Casos de agregação familiar na CCC apóiam essa
hipótese (ZICKER et al., 1990). Para elucidar os fatores ligados ao hospedeiro que
controlam a suscetibilidade diferencial ao desenvolvimento da doença, vários grupos
têm estudado a regulação da produção de citocinas na CCC.
1. 3. 2. 1 Citocinas inflamatórias e modelos experimentais
As citocinas inflamatórias desempenham um papel central na resistência à
infecção aguda pelo T. cruzi. Logo após a infecção, o parasita estimula macrófagos
a produzir citocinas inflamatórias, como TNF-α e IL-12. A produção de IL-12 estimula
a síntese de IFN-γ por linfócitos e células NK que, em conjunto com o TNF-α, ativa
macrófagos a produzir as espécies reativas de nitrogênio e oxigênio, que irão
destruir os parasitas e, dessa forma, controlar a disseminação do parasitismo. Já foi
mostrado que o IFN-γ inibe a replicação do parasita in vivo e in vitro, através da
Introdução
20
indução da síntese de óxido nítrico (NO, do inglês, nitric oxide) por macrófagos
(GAZZINELLI et al., 1992) e que esta atividade tripanocida é dependente de TNF-α
(SILVA et al., 1995). Esse aumento de citocinas inflamatórias é desencadeado
principalmente por âncoras de glicosilfosfatidilinositol, presentes em abundância na
membrana do T. cruzi, que se ligam em receptores do tipo Toll (TLR, do inglês, Toll
like receptors) presentes nos macrófagos. Camundongos geneticamente deficientes
de citocinas inflamatórias (IL-12, IFN-γ) ou de seus receptores (TNFR1, IFNR), ou de
moléculas induzidas por citocinas inflamatórias, como a óxido nítrico sintase
induzível (iNOS, do inglês, inducible nitric oxide synthase), são mais suscetíveis à
infecção aguda por T. cruzi, apresentando maior parasitismo e mortalidade (HUANG
et al., 1999; MICHAILOWSKY et al., 2001; ALIBERTI et al., 2001; CAMPOS et al.,
2004). Por outro lado, citocinas com atividade anti-inflamatória, como a IL-10,
também participam da infecção aguda por T. cruzi (SILVA et al., 1992; HOLSCHER
et al., 2000). Já foi mostrado que linhagens de camundongos naturalmente
resistentes (B6D2 – (C56BL/6 X DBA)F1) à infecção pela cepa TULAHUEN de T.
cruzi se tornaram suscetíveis quando tratados com anticorpo anti-IFN-γ e esta
suscetibilidade estava relaciona ao aumento da produção de IL-10 (SILVA et al.,
1992). Entretanto, camundongos deficientes de IL-10 infectados com a cepa
Tulahuem de T. cruzi, apesar de controlarem a parasitemia de maneira eficiente
devido ao aumento substancial de IFN-γ e TNF-α, desenvolvem uma resposta
inflamatória exacerbada que culmina na morte por choque tóxico mediado por TNF-α
(HOLSCHER et al., 2000). Esse resultado indica um papel deletério das citocinas
inflamatórias na infecção pelo T. cruzi.
O papel do TNF-α na infecção aguda por T. cruzi é controverso, com
diferentes estudos mostrando efeitos tanto protetores como prejudiciais. Essa
Introdução
21
aparente contradição parece estar relacionada não somente as diferenças de
abordagem experimental (por exemplo, uso de camundongos geneticamente
deficientes), mas também a questões inerentes às diferentes linhagens de
camundongos e cepas de T. cruzi. Camundongos suscetíveis à infecção pelo T.
cruzi (C3H infectados com a cepa CL ou Colombiana ou BALB/c infectados com a
cepa Tulahuen) apresentam níveis elevados de TNF-α circulante durante a fase
aguda e esses níveis se correlacionam com a parasitemia e mortalidade nesta fase
da infecção (RUSSO et al., 1989; STAROBINAS et al., 1991; TRUYENS et al.,
1999). Por outro lado, camundongos deficientes do receptor p55 de TNF-α (TNFR1)
apresentam elevada parasitemia e mortalidade quando infectados pela cepa Y de T.
cruzi, mostrando o papel do TNF-α no controle da infecção aguda (ALIBERTI et al.,
2001). Em conjunto, esses trabalhos sugerem que níveis aumentados de citocinas
inflamatórias e o desequilíbrio de citocinas inflamatórias vs. anti-inflamatórias podem
ser os responsáveis pela suscetibilidade à infecção aguda.
Em modelos murinos de infecção crônica (camundongos C57BL/6 ou
C3H/HeSnJ infectados com a cepa Brazil ou Sylvio X10/4, respectivamente), já foi
relatada a presença abundante de células produtoras de TNF-α no infiltrado
inflamatório miocárdico (ZHANG e TARLETON, 1996). Além disso, camundongos
C56BL/6 infectados por 60 ou 120 dias com a cepa Colombiana apresentaram
expressão elevada de TNF-α e IFN-γ no miocárdio (TALVANI et al., 2000). Nesse
trabalho, a expressão de IL-10 e IL-4 foi detectada em níveis ainda mais elevados,
comparáveis aos níveis de TNF-α e IFN-γ detectados em períodos mais precoces da
infecção. Nesta linha, a produção elevada de IFN-γ em camundongos deficientes de
IL-4 resultou em aumento significativo da miocardite crônica pós-infecção com a
cepa Colombiana de T. cruzi (SOARES et al., 2001). Em conjunto, os resultados
Introdução
22
sugerem a participação das citocinas inflamatórias na geração das lesões cardíacas
pós-infecção por T. cruzi e que IL-10 e IL-4 desempenham um possível papel
regulador da atividade inflamatória.
Além das citocinas inflamatórias participarem da patogênese da miocardite
chagásica, elas também parecem desempenhar importante papel em modelos de
cardiomiopatia não infecciosa. Modelos de camundongos transgênicos com
superexpressão de TNF-α e MCP-1 (quimiocina induzida por IFN-γ) seletivamente
no miocárdio desenvolvem espontaneamente, miocardite, dilatação das câmaras
cardíacas e disfunção ventricular (KOLATTUKUDY et al., 1998; KUBOTA et al.,
2000; SIVASUBRAMANIAN et al., 2001). No modelo de Kubota e colaboradores
(2000), o tratamento com receptor solúvel p55 do TNF-α (TNFR1) reverteu os efeitos
causados pelo excesso de TNF-α no miocárdio, mostrando que a inibição desta
citocina pode ser uma estratégia para controlar os seus efeitos amplificadores na
resposta inflamatória no miocárdio (KUBOTA et al., 2000). Nesta linha,
camundongos tratados com anticorpo neutralizante anti-TNF-α ou camundongos
deficientes de TNFR1 não desenvolvem miocardite auto-imune induzida por miosina
(SMITH e ALLEN, 1992; BACHMAIER et al., 1997). Em modelos animais de ICC, o
bloqueio da atividade de TNF-α com Etanercept (receptor solúvel p75 humano –
TNFR2 – conjugado com porção Fc de IgG1 humana) resultou em melhora da
função cardíaca (LI et al., 2002; MOE et al., 2004; PENG et al., 2003) e acelerou a
recuperação do endotélio vascular de ratos após indução de dano cardiovascular por
balão (KRASINSKI et al., 2001). Em humanos, o tratamento com Etanercept como
antagonista da ação de TNF-α apresentou resultados promissores no tratamento da
insuficiência cardíaca avançada em ensaios clínicos com pequenos números de
pacientes (DESWAL et al., 1999; FICHTLSCHERER et al., 2001). Em conjunto,
Introdução
23
esses resultados sugerem a participação de citocinas e quimiocinas inflamatórias na
indução de cardiomiopatia. Portanto, o bloqueio da atividade de TNF-α por meio do
Etanercept, poderia auxiliar a elucidar o papel patogenético desta citocina em
modelo experimental de CCC.
1. 3. 2. 2 Citocinas inflamatórias e estudos em humanos
Diferentes grupos já mostraram que pacientes com CCC apresentam níveis
circulantes aumentados de citocinas inflamatórias (FERREIRA et al., 2003; TALVANI
et al., 2004; PÉREZ-FUENTES et al., 2003; D’ANGELO-MENDONZA et al., 2005;
MOCELIN et al., 2005). Além disto, observa-se que a produção de citocinas
inflamatórias é maior por células de pacientes com CCC do que por células de
pacientes com a forma indeterminada (ABEL et al., 2001; GOMES et al., 2003;
SOUZA et al., 2004).
Nosso grupo mostrou que a freqüência de células mononucleares do sangue
periférico produtoras de IFN-γ é maior entre os pacientes com CCC em comparação
aos pacientes da forma IND após estímulo com fitohemaglutinina (PHA) (ABEL et al.,
2001). Nesta linha, outros grupos também mostraram que células mononucleares de
sangue periférico de pacientes com CCC estimuladas com antígenos de
tripomastigotas produzem mais IFN-γ e menos IL-10 do que as de pacientes IND.
Nesse trabalho, a elevada produção de IFN-γ se correlacionou com a gravidade do
acometimento cardíaco (GOMES et al., 2003). Além disso, células T infiltrantes das
lesões cardíacas obtidas de pacientes com CCC produzem IFN-γ e TNF-α mas não
produzem IL-4 quando estimuladas com PHA (CUNHA-NETO et al., 1998). Este
achado está de acordo com resultados anteriores que mostraram a presença
abundante de IFN-γ e TNF-α no tecido cardíaco de pacientes com CCC grave (REIS
Introdução
24
et al., 1993; REIS et al., 1997). Além disso, pacientes com CCC apresentam níveis
séricos elevados de TNF-α associados à gravidade da CCC (PÉREZ-FUENTES et
al., 2003). Dados do nosso grupo mostraram que tanto pacientes portadores de CCC
como IND apresentam níveis elevados de TNF-α plasmático em comparação a
indivíduos sadios, porém entre os pacientes com CCC grave, os níveis de TNF-α
são significativamente mais elevados do que nos pacientes não graves (FERREIRA
et al., 2003). Nesta linha, já foi mostrado que entre os pacientes portadores de CCC
grave, o genótipo de alta produção de TNF-α (alelo 2 do polimorfismo –308 TNFa)
está relacionado a uma menor sobrevida (DRIGO et al., 2005). Além da CCC, o
TNF-α também está relacionado à gravidade de outras cardiomiopatias de etiologia
não chagásica (LEVINE et al., 1990) e está presente em abundância no tecido
cardíaco de pacientes portadores de cardiomiopatia idiopática (DOYAMA et al.,
1996).
Resultados de nosso grupo mostraram que quimiocinas induzidas por IFN-γ,
como CCL2/MCP-1, CXCL9/Mig e CXCL10/IP-10, estão seletivamente
superexpressas em amostras de miocárdio de pacientes com CCC em comparação
a pacientes com cardiomiopatia dilatada idiopática (CUNHA-NETO et al., 2005). As
causas para essa polarização na produção de citocinas/quimiocinas inflamatórias
ainda não foram completamente elucidadas. O perfil pró-inflamatório pode estar
relacionado ao fato de glicoconjugados (do tipo mucina) do parasita estimularem a
produção de IL-12 (CAMARGO et al., 1997). Em conjunto, esses resultados sugerem
que a inflamação crônica secundária a infiltração por células mononucleares e seus
produtos – citocinas e quimiocinas inflamatórias – poderiam contribuir para o dano
cardíaco observado na CCC humana.
Introdução
25
Apesar de as citocinas inflamatórias estimuladas pela infecção pelo T. cruzi e
o burst oxidativo e NO por elas desencadeados serem essenciais ao controle do
parasitismo da fase aguda, esses componentes podem exercer efeitos deletérios
sobre o hospedeiro, aumentando o estresse oxidativo no coração, contribuindo para
as lesões cardíacas típicas da CCC. Nessa linha, vários autores tem sugerido a
participação do estresse oxidativo na patogênese da CCC (ZACKS et al., 2005).
Camundongos infectados por T. cruzi por 120 dias apresentam elevada expressão
de moléculas relacionadas ao estresse oxidativo em mitocôndrias isoladas de
cardiomiócitos (VYATKINA et al., 2004) e diminuição da atividade de enzimas anti-
oxidantes no miocárdio (WEN et al., 2004), sugerindo um impedimento da ativação
de defesas anti-oxidantes.
O estresse oxidativo é o desequilíbrio entre a produção de espécies reativas
de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS) e as defesas anti-oxidantes (MALLIWELL e
GUTTERIGE, 2000). As ROS são produzidas pela ação de oxigenases e
apresentam potente efeito oxidante. As RNS – NO e seus derivados – são
produzidos pelas NO sintases (NOS). Conforme descrito anteriormente, o TNF-α
estimula a expressão de iNOS, resultando em aumento da produção de NO. No
coração, o NO atua na contratilidade miocárdica e relaxamento ventricular (HARE,
2003). Alguns trabalhos sugerem que o aumento da iNOS contribui para a disfunção
miocárdica em pacientes com ICC uma vez que o aumento de NO induzido pelo
TNF-α resulta em aumento do estresse oxidativo no coração, impedindo a ativação
de vias anti-oxidantes (HARE, 2003; CHAMPION et al., 2003). Em modelo murino de
infecção por T. cruzi, camundongos deficientes da expressão de iNOS apresentam
cardiomiopatia aguda menos intensa do que camundongos com expressão normal
de iNOS (HUANG et al., 1999). Nesta linha, a inibição de iNOS em camundongos
Introdução
26
transgênicos com superexpressão de TNF-α no miocárdio, que desenvolvem
cardiomiopatia dilatada e apresentam elevada expressão de iNOS, resultou em
melhora da função cardíaca (FUNAKOSHI et al., 2002), possivelmente pela
diminuição do estresse oxidativo.
Enzimas anti-oxidantes são expressas em resposta a produção de ROS e
diminuem os efeitos oxidantes danosos causado pelas ROS. As principais enzimas
anti-oxidantes são superóxido dismutases (SOD), catalases, peroxiredoxina e
glutationa peroxidase. A isoforma mitocondrial da superóxido dismutase do
manganês (MnSOD) responde por 70% da atividade de SOD no coração e 90% em
cardiomiócitos (ZACKS et al., 2005). A MnSOD é ativada tanto por TNF-α como por
IFN-γ e sua atividade anti-oxidante contribui para a regulação dos efeitos deletérios
causados por essas citocinas (WONG e GOEDDEL, 1988; WONG et al., 1989),
sendo considerada um gene protetor. A importância da MnSOD na regulação das
vias oxidantes no coração foi ressaltada em camundongos geneticamente
deficientes de MnSOD que morrem após 10 dias de vida por anormalidades
cardíacas como dilatação do ventrículo esquerdo, afilamento das paredes do
ventrículo e fibrose endocárdica (LI et al., 1995).
Já foi descrito que o estresse oxidativo aumenta a apoptose de cardiomiócitos
e que este fenômeno é revertido pela indução de expressão de MnSOD (YANG et
al., 2003). Na CCC humana já foi sugerido que a apoptose de cardiomiócitos
poderia contribuir para o desenvolvimento da insuficiência cardíaca (TOSTES et al.,
2005). Além da CCC, alguns trabalhos sugerem que a apoptose de cardiomiócitos
seja um dos mecanismos responsáveis pela perda de miocárdio viável na ICC
(OLIVETTI et al., 1997; NARULA et al., 1998; NARULA et al., 2001). Em modelos
experimentais de ICC, a apoptose de cardiomiócitos estava correlacionada ao grau
Introdução
27
de disfunção cardíaca (MOE et al., 2002; SABBAH, 2000; WENCKER et al., 2003).
Apesar do clássico papel do TNF-α na indução de apoptose via TNFR1, TNF-
α/TNFR1 também desencadeia a ativação de genes protetores com atividade anti-
apoptótica (AGGARWAL, 2003). Um dos genes protetores anti-apoptóticos ativados
pelo TNF-α é o A20 (LEE et al., 2000). Esse gene codifica uma proteína
citoplasmática do tipo zinc finger e é ativado pelo NFκB (do inglês, nuclear factor
kappa B) quando o NFκB é ativado pelo TNF-α via TNFR1 (HEYNINCK e
BEYAERT, 2005). Após a sua ativação, o A20 se liga ao TRAF2 (do inglês, TNF
receptor associated factor 2) e ao IKKγ (do inglês, inhibitor of NFκB kinase gamma),
e desta forma inibe a ativação de NFκB (COOPER et al., 1996; BEYAERT et al.,
2000). Camundongos tratados com TNF-α apresentam elevada expressão de RNAm
de A20 em diferentes órgãos em comparação a animais não tratados (LEE et al.,
2000). Neste trabalho, os autores mostraram também que camundongos deficientes
de A20 apresentam inflamação em diversos órgãos, caquexia e hipersensibilidade a
lipopolissacarídeo e a TNF-α. Além disso, as células desses animais são mais
suscetíveis à apoptose induzida por TNF-α (LEE et al., 2000). Esses resultados
mostram a importância do A20 na regulação de respostas inflamatórias induzidas
pelo TNF-α via NFκB. Além disso, dados da literatura mostram que o gene A20 está
aumentado em modelos animais de insuficiência cardíaca e que está relacionado a
ativação de vias anti-apoptóticas (COOK et al., 2003). A expressão dessas
moléculas ainda não foi descrita na cardiomiopatia chagásica.
Em conjunto, esses resultados mostram que o equilíbrio entre a ativação de vias
efetoras de dano cardíaco e vias de proteção pode estar relacionado aos
mecanismos de lesão miocárdica pós-infecção por T. cruzi.
Introdução
28
1. 4 Modelos animais para a cardiomiopatia da doença de Chagas
A contribuição dos modelos murinos de infecção aguda pelo T. cruzi para o
entendimento dos mecanismos de patogênese da miocardite pós-infecção já foi
amplamente estudada, conforme ressaltado anteriormente. Entretanto, os
mecanismos de controle da disseminação do parasitismo durante a fase aguda e a
evolução para a fase crônica ainda não foram completamente esclarecidos. A
maioria das linhagens de camundongos isogênicos é suscetível à infecção aguda
com curta sobrevida após a infecção, dependendo da linhagem de camundongo, da
cepa e inóculo de T. cruzi (WRIGHTSMAN et al., 1982; ANDRADE et al., 1985;
STAROBINAS et al., 1991; ROGGERO et al., 2002). O que se observa em uma
dada combinação de linhagem isogênica e cepa de T. cruzi é um mesmo padrão de
doença em todos os animais agudamente infectados: intensa miocardite, elevado
parasitismo e curta sobrevida em linhagens de camundongos suscetíveis, ou
miocardite leve com baixo parasitismo e sobrevida mais longa em camundongos
resistentes. Os modelos murinos de fase crônica, como camundongos C3H/HeSnJ
infectados com a cepa Sylvio X10/4 (ZHANG e TARLETON, 1996; MARINHO et al.,
1999) ou camundongos BALB/c infectados com a cepa Colombiana (SOARES et al.,
2001; PONTES DE CARVALHO et al., 2002), apesar de desenvolverem miocardite
multi-focal, não desenvolvem disfunção cardíaca ou dilatação das câmaras
cardíacas, características da CCC grave. Alguns autores já mostraram que coelhos,
ratos, cães e macacos podem desenvolver cardiomiopatia dilatada após infecção
crônica por T. cruzi (AMORIM, 1985; ANDRADE et al., 1987; ANDRADE et al., 1997;
CHAPADEIRO et al., 1988; DE LANA et al., 1988; TEIXEIRA et al., 1975; FALASCA
et al., 1990; ROSNER et al., 1989). Entretanto, lesões cardíacas significativas
Introdução
29
semelhantes às lesões típicas da CCC humana são pouco reprodutíveis, os animais
são de difícil manipulação, exigem experimentos mais longos e de alto custo.
Dados da literatura mostraram que o hamster sírio após 3-10 meses de infecção
por T. cruzi reproduz as principais características anatomopatológicas da forma
cardíaca crônica humana, com dilatação das cavidades ventriculares, especialmente
do ápice do ventrículo esquerdo e trombose mural; histopatologicamente foi relatado
infiltrado mononuclear multi-focal, freqüentemente acompanhado de fibrose
(RAMIREZ et al., 1994). Nossos resultados anteriores mostraram que os hamsters
não isogênicos infectados pela cepa Y de T. cruzi apresentam suscetibilidade
diferencial à infecção aguda, uma vez que 30% dos hamsters infectados morreram
entre a 3° e 4° semana de infecção enquanto 70% dos animais sobreviveram
(BILATE et al., 2003). Entre os sobreviventes foi possível observar, através de
métodos quantitativos, uma progressão diferencial para a cardiomiopatia,
mimetizando os diferentes fenótipos encontrados entre os pacientes acometidos
pela CCC humana. Nesse trabalho, os exames ecocardiográficos mostraram que o
estabelecimento da cardiomiopatia, medido pelo grau de disfunção do ventrículo
esquerdo, ocorreu a partir do 8° mês pós-infecção em uma pequena parcela dos
animais e em todos os animais sobreviventes após 12 meses de infecção. Além da
disfunção ventricular, histopatologicamente, encontramos diferentes graus de lesão
cardíaca, caracterizada por miocardite e fibrose, que variaram de moderada a
intensa. Em conjunto, os resultados sugerem que o hamster sírio infectado com a
cepa Y de T. cruzi é um modelo adequado para o estudo de mecanismos de
patogênese relacionados tanto ao desenvolvimento de fase aguda como da fase
crônica da doença de Chagas.
Justificativa
30
2 JUSTIFICATIVA
Ainda não são conhecidos os fatores envolvidos na evolução diferencial nas
fases aguda e crônica da infecção por T. cruzi. Apenas 10% dos indivíduos
infectados por T. cruzi apresentam alguma manifestação clínica na fase aguda onde
a miocardite e parasitismo cardíaco estão presentes na grande maioria dos casos,
dos quais apenas 2-7% são fatais (PARADA et al., 1997; ANDRADE, 1999).
Décadas após a primo-infecção, 30% dos indivíduos infectados por T. cruzi
desenvolvem alguma forma de cardiomiopatia, e desses, apenas 1/3 desenvolve a
cardiomiopatia grave com dilatação das câmaras cardíacas e insuficiência cardíaca
congestiva refratária (MACÊDO, 1982; ROSSI, 1991). Portanto, a identificação dos
fatores envolvidos na resistência/suscetibilidade é fundamental para o entendimento
dos mecanismos de patogênese da miocardite aguda e cardiomiopatia crônica e
para o estudo de novos alvos terapêuticos específicos para a cardiomiopatia da
doença de Chagas. Dados de modelos de camundongos geneticamente deficientes
de citocinas inflamatórias mostraram que estas apresentam papel indispensável no
controle da infecção aguda por T. cruzi (HOLSCHER et al., 1998; MICHAILOWSKY
et al., 2001; ALIBERTI et al., 2001). A cardiomiopatia chagásica crônica humana
apresenta pior prognóstico (MADY et al., 1994; BESTETTI e MUCCILLO, 1997;
FREITAS et al., 2005) e maior expressão de citocinas e quimiocinas no miocárdio
que as cardiomiopatias dilatadas de natureza não inflamatória (CUNHA-NETO,
2005). Uma vez que a frequência de miocardite e a produção periférica e
intralesional de citocinas inflamatórias estão associadas com a gravidade da CCC
em pacientes (HIGUCHI, 1987; GOMES et al., 2003; FERREIRA, 2003; TALVANI et
al., 2004; SOUZA et al., 2004; GOMES et al., 2005), é possível hipotetizar que
diversos mediadores inflamatórios produzidos localmente estejam envolvidos nos
Justificativa
31
mecanismos determinantes para a progressão para a CCC e evolução para seus
estágios mais graves. Por outro lado, os trabalhos que avaliam a produção local de
citocinas são realizados apenas com amostras de pacientes graves ou após
transplante, impossibilitando a comparação com pacientes em estágios menos
avançados da doença.
Para avaliar o papel da inflamação local na geração e progressão das lesões
cardíacas que podem levar à morte, tanto na fase aguda como na crônica, em uma
parcela significativa dos indivíduos infectados pelo T. cruzi, é necessário um modelo
animal que reproduza tanto a fase aguda como a fase crônica e seus diferentes
graus de lesões cardíacas, comumente encontrados entre os pacientes com CCC.
Dados da literatura e do nosso grupo mostraram que o hamster sírio infectado
por T. cruzi reproduz as principais características anatomopatológicas da forma
cardíaca crônica humana, com infiltrado inflamatório multi-focal ou difuso na
ausência de T. cruzi, intensa fibrose, disfunção ventricular, dilatação e óbito após 12
meses de infecção (RAMIREZ et al., 1994; BILATE et al., 2003), recapitulando a
história natural da CCC. Os hamsters não isogênicos apresentam variações
qualitativas dos fenótipos cardíacos, o que não ocorre com camundongos isogênicos
ou geneticamente modificados. Isso representa uma vantagem adicional para o
estudo da suscetibilidade diferencial ao desenvolvimento da miocardite aguda e
cardiomiopatia crônica, mimetizando os diferentes fenótipos cardíacos encontrados
entre os pacientes acometidos pela doença de Chagas
Portanto, o hamster sírio pode ser considerado um modelo adequado para o
estudo dos mecanismos de patogênese da miocardite aguda e da cardiomiopatia
crônica e dos fatores envolvidos na progressão das formas leves e graves de
Justificativa
32
cardiomiopatia, bem como para testar novas abordagens terapêuticas para o
controle da CCC, fornecendo resultados em curto prazo.
Com o objetivo de investigar o papel da inflamação e seus mediadores na
miocardite aguda e cardiomiopatia crônica pós-infecção por T. cruzi avaliamos a
expressão de citocinas pró- e anti-inflamatórias e genes ativados por citocinas
inflamatórias em hamsters aguda e cronicamente infectados por T. cruzi e a sua
relação com a gravidade das fases aguda e crônica. Baseado em dados da literatura
que mostram o importante papel do TNF-α no controle da miocardite e da
parasitemia da fase aguda pelo T. cruzi em camundongos (RUSSO et al., 1991;
SILVA et al., 1995; ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996; ALIBERTI et al., 2001) e a
associação entre níveis aumentados de TNF-α plasmático e a gravidade da CCC
humana (FERREIRA et al., 2003; TALVANI et al., 2004; PÉREZ-FUENTES et al.,
2003), verificamos se o TNF-α também desempenhava algum papel (benéfico ou
deletério) na miocardite aguda e cardiomiopatia crônica em hamster sírios infectados
por T. cruzi. Para tal, testamos o efeito do bloqueio do TNF-α pelo Etanercept nas
fases aguda e crônica. O bloqueio de TNF-α somente na fase crônica da CCC
experimental permite avaliar o papel do TNF-α no desenvolvimento da CCC sem
influenciar o curso da fase aguda, onde o TNF-α tem papel protetor, enquanto que
em camundongos geneticamente deficientes dessa citocina isso não é possível. A
identificação dos fatores envolvidos na resistência/suscetibilidade poderá indicar
potenciais alvos terapêuticos que impeçam o desenvolvimento da CCC ou a
progressão para as formas graves.
Objetivos
33
3 OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar o papel do infiltrado inflamatório e expressão de citocinas e genes
ativados por citocinas inflamatórias na evolução das fases aguda e crônica da
infecção pelo T. cruzi em hamsters sírios.
Objetivos específicos
1. Analisar o perfil de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por
citocinas na infecção aguda e crônica pelo T. cruzi;
2. Investigar se o parasitismo cardíaco e a miocardite na fase aguda da
infecção pelo T. cruzi estão relacionados à expressão de citocinas e genes
ativados por citocinas no miocárdio;
3. Investigar se a gravidade da cardiomiopatia crônica pós-infecção por T. cruzi
está relacionada à miocardite e à expressão de citocinas e genes ativados
por citocinas no miocárdio;
4. Comparar a expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por
citocinas no na miocardite aguda e cardiomiopatia crônica;
5. Investigar o efeito do bloqueio de TNF-α nas fases aguda e crônica da
infecção pelo T. cruzi no hamster sírio sobre a miocardite aguda e
cardiomiopatia crônica, respectivamente.
Objetivos
34
Para cumprir esses objetivos, estabelecemos como metas:
(1) Analisar a mortalidade durante a infecção aguda e crônica
(2) Quantificar a intensidade de miocardite e parasitismo cardíaco na fase aguda da
infecção;
(3) Avaliar o desenvolvimento de disfunção ventricular e dilatação das câmaras
cardíacas na fase crônica da infecção pelo T. cruzi;
(4) Quantificar a intensidade de miocardite na fase crônica da infecção;
(5) Analisar a expressão miocárdica de RNAm de citocinas inflamatórias (TNF-α,
IFN-γ) e anti-inflamatórias (IL-10) e de genes ativados por citocinas inflamatórias
nas fases aguda e crônica da infecção pelo T. cruzi.
Metodologia
35
4 METODOLOGIA
4.1 Desenho experimental
Metodologia
36
Efeito in vivo do Etanercept sobre a fase aguda da infecção por T. cruzi
Grupo I Etanercept
(2,5mg/Kg via s.c) (n = 12)
Infecção i.p. com 105 tripomastigotas
sanguíneos da cepa Y de
Etanercept 2X/semana
(2,5mg/Kg via s.c)
Dia 1
Dias 5, 8, 12, 16
Parasitemia: Contagem direta
Dias 5, 8, 14, 21
Sacrifício
Dia 21
• Análise histopatológica: Quantificação ninhos no miocárdio Determinação da área ocupada por antígeno de T. cruzi Determinação da área de inflamação Detecção de células TNF-α positivas • Sorologia anti-T. cruzi: ELISA direto antígeno específico Determinação dos títulos de IgG anti-extrato alcalino de epimastigotas • Expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas: RT-PCR em tempo real para TNF-α, IFN-γ, IL-10, iNOS, MnSOD, A20
Desenho experimental I
Avaliação sintomas clínicos: caquexia, letargia, febre, vômito e diarréia
Grupo II Sem tratamento
(n = 12)
Grupo III Controles não
infectados (n = 6)
Injeção de solução salina
Controles sem tratamento (n = 12)
Metodologia
37
9 meses PI
Infecção com 105 formas tripomastigotas de
T. cruzi cepa Y (n=74)
Controles injetados com solução salina
(n=13)
Controles tratados com Etanercept s.c. 2.5mg/Kg/
2x/semana/ 10 semanas (n=7)
Infectados sem
tratamento (n=19)
Infectados tratados com Etanercept s.c.
2.5mg/Kg/ 2x/semana/10 semanas
(n=13)
Hamsters sírios fêmeas (10 semanas) (n=94)
Análise ecocardiográfica basal
Medida da parasitemia
13 dias PI
8 meses PI
Análise ecocardiográfica
11 meses PI
• Curva de sobrevida; análise ecocardiográfica; parasitemia; sorologia para T. cruzi • Análise anátomo-patológica e morfométrica do coração: presença de dilatação e miocardite • Análise imunohsitoquímica para detecção de: antígenos de T. cruzi, células TNF-α+, imunocomplexos de IgG • RT-PCR em tempo real: análise da expressão de RNAm de citocinas (TNF-α, IFN-γ, IL-10) e genes ativados por citocinas (iNOS, MnSOD, A20) no miocárdio.
Medida da parasitemia
Desenho experimental II
Efeito do Etanercept sobre o desenvolvimento da cardiomiopatia crônica pós-infecção por T. cruzi
Controles injetados com solução salina
(n=13)
9 e 10 meses PI
Metodologia
38
Injeção i.p. de LPS (10mg/kg)
90 minutos
Coleta de soro
Quantificação dos níveis séricos de TNF-α/LT-α bioativos
Bioensaio de citotoxicidade a células L929
Efeito in vitro do Etanercept sobre a bioatividade de TNF-α/LT-α de hamster
Desenho experimental III
Soro hamster ( TNF-α bioativo) ou
TNF-α recombinante humano
Quantificação dos níveis séricos de TNF-α/LT-α bioativos
Bioensaio de citotoxicidade a células L929
Soro hamster ( TNF-α bioativo) ou TNF-α recombinante humano + Etanercept (14, 140, 1400pg/ml)
Metodologia
39
Efeito in vivo do Etanercept sobre bloqueio da bioatividade de TNF-α em modelo de endotoxemia
2h
Etanercept (2,5mg/Kg via s.c.)
n=6
90 minutos
Coleta de soro
Coleta de soro (Tempo zero)
Quantificação dos níveis séricos de TNF-α/LT-α Bioensaio de citotoxicidade a células L929
Solução salina s.c n=6
Desenho experimental IV
Injeção i.p. LPS (10mg/kg)
Metodologia
40
4.2 Obtenção, manutenção e manipulação dos animais
Hamsters sírios não isogênicos (Mesocricetus auratus) de 2 meses de idade e
do sexo feminino foram obtidos do Biotério Central da Faculdade de Medicina da
USP e mantidos com ração e água filtrada ad libitum no biotério do Instituto de
Medicina Tropical da Faculdade de Medicina da USP. Para os procedimentos longos
(> 20 minutos), os animais foram previamente anestesiados com 250 mg/Kg de
tribromoetanol ou 50 mg/Kg de pentobarbitol via intraperitoneal. Para os
procedimentos curtos (< 20 minutos), os animais foram anestesiados via inalatória
com éter etílico.
Para os experimentos de fase aguda e de fase crônica da infecção por T.
cruzi, os animais foram identificados com chip PINOS TRANSPONDER ID100
(Trovan, ULM, Alemanha) implantado no subcutâneo de cada animal. A cada
procedimento, os chips eram escaneados com leitor ótico (Trovan, ULM, Alemanha)
para obtenção do código do chip.
4.3 Obtenção dos parasitas e infecção dos animais
Dez camundongos BALB/c foram infectados com 105 formas tripomastigotas
de cultura da cepa Y de Trypanosoma cruzi e após 7 dias foram submetidos a
sangria total para obtenção das formas tripomastigotas sangüíneas. Para a obtenção
da suspensão de parasitas para a infecção dos hamsters, uma alíquota de sangue
dos camundongos infectados foi diluída em tampão de lise de hemácias e os
tripomastigotas foram contados pelo método de contagem direta em câmara de
Neubauer. Após a contagem, os parasitas foram diluídos em solução salina e 105
formas tripomastigotas por 400 µl foram injetadas via intraperitoneal em cada
Metodologia
41
hamster. Como controle, foram utilizados animais sadios não infectados da mesma
idade, injetados com salina no mesmo dia da infecção.
4.4 Tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção
Nos dias zero (antes da infecção), 5, 8,12 e 16 PI, um grupo de 12 animais foi
tratado com 2,5 mg/Kg de Etanercept via subcutânea a cada 72 h, totalizando 5
injeções. Os animais foram sacrificados 21 dias PI para análise do efeito do
tratamento, conforme descrito a seguir. Este esquema experimental foi baseado em
trabalhos da literatura que mostraram que após 5, 10 e 15 dias de infecção por T.
cruzi ocorre aumento significativo de RNAm de TNF-α no miocárdio
(CHANDRASEKAR et al., 1998) e em trabalhos que utilizaram anticorpo monoclonal
neutralizante anti-TNF-α para tratar camundongos antes da infecção e após 7 dias e
sacrifício após 12 dias de infecção (ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996). A dose
de Etanercept foi escolhida baseada em protocolos descritos na literatura para
modelos experimentais de disfunção cardíaca em ratos e camundongos
(KRASINSKI et al., 2001; PENG et al., 2003). Como controle, 12 animais foram
infectados e não receberam tratamento e 6 animais não foram infectados nem
tratados.
4.5 Avaliação da eficácia do tratamento com Etanercept na fase aguda da
infecção
Após 21 dias de infecção (15 dias pós-tratamento), os animais foram
avaliados quanto a presença ou ausência de sintomas de fase aguda e sacrificados
por injeção intracardíaca de KCl 3 M após indução de anestesia com pentobarbital.
O coração foi retirado e o tecido cardíaco processado para estudo histopatológico,
Metodologia
42
onde analisou-se a presença de miocardite, e imunohistoquímica para detecção de
antígenos de T. cruzi e TNF-α. A ponta do ventrículo esquerdo (VE) foi congelada
para posterior extração de RNA para avaliação da expressão de citocinas (TNF-α,
IFN-γ e IL-10) e genes ativados por citocinas (iNOS, MnSOD, A20) por RT-PCR em
tempo real.
4.6 Tratamento com Etanercept na fase crônica da infecção
A partir do 9° mês de infecção, os animais foram divididos aleatoriamente em
2 grupos: 1) infectados sem tratamento; 2) infectados e tratados por via subcutânea
(s.c.) com 2,5 mg/Kg de Etanercept (Immunex Co, Seatle, EUA) 2x/semana por 70
dias. O período escolhido para início dos tratamentos foi o 9° mês pós-infecção com
o objetivo de avaliar o efeito do bloqueio de TNF-α na prevenção da progressão para
a forma grave da cardiomiopatia e também no tratamento da disfunção ventricular já
instalada, uma vez que nossos resultados anteriores (BILATE et al., 2003)
mostraram que 8 meses pós-infecção em torno de 50% dos animais infectados
apresentaram disfunção ventricular enquanto o restante apresentou função
ventricular preservada. O esquema de tratamento com Etanercept foi baseado em
protocolos descritos na literatura para tratamento de pacientes com insuficiência
cardíaca (BOZKURT et al., 2001). A dose de 2,5 mg/Kg de Etanercept foi escolhida
baseada em protocolos descritos na literatura para modelos experimentais de
disfunção cardíaca em ratos e camundongos (KRASINSKI et al., 2001; PENG et al.,
2003). Como controle de toxicidade da terapia, um grupo de 7 animais sadios,
pareados para idade e sexo, foram submetidos ao mesmo esquema e tempo de
tratamento com Etanercept.
Metodologia
43
4.7 Avaliação da eficácia do tratamento com Etanercept na fase crônica da
infecção
Antes da infecção por T. cruzi e 8 meses PI (período pré-tratamento), todos
os animais foram submetidos a exame ecocardiográfico para análise da estrutura e
função cardíaca. Os registros de óbitos durante o período de tratamento foram
utilizados para a determinação da curva de sobrevida. Após 15 e 45 dias de
tratamento, uma amostra de sangue foi colhida para a detecção de parasitas
circulantes. Após o tratamento (11 meses PI), todos os animais sobreviventes foram
submetidos a exame ecocardiográfico para análise da função cardíaca e presença
de dilatação do VE. Após 72h do exame ecocardiográfico, os animais foram
sacrificados, o coração foi retirado, pesado e o tecido cardíaco processado para
estudo histopatológico, onde se analisou a presença de miocardite; imuno-
histoquímica para detecção de antígenos de T. cruzi, imunocomplexos de IgG e
TNF-α. A ponta do VE foi congelada para posterior extração de RNA para avaliação
da expressão de citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-10) e genes ativados por citocinas
(iNOS, MnSOD, A20) por RT-PCR em tempo real.
4.8 Análise de sobrevida
Após a infecção por T. cruzi, os animais foram observados diariamente para
determinação da curva de sobrevida. Os animais que, no decorrer das observações,
apresentaram incapacidade de movimentar-se e/ou alimentar-se voluntariamente
foram sacrificados e considerados como mortos para a análise de sobrevida. Os
óbitos espontâneos ocorridos no decorrer do estudo também foram registrados. As
curvas de sobrevida foram analisadas pelo teste de LogRank através do programa
computacional GraphPad Prism, versão 3.0.
Metodologia
44
4.9 Coleta de sangue
Os animais foram sangrados pelo plexo retro-orbital com auxílio de pipeta
Pasteur heparinizada e o sangue obtido foi utilizado para detecção de parasitas
circulantes. No momento do sacrifício, o sangue de cada animal foi obtido através de
punção cardíaca para obtenção do soro e posterior detecção de anticorpos anti-T.
cruzi.
4.10 Obtenção do soro
Para obtenção do soro, o sangue colhido foi deixado à temperatura
ambiente por 2 h para completa coagulação e transferido para tubos secos de 1,5
ml. O soro foi centrifugado a 10000 g por 6 minutos em centrífuga refrigerada de 8-
10°C e em seguida foi estocado a -80°C até o momento de uso.
4.11 Detecção de parasitas circulantes
Uma alíquota de 5 µl de sangue de cada animal foi obtida, conforme descrito
anteriormente e diluída 1/2 em tampão de lise de hemácias para contagem de
parasitas circulantes pelo método de contagem direta em câmara de Neubauer
(WRIGHTSMAN et al., 1982). Alternativamente, 5 µl de sangue de cada animal foi
colocado diretamente em lâmina com lamínula (22x22 mm) e a contagem de
parasitas circulantes foi realizada em 50 campos em objetiva 40X (BRENER, 1962).
4.12 Análise ecocardiográfica da estrutura e função cardíaca
O estudo das alterações da anatomia cardíaca bem como da função
ventricular dos animais foi realizado através de ecocardiografia transtorácica bi-
dimensional, Modo-M e Doppler pulsado, utilizando ecocardiógrafo Accuson, modelo
Metodologia
45
Sequóia 512 com transdutor linear de 13 MHz (15L8) que oferece 0,35 mm de
resolução lateral e 0,25 mm de resolução axial. Para a realização desse exame, os
animais foram previamente anestesiados com 250 mg/Kg de tribromoetanol (Sigma
Chemicals Co. EUA) via intraperitoneal, pesados, colocados em posição supino
ventral, submetidos a tricrotomia e restringidos de movimentos. Imagens
bidimensionais foram obtidas e, a partir destas, o cursor para Modo-M foi
posicionado perpendicular ao septo intraventricular e à parede posterior do VE ao
nível dos músculos papilares. As imagens foram armazenadas em formato digital
para análise posterior pelo ecocardiografista de maneira cega. Os exames foram
realizados de acordo com a padronização deste exame em roedores pequenos
(TANAKA et al., 1996; HAAS et al., 1995; GARDIN et al., 1995) e segundo as
recomendações da Sociedade Americana de Ecocardiografia (SAHN et al., 1978).
As dimensões cardíacas durante a sístole e diástole foram analisadas pelo Modo-M
para a determinação dos diâmetros diastólico (DDVE) e sistólico (DSVE) do
ventrículo esquerdo. A função ventricular esquerda foi calculada através da fração
de encurtamento do ventrículo esquerdo: ∆D (%) = [(DDVE-DSVE)/DDVE] X 100. Os
valores de DDVE e DSVE foram corrigidos pelo peso corporal. Simultaneamente ao
ecocardiograma, o eletrocardiograma de uma derivada também foi realizado para
localizar a diástole. Como controle, foram utilizados os ecocardiogramas de animais
sadios não infectados, pareados por idade e sexo.
4.13 Análise histopatológica do tecido cardíaco
Para a análise histopatológica do coração, os animais foram previamente
anestesiados, pesados e os batimentos cardíacos foram interrompidos em diástole
através da injeção intracardíaca de solução de KCl 3 M. Alguns animais com morte
Metodologia
46
espontânea também tiveram o coração recuperado antes do rigor mortis. O coração
foi retirado da cavidade torácica, pesado, dissecado e cortado transversalmente ao
nível do equador. A porção mediana foi fixada por 48 h em solução tamponada (pH
7.2) de formalina 10% e posteriormente processado pelo método de inclusão em
parafina. Cortes transversais de tecido cardíaco (5-7 µm) ao nível do músculo papilar
do coração foram realizados de modo a analisar conjuntamente ventrículo direito
(VD) e esquerdo. Todas as análises histopatológicas foram realizadas de modo
cego.
4.13.1 Cálculo do índice de dilatação
As imagens do corte transversal corado com hematoxilina e eosina (H&E)
foram digitalizadas em aumento de 10X e as medidas de diâmetro do VE, espessura
da parede posterior (PP) e do septo intraventricular (SIV) foram obtidas com o
programa AxioVision 3.0 (Zeiss, Alemanha). O cálculo do índice de dilatação do VE
foi calculado pela equação: diâmetro do VE / média do SIV + PP. Este índice foi
calculado de modo a obter a informação de presença ou ausência de dilatação na
data da morte.
4.13.2 Quantificação da miocardite
As imagens do corte transversal corado com hematoxilina e eosina (H&E)
foram digitalizadas em aumento de 400X e a quantificação da intensidade da
inflamação foi feita por morfometria com auxílio de programa analisador de imagens
(AxioVision 3.1, Zeiss, Alemanha). Para isso, o número de células inflamatórias
presentes em dois cortes não consecutivos (8-10 campos aleatórios por corte) foi
somado e dividido pela área total de tecido cardíaco (n°células inflamatórias/mm2). A
Metodologia
47
área de inflamação no miocárdio foi quantificada com o auxílio do programa
MetaMorph 5.0 (Nikon, Japão). A soma das áreas dos infiltrados de dois cortes não
consecutivos (20 campos/corte) foi calculada para cada animal e dividida pela soma
das áreas de todos os campos analisados. O resultado foi expresso em
porcentagem de área de inflamação.
4.13.3 Detecção de antígenos de T. cruzi no tecido cardíaco
Os cortes de tecido cardíaco embebidos em parafina foram submetidos a
imuno-histoquímica para detecção in situ de antígenos do T. cruzi no miocárdio.
Para isso, os cortes foram previamente desparafinizados e o bloqueio de peroxidase
endógena foi feito com H2O2 3%. Após essa etapa, os cortes foram incubados
durante 18h a 4oC com soro policlonal de coelho anti-T. cruzi (1:30000). A revelação
foi feita com anticorpo biotinilado anti-IgG de coelho (1:800) e complexo avidina-
biotina-peroxidase para amplificação da reação (1:1000) (Dako, CA, EUA). A
visualização da reação foi feita após a adição do substrato cromogênico da
peroxidase diaminobenzidina (DAB). Todos os cortes foram contra-corados com
hematoxilina. Como controle positivo, foram utilizados cortes de tecido cardíaco de
camundongo com miocardite aguda pós-infecção por T. cruzi. A omissão do
anticorpo primário anti-T.cruzi foi utilizada como controle negativo interno da reação.
A área de antígeno de T.cruzi no miocárdio (corada em marrom pela
peroxidase) foi quantificada com o auxílio do programa MetaMorph 5.0 (Nikon,
Japão). Para esta análise, o programa quantifica automaticamente a área corada em
marrom (definido pelo experimentador) em cada campo (aumento de 200X). A soma
das áreas de antígeno de T.cruzi de dois cortes não consecutivos foi calculada para
cada animal e dividida pela soma das áreas de todos os campos analisados. O
Metodologia
48
resultado foi expresso em porcentagem de área de antígeno de T.cruzi . A área de
antígeno de T.cruzi compreende a área de ninhos intactos e a área de antígeno
disperso pelo miocárdio, proveniente do rompimento de ninhos.
O número de ninhos no miocárdio foi obtido após contagem manual de dois
cortes não consecutivos (40-50 campos por corte) em aumento de 400X com auxílio
de programa analisador de imagens (AxioVision, Zeiss, Alemanha). Para o cálculo
do número de ninhos/mm2 de tecido, foi somado o número de ninhos de todos os
campos e dividido pela soma da área de todos os campos analisados.
4.13.4 Detecção de TNF-α no miocárdio
Cortes de tecido cardíaco de 5µm fixados em formalina e embebidos em
parafina foram desparafinizados e submetidos a reação de imuno-histoquímica para
detecção de TNF-α. Os cortes foram submetidos a digestão enzimática com tripsina
0,025% pH 7,4 para exposição dos sítios antigênicos. O bloqueio de peroxidase
endógena foi feito com H2O2 3% e o bloqueio de reações inespecíficas foi feito com
leite Molico 10% em PBS. Após essas etapas, a permeabilização dos cortes foi feita
com tampão saponina 0,1%. Os cortes foram então incubados com anticorpo
primário anti-TNF-α produzido em cabra (Santa Cruz, CA, EUA). Em seguida foi
adicionado anti-IgG de cabra conjugado com peroxidase. A visualização da reação
foi feita com a adição do substrato cromogênico da peroxidase (diaminobenzidina) e
em seguida as lâminas foram contra-coradas com hematoxilina. A omissão do
anticorpo primário foi utilizada como controle negativo. Cortes de tecido esplênico de
hamster infectado por T.cruzi e tecido de tonsila humana com inflamação crônica
foram utilizados como controle positivo. O anticorpo anti-TNF-α utilizado é específico
para TNF-α humano, de rato e de camundongo, porém também reconhece TNF-α
Metodologia
49
de hamster. O antígeno peptídico específico para obtenção do anticorpo anti-TNF-α
apresenta 72% de identidade com TNF-α de hamster e quando analisado pelo
programa NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), conforme descrição do
fabricante (Santa Cruz, CA, EUA). Esta análise também mostrou que o antígeno
peptídico não apresenta identidade com nenhuma seqüência de proteína de hamster
depositada em banco de dado.
Para esta análise 30-40 campos em aumento de 400X de 3-4 cortes não
consecutivos de cada animal foram examinados. A identificação de marcação
positiva pela peroxidase em pelo menos um campo foi utilizada para o cálculo de
freqüência de animais com células TNF-α positivas no infiltrado inflamatório.
4.13.5 Detecção de imunocomplexos no miocárdio
Cortes de tecido cardíaco de 5 µm fixados em formalina e embebidos em
parafina foram desparafinizados e submetidos a imuno-histoquímica para detecção
de imunocomplexos de IgG depositados sobre as estruturas cardíacas. Os cortes
foram incubados com anticorpo produzido em cabra anti-IgG de hamster conjugado
a peroxidase (Rockland, PA, EUA) e em seguida com complexo amplificador LSAB
(Dako, CA, EUA). A visualização da reação foi feita com a adição do substrato
cromogênico da peroxidase (diaminobenzidina) e em seguida as lâminas foram
contra-coradas com hematoxilina. A omissão do anticorpo primário foi utilizada como
controle negativo e cortes de tecido renal de hamsters infectados por Toxocara canis
foram utilizados como controle positivo.
Para esta análise 30-40 campos em aumento de 400X de 3-4 cortes não
consecutivos de cada animal foram examinados. A identificação de marcação
Metodologia
50
positiva pela peroxidase em pelo menos um campo foi utilizada para o cálculo de
freqüência de animais com imunocomplexo IgG no miocárdio ou no endotélio.
4.14 Quantificação dos níveis de TNF bioativo
A quantificação dos níveis bioativos de TNF-α e LT-α foi feita por meio de
bioensaio de citotoxicidade a fibroblastos L929 (modificado de HOGAN e VOGEL,
1988).
Cultivo de fibroblastos: os fibroblastos foram cultivados por 48 h em meio DMEM
acrescido de 10% de soro fetal bovino (Gibco, Grand Island, NY, EUA) em garrafa
de 25 ml. Após 48 h, a confluência da monocamada de células foi checada ao
microscópio e, para o repique, as células foram tratadas por 2-4 minutos a 37°C com
tripsina 0,1%/EDTA 0,02% em solução Hanks sem Ca2+/Mg2+. A ação da tripsina foi
bloqueada com 10 ml de DMEM com 10% de soro fetal bovino. As células L929
foram centrifugadas a 600 g por 8 minutos e em seguida ressuspensas em meio de
cultivo DMEM com 10% de soro fetal bovino.
Bioensaio de citotoxicidade: 3 X 104 fibroblastos L929 foram cultivados em placas de
96 poços por 24 h a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. Após este período, as
amostras (plasmas ou sobrenadantes de cultivo de células esplênicas) foram
adicionadas aos poços contendo a monocamada de células L929. A divisão celular
foi interrompida com 2 µg/ml de actinomicina D (Sigma Chemicals Co, CA, EUA).
Em seguida, as placas foram incubadas por 18-20 h a 37°C em atmosfera de 5% de
CO2. O sobrenadante foi aspirado e os poços lavados com solução salina. A
coloração foi feita com 50 µl do corante vital violeta cristal 0,05% em etanol 20% por
10 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem e secagem, a coloração das
células foi eluída com 100 µl de metanol e a citotoxicidade foi determinada em leitora
Metodologia
51
de ELISA (BIORAD, model 3550) em comprimento de onda de 595nm. Como curva-
padrão, utilizamos TNF-α recombinante murino (Pharmigen, CA, EUA) em
concentrações conhecidas. A concentração de TNF-α/LT-α nas amostras foi
calculada por meio de interpolação na curva padrão.
4.15 Determinação do efeito in vitro e in vivo do Etanercept sobre a atividade
de TNF-α em hamster
A capacidade do receptor solúvel de TNF-α humano (Etanercept, Immunex
Co, Seattle, EUA) de bloquear a atividade de TNF-α de hamster foi testada através
do bioensaio de citotoxicidade em células L929, descrito acima. Para isso utilizamos
soro de hamster com elevados níveis de TNF-α bioativo e diferentes concentrações
de Etanercept. Dados da literatura mostraram que 140 pg/ml de Etanercept bloqueia
a citólise de células L929 induzida por 1,7 ng/ml (equivalente a 100 U/ml de TNF-α
bioativo) de TNF-α recombinante humano (BECHER et al., 1999). Essa relação foi
utilizada como parâmetro para saber qual concentração de Etanercept deveria ser
utilizada para bloquear o TNF-α de hamster. Células L929 foram cultivadas na
presença de soro de animal injetado com 10 mg/Kg de LPS de E. coli sorotipo
0127:B8 (Sigma Chemicals Co, EUA), com elevados níveis de TNF-α bioativo, e
concentrações crescentes de Etanercept (14, 140, 1400 pg/ml). Como controle,
utilizamos TNF-α recombinante humano (1700 pg/ml). Após incubação por 20h a
37°C em atmosfera de 5% de CO2, a citotoxicidade às células L929 foi medida
conforme descrito acima e a porcentagem de lise celular foi calculada a partir da
fórmula: (1-(absorbância amostra/absorbância controle))X100, usando como controle
a absorbância das células L929 cultivadas apenas em meio. A lise celular nos poços
contendo Etanercept e TNF-α humano ou de hamster foi comparada à lise celular
Metodologia
52
obtida nos poços controles sem Etanercept. Os resultados foram expressos em U/ml
de TNF-α bioativo.
O efeito do Etanercept no bloqueio de TNF-α in vivo foi avaliado em modelo
de endotoxemia, conforme descrito na literatura (WU et al., 1999). O modelo para
verificar se o Etanercept bloqueia a atividade de TNF-α induzida por LPS consistiu
na administração i.p. de 10 mg/Kg de LPS de E. coli sorotipo 0127:B8 (Sigma
Chemicals Co, EUA) em animais previamente tratados com 2,5 mg/Kg de Etanercept
(2 h antes da injeção com LPS). Noventa minutos após a injeção de LPS, o soro dos
animais foi coletado para dosagem de TNF-α bioativo. Como controle positivo, um
grupo de animais não recebeu Etanercept e foi injetado com LPS e o soro foi obtido
nos mesmos períodos. Como controles, o soro de todos os animais foi obtido antes
da injeção de LPS ou Etanercept. Os níveis de TNF-α foram determinados pelo
bioensaio de citotoxicidade às células L929. A dose de 10 mg/Kg de LPS foi
previamente testada em hamster e mostrou-se eficaz na indução de endotoxemia.
4.16 Pesquisa de anticorpos séricos anti-T.cruzi
A confirmação da infecção foi feita através da pesquisa de IgG anti-T.cruzi no
soro dos animais infectados (agudos e crônicos) pelo método de ELISA direto
antígeno específico. Para isso, placas de poliestireno foram sensibilizadas com
167ng/poço de extrato alcalino de formas epimastigotas de T. cruzi por 18-24 h a
4°C. O bloqueio contra reações inespecíficas foi feito com PBS-Tween 20 0,1%
acrescido de 2% de BSA por 1 h a 37°C. Em seguida, os soros foram diluídos em
PBS-BSA 1% e incubados por 2 h a 37°C. A revelação da reação foi feita com a
incubação do anticorpo de cabra anti-IgG de hamster conjugado a peroxidase
(Rockland, Gilbertsville, PA, EUA) por 1 h a 37°C. A reação foi visualizada após a
Metodologia
53
adição do tampão citrato pH 5,0 e substrato da peroxidase o-fenilenodiamina e em
seguida determinada a absorbância (Abs) em comprimento de onda de 490 nm,
utilizando leitora de ELISA (model 3550, BioRad, Hercules, CA, EUA). Para a
determinação do título de IgG, os soros foram diluídos 1/200 até 1/25600. O valor
de cut-off foi determinado da seguinte maneira: média da Abs dos soros de animais
controles não infectados na diluição 1/200 (menor diluição) dos experimentos da
fase aguda e crônica acrescido de 2 desvios-padrão: 0,173 + 2(0,079) = 0,331. O
título de IgG anti-T.cruzi foi determinado como sendo o inverso da primeira diluição
com Abs superior ao cut-off. Todos os animais que foram infectados e apresentaram
título de IgG sérica anti-T. cruzi > 800 foram incluídos nas análises. Os animais
controles não infectados que apresentaram título > 400 foram excluídos de todas as
análises.
4.17 Quantificação gênica por RT-PCR em tempo real
4.17.1 Extração de RNA
O RNA foi extraído pelo método descrito por Chomzynski e colaboradores
(1987), o qual utiliza solução de Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA)
para isolamento de RNA total. Trizol é uma solução monofásica de fenol e
isotiocianato de guanidina que rompe a célula mantendo a integridade do RNA. Este
método consistiu inicialmente da homogeneização de amostras de tecido cardíaco
(ventrículo esquerdo) de aproximadamente 20-40 mg em solução de Trizol
(Invitrogen, Carlsbad, CA) utilizando homogeneizador de tecido (Power Gen 1000,
Fisher Scientific, Atlanta, EUA). Após a incubação das amostras por 5 minutos a
temperatura ambiente, para permitir completa dissociação de complexos de
nucleoproteínas, foi adicionado 0,2 ml de clorofórmio para cada ml de trizol, seguido
Metodologia
54
de agitação vigorosa por aproximadamente 15 segundos. O material foi
posteriormente incubado por 2 a 3 minutos à temperatura ambiente e centrifugado
por 15 minutos a 1120 g a 4oC. Após esta centrifugação ocorre a separação da
solução em três fases (aquosa, interface e orgânica). A fase aquosa foi transferida
para um novo tubo contendo 0,5 ml de álcool isopropílico para cada ml de trizol, para
a precipitação do RNA. Este tubo foi homogeneizado por inversão, seguido de
incubação por 10 minutos a temperatura ambiente e então centrifugado novamente
a 1120 g por 15 minutos a 4oC. O sobrenadante foi removido e o pellet de RNA
lavado com etanol 75% diluído em água DEPC (Dietilpirocarbonato, Sigma-Aldrich,
Steinhein, Alemanha) seguido de centrifugação a 640 g por 5 minutos a 4oC. O RNA
assim obtido foi deixado secar por 5 minutos para evaporação do etanol e então
ressuspenso em 10 µl de água DEPC. Este material foi mantido a – 80oC até o
momento da transcrição.
Alternativamente, algumas amostras de tecido cardíaco foram extraídas
utilizando kit comercial RNeasy® Fibrous Tissue Mini kit (Quiagen, Valencia, CA,
EUA), de acordo com especificações do fabricante. Resumidamente, as amostras
foram lisadas com tiocianato de guanidina e tratadas com proteinase K. Os restos
celulares foram separados por centrifugação e adição de etanol e as amostras foram
colocadas em coluna de sílica. Possíveis contaminações com DNA foram eliminadas
através do tratamento das amostras com DNase e por último as amostras foram
eluídas da coluna em água DEPC.
4.17.2 Quantificação do RNA
Após extração, o RNA obtido foi quantificado através de leitura em
espectrofotômetro (Beckman, DU530, Fullerton, CA, EUA) nos comprimentos de
Metodologia
55
onda (λ) de 260 e 280 nm. O grau de pureza da amostra foi verificado através da
análise da relação entre 260 e 280 nm. Sendo considerada uma boa extração
aquela que apresentou valores entre 1,6 a 1,8. Para o cálculo da concentração da
amostra considerou-se que a absorbância igual a 1 corresponde a 40 µg de RNA /
ml no comprimento de onda de 260 nm (SAMBROOK, 1989).
Além disso, uma alíquota de RNA foi submetida a eletroforese em gel de
agarose 1% para visualização da integridade das amostras e também possíveis
contaminações com DNA (Figura 3).
Figura 3. Avaliação da integridade das amostras de RNA. 1 µg de RNA para cada amostra foi carregado em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio (0,5 µg/ml) e submetido a corrida eletroforética a 100 V durante 40 minutos. Lanes 1 a 3 representam RNA de diferentes amostras de tecido cardíaco e lane 4 marcador de peso molecular de 100 pb (Ladder 100 bp, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).
4.17.3 Transcrição reversa
Após constatação da qualidade e pureza do RNA, a transcrição reversa do
RNA para cDNA foi feita com 5 µg de RNA total utilizando a enzima transcriptase
reversa (Super-script II™ Reverse Transcriptase, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA).
Para este protocolo foi adicionado ao RNA 1µl de oligodT (500 µg/ml), 1 µl de dNTP
1 2 3 4
28S
18S
Metodologia
56
(10 mM de dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e água DEPC q.s.p. 12 µl. Esta mistura foi
aquecida a 65oC por 5 minutos em termociclador (MJ research, Inc., watertown, MA,
EUA). Em seguida foi adicionado ao tubo de reação 4 µl de tampão de transcrição
5x (Tris-HCl 250mM pH 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM), 2 µl de DTT 0,1 M e 1 µl de
inibidor de RNase (40 U/µL) (RNAse OUT™, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As
amostras foram então colocadas em termociclador a 42oC por 2 minutos. Por último
foi adicionado 1 µl da enzima transcriptase reversa (200 U/µL) e a solução foi
colocada novamente em termociclador a 42oC por 50 minutos seguidos de 70oC por
15 minutos.
4.17.4 Reação de RT-PCR em tempo real
Os primers utilizados nas reações de amplificação foram desenhados pelo
programa Primer Express (Applied Biosystems, EUA). O tamanho dos primers variou
de 18 a 23 bases, a temperatura de anelamento (Tm, do inglês melting temperature)
de 59-61ºC e o conteúdo de GC de 40-60% e foram utilizados na concentração de
250 nM. O tamanho dos produtos de amplificação gerados variou de 90 a 110 pb e
75-85°C de Tm. As reações de PCR em tempo real foram realizadas em placas de
96 poços, usando o reagente “SYBR-Green PCR Master Mix” (Applied Biosystems,
Foster City, CA, EUA) e o equipamento “Perkin-Elmer ABI Prism 7500 Sequence
Detection System”. A reação foi realizada em 40 ciclos de 15 segundos a 94ºC e 1
minuto a 60ºC, de acordo com o manual de instruções do fabricante ABI PRISM
7500. A determinação da intensidade de fluorescência na reação foi feita pelo
cálculo do ∆Rn (∆Rn = Rn+ - Rn-), onde Rn+ = intensidade de emissão do SYBR
Green / intensidade de emissão do ROX em um dado momento da reação, e Rn- =
intensidade de emissão do SYBR Green / intensidade de emissão do ROX, antes da
Metodologia
57
amplificação. O composto ROX é utilizado como controle interno passivo, pois a
fluorescência que emite tem intensidade constante durante toda a reação, enquanto
que o a fluorescência emitida pelo SYBR Green aumenta à medida que este liga-se
nas duplas fitas de DNA. Durante os ciclos iniciais da reação, não há acúmulo de
produtos de amplificação e os valores de ∆Rn permanecem na linha de base
(fluorescência do ROX > SYBR Green). Na fase logarítmica da reação ocorre
acúmulo dos produtos de amplificação e a ∆Rn ultrapassa a linha de base. Para a
quantificação relativa, foi estabelecido um valor de ∆Rn, que é uma linha de corte
(Threshold) para cada curva de amplificação de um dado par de primers. O número
do ciclo em que a ∆Rn cruza o threshold corresponde ao Ct (cycle threshold) da
amostra. O valor de Ct é preditivo da quantidade de RNAm alvo presente na
amostra. O cálculo da quantificação relativa foi feito pelo método de 2-∆∆Ct descrito
por Livak e Schmittgen (2001), utilizando como gene de referência o GAPDH. A
fórmula utilizada para a quantificação relativa (QR) é QR= 2∆∆Ct, onde ∆Ct= Ct gene
alvo – Ct gene eferência, e ∆∆Ct= ∆Ct amostra - ∆Ct controle.
Os genes ciclofilina, transferrina e GAPDH foram testados para a escolha do
gene endógeno. Após vários experimentos, foi escolhido o gene GAPDH como gene
referência pois o Ct para esse gene foi semelhante nas amostras de miocárdio de
animais controles não infectados, animais infectados e infectados tratados.
4.17.5 Especificidade e adequação dos primers
A especificidade dos primers desenhados pelo Primer Express foi avaliada
pela curva de dissociação. Para isso, após a reação, a placa foi submetida a um
segundo programa: 95°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto e 95°C por 1 minuto. A
curva de dissociação consiste na monitorização da fluorescência das amostras em
Metodologia
58
relação ao aumento de temperatura. A fluorescência das amostras decresce com o
aumento da temperatura, pois a medida que as pontes de hidrogênio, que mantém
as duplas fitas unidas se rompem (devido ao aumento de temperatura), o SYBR-
Green é liberado. A fluorescência é emitida somente quando o DNA está em dupla
fita. Assim, quando observamos somente um pico de fluorescência em uma dada
temperatura significa que houve amplificação de um produto específico. Esta
temperatura é a temperatura de anelamento ou melting point (Tm) do produto de
amplificação (amplicon). A Tabela 1 mostra a seqüência e as características dos
primers utilizados e a Figura 4 as suas respectivas curvas de amplificação e
dissociação. Para o desenho dos primers para os genes codificadores de A20, iNOS,
e MnSOD, foram utilizadas regiões conservadas seqüências de camundongo e rato
depositadas no banco de dados, uma vez que, até o momento, não existem
seqüências correspondentes para hamster disponíveis em banco de dados.
A especificidade da reação de PCR em tempo real foi também avaliada
através da migração do produto de amplificação em gel de poliacrilamida 8%, o qual
possibilita a separação de fragmentos pequenos e a visualização de possíveis
amplificações não específicas. A Figura 5 mostra que a reação de PCR em tempo
real para os genes estudados amplificou fragmento único com o tamanho em pb
esperado.
4.17.6 Cálculo da eficiência de amplificação dos primers utilizados
O método 2-∆∆Ct para cálculo da expressão gênica assume que a eficiência de
amplificação do gene alvo e do gene de referência é igual a 2, ou seja, 100%. Para o
cálculo da eficiência foi utilizada a equação E = 10(-1/slope), onde E corresponde à
eficiência e slope corresponde ao coeficiente de angulação da curva (PFAFFL, 2001;
Metodologia
59
PFAFFL et al., 2002). Para cada gene estudado foi realizada uma reação com
diluições seriadas de amostra de cDNA (1/5 a 1/1250) e o primer de interesse. Os
valores de Ct obtidos foram plotados em gráfico para cálculo do slope e da
eficiência. A Figura 4 mostra as curvas de amplificação utilizadas para cálculo da
eficiência de amplificação dos genes estudados.
Tabela 1. Descrição e identificação dos genes estudados, seqüência dos primers
utilizados e características do produto de amplificação
Primers Identificação
Gene Bank Seqüência Tm
amplicon (0C)
Tamanhoamplicon
(pb)
GAPDH
X02231
5´CTGACATGCCGCCTGGAG
3´TCAGTGTAGCCCAGGATGCC
82
101
TNF-α M13049 5´TCAAAATTCGAACGACAAGCC
3´TTGGCCAGGAGGGCATT
84 102
IFN-γ M28621 5´GAAGCTCACCAAGATTCCGGTAA
3´TTTTCGTGACAGGTGAGGCAT
78 91
IL-10 AF046210 3´GGCAACTGCAGCGCTGTC
5´AGACGCCTTTCTCTTGGAGCTTAT
77 102
iNOS M92649 5´TCCCTCCTGATCTTGTGTTGGA
3´GCATACCACTTCAACCCGAGC
79 86
MnSOD X04972 5´CCTGCTCTAATCAGGACCCATT
3´GCTCCCACACGTCAATCCC
79 72
A20 U19463 5´GAATTTGTGGAAACAGGACTTTGC
3´TGCTGATGCCATTTTGACCA
78 81
Metodologia
60
b) TNF-
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3log RNA (ng)
Méd
ia C
t
y = -3.198x + 36.794 R2 = 0.997
E = 10(-1/3.198) = 2.0
A) GAPDH
y = - 3.569x + 28.831 R2 = 0.9993
E = 10 (-1/3.589) = 1.9
log RNA (ng)
Média Ct
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
3 1 2 4
a b
c
B) TNF-α a b
c
1 2 3 4
12
34
1 2
3 4
Metodologia
61
log RNA (ng)
Méd
ia C
t
C) A20 a) b)
c)
D) MnSOD a) b)
c)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
y = -3.653x + 35.6026 R2 = 0.9934
E=10 (-1/3.653) = 1,9
1 2 3 4
0
5
10
15
20
25
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
y = -3.309x + 25.744 R2 = 1
E= 10 (-1/3.309) = 2,0
log RNA (ng)
Méd
ia C
t 1 2 3 4
1 2
3 4
1
2
3
4
Metodologia
62
log RNA (ng)
Méd
ia C
t
E) INF-γ a b)
c
F) a b)
clog RNA (ng)
Méd
ia C
t
1 2 3 4
0
5
10
15
20
25
30
35
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
1 2
3 4
1 3 4
y = -3.605x + 30.937 R2 = 0.9792
E = 10 (-1/3.605) = 1,9
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
1 2
3 4
y = -3.909x + 41.128 R2 = 0.9919
E = 10(-1/3.909) = 1.8
2
Metodologia
63
log RNA (ng)
Méd
ia C
t
a b
c
0
5
10
15
20
25
30
35
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
y = -3,398x + 32,371 R2 = 0,9979
E = 10 (-1/3.398) = 1.9
1 2 3 4
1 2
3 4
G) IL-10
Figura 4. Curva de amplificação, eficiência e dissociação dos genes estudados. A) GAPDH; B) TNF-α; C) A20; D) MnSOD; E) INF-γ; F) iNOS; G) IL-10. Em (a) curva de amplificação utilizada para verificar a eficiência de amplificação dos primers utilizados. Em (b) gráfico utilizado para o cálculo da eficiência. O quadro interno em (b) mostra a equação da reta e o valor do coeficiente de angulação utilizado para cálculo da eficiência. Em (c) curva de dissociação mostrando a amplificação de um único fragmento para os primers testados. 1. cDNA diluído 1/10 (500ng RNA); 2. cDNA diluído 1/50 (100ng RNA); 3. cDNA diluído 1/250 (20ng RNA); 4. cDNA diluído 1/1250 (4ng RNA).
Metodologia
64
Figura 5. Produto de amplificação da reação de PCR em tempo real para controle de amplificações não específicas. 10 µl do produto de amplificação da reação de PCR em tempo real para os genes de TNF-α (1), MnSOD (2), A20 (3), iNOS (4), INF-γ (5), IL-10 (6) e GAPDH (7) foram submetidos a eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado com brometo de etídeo (0,5 µg/ml). Todos os genes apresentam amplificação de um único fragmento com o tamanho esperado. TNF-α – 102 pb, MnSOD – 72 pb, A20 – 81 pb, iNOS – 82 pb, INF-γ – 91pb, IL-10 – 102 pb e GAPDH – 101 pb. L – marcador de peso molecular (ladder) de 50pb.
1 2 L 3 4 5 6 7 L
Metodologia
65
4.18 Análise estatística
A estatística descritiva está representada pela mediana e valores mínimo e
máximo. As comparações entre dois grupos para variáveis numéricas não pareadas
foram realizadas utilizando-se o teste não-paramétrico U de Mann-Whitney. As
comparações entre mais de dois grupos de variáveis numéricas não pareadas foram
feitas utilizando-se o teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal Wallis e o teste de
Dunns como pós-teste. As comparações intragrupo para dois diferentes tempos
analisados foram feitas pelo teste pareado não-paramétrico Wilcoxon signed rank
test. As associações entre variáveis qualitativas nominais foram analisadas
utilizando-se o teste exato de Fisher, ou pelo teste Qui-quadrado com correção de
Yates quando o valor de alguma das caselas foi igual a zero. As análises de
correlação entre duas variáveis numéricas independentes foram feitas utilizando-se
o teste de correlação não-paramétrico de Spearman. Todos os valores de p
relatados são bicaudais. Valores de p menores que 0,05 foram considerados
significativos. Os testes U de Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Fisher e qui-
quadrado com correção de Yates foram executados no programa computacional
GraphPad Prism, versão 3.0. O teste de Spearman foi executado no programa de
estatística SPSS 10.
Resultados
66
5 RESULTADOS
5.1 Fase aguda da infecção pelo T. cruzi
5.1.1 Sinais e sintomas
Baseado em nossos resultados anteriores, onde aproximadamente 30% dos
hamsters infectados morreram espontaneamente durante a fase aguda (a partir do
21° dia PI) (BILATE et al., 2003), objetivamos investigar as diferenças
histopatológicas entre os animais que sucumbem à fase aguda e os que resistem.
Para isso, os animais foram infectados e sacrificados após 21 dias de infecção.
Neste experimento foi possível distinguir dois subgrupos de acordo com a presença
ou ausência de sintomas de fase aguda na terceira semana de infecção: 50% (6/12)
dos animais apresentaram sintomas de fase aguda (caquexia, letargia, vômito,
diarréia e perda de peso) e o restante permaneceu sem os sintomas clínicos
descritos acima. A perda de peso no grupo de animais infectados que apresentaram
sintomas de fase aguda 21 dias PI foi significativamente maior do que entre os
animais infectados que não apresentaram sintomas (Figura 6). Entre os animais
controles não infectados, ao contrário, observou-se ganho de peso (Anexo A). Em
conjunto, os resultados mostram que o hamster sírio não isogênico apresenta
suscetibilidade diferencial à fase aguda da infecção pela cepa Y de T. cruzi.
5.1.2 Parasitemia
A pesquisa direta de parasitas circulantes mostrou que a freqüência de
animais com parasitemia detectável após 5, 8, 13 e 21 dias PI foi muito baixa: 1/12,
3/12, 0/12 e 0/12, respectivamente.
Resultados
67
Figura 6. Perda de peso durante a fase aguda da infecção por T. cruzi em hamster.
Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas da cepa Y de T. cruzi. Antes e 21 dias após a infecção, os animais foram pesados para cálculo da perda de peso em relação ao peso inicial antes da infecção. O gráfico mostra a comparação dos animais sem sintomas de fase aguda (FA-) e dos animais com sintomas de fase aguda (FA+). Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana. Valor de p bicaudal obtido pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
5.1.3 Análise anátomo-patológica
A análise histopatológica e imunohistoquímica para detecção de antígenos de
T. cruzi no tecido cardíaco mostrou que os animais sacrificados 21 dias PI (com e
sem sintomas de fase aguda) apresentaram intensa miocardite multi-focal de grau
moderado a grave e elevado número de ninhos de parasita (Figura 7). Os ninhos
rotos freqüentemente estavam acompanhados de intenso infiltrado inflamatório,
enquanto que os ninhos intactos estavam presentes em áreas livres de infiltrado
inflamatório (Figura 7). Como a infecção aguda pelo T. cruzi resultou em dois
padrões distintos de evolução (ausência ou presença de sintomas de fase aguda)
optamos por comparar separadamente os grupos de acordo com a presença dos
sintomas de fase aguda. No grupo sintomático, o parasitismo cardíaco, medido tanto
FA - FA +-10
0
10
20
30
40
p=0,0011
21 dias PI
% p
erda
pes
o
p=0,001
Resultados
68
pelo número de ninhos como pela área de antígeno de T. cruzi (incluindo a área dos
ninhos e a área de antígeno fora dos ninhos) foi significativamente maior do que
entre os animais sem sintomas (Figura 8). Observou-se correlação positiva
estatisticamente significativa entre o número de ninhos no miocárdio e a área de
antígeno de T. cruzi (r=0,81; p=0,003; teste de correlação de Spearman bicaudal).
Figura 7. Parasitismo cardíaco e miocardite após 21 dias de infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. e sacrificados 21 dias PI. Os animais foram divididos em dois grupos de acordo com a presença ou ausência de sintomas de fase aguda. Os corações foram coletados e o tecido cardíaco processado pelo método de inclusão em parafina. Cortes de 5 µm foram corados com H&E (A e B) ou submetidos a imunohistoquímica para detecção de antígeno de T. cruzi (C e D). Em (A e C), fotomicrografia de tecido cardíaco mostrando infiltrado inflamatório de um animal assintomático e em (B e D) de um animal sintomático, aumento de 400X. As setas indicam os ninhos. As cabeças de setas indicam áreas de inflamação sem ninho. Em marrom, marcação positiva da peroxidase para antígeno de T. cruzi. Aumento de 400X.
A
C D
B
Resultados
69
Entre os animais que desenvolveram sintomas de fase aguda, o parasitismo
cardíaco foi caracterizado por numerosos e grandes ninhos de amastigotas em
regiões livres de inflamação, enquanto que, entre os animais que não apresentaram
sintomas, o parasitismo foi caracterizado por ninhos menores e antígenos do
parasita localizados em meio a focos de infiltrado linfomononuclear (Figura 7).
Entretanto, a intensidade de miocardite, medida pela área de inflamação no
miocárdio nos mesmos campos onde foi medida a área de antígeno de T. cruzi, foi
semelhante entre os animais com sintomas em comparação aos animais sem
sintomas (Figura 8).
Em conjunto, os resultados sugerem que o desenvolvimento de sintomas de
fase aguda, aliado ao intenso parasitismo cardíaco contribuem para a suscetibilidade
à infecção aguda.
Resultados
70
Figura 8. Intensidade de parasitismo cardíaco e miocardite após 21 dias de infecção.
Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. e sacrificados 21 dias PI. Os animais foram divididos em dois grupos de acordo com a presença ou ausência de sintomas de fase aguda. Os corações foram coletados e o tecido cardíaco processado pelo método de inclusão em parafina. Cortes de 5µm foram corados com H&E ou submetidos a imunohistoquímica para detecção de antígeno de T. cruzi. O número de ninhos (A) foi obtido após contagem de 40 campos em aumento de 400X após a imunohistoquímica. A área de antígeno de T. cruzi (B) foi obtida após contagem de 15-20 campos/corte em aumento de 200X e quantificação automática da área pelo programa de análise de imagens MetaMorph 5.0 (Nikon, Japão) após a imunohistoquímica. A área de miocardite (C) foi medida em 20-30 campos de 2 cortes não consecutivos em aumento de 200X e quantificação automática da área pelo programa de análise de imagens MetaMorph 5.0 (Nikon, Japão) após a coloração com H&E. Valores de p determinados pelo teste U não-paramétrico de Mann-Whitney bicaudal. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal mostra a mediana.
ausente presente0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
fase aguda - 21 dias PI
Nin
hos/
mm
2
p=0,009
A
FA – FA +
21 dias PI
ausente presente0.0001
0.001
0.01
0.1
1
fase aguda - 21 dias PI
Áre
a A
g.T.
cru
zi (%
)
p=0,004
B
FA – FA +
21 dias PI
ausente presente0
1
2
3
4
5
6
7
fase aguda - 21 dias PI
Áre
a in
flam
ação
(%)
C
FA – FA +
21 dias PI
p=NS
Resultados
71
5.1.4 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio
Uma vez que o aparecimento de sintomas de fase aguda estava associado à
intensidade do parasitismo cardíaco, comparamos a expressão de RNAm de
citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-10) e genes ativados por citocinas inflamatórias
(MnSOD, A20, iNOS) no miocárdio de animais com e sem sintomas de fase aguda
no 21° dia PI. A Figura 9 mostra os níveis de expressão de RNAm de citocinas e
genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados em relação aos de
controles não infectados. Pode-se observar o predomínio de IFN-γ e IL-10, embora
os outras citocinas analisadas também tenham sido detectadas em níveis superiores
aos dos controles. A expressão de TNF-α, IFN-γ, IL-10, A20 e MnSOD foi
significativamente maior nos animais sintomáticos do que nos assintomáticos (Figura
10 e 11). Entretanto, não observamos diferença significativa na expressão de iNOS
entre sintomáticos e assintomáticos (Figura 11). Por outro lado, considerando todos
os animais infectados (com e sem sintomas de fase aguda), a expressão de iNOS
esteve significativamente correlacionada com a expressão de TNF-α e A20 (Figura
12, Tabela 2).
Considerando todos os animais infectados (com e sem sintomas de fase
aguda), a expressão de TNF-α esteve positivamente correlacionada com a
expressão de A20, IL-10, IFN-γ e MnSOD (Figura 12, Tabela 2). A expressão de IL-
10 correlacionou-se positivamente com a expressão de IFN-γ, A20 e MnSOD (Figura
12, Tabela 2).
A intensidade do parasitismo cardíaco, medida pela área de ninho/antígeno
de T. cruzi no miocárdio, esteve positivamente correlacionada com a expressão de
TNF-α, L-10, A20 e iNOS. (Figura 12, Tabela 2). As correlações entre expressão de
Resultados
72
citocinas e intensidade do parasitismo cardíaco são apresentadas na Figura 12 e
Tabela 2. Em conjunto, os resultados sugerem que a gravidade da fase aguda,
evidenciada pelo aparecimento de sintomas clínicos e intenso parasitismo
miocárdico, está associada a uma elevada expressão de mediadores pró- e anti-
inflamatórios no miocárdio.
Figura 9. Perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio na fase aguda da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 21 dias de infecção, os animais foram sacrificados e a ponta do VE do coração foi obtida para a extração de RNA. A quantificação relativa da expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados em relação ao miocárdio de animais controles não infectados (n=6) foi feita por RT-PCR em tempo real, utilizando SYBR green. Uma amostra de RNA foi considerada imprópria para a análise e foi excluída. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana.
TNF-α A20 MnSOD iNOS IFN-γ IL-100.0625
0.1250.25
0.51248
163264
128256512
1024
infectados - 21 dias
expr
essã
o re
lativ
a R
NA
m
Resultados
73
Figura 10. Expressão miocárdica de citocinas na fase aguda da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 21 dias de infecção, os animais foram divididos em dois grupos de acordo com a presença (FA+) ou ausência (FA-) de sintomas de fase aguda. A ponta do VE do coração foi obtida para a extração de RNA após o sacrifício dos animais. A quantificação relativa da expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados em relação ao miocárdio de animais controles não infectados (n=6) foi feita por RT-PCR em tempo real, utilizando SYBR green. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
FA - FA +0.125
0.250.5
1248
163264
128256
p=0,026
21 dias PIex
pres
são
rela
tiva
IFN
- γ
FA - FA +1248
163264
128256512
p=0,0022
21 dias PI
expr
essã
o re
lativ
a IL
-10
FA - FA +1
2
4
8
16
32
p=0,0087
21 dias PI
expr
essã
o re
lativ
a TN
F-α
p=0,009
Resultados
74
FA - FA +0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
p=NS
21 dias PI
expr
essã
o re
lativ
a iN
OS
FA - FA +0.0625
0.1250.25
0.51248
1632
p=0,010
21 dias PI
expr
essã
o re
lativ
a A2
0
Figura 11. Expressão miocárdica de genes ativados por citocinas na fase aguda da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 21 dias de infecção, os animais foram divididos em dois grupos de acordo com a presença (FA+) ou ausência (FA-) de sintomas de fase aguda. A ponta do VE do coração foi obtida para a extração de RNA após o sacrifício dos animais. A quantificação relativa da expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados em relação ao miocárdio de animais controles não infectados (n=6) foi feita por RT-PCR em tempo real, utilizando SYBR green. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
FA - FA +0.25
0.5
1
2
4 p=0,0043
21 dias PI
expr
essã
o re
lativ
a M
nSO
D p=0,004
Resultados
75
Tabela 2. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e intensidade de parasitismo cardíaco na fase aguda da infecção por T. cruzi.
A tabela mostra os valores de r e p dos testes de correlação entre a área de antígeno de T. cruzi no miocárdio e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados por 21 dias. Em cinza, correlações significativas. Valores de r e p obtido pelo teste de correlação não-paramétrico bicaudal de Spearman.
r p
Área Ag. T. cruzi (%) TNF-α IFN-γ IL-10 A20 iNOS MnSOD
Área Ag. T. cruzi (%)
0,66 0,03
0,42 0,19
0,69 0,02
0,60 0,05
0,64 0,03
0,50 0,12
TNF-α 0,66 0,03
0,70 0,02
0,84 0,001
0,93 0,0001
0,70 0,02
0,64 0,03
IFN-γ 0,42 0,19
0,70 0,02
0,80 0,003
0,54 0,09
0,38 0,25
0,59 0,06
IL-10 0,69 0,02
0,84 0,001
0,80 0,003
0,75 0,007
0,46 0,15
0,78 0,004
A20 0,60 0,05
0,93 0,0001
0,54 0,09
0,75 0,007
0,78 0,004
0,60 0,05
iNOS 0,64 0,03
0,70 0,02
0,38 0,25
0,46 0,15
0,78 0,004
0,33 0,33
MnSOD 0,50 0,12
0,64 0,03
0,59 0,06
0,78 0,004
0,60 0,05
0,33 0,33
Resultados
76
% Área Ag T. cruzi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗ ∗ ∗
∗ ∗∗∗∗∗∗
∗∗
∗∗ ∗∗
∗∗ ∗
% Área Ag T. cruzi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
% Área Ag T. cruzi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗ ∗ ∗
∗ ∗∗∗∗∗∗
∗∗
∗∗ ∗∗
∗∗ ∗
Figura 12. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e
intensidade de parasitismo cardíaco na fase aguda da infecção. O gráfico em matriz mostra a correlação entre a área de antígeno de T. cruzi no miocárdio e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados por 21 dias. *p<0,05 e ** p<0,01, valores de p bicaudais obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
Resultados
77
5.2 Efeito do Etanercept in vitro e in vivo sobre o bloqueio de TNF-α de
hamster
Para investigar se o Etanercept, receptor p75 solúvel de TNF-α humano e,
portanto, antagonista da ação dessa citocina, também bloqueia a atividade de TNF-α
de hamster in vitro, verificamos o efeito de diferentes concentrações de Etanercept
sobre a atividade citotóxica de soro de hamster com elevados níveis de TNF-α
bioativo, em células sensíveis ao TNF-α (células L929). Os resultados mostraram
que enquanto o soro rico em TNF-α apresentou 4000 U/ml de TNF-α bioativo
quando cultivado com células L929 na ausência de Etanercept, na presença de 140
pg/ml ou 1400 pg/ml de Etanercept, apresentou 2000 U/ml e 500 U/ml de TNF-α
bioativo, respectivamente. Esse resultado mostra que 140 pg/ml de Etanercept reduz
50% da bioatividade de TNF-α de hamster e 1400 pg/ml reduz 88% (Figura 13).
Para verificar se in vivo o Etanercept bloqueia sistemicamente a bioatividade
de TNF-α de hamster, utilizamos o modelo de endotoxemia (WU et al., 1999),
conforme descrito na metodologia. Os resultados mostraram que os níveis séricos
de TNF-α bioativo após 90 minutos da injeção de LPS são significativamente
menores entre os animais que receberam Etanercept 2h antes do LPS em
comparação aos animais apenas injetados com LPS (respectivamente, 2896,3 vs.
4,5 U/ml, média geométrica). Este resultado mostrou que a administração de 2,5
mg/Kg Etanercept 2h antes da injeção de LPS bloqueou in vivo a bioatividade de
TNF-α de hamster (Figura 14).
Em conjunto, nossos resultados mostraram que o Etanercept bloqueia a
atividade de TNF-α de hamster tanto in vitro como in vivo e, portanto, foi
considerado adequado para ser utilizado para investigar os efeitos do bloqueio de
TNF-α sobre a miocardite aguda e cardiomiopatia crônica da infecção pelo T. cruzi.
Resultados
78
Figura 13. Efeito in vitro do Etanercept sobre a atividade de TNF-α de hamster. Em (A) lise
celular de células L929 mediada por TNF-α recombinante humano (1,7 ng/ml) ou por soro de hamster com níveis elevados de TNF-α bioativo (4000 U/ml), coletado 90 minutos após injeção de 10 mg/Kg de LPS de E. coli, na presença de diferentes concentrações de Etanercept. (B) Níveis de TNF-α bioativo presentes no soro de hamster injetado com LPS cultivado com células L929 em diferentes concentrações de Etanercept por 24 h. A quantificação dos níveis de TNF-α bioativo foi realizada pelo bioensaio de citotoxicidade a células L929 e o resultado está expresso em unidades de TNF bioativo por ml de soro. As unidades de TNF foram determinadas como sendo o inverso da diluição de soro onde se observou 50% de lise celular. A lise celular foi calculada pela fórmula: 1-(abs amostra/abs controle)X100.
0.010.020.030.040.050.060.070.080.090.0
100.0
0 14 140 1400
Etanercept (pg/ml)
Lise
cel
ular
(%)
TNF humTNF ham
A
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 14 140 1400Etanercept (pg/ml)
TNF
(U/m
l)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 14 140 1400Etanercept (pg/ml)
TNF
(U/m
l)
B
rTNF-α humano
TNF-α hamster
Resultados
79
Figura 14. Efeito in vivo do Etanercept sobre a atividade de TNF-α de hamster. Um grupo de 6 animais foi injetado via i.p. com 10mg/Kg de LPS de E. coli e o soro coletado 90 minutos depois (T90) e outro grupo recebeu 2,5 mg/Kg de Etanercept via s.c. e 2h depois foram injetados via i.p. com 10mg/Kg de LPS de E. coli e o soro coletado 90 minutos depois (T90). Como controle, amostras de soro foram coletadas de todos os animais antes das injeções de LPS ou Etanercept (T0). sTNFR, Etanercept. Os níveis séricos de TNF-α foram determinados pelo bioensaio de citotoxicidade a células L929 e o resultado está expresso em unidades de TNF bioativo por ml de soro. As unidades de TNF foram determinadas como sendo o inverso da diluição de soro onde se observou 50% de lise celular. A lise celular foi calculada pela fórmula: 1-(abs amostra/abs controle)X100. Valor de p bicaudal obtido pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
T0 T 90 T0 T901
32
1024
32768
LPS Etan+LPS
TN
F (U
/mL)
p=0,001
sTNFR + LPS
Resultados
80
5.3 Efeito do tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção por T. cruzi
5.3.1 Parasitismo sanguíneo e cardíaco
Baseado em resultados anteriores da literatura que mostram o importante papel
do TNF-α no controle da infecção aguda pelo T. cruzi em camundongos (RUSSO et
al., 1991; SILVA et al., 1995; ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996; CASTANOS-
VELEZ et al., 1998; ALIBERTI et al., 2001), e com base nos nossos resultados de
níveis aumentados de expressão de TNF-α no miocárdio, correlacionados à
intensidade do parasitismo cardíaco, verificamos o efeito do bloqueio do TNF-α pelo
Etanercept na infecção aguda da infecção pelo T. cruzi. Os resultados mostraram
que 6/12 animais infectados e tratados com Etanercept apresentaram sintomas de
fase aguda, proporção semelhante à observada entre os infectados não tratados
(conforme descrito anteriormente no item 5.1.1). A parasitemia foi medida após 5, 8,
14 e 21 dias de infecção. Apenas no 21° dia PI a freqüência de animais infectados e
tratados com parasitemia detectável foi significativamente maior do que nos
infectados não tratados (5/11 vs. 0/12; p=0,01; teste qui-quadrado com correção de
Yates). (Figura 15). Entre os cinco animais infectados tratados que apresentaram
parasitemia detectável no 21° dia PI, apenas um apresentou parasitemia em um dos
outros dias anteriores.
Resultados
81
Figura 15. Freqüência de positividade de parasitemia em diferentes dias pós-infecção.
Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. 12 hamsters foram tratados com 2,5 mg/Kg de Etanercept via subcutânea nos dias 0 (1 dia antes da infecção), 5, 8, 12 e 16 pós infecção. A parasitemia foi medida por contagem direta em 5 µl de sangue. Foram contados 50 campos em lâmina convencional de microscopia e lamínula 22X22mm (BRENER, 1962). Limite de detecção: 104 parasitas/ml de sangue.
Os animais infectados e tratados com Etanercept durante a fase aguda e
sacrificados após 21 dias de infecção apresentaram aumento significativo do número
de ninhos no miocárdio quando comparados aos animais infectados não tratados
(Figuras 16 e 17). A área de antígeno de T. cruzi no miocárdio foi significativamente
maior entre os animais infectados tratados do que entre os infectados não tratados
(Figuras 16 e 17). Além disso, observamos correlação positiva estatisticamente
significativa entre o número de ninhos no miocárdio e a área de antígeno de T.cruzi
no miocárdio (r=0,86; p<0,0001, bicaudal, teste de correlação não-paramétrico de
Spearman). Enquanto o miocárdio da maioria dos animais infectados não tratados
apresentou antígenos de T.cruzi em meio a infiltrado inflamatório, o miocárdio de
uma parcela de animais tratados com Etanercept apresentou numerosos ninhos de
amastigotas na ausência de inflamação (Figura 16). Considerando-se apenas o
grupo de animais que não apresentaram sintomas de fase aguda, a área de
5 8 14 210
10
20
30
40
50infectadosinf+Etan
dias PI
Freq
uênc
ia p
ositi
vida
de (%
)infectados + Etanercept (n=12)
infectados (n=12)
Resultados
82
antígeno de T. cruzi no miocárdio foi significativamente maior entre os animais
infectados e tratados com Etanercept quando comparados aos infectados não
tratados (Figura 17). Por outro lado, no grupo de animais com sintomas de fase
aguda, a área de antígeno de T. cruzi foi semelhante entre infectados e infectados
tratados com Etanercept (Figura 17). Além disso, a área de antígeno de T. cruzi no
miocárdio dos animais infectados e tratados com Etanercept que não apresentaram
sintomas de fase aguda foi semelhante à observada nos infectados não tratados que
apresentaram sintomas (Figura 16). Em conjunto, os resultados sugerem que o
tratamento com Etanercept durante a fase aguda facilitou a disseminação do
parasitismo sangüíneo e cardíaco na terceira semana de infecção em uma parcela
de animais que seriam resistentes ao desenvolvimento de fase aguda e que
apresentariam baixo parasitismo cardíaco.
Resultados
83
Figura 16. Parasitismo cardíaco e miocardite após tratamento com Etanercept na fase
aguda da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. 12 hamsters foram tratados com 2,5 mg/Kg de Etanercept via subcutânea nos dias 0 (1 dia antes da infecção), 5, 8, 12 e 16 pós infecção. Após 21 dias de infecção, os animais foram divididos em dois grupos de acordo com a presença ou ausência de sintomas de fase aguda e foram sacrificados. Os corações foram coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Cortes transversais de 5µm foram corados com H&E (A e B) ou submetidos a imunohistoquímica para detecção de antígeno de T. cruzi (C e D). Em (A) e (C), fotomicrografia de tecido cardíaco de animais infectados não tratados e em (B) e (D), de animais infectados e tratados com Etanercept. Aumento de 400X. As setas indicam os ninhos. As cabeças de setas indicam áreas de inflamação sem ninho. Em marrom, marcação positiva para antígeno de T. cruzi.
C D
BA
Resultados
84
infectados inf+TNFR0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10p=0,0087
ausência sintomas FA - 21 dias PI
área
Ag.
T. c
ruzi
(%) p=0,009
Figura 17. Intensidade de parasitismo cardíaco após tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. 12 hamsters foram tratados com 2,5 mg/Kg de Etanercept via subcutânea nos dias 0 (1 dia antes da infecção), 5, 8, 12 e 16 pós infecção. Após 21 dias de infecção, os animais foram sacrificados e os corações foram coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Cortes transversais de 5µm foram submetidos à detecção de antígenos de T. cruzi. O número de ninhos (A) foi obtido após contagem de 40 campos consecutivos em aumento de 400X após imunohistoquímica para detecção de antígenos de T. cruzi. A área de antígeno de T. cruzi (B, C e D) foi obtida após contagem de 15-20 campos/corte em aumento de 200X após imunohistoquímica para detecção de antígenos de T. cruzi e quantificação automática da área pelo programa de análise de imagens MetaMorph 5.0 (Nikon, Japão). Para essas análises fora utilizados 2 cortes não consecutivos de tecido cardíaco. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
infectados inf+sTNFR0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10p=0,03
21 dias PI
% á
rea
antíg
eno
T. c
ruzi
infectados inf+sTNFR1
4
16
64p=0,05
21 dias PI
n° n
inho
s/m
m2
infectado inf+sTNFR0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10
presença de sintomas FA - 21 dias PI
área
Ag.
T. c
ruzi
(%)p=NS
A B
C D
Resultados
85
5.3.2 Detecção de TNF-α no miocárdio
Após 21 dias de infecção os animais foram sacrificados e o miocárdio submetido
a imunohistoquímica para detecção de células TNF-α+. O miocárdio de todos os
animais infectados (tratados ou não com Etanercept) apresentou numerosas células
mononucleares com marcação positiva para TNF-α enquanto que nenhum animal
controle não infectado apresentou células TNF-α+ (Figura 18). Este resultado indica
que hamsters infectados por T. cruzi por 21 dias exibem alta produção local de TNF-
α pelo infiltrado linfomononuclear.
Resultados
86
Figura 18. Presença de TNF-α no infiltrado inflamatório cardíaco após tratamento com Etanercept. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. 12 hamsters foram tratados com 2,5 mg/Kg de Etanercept via subcutânea nos dias 0 (1 dia antes da infecção), 5, 8, 12 e 16 pós infecção. Após 21 dias de infecção, os animais foram sacrificados e os corações foram coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Cortes transversais de tecido cardíaco de 5µm foram submetidos a imunohistoquímica para detecção de TNF-α e contracorados com hematoxilina. Como controle positivo, foi utilizado tecido linfóide de tonsila humana com inflamação crônica (A e B) e tecido de baço de hamsters infectados por T. cruzi (C e D). Como controle negativo, foi utilizada a omissão do anticorpo primário anti-TNF-α (A e C). Em marrom, marcação positiva para TNF-α. As setas apontam para células TNF-α+ no infiltrado inflamatório de um animal infectado não tratado (E) e em (F) de um infectado tratado. Para esta análise, 30-40 campos (aumento 400X) de 3-4 cortes (5µm) não consecutivos de tecido cardíaco de cada animal foram examinados. A identificação de marcação positiva pela peroxidase em pelo menos um campo foi utilizada para o cálculo de freqüência de animais com células TNF-α+ no infiltrado inflamatório.
Resultados
87
B
DC
A
E F
Resultados
88
5.3.3 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio
Para saber se o tratamento com bloqueador de TNF-α (Etanercept) durante a
fase aguda alterou o perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas
no miocárdio, realizamos a quantificação relativa do RNAm por RT-PCR em tempo
real. Os níveis de expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas
do miocárdio de animais infectados e tratados com Etanercept em relação aos
controles não infectados estão mostrados na Figura 19. A expressão de citocinas
TNF-α, IFN-γ e IL-10 e de genes ativados por TNF-α (A20) ou por TNF-α e IFN-γ
(MnSOD e iNOS) foi semelhante entre animais infectados não tratados e infectados
tratados (Tabela 3). Como a infecção aguda pelo T. cruzi resultou em dois padrões
de evolução (ausência ou presença de sintomas de fase aguda) tanto nos infectados
sem tratamento como nos tratados com Etanercept, optamos por comparar
separadamente os grupos de acordo com a presença dos sintomas de fase aguda
(Tabela 4). Enquanto que, no grupo de animais infectados não tratados, a expressão
de TNF-α, IFN-γ, IL-10, MnSOD e A20 foi significativamente maior entre os animais
sintomáticos do que entre os infectados assintomáticos (Figuras 10 e 11, item 5.1.4),
entre os animais infectados e tratados com Etanercept não houve diferenças
significativas de expressão em relação a presença ou ausência de sintomas de fase
aguda (Tabela 4). Embora a mediana de expressão de iNOS tenha sido três vezes
menor, e a de A20, três vezes maior, nos animais infectados tratados sintomáticos
em relação aos tratados assintomáticos, não houve diferença significativa. Por outro
lado, a expressão de IL-10 entre os animais tratados assintomáticos foi
significativamente maior do que entre os não tratados assintomáticos (Tabela 5).
Este resultado mostra que o tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção
aumentou a expressão de IL-10 no miocárdio de animais que não apresentam
Resultados
89
sintomas de fase aguda. Embora a mediana de expressão de A20, TNF-α e IFN-γ
tenha sido 2,5, 2 e 6,5 vezes maior, respectivamente, nos animais tratados
assintomáticos do que nos não tratados assintomáticos (Tabela 5), não houve
diferença significativa. Embora a mediana de expressão de iNOS tenha sido 2 vezes
maior nos tratados sintomáticos do que nos não tratados sintomáticos (Tabela 6),
também não houve diferença significativa.
Enquanto a intensidade do parasitismo cardíaco nos animais infectados não
tratados esteve correlacionada à expressão de citocinas no miocárdio, o mesmo não
foi observado entre os infectados tratados. Por outro lado, a expressão de TNF-α
esteve correlacionada a expressão de A20, iNOS, MnSOD, IFN-γ e IL-10. As
correlações entre expressão de citocinas e intensidade do parasitismo cardíaco e
inflamação são apresentadas na Figura 20 e Tabela 7.
Considerando todos os animais infectados e tratados, o tratamento com
Etanercept durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi não afetou de maneira
significativa o perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no
miocárdio, e este não está relacionado à intensidade de parasitismo cardíaco.
Resultados
90
Figura 19. Perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais após tratamento com Etanercept durante a fase aguda. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Doze hamsters foram tratados com 2,5 mg/Kg de Etanercept via subcutânea nos dias 0 (1 dia antes da infecção), 5, 8, 12 e 16 pós infecção. Após 21 dias de infecção, os animais foram sacrificados e a ponta do VE do coração foi obtida para a extração de RNA. A quantificação relativa da expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados e tratados em relação ao miocárdio de animais controles não infectados (n=6) foi feita por RT-PCR em tempo real, utilizando SYBR green. Duas amostras de RNA foram consideradas impróprias para a análise e foram excluídas. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana.
TNF-α iNOS A20 MnSOD IFN-γ IL-100.0625
0.1250.25
0.51
2
4
8
16
32
64
128
256
512
infectados + sTNFR 21 dias
expr
essã
o re
lativ
a R
NAm
Resultados
91
Tabela 3. Expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados e tratados com Etanercept
Expressão Infectados (n=11)
Infectados + sTNFR (n=10)
TNF-α 5,8 (1,3-31,4) 5,1 (2,1-46,2)
IFN-γ 67,0 (0,7-160,3) 72,3 (15,8-214,0)
IL-10 142,5 (11,4-366,0) 142,9 (50,6-387,0)
MnSOD 1,0 (0,3-2,1) 0,7 (0,4-4,1)
iNOS 1,4 (0,1-7,9) 1,5 (0,2-7,6)
A20 2,6 (0,08-29,3) 3,1 (0,9-56,1)
A expressão relativa em relação aos controles não infectados está representada pela mediana (mínimo-máximo). P=NS para as comparações entre infectados vs. infectados tratados com Etanercept (infectados + sTNFR). Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Tabela 4. Expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados e tratados com Etanercept de acordo com a presença ou ausência de sintomas de fase aguda
Expressão FA - (n=5)
FA + (n=5)
TNF-α 5,0 (4,9-5,6) 9,0 (2,1-46,2)
IFN-γ 83,8 (59,4-138,7) 46,4 (15,8-214,0)
IL-10 127,1 (54,1-179,6) 155,9 (50,6-1653,0)
MnSOD 0,7 (0,6-0,9) 1,07 (0,4-4,1)
iNOS 1,5 (0,2-1,8) 5,2 (0,5-7,6)
A20 3,1 (1,9-3,9) 9,8 (0,9-56,1)
A expressão relativa em relação aos controles não infectados está representada pela mediana (mínimo-máximo). P=NS para as comparações entre animais infectados tratados com Etanercept sem sintomas de fase aguda (FA -) vs. com sintomas (FA +). Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Resultados
92
Tabela 5. Comparação da expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais assintomáticos infectados e tratados com Etanercept e infectados não tratados
Expressão Infectados
(n=5)
Infectados + sTNFR (n=5)
TNF-α 2,5 (1,3-5,7) 5,0 (4,9-5,6)
IFN-γ 12,9 (0,7-140,5) 83,8 (59,4-138,7)
IL-10 28,0 (11,4-75,3) 127,1 (54,1-179,6)*
MnSOD 0,5 (0,3-1,0) 0,7 (0,6-0,9)
iNOS 0,8 (0,1-2,1) 1,5 (0,2-1,8)
A20 1,2 (0,08-2,6) 3,1 (1,9-3,9)
A expressão relativa em relação aos controles não infectados está representada pela mediana (mínimo-máximo). P=NS para as comparações entre infectados vs. infectados tratados com Etanercept (infectados + sTNFR). * p=0,016 para a comparação entre infectados vs. infectados tratados com Etanercept. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Tabela 6. Comparação da expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais sintomáticos infectados e tratados com Etanercept e infectados não tratados
Expressão Infectados
(n=6)
Infectados + sTNFR (n=5)
TNF-α 14,8 (4,6-31,3) 9,0 (2,0-46,2)
IFN-γ 79,6 (44,8-160,3) 46,3 (15,8-214,0)
IL-10 192,7 (142,5-366,0) 155,9 (50,64-1653,0)
MnSOD 1,1 (1,0-2,1) 1,1 (0,4-4,1)
iNOS 2,3 (0,2-7,9) 5,2 (0,5-7,6)
A20 15,2 (1,0-29,2) 9,8 (0,9-56,1)
A expressão relativa em relação aos controles não infectados está representada pela mediana (mínimo-máximo). P=NS para as comparações entre infectados vs. infectados tratados com Etanercept (infectados + sTNFR). Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Resultados
93
Tabela 7. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e intensidade de parasitismo cardíaco após tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção por T. cruzi
A tabela mostra os valores de r e p dos testes de correlação entre a área de antígeno de T. cruzi no miocárdio e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados e tratados. Em cinza, correlações significativas. Valores de r e p bicaudais obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
r p
Área Ag. T. cruzi (%) TNF-α IFN-γ IL-10 A20 iNOS MnSOD
Área Ag. T. cruzi (%) 0,20
0,58 -0,14 0,70
0,34 0,33
0,34 0,33
0,37 0,29
0,28 0,42
TNF-α 0,20 0,58 0,70
0,02 0,67 0,03
0,82 0,004
0,78 0,008
0,98 0,0001
IFN-γ -0,14 0,70
0,70 0,02 0,56
0,09 0,51 0,13
0,30 0,40
0,66 0,04
IL-10 0,34 0,33
0,67 0,03
0,56 0,09 0,54
0,11 0,34 0,33
0,77 0,009
A20 0,34 0,33
0,82 0,004
0,51 0,13
0,54 0,11 0,74
0,01 0,79
0,006
iNOS 0,37 0,29
0,78 0,008
0,30 0,40
0,34 0,33
0,74 0,01 0,70
0,02
MnSOD 0,28 0,42
0,98 0,0001
0,66 0,04
0,77 0,009
0,79 0,006
0,70 0,02
Resultados
94
Figura 20. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e intensidade de parasitismo cardíaco após tratamento com Etanercept na fase aguda da infecção por T. cruzi. O gráfico em matriz mostra a correlação entre a área de antígeno de T. cruzi no miocárdio e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados e tratados com Etanercept na fase aguda da infecção por T. cruzi. *p<0,05 e ** p<0,01, valores de p bicaudais obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
% Área Ag T. cruzi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗∗ ∗∗∗∗∗∗
∗
∗∗∗∗∗
∗
% Área Ag T. cruzi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
% Área Ag T. cruzi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗∗ ∗∗∗∗∗∗
∗
∗∗∗∗∗
∗
Resultados
95
5.4 Evolução da infecção por T. cruzi em hamsters: fase aguda e fase
crônica
5.4.1 Fase aguda
A evolução da infecção aguda em animais que foram acompanhados até a
fase crônica foi avaliada em 74 animais infectados com 105 tripomastigotas
sanguíneos da cepa Y de T. cruzi. Esses animais foram acompanhados durante os
dois primeiros meses de infecção para análise da sobrevida e presença de parasitas
circulantes na fase aguda. Dos animais que morreram espontaneamente durante a
fase aguda (0-125 dias PI), analisamos também a presença de miocardite e ninhos
de parasitas no tecido cardíaco na data da morte.
Sinais, sintomas e mortalidade durante a fase aguda
Nossos resultados mostraram que, entre 21 e 32 dias PI, 30% dos animais (22/74)
apresentam um quadro de sintomas clínicos semelhante ao quadro observado em
humanos suscetíveis à infecção aguda, tais como caquexia, letargia, vômito, diarréia
e perda de peso. Todos os animais que apresentaram esses sintomas morreram
neste período da fase aguda (entre os dias 21 e 32 PI), enquanto que os animais
que não apresentaram sintomas nesta fase sobreviveram até a fase crônica.
Nenhum animal não infectado morreu no período equivalente (Figura 21A). Entre os
dias 33 e 125 PI, não foram observados óbitos dos animais infectados (Figura 21A).
Esses achados são semelhantes ao observado em nosso estudo anterior, onde
utilizamos o mesmo modelo experimental (BILATE et al., 2003). Entre os animais
sintomáticos que morreram espontaneamente entre 21 e 32 dias PI e que puderam
ser recuperados, a perda de peso foi significativamente maior do que entre os
Resultados
96
animais infectados que sobreviveram à fase aguda e não apresentaram sintomas
(Figura 21B).
Parasitemia
A pesquisa direta de parasitas circulantes mostrou que 27% (20/74) dos
animais apresentaram parasitemia detectável no 13° dia PI (Figura 21C), e a
presença de parasitas circulantes neste período esteve significativamente associada
à mortalidade durante a fase aguda (Tabela 8). Este resultado sugere que a
sobrevivência à fase aguda está relacionada ao controle da parasitemia.
Resultados
97
Figura 21. Sobrevida, perda de peso e parasitemia durante a fase aguda da infecção por T. cruzi em hamsters. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Os óbitos ocorridos entre os dias zero e 125 PI foram registrados para a análise da sobrevida durante a fase aguda (A). *p=0,03 controles vs. infectados, teste de logrank. Em (B), o gráfico mostra a % de perda de peso em relação ao peso antes da infecção. Antes da infecção e no dia da morte espontânea (entre 21 e 28 dias PI), os animais foram pesados para cálculo da perda de peso em relação ao peso inicial antes da infecção. Como controle, os animais infectados sobreviventes foram pesados no mesmo período. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana. Valor de p bicaudal obtido pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney. Em (C), o gráfico mostra a freqüência de animais com parasitemia indetectável (<104 parasitas/ml) e detectável (>104 parasitas/ml) no 13° dia PI. Uma alíquota de sangue foi retirada por punção retro-orbital com auxílio de pipeta Pasteur e diluída em tampão de lise de hemácias. A parasitemia foi medida pelo método de contagem direta em câmara de Neubauer conforme descrito em trabalhos anteriores (WRIGHTSMAN et al., 1982).
Resultados
98
<104 >104 e <105 >105 e <1080
25
50
75
100
54/74
8/74 12/74
n° parasitas/ml sangue
% a
nim
ais
0 25 50 75 100 1250
20
40
60
80
100controles (n=13)infectados (n=74)
dias pós-infecção
sobr
eviv
ênci
a (%
)
sobreviventes mortos-150
-125
-100
-75
-50
-25
0
25
50
p<0,0001
(n=50) (n=13)
fase aguda
% p
erda
pes
o
A
B
C
∗
Resultados
99
Tabela 8. Associação entre parasitemia e mortalidade na fase aguda
N° animais parasitemia vivos mortos
negativa 46 8
positiva 6 14
p<0,0001; RR=2,84; OR=13,42; Teste exato de Fisher.
Análise histopatológica
Dos 22 animais que não sobreviveram à fase aguda, corações de 14 animais
foram recuperados e submetidos à análise histopatológica. A análise histopatológica
e imunohistoquímica para detecção de antígenos de T. cruzi no tecido cardíaco
mostrou que todos os animais que morreram espontaneamente entre 21 e 28 dias PI
apresentaram miocardite multi-focal e/ou difusa, de grau moderado a grave e
elevado número de ninhos de parasita rotos ou intactos (Figura 22). Os ninhos rotos
freqüentemente estavam acompanhados de intenso infiltrado inflamatório, enquanto
que os ninhos intactos de amastigotas estavam presentes em áreas livres de
infiltrado (Figura 22). Além disso, foi possível verificar que, em alguns casos,
numerosos focos de células inflamatórias estavam presentes em áreas de fibras
cardíacas que haviam sido destruídas (Figura 22).
Dada a associação entre presença de parasitas circulantes no 13° dia PI e
morte durante a fase aguda (Tabela 8), investigamos se a parasitemia estava
relacionada ao parasitismo cardíaco da fase aguda. Para isso, quantificamos o
número de ninhos presentes no miocárdio na data da morte espontânea durante a
fase aguda (21-28 dias PI) dos animais com e sem parasitemia detectável. A
intensidade do parasitismo cardíaco foi significativamente maior entre os animais
Resultados
100
com parasitemia detectável do que nos animais com parasitemia indetectável (Figura
22), sugerindo que o controle da parasitemia impede a instalação e disseminação do
parasitismo cardíaco.
Resultados
101
Figura 22. Parasitismo cardíaco e miocardite na fase aguda. Hamsters de 2,5 meses de idade
foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Os corações dos animais que morreram espontaneamente durante a fase aguda (21-28 dias PI) foram recuperados e processados pelo método de inclusão em parafina. Cortes transversais de 5 µm foram corados com H&E (A) ou submetidos a imunohistoquímica para detecção de antígeno de T. cruzi (B e D). Em (A), fotomicrografia de tecido cardíaco de um animal que morreu espontaneamente durante a fase aguda. As setas apontam para o infiltrado inflamatório e para uma fibra cardíaca destruída, aumento de 400X. Em (B) fotomicrografia de tecido cardíaco de um animal com parasitemia detectável (positiva) e (D), animal com parasitemia indetectável (negativa); aumento de 400X. As setas apontam para os ninhos. Em marrom, marcação positiva para antígeno de T. cruzi. A parasitemia foi medida 13 dias PI pelo método de contagem direta em câmara de Neubauer, conforme descrito anteriormente. O parasitismo cardíaco foi medido pela contagem do número de ninhos presentes em 40 campos microscópicos (aumento 400X) de dois cortes não consecutivos de tecido cardíaco após imunohistoquímica para detecção de antígenos de T. cruzi (C). O número total de ninhos presentes nos campos foi dividido pela soma das áreas dos campos. A média do número de ninhos/mm2 de miocárdio foi obtida para os dois cortes. Valor de p bicaudal obtido pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal mostra a mediana.
B
C
A
Dnegativa positiva
0.5 1 2 4 8
16 32
p=0,01
parasitemia 13 dias
Nin
hos/
mm
2
Resultados
102
Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio
Uma vez que os animais que morreram espontaneamente durante a fase
aguda também apresentaram miocardite e intenso parasitismo cardíaco,
investigamos a presença de mediadores inflamatórios no miocárdio. Dos 14
corações que foram recuperados antes do rigor mortis, apenas 5 forneceram RNA
íntegros que permitiram a quantificação relativa por RT-PCR em tempo real. O perfil
de expressão de RNAm de citocinas (TNF- α, IFN-γ e IL-10) e genes ativados por
citocinas (MnSOD, iNOS, A20) é apresentado na Figura 23. Nestes animais, que
morreram entre 21-28 dias PI, houve predomínio da expressão de IFN-γ, IL-10 e do
gene A20 em comparação à expressão de TNF-α, iNOS e MnSOD, embora a
expressão de TNF- α tenha sido superior à expressão de controles não infectados.
Este resultado sugere que a morte na fase aguda está associada a um perfil de
expressão miocárdica de RNAm de citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias.
Resultados
103
Figura 23. Perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados que morreram espontaneamente durante a fase aguda. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Os corações dos animais que morreram espontaneamente durante a fase aguda (21-28 dias PI) foram recuperados e a ponta do VE foi obtida para a extração de RNA. A quantificação relativa da expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados em relação ao miocárdio de animais controles não infectados (n=3) foi feita por RT-PCR em tempo real, utilizando SYBR green.
5.4.2 Fase crônica
Mortalidade durante a fase crônica
Durante a fase crônica (4-11 meses PI), a freqüência de óbitos foi
significativamente mais elevada entre os animais infectados do que nos controles
não infectados (64% (16/25) vs. 23% (3/13), respectivamente) (Figura 24).
Considerando somente o grupo de animais que foram acompanhados desde o
primeiro dia de infecção até a morte espontânea ou sacrifício 11 meses PI (n=38), 13
animais morreram durante a fase aguda. Dos 25 animais restantes, 16 morreram
durante a fase crônica e 9 sobreviveram até o final do estudo (11 meses PI). Os
óbitos durante a fase crônica ocorreram entre 5 e 10,5 meses PI.
TNF-α A20 MnSOD iNOS IFN-γ IL-100.0625
0.1250.25
0.51248
163264
128256512
1024
infectados - fase aguda (21-28 dias PI)
expr
essã
o re
lativ
a R
NA
m
Resultados
104
Nesse mesmo grupo, observamos que, dos 24 animais com parasitemia
indetectável 13 dias PI, 4 animais (17%) morreram espontaneamente durante a fase
aguda, 14 animais (58%) morreram durante a fase crônica e 6 (25%) sobreviveram
até o final do estudo (11 meses PI). Dos 14 animais que apresentaram parasitemia
detectável 13 dias PI, 9 animais (64%) morreram durante a fase aguda, 2 animais
(14%) morreram durante a fase crônica e 3 animais (21%) sobreviveram até 11
meses PI.
Figura 24. Sobrevivência durante a infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Os óbitos ocorridos nestes períodos foram registrados para a análise de sobrevida. A comparação entre as curvas de sobrevida foi feita pelo teste de Logrank. * p=0,0006 para a comparação entre infectados e controles.
Análise ecocardiográfica
Para verificar a integridade da estrutura e função do ventrículo esquerdo (VE)
dos animais empregados no estudo, realizamos uma análise ecocardiográfica basal
(antes da infecção por T. cruzi). Esta análise mostrou que todos os animais
empregados neste estudo apresentaram anatomia cardíaca e função ventricular
0 50 100 150 200 250 300 3500
20
40
60
80
100 controles (n=13)
infectados (n=38)
dias pós-infecção
sobr
eviv
ênci
a (%
)
*
Resultados
105
esquerda dentro dos padrões de normalidade (SALEMI et al., 2005). A Tabela 9
mostra os valores basais de função sistólica do VE, medida pela fração de
encurtamento do VE (∆D%), diâmetro das câmaras cardíacas durante a sístole
(DSVE) e diástole (DDVE).
Após 8 meses de infecção, os animais sobreviventes à fase aguda foram
submetidos novamente ao exame ecocardiográfico, que mostrou aumento
significativo do diâmetro diastólico e sistólico do VE e diminuição também
significativa da função sistólica do VE entre os animais infectados em comparação
aos controles não infectados (Figura 25), indicando dilatação e disfunção do VE.
Baseando-se em nosso trabalho anterior, onde utilizamos 94 hamster sadios para
obter os parâmetros ecocardiográficos de normalidade (SALEMI et al., 2005),
estabelecemos como função ventricular normal valores de ∆D% maiores ou iguais a
30,0. Com base neste valor, identificamos que 30% (13/43) dos animais infectados
apresentaram disfunção ventricular 8 meses PI. Considerando somente o grupo de
animais que foram acompanhados desde o primeiro dia de infecção até a morte
espontânea ou sacrifício 11 meses PI, a função ventricular, medida 8 meses PI, foi
significativamente menor entre os animais que morreram durante a fase crônica
(entre 8 e 10 meses PI) do que entre os animais que sobreviveram até o final do
estudo (11 meses PI) (Figura 26).
De acordo com a função ventricular obtida 8 meses PI, foi possível distinguir
diferentes padrões de evolução nos animais que foram acompanhados desde o
primeiro dia de infecção até a morte espontânea ou sacrifício 11 meses PI: (1)
desenvolvimento de disfunção ventricular acompanhada de morte entre 8-10 meses
PI em 21% (4/19) dos animais; (2) função ventricular preservada na parcela restante.
Dos animais que apresentaram função ventricular preservada 8 meses PI,
Resultados
106
observamos três distintos desfechos: 1. 40% (6/15) dos animais morreram entre 8-10
meses PI e, portanto, a função ventricular não pôde ser registrada após 11 meses de
infecção; 2. 11% (1/9) sobreviveu até 11 meses PI e desenvolveu disfunção
ventricular; 3. 89% (8/9) dos animais mantiveram função ventricular preservada 11
meses PI e sobreviveram até o final do estudo (Figura 27). Esses resultados
sugerem que, após 8 meses de infecção, um subgrupo de hamsters infectados
desenvolve dilatação do VE acompanhada de disfunção ventricular enquanto que o
restante evolui com perfil semelhante aos pacientes da forma indeterminada da
doença de Chagas.
Tabela 9. Medidas ecocardiográficas basais
Antes da infecção, todos os animais empregados no estudo (n=94) foram submetidos ao exame ecocardiográfico para determinação do tamanho e função cardíaca basal. DDVE, diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE, diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo, ∆D%, fração de encurtamento do ventrículo esquerdo. Os valores de diâmetro foram corrigidos pelo peso corporal: DDVE ou DSVE(cm)/peso corporal (g) X 1000.
Medidas ecocardiográficas média desvio-padrão
mediana
min-max
DDVE/peso 3,99 0,43 4,02 2,83-4,81
DSVE/peso 2,20 0,39 2,22 1,20-3,17
∆D% 44,47 6,54 43,87 32,11-67,64
Resultados
107
C D E
∆D(%
)
A B
Figura 25. Função ventricular esquerda e diâmetros diastólico e sistólico do ventrículo esquerdo após 8 meses de infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Após 8 meses de infecção, os animais foram submetidos ao exame ecocardiográfico (A e B). Em (A) ecocardiograma transtorácico Modo-M do VE de um animal controle não infectado e em (B) de um animal infectado por 8 meses. Em B, podemos notar o aumento do diâmetro diastólico do VE (DDVE) e do diâmetro sistólico do VE (DSVE) em comparação ao controle não infectado. As medidas de DDVE e DSVE foram corrigidas pelo peso corporal (C e D, respectivamente) (DDVE ou DSVE (cm)/peso corporal (g) X 1000). (E) A função ventricular esquerda, medida pela fração de encurtamento do VE (∆D%) foi calculada pela fórmula: ∆D%= DDVE-DSVE/DDVE X 100. Cada símbolo representa um animal. A barra horizontal mostra a mediana e a linha pontilhada o valor de ∆D% considerado como parâmetro de função ventricular normal (∆D=30%). Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
5 m
m
DDVEDSVEDDVE DSVE
5 m
m
DDVEDSVEDDVE DSVE
controles infectados0
1
2
3
4
p=0,002
8 meses PI
DSV
E/pe
so
controles infectados0
2
4
6
8 p=0,0184
8 meses PI
DD
VE/p
eso
controles infectados0
10
20
30
40
50
60
p=0,0127
8 meses PI
∆D
%
p=0,013 p=0,02
Resultados
108
Figura 26. Função ventricular de animais que sobreviveram ou morreram durante a fase crônica da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Oito meses PI, os animais foram submetidos ao exame ecocardiográfico e a função ventricular foi medida pela fração de encurtamento do VE (∆D%). Cada símbolo representa um animal. A barra horizontal mostra a mediana e a linha pontilhada o valor de ∆D% considerado como parâmetro de função ventricular normal (∆D=30%). Valor de p bicaudal obtido pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney. Para essa análise, foram considerados apenas 19 animais dos 25 sobreviventes à fase aguda, pois 6 animais morreram entre 5 e 7,5 meses PI, portanto antes do exame ecocardiográfico.
sobreviventes mortos0
10
20
30
40
50
p=0,0101
fase crônica
FEVE
8 m
eses
PI
∆D(%
) 8 m
eses
PI
p=0,01
Resultados
109
Figura 27. Evolução da função ventricular ao longo da infecção crônica pelo T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Após 8 e 11 meses de infecção, os animais foram submetidos ao exame ecocardiográfico para análise da função ventricular, medida pela fração de encurtamento do VE (∆D%). Em (A), função ventricular de hamsters controles não infectados ( animais com função ventricular preservada aos 8 e 11 meses PI e que sobreviveram até 11 meses PI (n=10). animais com função ventricular preservada 8 meses PI e que morreram entre 8-10 meses PI (n=2)). Em (B) função ventricular de hamsters infectados por T. cruzi ( animais com função ventricular preservada 8 meses PI e que desenvolveram disfunção VE 11 meses PI (n=1); animais com função ventricular preservada 8 meses PI e que morreram entre 8-10 meses PI (n=6); animais com disfunção ventricular 8 meses PI e que morreram entre 8-10 meses PI (n=4); animais com função ventricular preservada aos 8 e 11 meses PI e que sobreviveram até 11 meses PI (n=8).
A. controles não infectados
B. infectados
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
8 meses 11 meses
tempo de infecção
FEVE
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
8 meses 11 meses
tempo de infecção
FEV
E∆D
%
∆D%
Resultados
110
Análise anatomo-patológica
Para investigar a presença de dilatação das câmaras cardíacas e saber se a
morte espontânea durante a fase crônica esteve relacionada ao desenvolvimento de
dilatação, calculamos o índice de dilatação do ventrículo esquerdo, com base no
diâmetro das cavidades do VE e espessura das paredes do VE (septo
intraventricular e parede livre). Os resultados mostraram que o índice de dilatação foi
significativamente maior entre os animais infectados (sobreviventes e mortos durante
a fase crônica) em comparação aos animais controles não infectados (Figura 28).
Entretanto, o índice de dilatação do VE dos animais infectados sobreviventes foi
semelhante ao dos mortos (Figura 28). Com base no valor de corte de 3,28 (média +
2 desvios-padrão dos valores de índice de dilatação dos controles), verificamos que
7 animais apresentaram dilatação do VE. Desses 7 animais, 4 sobreviveram até o
final do estudo (11 meses PI) e 3 morreram espontaneamente durante a fase
crônica.
A intensidade de miocardite, medida pelo número de células inflamatórias
presentes no miocárdio, foi significativamente maior entre os animais infectados
(sobreviventes e mortos durante a fase crônica) do que nos animais controles não
infectados (Figura 29). Para verificar se a morte espontânea durante a fase crônica
estava relacionada à intensidade de miocardite, o grupo de animais infectados foi
dividido em sobreviventes e mortos durante a fase crônica. O resultado mostrou que
o número de células inflamatórias foi semelhante nesses dois grupos (Figura 29).
Isso sugere que a intensidade de miocardite não está relacionada à progressão para
morte na fase crônica da infecção. Por outro lado, o número de células inflamatórias
presentes no miocárdio foi significativamente maior no grupo de animais que
apresentou dilatação macroscópica do VE do que nos animais que não
Resultados
111
apresentaram dilatação (Figura 30). Considerando-se o grupo de animais infectados
(sobreviventes e mortos durante a fase crônica), observamos uma correlação
positiva estatisticamente significativa entre o número de células inflamatórias
presentes no miocárdio e o índice de dilatação do VE (Figura 30). Em conjunto, os
resultados mostram que um subgrupo de hamsters infectados pelo T. cruzi
desenvolveu simultaneamente dilatação das câmaras cardíacas e miocardite.
Entretanto, a presença de miocardite e dilatação não está associada à morte,
sugerindo que outros eventos que não a inflamação e dilatação ventricular são
decisivos para a evolução ao óbito.
Resultados
112
Figura 28. Dilatação do ventrículo esquerdo na fase crônica da infecção por T. cruzi. Hamsters
de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 11 meses de infecção os animais sobreviventes foram sacrificados e os corações coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Alguns corações de animais que morreram espontaneamente durante a fase crônica foram recuperados antes do rigor mortis e também foram processados. Cortes transversais de 5µm ao nível do equador do coração foram corados com H&E (A e B). Em (A), coração de um animal infectado sem dilatação do ventrículo esquerdo (VE) ou do ventrículo direito (VD) e em (B) de um animal infectado com dilatação do VE e do VD. Para o cálculo do índice de dilatação do VE, as imagens do corte foram digitalizadas em aumento de 10X e as medidas de diâmetro do VE, espessura da parede livre e do septo intraventricular foram obtidas com o programa AxioVision 3.0 (Zeiss, Alemanha). O índice de dilatação do VE foi calculado pela equação: diâmetro VE/ média espessura parede livre e septo intraventricular. Em (C), comparação entre controles e infectados e em (D), comparação entre os animais infectados sobreviventes até o final do estudo (11 meses PI) e mortos espontaneamente durante a fase crônica. Cada símbolo representa um animal. A barra horizontal mostra a mediana. Os animais com valores de índice de dilatação ≥ 3,28 foram considerados como apresentando dilatação do VE (linha pontilhada) Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
BA
sobreviventes mortos0
2
4
6
8
fase crônica
índi
ce d
ilata
ção
VE
controles infectados0
2
4
6
8 p=0,0398
fase crônica
índi
ce d
ilata
ção
VE
p=0,04 C D
p=NS
Resultados
113
Figura 29. Miocardite na fase crônica da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade
foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 11 meses de infecção os animais sobreviventes foram sacrificados e os corações coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Alguns corações de animais que morreram espontaneamente durante a fase crônica foram recuperados antes do rigor mortis e também foram processados. Cortes transversais de 5 µm ao nível do equador do coração foram corados com H&E (A e B) Em (A), fotomicrografia de tecido cardíaco de um animal controle não infectado e em (B) de um animal infectado por 11 meses. As setas apontam para o infiltrado inflamatório (aumento de 160X). A intensidade de miocardite foi medida pelo número de células inflamatórias presentes no miocárdio (C e D). Para esta análise, as imagens de 2 cortes corte foram digitalizadas em aumento de 400X e 8-10 campos não consecutivos de cada corte de tecido cardíaco de cada animal foram examinados com auxílio do programa AxioVision 3.0 (Zeiss, Alemanha). O número total de células inflamatórias presentes nos dois cortes foi dividido pela área total de miocárdio. Em (C), comparação entre controles e infectados e em (D), comparação entre os animais infectados sobreviventes até o final do estudo (11 meses PI) e mortos espontaneamente durante a fase crônica. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
B A
sobreviventes mortos0
50
100
150
200
250
300
350
fase crônica
n° c
els
infla
mat
ória
s/m
m2
p=NS
controles infectados0
50
100
150
200
250
300
350
p=0,0051
fase crônica
n° c
els
infla
mat
ória
s/m
m2
p=0,005 C D
Resultados
114
Figura 30. Dilatação do ventrículo esquerdo e miocardite na fase crônica da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 11 meses de infecção os animais sobreviventes foram sacrificados e os corações coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Alguns corações de animais que morreram espontaneamente durante a fase crônica foram recuperados antes do rigor mortis e também foram processados. A intensidade de miocardite e a dilatação do VE foram medidas conforme descrito anteriormente. Em (A), comparação da miocardite no grupo de animais infectados com e sem dilatação do VE; valor de p determinado pelo teste U não-paramétrico bicaudal de Mann-Whitney. Animais com índice de dilatação acima de 3,28 (linha pontilhada) foram considerados com dilatação do VE. Em (B) correlação entre a intensidade de miocardite e a dilatação do VE nos animais infectados; valores de r e p bicaudal obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
A B
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0,0 100,0 200,0 300,0 400,0
n° céls. Inflamatórias/mm2
índi
ce d
ilata
ção
VE
p=0,03 r=0,50
ausente presente0
100
200
300
400
p=0,007
dilatação VE na fase crônica
n° c
éls.
infla
mat
ória
s/m
m2
Resultados
115
Detecção de TNF-α no miocárdio
A análise imunohistoquímica para detecção de TNF- α no miocárdio mostrou
que 5/13 animais infectados apresentaram células mononucleares com marcação
positiva para TNF- α, enquanto que nenhum animal controle não infectado
apresentou marcação (Figura 31). Dos cinco animais com células mononucleares
TNF- α+ no miocárdio, quatro morreram espontaneamente durante a fase crônica
enquanto dos oito animais com células mononucleares TNF- α– no miocárdio, três
animais morreram espontaneamente entre 8-10 meses PI e cinco sobreviveram até
o final do estudo (11 meses PI). Esse resultado mostra que, na fase crônica, um
subgrupo de animais infectados apresenta células mononucleares produtoras de
TNF-α no infiltrado inflamatório.
Resultados
116
Figura 31. Presença de TNF- α no infiltrado inflamatório cardíaco na fase crônica da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 11 meses de infecção os animais sobreviventes foram sacrificados e os corações coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Alguns corações de animais que morreram espontaneamente durante a fase crônica foram recuperados antes do rigor mortis e também foram processados. Cortes transversais de tecido cardíaco de 5µm foram submetidos a imunohistoquímica para detecção de TNF- α. Como controle positivo, foram utilizados baço de hamsters infectados por T. cruzi (A e B) e tecido cardíaco de paciente com CCC grave (C e D) onde já havia sido feita a confirmação de marcação com TNF- α por imunohistoquímica utilizando outro anticorpo anti-TNF- α. Como controle negativo, foi utilizada a omissão do anticorpo primário anti-TNF- α (A, C e E). Em (E) e (F), tecido cardíaco de um animal infectado por 11 meses. Em marrom, marcação positiva para TNF- α. As setas apontam para células TNF- α+ no infiltrado inflamatório de um animal infectado por 11 meses (F). Para esta análise, 30-40 campos (aumento 400X) de 3-4 cortes (5µm) não consecutivos de tecido cardíaco de cada animal foram examinados. A identificação de marcação positiva pela peroxidase em pelo menos um campo foi utilizada para o cálculo de freqüência de animais com células TNF- α+ no infiltrado inflamatório.
Resultados
117
B
DC
A
E F
Resultados
118
Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio
Para investigar o perfil de expressão de citocinas (TNF- α, IFN-γ e IL-10) e
genes ativados por citocinas (iNOS, MnSOD, A20) no miocárdio de animais
cronicamente infectados e a sua influência na progressão diferencial da CCC no
hamster, utilizamos a técnica de RT-PCR em tempo real. Essa análise mostrou que
o miocárdio de animais infectados por 8-11 meses apresenta o predomínio de
expressão de RNAm de IFN-γ mas também expressa em níveis aumentados TNF- α,
IL-10 e A20 em comparação ao miocárdio de animais não infectados (Figura 32). Os
níveis de expressão de MnSOD e iNOS foram semelhantes entre infectados e não
infectados (Figura 32). Por outro lado, observamos correlação positiva
estatisticamente significativa entre os níveis de expressão de A20 e a expressão de
IL-10 e MnSOD (Figura 33, Tabela 10). A expressão de IL-10 também esteve
correlacionada com a expressão de MnSOD, que por sua vez esteve correlacionada
com expressão de TNF- α, enquanto que a expressão de IFN-γ esteve
correlacionada com a expressão de iNOS (Figura 33, Tabela 10).
Para investigar se o perfil de expressão de citocinas e genes ativados por
citocinas no miocárdio dos animais cronicamente infectados estava relacionado com
sobrevivência à fase crônica, comparamos os níveis de expressão nos animais
infectados que morreram espontaneamente durante a fase crônica com os animais
que sobreviveram até o final do estudo (11 meses PI). Os resultados mostraram que
não houve diferença estatisticamente significativa nos níveis de expressão de TNF-
α, IFN-γ, IL-10, iNOS e MnSOD entre os sobreviventes e mortos espontaneamente
durante a fase crônica (Tabela 11). Entretanto, a mediana de expressão de IL-10 foi
4,3 vezes maior nos animais que morreram espontaneamente do que nos animais
que sobreviveram (Tabela 11). A expressão do gene anti-apoptótico A20 foi
Resultados
119
significativamente maior entre os animais que morreram espontaneamente durante a
fase crônica do que entre os sobreviventes até o final dos 11 meses de infecção
(Tabela 11), sugerindo que esse gene pode estar relacionado a morte durante a fase
crônica. Além disso, os níveis de expressão de A20 e IL-10 estavam negativamente
correlacionados com a função ventricular medida 8 meses PI (Tabela 10, Figura 33).
Para investigar se o perfil de expressão das citocinas estava relacionado à
gravidade da cardiomiopatia, comparamos o grupo de animais que desenvolveu
dilatação e miocardite na fase crônica com o grupo que não desenvolveu. A
expressão de citocinas ou genes ativados por citocinas foi semelhante nos animais
com dilatação do VE e miocardite em comparação aos que não apresentaram
dilatação ou miocardite na fase crônica (Tabela 12).
Resultados
120
TNF-α A20 MnSOD iNOS IFN-γ IL-100.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
infectados - fase crônica
expr
essã
o re
lativ
a RN
Am
Figura 32. Perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais cronicamente infectados. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 11 meses de infecção os animais sobreviventes foram sacrificados (n=8), os corações coletados e a ponta do VE foi obtida para a extração de RNA. Os corações dos animais que morreram espontaneamente durante a fase crônica (8-11 meses PI) (n=5) também foram recuperados e a ponta do VE foi obtida para a extração de RNA. A quantificação relativa da expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados em relação ao miocárdio de animais controles não infectados (n=10) foi feita por RT-PCR em tempo real, utilizando SYBR green. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana.
Resultados
121
Tabela 10. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e função ventricular na fase crônica da infecção por T. cruzi
A tabela mostra os valores de r e p dos testes de correlação entre a função ventricular (∆D%) medida 8 meses PI e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados por 11 meses. Em cinza, correlações significativas. Valores de r e p bicaudal obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
r p
∆D% 8 meses
PI TNF-α IFN-γ IL-10 A20 iNOS MnSOD
∆D% 8 meses PI 0,014
0,97 0,25 0,47
-0,82 0,002
-0,63 0,04
0,54 0,08
-0,41 0,20
TNF-α 0,014 0,97 0,54
0,05 0,43 0,17
0,24 0,43
0,01 0,97
0,65 0,015
IFN-γ 0,25 0,47
0,54 0,05 0,24
0,46 -0,03 0,93
0,57 0,04
0,47 0,10
IL-10 -0,8 0,002
0,43 0,17
0,24 0,46 0,74
0,006 -0,27 0,39
0,7 0,01
A20 -0,6 0,04
0,24 0,43
-0,03 0,93
0,74 0,006 -0,05
0,86 0,7 0,01
iNOS 0,54 0,08
0,01 0,97
0,57 0,04
-0,27 0,39
-0,05 0,86 0,02
0,96
MnSOD -0,41 0,20
0,65 0,015
0,47 0,10
0,7 0,01
0,7 0,01
0,02 0,96
Resultados
122
Figura 33. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e
função ventricular na fase crônica da infecção por T. cruzi. O gráfico em matriz mostra a correlação entre a função ventricular (∆D%) medida 8 meses PI e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados por 11 meses. *p<0,05 e ** p<0,01, valores de e p bicaudais obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
∆D%8mPi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗
∗
∗∗ ∗
∗
∗ ∗∆D%8mPi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∆D%8mPi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗
∗
∗∗ ∗
∗
∗ ∗
Resultados
123
Tabela 11. Níveis de Expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais sobreviventes e mortos na fase crônica
Expressão Sobreviventes
(n=8) Mortos (n=5)
TNF-α 2,2 (0,7-3,9) 0,9 (0,3-14,1)
IFN-γ 5,9 (1,2-11,3) 3,3 (1,7-5,3)
IL-10 1,4 (0,3-2,3) 6,0 (0,7-27,5)
MnSOD 0,9 (0,7-2,0) 1,0 (0,7-4,9)
iNOS 1,9 (0,6-3,0) 0,8 (0,3-3,1)
A20 1,1 (0,4-1,8) 3,5 (0,6-14,2)*
A expressão relativa em relação aos controles não infectados está representada pela mediana (mínimo-máximo). p=NS para as comparações entre sobreviventes vs. mortos durante a fase crônica. * p= 0,03, sobreviventes vs. mortos. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Tabela 12. Níveis de Expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais com ou sem dilatação do ventrículo esquerdo e miocardite
Expressão não dilatados (n=7)
Dilatados (n=5)
TNF-α 1,7 (0,3-14,0) 1,7 (0,7-3,8)
IFN-γ 4,0 (2,0-8,0) 5,5 (1,2-11,3)
IL-10 1,6 (0,7-27,5) 2,0 (0,3-3,2)
MnSOD 1,1 (0,7-4,9) 0,9 (0,7-1,5)
iNOS 0,9 (0,3-3,1) 2,0 (1,0-2,4)
A20 1,8 (0,6-14,2) 1,1 (0,9-4,0) A expressão relativa em relação aos controles não infectados está representada pela mediana (mínimo-máximo). p=NS para as comparações entre dilatados e não dilatados. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney. A diferença de número de animais analisados nesta tabela em relação a tabela anterior se deve ao fato de um corte de tecido cardíaco de um animal foi considerado inapropriado para o cálculo do índice de dilatação.
Resultados
124
5.4.3 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio: fase aguda X fase
crônica
Uma vez que os hamsters infectados por T. cruzi desenvolvem tanto a fase
aguda, evidenciada por intenso parasitismo cardíaco e intensa miocardite, como a
fase crônica, caracterizada por miocardite, dilatação e disfunção ventricular,
objetivamos a comparação da expressão miocárdica de RNAm de citocinas e genes
ativados por citocinas inflamatórias na fase aguda e na fase crônica (Tabela 13). Os
resultados mostraram que os níveis de expressão de RNAm das citocinas TNF-α,
IFN-γ e IL-10 foram significativamente menores nos animais infectados por 8-11
meses (fase crônica) do que nos animais infectados por 21 dias (fase aguda),
enquanto os níveis de expressão dos genes ativados por citocinas foram
semelhantes nos animais aguda e cronicamente infectados.
Tabela 13. Perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio: fase aguda X fase crônica
Expressão Fase aguda (n=11) Fase crônica (n=13)
TNF-α 5,7 (1,3-31,3) 1,7 (0,3-14,1)*
IFN-γ 67,0 (0,7-160,3) 4,0 (1,2-11,3)*
IL-10 142,5 (11,4-366,0) 1,7 (0,2-27,5)*
MnSOD 1,0 (0,3-2,1) 0,9 (0,7-4,9)
iNOS 1,4 (0,1-7,9) 1,3 (0,3-3,1)
A20 2,6 (0,07-29,3) 1,5 (0,4-14,2)
A expressão relativa em relação aos controles não infectados está representada pela mediana (mínimo-máximo). p=NS e *p<0,001 para comparação entre infectados fase aguda vs. infectados fase crônica. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Resultados
125
5.5 Efeito do tratamento com Etanercept na fase crônica da infecção pelo T.
cruzi
Para avaliar o efeito do bloqueio de TNF-α sobre o desenvolvimento de
cardiomiopatia e alterações de mediadores inflamatórios, os animais infectados
foram divididos em 2 grupos no 9° mês PI: infectados sem tratamento e infectados
tratados via subcutânea com 2,5 mg/Kg de Etanercept 2X/semana durante 10
semanas. Como controles, um grupo de animais sadios não foi infectado, sendo
apenas injetado com salina no mesmo dia da infecção, e outro grupo de animais não
infectados foi submetido ao tratamento com Etanercept (mesma dose, via e tempo
de administração).
5.5.1 Mortalidade
A freqüência de óbitos durante o período de tratamento com Etanercept (9-11
meses PI) foi de 62% (8/13) para os animais infectados e tratados, e de 40% (6/15)
para os infectados não tratados (sem diferença significativa entre as curvas de
sobrevida) (Figura 34), representando apenas uma tendência não significativa de
aumento de mortalidade. Para descartar um possível efeito tóxico do tratamento, um
grupo de animais sadios foi submetido ao mesmo esquema de tratamento e
observamos que o tratamento com Etanercept per se não resulta em aumento de
mortalidade (Figura 34).
Resultados
126
0 10 20 30 40 50 60 70 800
20
40
60
80
100controles (n=13)
infectados (n=15)
infectados + sTNFR (n=13)
controles + sTNFR (n=7)
dias pós-tratamento
Sobr
eviv
ênci
a (%
)
*
Figura 34. Sobrevivência durante tratamento com Etanercept na fase crônica da infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Após 9 meses de infecção, os animais infectados foram divididos em dois grupos: infectados sem tratamento, e infectados e tratados com 2,5 mg/Kg de Etanercept (sTNFR) via subcutânea 2X/semana durante 10 semanas. Como controle foram utilizados animais sadios não infectados sem tratamento ou tratados com Etanercept. Todos os grupos foram mantidos em biotério por até 11 meses após a infecção. Os óbitos ocorridos neste período foram registrados para a análise de sobrevida. A comparação entre as curvas de sobrevida foi feita pelo teste de Logrank. * p=0,01 vs. controles + etanercept e p=0,008 vs. controles.
5.5.2 Análise ecocardiográfica
A análise ecocardiográfica realizada 11 meses PI nos animais sobreviventes
mostrou que o tratamento com Etanercept durante a fase crônica da infecção por T.
cruzi resultou em aumento significativo do diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo
(DDVE), indicando dilatação ventricular, e diminuição significativa da função
ventricular, medida pela fração de encurtamento do VE, em relação aos animais
infectados não tratados (Figura 35). Um possível efeito cardiotóxico direto do
Etanercept foi descartado, uma vez que animais sadios tratados com Etanercept
pelo mesmo período e dose não apresentaram aumento do DDVE ou diminuição da
função ventricular após o tratamento (Figuras 35 e 36). Comparando os valores de
DDVE corrigidos pelo peso corporal bem como a função ventricular dos animais
Resultados
127
infectados antes e depois do tratamento com Etanercept, observamos que o
tratamento com Etanercept resultou em aumento significativo do DDVE e diminuição
significativa da fração de encurtamento do VE (Figura 36). Em conjunto, nossos
resultados sugerem que o tratamento com Etanercept na dose de 2,5 mg/Kg,
2x/semana, na fase crônica da infecção pelo T. cruzi piorou a cardiomiopatia
chagásica crônica avaliada 11 meses PI.
Resultados
128
controles ctr+sTNFR infectados inf+sTNFR0
1
2
3
4
5
6
7
8
p<0,001
p<0,05
11 meses PI
DD
VE/p
eso
controles ctr+sTNFR infectados inf+sTNFR0
1
2
3
4
5
6
p<0,001
p<0,05
11 meses PI
DSV
E/pe
so
controles ctr+sTNFR infectados inf+sTNFR0
10
20
30
40
50
60
p<0,01
p<0,05
11 meses PI∆
D (%
)
C D E
A BFigura 35. Função ventricular esquerda e diâmetros sistólico e
diastólico do ventrículo esquerdo após tratamento com Etanercept na fase crônica de infecção por T. cruzi. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. A partir do 9° mês de infecção por T. cruzi, os animais foram tratados via s.c. com 2,5 mg/Kg de Etanercept (sTNFR) 2x/semana. Setenta dias após tratamento (11 meses PI) os animais foram submetidos ao exame ecocardiográfico para medida dos diâmetros diastólico (DDVE, A) e sistólico (DSVE, B), corrigido pelo peso corporal, e função ventricular esquerda (C), expressa pela fração de encurtamento do VE ( ∆D%= DDVE-DSVE/DDVE X 100). Como controle foram utilizados animais sadios não infectados tratados (ctr+sTNFR) ou não com Etanercept, pareados para idade, sexo e tempo em biotério. Cada símbolo representa um animal. A barra horizontal mostra a mediana e a linha pontilhada o valor de ∆D% considerado como parâmetro de função ventricular normal (∆D=30%). Valores de p bicaudais determinados pelo teste Anova não-paramétrico de Kruskal-Wallis e teste post-hoc de Dunns, para as comparações individuais
5 m
m
DDVE DSVE DDVEDSVE 5 m
m
DDVE DSVE DDVEDSVE
Resultados
129
Figura 36. Perda de função ventricular e aumento do diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo após tratamento com Etanercept. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. A partir do 9° mês de infecção por T. cruzi, os animais foram tratados via s.c. com 2,5 mg/Kg de Etanercept (sTNFR) 2X/semana. Antes do tratamento (8 meses PI) e setenta dias após o tratamento (11 meses PI) os animais foram submetidos ao exame ecocardiográfico para medida dos diâmetros diastólico (DDVE) e sistólico (DSVE), corrigido pelo peso corporal, e função ventricular esquerda, expressa pela fração de encurtamento do VE (∆D%= DDVE-DSVE/DDVE X 100). Os gráficos mostram a % de diminuição da função ventricular (A) e % de aumento do DDVE (B) em relação a antes do tratamento. Como controle foram utilizados animais sadios não infectados tratados (ctr+sTNFR) ou não com Etanercept, pareados para idade, sexo e tempo em biotério. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal mostra a mediana. Valores de p bicaudais determinados pelo teste Anova não-paramétrico de Kruskal-Wallis e teste post-hoc de Dunns, para as comparações individuais.
controles ctr+sTNFR infectados inf+sTNFR-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
p<0,05
p<0,05
8-11 meses PI
% a
umen
to D
DVE
controles ctr+sTNFR infectados inf+sTNFR
0
25
50
75
100
p<0,05
p<0,05
8-11 meses PI
% p
erda
funç
ão V
EA B
Resultados
130
5.5.3 Análise histopatológica
Para saber se o tratamento com Etanercept influencia a gravidade da
miocardite, foi feita a análise morfométrica para quantificar as células inflamatórias
presentes no miocárdio. Os resultados mostraram que o número de células
inflamatórias no miocárdio, foi semelhante entre infectados tratados e infectados não
tratados (Figura 37). Entretanto, foi observada inflamação subendocárdica no tecido
cardíaco dos animais infectados tratados, enquanto que nos animais infectados não
tratados a inflamação é apenas miocárdica (Figura 37). Este dado sugere que,
embora a intensidade da inflamação seja semelhante, o tratamento com Etanercept
alterou a localização do infiltrado inflamatório. A análise imunohistoquímica para
detecção de células produtoras de TNF-α no miocárdio mostrou que 2/10 (20%)
infectados e tratados com Etanercept apresentou células mononucleares TNF-α+ no
infiltrado inflamatório subendocárdico (Figura 37).
Resultados
131
Figura 37. Inflamação e TNF- α no miocárdio após tratamento com Etanercept. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Após 9 meses de infecção, os animais infectados foram divididos em dois grupos: infectados sem tratamento e infectados e tratados via s.c. com 2,5 mg/Kg de Etanercept (sTNFR) 2X/semana por 70 dias. Após o tratamento, os animais sobreviventes foram sacrificados e os corações coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Alguns corações de animais que morreram espontaneamente durante o período de tratamento foram recuperados antes do rigor mortis e também foram processados. Cortes transversais de tecido cardíaco de 5µm foram submetidos a coloração com H&E (A e B) ou imunohistoquímica para detecção de TNF-α (C, D e E). Em (A) miocardite de um animal infectado não tratado e em (B) miocardite subendocárdica de um animal infectado tratado, aumento de 400X. As cabeças de seta apontam para o infiltrado inflamatório. Em (C) células TNF-α+ no infiltrado inflamatório miocárdico de um animal infectado não tratado (aumento de 400X) e em (D) no infiltrado inflamatório subendocárdico de um animal infectado tratado (aumento de 100X e canto inferior direito, ampliação em 400X). As setas apontam para células TNF-α+ coradas em marrom pela peroxidase. Para esta análise, 30-40 campos (aumento 400X) de 3-4 cortes (5µm) não consecutivos de tecido cardíaco de cada animal foram examinados. A identificação de marcação positiva da peroxidase em pelo menos um campo foi utilizada para o cálculo de freqüência de animais com células TNF-α+ no infiltrado inflamatório. Em (E) a intensidade de miocardite foi medida pelo número de células inflamatórias presentes no miocárdio nos animais infectados não tratados ou tratados com Etanercept (inf + sTNFR). Para esta análise, as imagens do corte foram digitalizadas em aumento de 400X e 6-10 campos de dois cortes não consecutivos de tecido cardíaco de cada animal foram examinados com auxílio do programa AxioVision 3.0 (Zeiss, Alemanha). O número total de células inflamatórias presentes nos dois cortes foi dividido pela área total de miocárdio. Cada símbolo representa um animal. A barra horizontal mostra a mediana. Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Resultados
132
B
C D
A
infectados inf+sTNFR0
100
200
300
400
500
600
fase crônica
cels
infla
mat
ória
s/m
m2
p=NS
E
Resultados
133
5.5.4 Investigação das causas do agravamento da cardiomiopatia
Para investigar o mecanismo pelo qual o tratamento com Etanercept durante
a fase crônica induziu piora significativa da cardiomiopatia nos animais infectados
por T. cruzi, analisamos a parasitismo sangüíneo e cardíaco, a presença de
imunocomplexos no miocárdio após o tratamento.
Parasitismo sangüíneo e cardíaco
Uma vez que o TNF-� é importante para o controle de patógenos intracelulares
(TITUS et al., 1989; GARCIA et al., 1995; ZGANIACZ et al., 2004), investigamos
se o tratamento com Etanercept desencadeou a reagudização da infecção, o que
estaria associado a um possível aumento de parasitemia e parasitismo cardíaco.
Para isso, após 25 e 50 dias de tratamento, fizemos a detecção de parasitas
circulantes no sangue dos animais sobreviventes pelo método de contagem direta
em câmara de Neubauer e imunohistoquímica para detecção de antígenos de T.
cruzi no miocárdio. Nenhum animal infectado e tratado com Etanercept ou
infectado não tratado apresentou parasitemia detectável nos dois períodos
analisados, sugerindo que tratamento com Etanercept não desencadeou aumento
substancial do número de parasitas circulantes.
A análise imunohistoquímica para detecção de antígenos de T. cruzi foi
realizada em 3 cortes não consecutivos de tecido cardíaco de 14 animais infectados
não tratados e de 10 infectados tratados com Etanercept. Os resultados mostraram
que nenhum animal infectado não tratado apresentou antígenos ou ninhos de T.cruzi
no miocárdio e apenas 1/10 animais infectados tratados apresentou antígenos de T.
cruzi no miocárdio. Neste animal foi encontrado apenas um ninho de T. cruzi em
apenas um campo dos 3 cortes de tecido cardíaco analisados (120 campos) (Figura
Resultados
134
38). Este resultado sugere que o agravamento da disfunção ventricular observado
nos animais infectados e tratados com Etanercept não foi decorrente de aumento de
parasitismo cardíaco.
Figura 38. Detecção de antígenos de T. cruzi no miocárdio após tratamento com Etanercept. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Após 9 meses de infecção, os animais infectados foram divididos em dois grupos: infectados sem tratamento e infectados e tratados via s.c. com 2,5 mg/Kg de Etanercept (sTNFR) 2X/semana por 70 dias. Após o tratamento, os animais sobreviventes foram sacrificados e os corações coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Alguns corações de animais que morreram espontaneamente durante o período de tratamento foram recuperados antes do rigor mortis e também foram processados. Cortes transversais de 5 µm foram submetidos a imunohistoquímica para detecção de antígeno de T. cruzi. A seta aponta para o ninho de amastigotas de T. cruzi.
Detecção de imunocomplexos no miocárdio
Uma vez que o Etanercept é uma molécula que contém uma porção do
receptor de TNF humano e uma porção de IgG de camundongo, ou seja, proteína
heteróloga, o tratamento prolongado poderia acarretar o desenvolvimento de
anticorpos anti-Etanercept e subseqüente geração de imunocomplexos circulantes
que poderiam, eventualmente, se depositar no miocárdio e ser o responsável pela
significativa perda de função ventricular observada pós-tratamento. Para descartar
esta hipótese, avaliamos por imunohistoquímica a presença de imunocomplexos IgG
Resultados
135
e os resultados mostraram que nenhum animal infectado não tratado ou infectado e
tratado com Etanercept apresentou depósitos de imunocomplexos IgG no miocárdio
(Figura 39). Este resultado sugere que o agravamento da disfunção ventricular não
foi decorrente da deposição de imunocomplexos no miocárdio.
Figura 39. Pesquisa de imunocomplexos no miocárdio após tratamento com Etanercept.
Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi. Após 9 meses de infecção, os animais infectados foram divididos em dois grupos: infectados sem tratamento e infectados e tratados via s.c. com 2,5 mg/Kg de Etanercept (sTNFR) 2X/semana por 70 dias. Após o tratamento, os animais sobreviventes foram sacrificados e os corações coletados e processados pelo método de inclusão em parafina. Cortes transversais de 5 µm foram submetidos a imunohistoquímica para detecção de imunocomplexos IgG. Em B, C e D fotomicrografia de miocárdio de animal controle não infectado, infectado por 11 meses e infectado e tratado com Etanercept, respectivamente. Aumento de 400X. Como controle positivo, foi utilizado rim de hamster infectado por Toxocara canis (A). Como controle negativo, foi utilizada a omissão do anticorpo primário. Em marrom, marcação positiva para imunocomplexos IgG.
C D
A B
Resultados
136
5.5.5 Citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio
Para investigar se o tratamento com Etanercept durante a fase crônica altera
o perfil de expressão de citocinas (TNF-α, IFN-γ e IL-10) e genes ativados por
citocinas (A20, iNOS, MnSOD) no miocárdio, realizamos a quantificação relativa do
RNAm por RT-PCR em tempo real. Os níveis de expressão de RNAm de citocinas e
genes ativados por citocinas do miocárdio de animais infectados e tratados com
Etanercept em relação aos controles não infectados são apresentados na Figura 40,
onde podemos observar o predomínio de IL-10 e IFN-γ. Os resultados mostraram
que a expressão de iNOS foi significativamente menor e a expressão de IL-10 foi
significativamente maior no miocárdio de animais infectados e tratados com
Etanercept do que entre os infectados não tratados (Tabela 14). Quando
comparamos a expressão somente entre os animais sobreviventes até o final do
estudo, a diferença é ainda mais significativa (Tabela 15). A expressão de RNAm
das outras citocinas investigadas (TNF-α e IFN-γ) e dos genes ativados por citocinas
(A20, MnSOD) foi semelhante entre infectados tratados e não tratados (Tabela 14) e
também foi semelhante quando consideramos apenas os sobreviventes nos dois
grupos (Tabela 15).
Enquanto nos animais infectados não tratados, a expressão de A20 e IL-10
correlacionavam-se negativamente com a função ventricular medida 8 meses PI, nos
animais infectados e tratados, observamos correlação negativa estatisticamente
significativa com a expressão de TNF-α (Figura 41, Tabela 16). Além disso, a
expressão de TNF-α estava positivamente correlacionada com a expressão de iNOS
e com IFN-γ (Figura 41, Tabela 16).
Resultados
137
TNF-α A20 MnSOD iNOS IFN-γ IL-100.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
infectados + sTNFRfase crônica
expr
essã
o re
lativ
a RN
Am
Figura 40. Perfil de expressão de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio após tratamento com Etanercept. Hamsters de 2,5 meses de idade foram infectados com 105 formas tripomastigotas sangüíneas de T. cruzi. Após 9 meses de infecção, os animais infectados foram divididos em dois grupos: infectados sem tratamento e infectados e tratados via s.c. com 2,5 mg/Kg de Etanercept (sTNFR) 2X/semana por 70 dias. Após 11 meses de infecção os animais sobreviventes ao tratamento foram sacrificados (n=5), os corações coletados e a ponta do VE foi obtida para a extração de RNA. Os corações dos animais que morreram espontaneamente durante o tratamento (n=5) também foram recuperados e a ponta do VE foi obtida para a extração de RNA. A quantificação relativa da expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados em relação ao miocárdio de animais controles não infectados (n=10) foi feita por RT-PCR em tempo real, utilizando SYBR green. Cada símbolo representa um animal e a barra horizontal, a mediana.
Resultados
138
Tabela 14. Expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados e tratados com Etanercept
Mediana (min-max); p=NS e *p<0,05 para comparação infectados vs. infectados tratados com Etanercept (infectados + sTNFR). Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Tabela 15. Expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas no miocárdio de animais infectados sobreviventes ao tratamento com Etanercept
Mediana (min-max); p=NS e *p<0,05 para comparação infectados vs. infectados tratados com Etanercept (infectados + sTNFR). Valores de p bicaudais obtidos pelo teste não-paramétrico U de Mann-Whitney.
Genes Infectados (n=12)
Infectados + sTNFR (n=10)
TNF-α 1,7 (0,3-14,0) 1,6 (0,7-5,0)
IFN-γ 4,0 (1,2-11,3) 4,5 (0,9-10,7)
IL-10 1,7 (0,3-27,5) 4,4 (1,5-50,8)*
iNOS 1,3 (0,3-3,1) 0,8 (0,2-1,6)*
MnSOD 0,9 (0,7-4,9) 0,9 (0,4-1,6)
A20 1,5 (0,4-14,2) 1,6 (0,3-8,0)
Genes Infectados (n=8)
Infectados + sTNFR (n=5)
TNF-α 2,2 (0,7-3,8) 1,6 (0,7-3,3)
IFN-γ 5,9 (1,2-11,3) 4,6 (3,4-10,7)
IL-10 1,4 (0,3-2,2) 3,8 (1,8-50,8)*
iNOS 1,8 (0,6-3,0) 0,7 (0,5-1,3)*
MnSOD 0,9 (0,7-2,0) 0,9 (0,7-1,1)
A20 1,1 (0,4-1,8) 0,9 (0,3-1,6)
Resultados
139
Figura 41. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e função ventricular na fase crônica da infecção. O gráfico em matriz mostra a correlação entre a função ventricular (∆D%) medida 8 meses PI e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados e tratados com Etanercept durante a fase crônica da infecção por T. cruzi. *p<0,05 e ** p<0,01, valores de p bicaudais obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
∆D%8mPi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗ ∗∗
∗∆D%8mPi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∆D%8mPi
TNF- α
IFN- γ
IL-10
A 20
iNOS
MnSOD
∗ ∗∗
∗
Resultados
140
Tabela 16. Correlação entre expressão de citocinas e genes ativados por citocinas e função ventricular após tratamento com Etanercept na fase crônica da infecção por T. cruzi
A tabela mostra os valores de r e p dos testes de correlação entre a função ventricular (∆D%) medida 8 meses PI e os níveis de expressão miocárdica de citocinas e genes ativados por citocinas bem como a correlação das citocinas e genes entre si nos animais infectados e tratados. Em cinza, correlações significativas. Valores de r e p bicaudal obtidos pelo teste de correlação não-paramétrico de Spearman.
r p
∆D% 8 meses PI TNF-α IFN-γ IL-10 A20 iNOS MnSOD
∆D% 8 meses PI -0,64
0,04 -0,55 0,10
-0,15 0,68
-0,13 0,73
-0,56 0,09
-0,06 0,87
TNF-α -0,64 0,04 0,72
0,02 -0,28 0,42
0,08 0,83
0,82 0,004
0,14 0,70
IFN-γ -0,55 0,10
0,72 0,02 0,006
0,99 -0,39 0,26
0,62 0,05
-0,02 0,95
IL-10 -0,15 0,68
-0,28 0,42
0,006 0,99 0,14
0,70 -0,53 0,12
0,24 0,50
A20 -0,13 0,73
0,08 0,83
-0,39 0,26
0,14 0,70 -0,19
0,60 0,51 0,13
iNOS -0,56 0,09
0,82 0,004
0,62 0,05
-0,53 0,12
-0,19 0,60 -0,02
0,95
MnSOD -0,06 0,87
0,14 0,70
-0,02 0,95
0,24 0,50
0,51 0,13
-0,02 0,95
Discussão
141
6 DISCUSSÃO
No presente estudo, nós utilizamos o modelo de infecção por T. cruzi em
hamster sírio previamente descrito (RAMIREZ et al., 1994; BILATE et al., 2003)
para investigar o papel da inflamação e seus mediadores na miocardite aguda e
cardiomiopatia crônica. Nossos resultados mostraram que, a despeito de níveis
baixos ou indetectáveis de parasitemia em todos os animais, os hamsters
infectados pela cepa Y de T. cruzi apresentaram diferentes padrões de evolução da
doença cardíaca na fase aguda e principalmente na fase crônica, de maneira
semelhante ao que ocorre em pacientes. A presença de parasitas circulantes no 13°
dia pós-infecção esteve associada ao intenso parasitismo cardíaco na data da
morte espontânea durante a fase aguda. O elevado parasitismo cardíaco, além de
associado com a presença de sintomas, esteve associado também à elevada
expressão de RNAm de IL-10 e TNF-α e genes ativados por citocinas inflamatórias
(A20 e iNOS) no miocárdio. Na fase crônica da infecção, embora a intensidade de
miocardite estivesse correlacionada positivamente com a dilatação do ventrículo
esquerdo, nenhuma das duas variáveis esteve associada à morte durante a fase
crônica. Nesta fase, houve predomínio de expressão de RNAm de IFN-γ no
miocárdio em detrimento de TNF-α e IL-10, embora essas duas últimas também
tenham sido detectadas em níveis aumentados. A morte durante a fase crônica
somente esteve associada à expressão de A20.
Uma única combinação de parasita e hospedeiro não isogênico nos permitiu
recapitular o espectro da evolução da doença de Chagas humana, que exibe
diferentes padrões de progressão da fase aguda e crônica (RASSI et al., 2000;
PRATA, 2001). A vantagem do hamster sírio infectado por T. cruzi como modelo
para se estudar a patogênese da miocardite aguda da doença de Chagas está no
Discussão
142
fato deste roedor poder desenvolver tanto miocardite e parasitismo cardíaco
intensos, associados à morbidade e mortalidade na fase aguda, como miocardite e
parasitismo leves, associados a sobrevivência à esta fase. Já na cardiomiopatia
crônica, a vantagem deste modelo deve-se ao fato de o hamster poder desenvolver
tanto a cardiomiopatia grave, associada à morte durante a fase crônica, como não
desenvolver lesão cardíaca nesta fase. Como uma parcela significativa dos animais
sobrevive à fase aguda, é possível estudar, utilizando o mesmo esquema
experimental, a indução e resolução da miocardite e a evolução da cardiomiopatia
crônica.
A freqüência de morte espontânea observada durante a fase aguda (Figura 21)
está de acordo com nossos resultados anteriores (BILATE et al., 2003), onde,
utilizando o mesmo modelo experimental, observamos 30% de mortalidade durante
esta fase. A mortalidade diferencial durante a fase aguda pode ser explicada pelo
fato que os hamsters empregados neste estudo não são isogênicos, ao contrário
dos modelos murinos de doença de Chagas. Nesses modelos isogênicos, observa-
se ou 100% de mortalidade, ou 100% de sobrevivência à fase aguda, de acordo
com a cepa e carga de parasita e a linhagem de camundongo utilizadas
(WRIGHTSMAN et al., 1982; TRISCHMANN e BLOOM, 1982). Esses trabalhos
utilizaram as cepas Peru (WRIGHTSMAN et al., 1982) ou Brazil (TRISCHMANN e
BLOOM, 1982) para a infecção de diferentes linhagens isogênicas de camundongos
e conseguiram definir linhagens resistentes (C57BL/6, C57BL/10; SJL/J; DBA/2J) e
suscetíveis (A/J, CBA/N, C3H/HeJ, BALB/c) de acordo com a intensidade de
parasitemia e a sobrevivência à fase aguda, mostrando a importância dos fatores
genéticos na determinação da suscetibilidade/resistência à infecção.
Discussão
143
Apesar da confirmação sorológica da infecção dos animais empregados no
estudo, a infecção com a cepa Y do T. cruzi resultou em baixa freqüência de
parasitemia detectável durante a fase aguda. Quando detectável, os níveis de
parasitemia foram baixos (Figura 21) quando comparados a camundongos
suscetíveis à infecção pela cepa Y (ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996;
MARINHO et al., 1999; ABRAHAMSOHN et al., 2000), mas semelhantes aos níveis
encontrados em camundongos resistentes à infecção por esta cepa
(ABRAHAMSOHN et al., 2000; GALVÃO DA SILVA et al., 2003). Os resultados de
baixa freqüência e baixos níveis de parasitemia nos hamsters infectados estão de
acordo com resultados anteriores de nosso grupo (BILATE, 2001) e de outros
grupos (RAMIREZ et al., 1994; CABRINE-SANTOS et al., 2001) utilizando o mesmo
modelo de infecção. Entretanto, a associação entre presença de parasitas
circulantes no 13° dia PI e morte durante a fase aguda (Tabela 8) sugere que, neste
modelo, o controle da parasitemia parece conferir resistência à fase aguda e,
conseqüentemente, levar à sobrevivência à esta fase. Além disso, o fato de que os
animais com parasitemia detectável no 13° dia PI e que morreram
espontaneamente durante a fase aguda apresentarem maior parasitismo cardíaco
na data da morte do que os animais com parasitemia indetectável, que também
morreram espontaneamente durante o mesmo período (Figura 22), sugere que o
controle precoce da parasitemia preveniu a disseminação dos parasitas pelo tecido
cardíaco. Por outro lado, esse resultado também sugere que, além do parasitismo,
outros fatores contribuem para a suscetibilidade à morte durante a fase aguda.
Corroborando essa hipótese, dados da literatura mostram que camundongos
suscetíveis (BALB/c) apresentam elevada parasitemia e menor sobrevida à fase
aguda do que camundongos resistentes (C57BL/6) quando infectados com a cepa Y
Discussão
144
(ABRAHAMSOHN et al., 2000) ou com a cepa Colombiana (MICHAILOWSKY et al.,
2001). Esses resultados sugerem que, nos modelos murinos de infecção aguda, o
controle da parasitemia também está associado à sobrevivência à fase aguda.
Os animais sintomáticos aos 21 dias PI apresentaram elevado parasitismo
cardíaco e elevada expressão de citocinas, como TNF-α e IL-10, e genes ativados
por citocinas, como A20 e iNOS quando comparados aos animais assintomáticos
(Figuras 8, 10 e 11). Isso sugere que, neste modelo, o aparecimento de sintomas
está relacionado ao intenso parasitismo cardíaco e este parece determinar os níveis
das citocinas no miocárdio. A correlação positiva entre expressão de citocinas e
genes ativados por citocinas e a área de antígeno de T. cruzi (Tabela 2 e Figura 12)
apóia essa hipótese. Essa correlação com citocinas produzidas tanto por
macrófagos como por linfócitos sugere a participação das respostas inata e
adquirida no controle da infecção aguda. Esse resultado é consistente com dados
anteriores de modelos murinos suscetíveis ou resistentes à infecção aguda pelo T.
cruzi que mostram a importância da produção local e periférica das citocinas na
fase aguda para o controle da infecção (RUSSO et al., 1989; STAROBINAS et al.,
1991; SILVA et al., 1992; TRUYENS et al., 1999; TALVANI et al., 2000;
MICHAILOWSKY et al., 2001).
O aumento significativo dos níveis de expressão de TNF-α e IFN-γ no
miocárdio dos animais sintomáticos com intenso parasitismo cardíaco em
comparação aos assintomáticos com baixo parasitismo (Figura 10), aliado à
correlação positiva entre os níveis de expressão das duas citocinas (Tabela 2 e
Figura 12), sugere a participação conjunta de TNF-α e IFN-γ no controle do
parasitismo cardíaco na fase aguda da infecção por T. cruzi em hamsters. Esses
resultados estão de acordo com os modelos de infecção por T. cruzi em
Discussão
145
camundongos e ratos (CHANDRASEKAR et al., 1998; TALVANI et al., 2000). Ratos
Lewis infectados com a cepa Sylvio X10/7 de T. cruzi apresentaram elevada
expressão de TNF-α no miocárdio após 5, 10 e 15 dias de infecção, sendo que os
maiores níveis de expressão de TNF-α e miocardite mais intensa foram detectados
no 15° dia de infecção (CHANDRASEKAR et al., 1998). Camundongos C57BL/6
infectados com a cepa Colombiana de T. cruzi também apresentaram elevada
expressão miocárdica de RNAm de TNF-α e IFN-γ após 15 e 30 dias de infecção,
quando a miocardite e o parasitismo cardíaco eram intensos em relação ao período
de 60 e 120 dias PI (TALVANI et al., 2000). Por outro lado, um papel patogênico do
TNF-α na suscetibilidade à infecção aguda foi ressaltada em trabalhos que
mostraram que camundongos suscetíveis à infecção pela cepa CL de T. cruzi
(C3H/He) apresentaram níveis séricos de TNF-α bioativos mais elevados do que
camundongos resistentes (C57BL/6) (RUSSO et al., 1989; STAROBINAS et al.,
1991). Nesta linha, Truyens e colaboradores (1999) mostraram que níveis elevados
de TNF-α circulante durante a fase aguda estavam associados com elevada
parasitemia, caquexia e mortalidade de camundongos BALB/c suscetíveis à
infecção aguda por T. cruzi. Entretanto, camundongos deficientes de TNFR1
infectados com a cepa Tulahuen ou Y de T. cruzi apresentaram elevada parasitemia
e sobrevida mais curta na fase aguda em comparação aos controles (CASTANOS-
VELEZ et al., 1998; ALIBERTI et al., 2001), sugerindo que a sinalização por TNF-α
participa do controle da parasitemia, inflamação e influencia a sobrevivência à
infecção aguda. Em conjunto, esses resultados sugerem que o TNF-α é essencial
para o controle da parasitemia e sobrevivência à fase aguda, mas que, em níveis
elevados, pode contribuir para a suscetibilidade e morte nesta fase.
Discussão
146
Quanto ao IFN-γ, linhagens de camundongos naturalmente resistentes
(B6D2) à infecção pela cepa Tulahuen de T. cruzi apresentaram significativo
aumento de parasitemia e mortalidade após tratamento com anticorpo neutralizante
anti-IFN-γ (SILVA et al., 1992). Além disso, a infecção com a cepa Tulahuen,
Colombiana ou Y em camundongos geneticamente deficientes de IFN-γ ou de seu
receptor resulta em elevada parasitemia, mortalidade na fase aguda, parasitismo
cardíaco disseminado e miocardite leve quando comparados a animais com
expressão normal de IFN-γ (HOLSCHER et al., 1998; MICHAILOWSKY et al., 2001;
ALIBERTI et al., 2001). Em conjunto, esses resultados demonstram a importância
do IFN-γ no controle da infecção aguda. Por outro lado, nossos resultados
contrastam com os dados de Zhang e Tarleton (1996), que utilizaram dois modelos
de infecção aguda com a cepa Brazil, um suscetível (camundongos C3H) e outro
resistente (C57BL/6) e encontraram expressão semelhante de TNF-α e IFN-γ no
coração por análise imuno-histoquímica. As diferenças de resultado podem ser
explicadas pela técnica utilizada para a detecção da expressão de citocinas. No
nosso estudo, a análise da expressão de citocinas no coração foi feita por RT-PCR
em tempo real, uma técnica que permite detectar e quantificar pequenas diferenças,
enquanto no trabalho de Zhang e Tarleton, a expressão de citocinas foi analisada
por imuno-histoquímica semi-quantitativa, que não permite detectar diferenças sutis.
Vale ressaltar que, no nosso estudo, todos os animais infectados (sintomáticos ou
assintomáticos) apresentaram grande quantidade de células expressando TNF-α no
coração (Figura 18), mas a diferença de expressão entre os grupos sintomáticos e
assintomáticos foi detectada somente pelo RT-PCR em tempo real.
A correlação positiva entre os níveis de expressão de iNOS e a intensidade
do parasitismo cardíaco e a expressão de TNF-α (Tabela 2 e Figura 12) sugere que
Discussão
147
o parasitismo cardíaco resultou em aumento de TNF-α no coração e este modulou a
expressão de iNOS durante a fase aguda. No entanto, não houve diferença
significativa nos níveis de expressão de iNOS entre os animais assintomáticos e
sintomáticos (Figura 11), possivelmente devido à grande dispersão e ao pequeno
número de animais. Corroborando a hipótese de que o parasitismo modula a
expressão de iNOS no miocárdio, ratos Lewis ou camundongos CD1 infectados por
T. cruzi apresentaram elevada expressão miocárdica de iNOS após 15 ou 32 dias
de infecção, respectivamente (CHANDRASEKAR et al., 1998; CHANDRASEKAR et
al., 2000; HUANG et al., 1999), período em que a expressão de TNF-α também é
elevada. Além disso, a infecção com a cepa Tulahuen ou Colombiana de T. cruzi
em camundongos geneticamente deficientes de iNOS resultou em maior
parasitismo sangüíneo e cardíaco e mortalidade na fase aguda (HOLSCHER et al.,
1998; MICHAILOWSKY et al., 2001), sugerindo que a iNOS está envolvida no
controle da infecção aguda. Já foi mostrado que, in vitro, a atividade tripanocida de
macrófagos é dependente de NO e TNF-α (SILVA et al., 1995). Por outro lado, outro
estudo utilizando uma combinação diferente de parasita-hospedeiro mostrou que
camundongos geneticamente deficientes de iNOS apresentam mortalidade e
parasitemia semelhantes às de camundongos com expressão normal após infecção
com a cepa Brazil ou Tulahuen de T. cruzi (CUMMINGS e TARLETON, 2003),
questionando o papel da iNOS no controle da infecção aguda.
Além da importância das citocinas inflamatórias e dos mediadores por elas
ativados no controle do parasitismo da fase aguda, as citocinas anti-inflamatórias
também desempenham papel fundamental na limitação da resposta inflamatória. O
aumento significativo da expressão de IL-10 nos animais sintomáticos em
comparação aos assintomáticos (Figura 10) permite sugerir que o intenso
Discussão
148
parasitismo cardíaco, ou as citocinas inflamatórias por ele induzidas, tenha
estimulado a produção desta citocina, que poderia regular a ação danosa das
citocinas inflamatórias. Nesta linha, nossos resultados também mostraram que os
níveis de expressão de IL-10 estavam correlacionados positivamente com a
expressão de IFN-γ e TNF-α e com a intensidade do parasitismo cardíaco (Tabela 2
e Figura 12), sugerindo um mecanismo conjunto de regulação. Em apoio a essas
hipóteses, camundongos C57BL/6 infectados com a cepa Colombiana de T. cruzi
apresentaram elevada expressão miocárdica de RNAm de IL-10 após 15, 30, 60 e
120 dias PI, com pico expressão após 60 e 120 dias, quando a miocardite e o
parasitismo cardíaco eram menos intensos do que 15 e 30 dias após a infecção
(TALVANI et al., 2000). Além disso, camundongos deficientes de IL-10 infectados
com cepa Y ou Tulahuen de T. cruzi apresentaram elevada produção de IFN-γ e
TNF-α e baixa parasitemia quando comparados aos controles com expressão
normal de IL-10, mas tiveram uma menor sobrevida em função de uma síndrome
semelhante ao choque tóxico induzido pelo aumento descontrolado de IFN-γ e TNF-
α (ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996; HUNTER et al., 1997; HOLSCHER et al.,
2000), ressaltando a importância da IL-10 no controle da resposta inflamatória
exacerbada na infecção aguda. Em conjunto, nossos resultados e de outros grupos
apontam a participação da IL-10 no controle da resposta inflamatória na infecção
aguda por T. cruzi. Entretanto, nossos resultados contrastam com dados de Zhang
e Tarleton (1996), citados anteriormente. Nesse trabalho, os autores utilizaram
imuno-histoquímica para detectar a expressão de citocinas no coração e
observaram que a expressão de IL-10 no coração durante a fase aguda foi
semelhante nos camundongos suscetíveis e resistentes à infecção pela cepa Brazil.
As diferenças de resultados também podem ser explicadas pelo fato de terem sido
Discussão
149
utilizadas técnicas distintas para a detecção das citocinas, conforme descrito
anteriormente, e pelo fato de termos usado um esquema experimental diferente do
utilizado por Zhang e Tarleton.
O aumento da expressão de MnSOD no miocárdio dos animais sintomáticos
com intenso parasitismo cardíaco em relação aos assintomáticos com baixo
parasitismo cardíaco sugere que, nessa parcela de animais suscetíveis, a infecção
aguda pelo T. cruzi resultou em aumento da ativação de vias anti-oxidantes. Nossos
resultados mostraram também que os níveis de expressão de MnSOD
correlacionaram-se positivamente com a expressão de IL-10 e TNF-α, bem como
com a intensidade do parasitismo, sugerindo que essas citocinas modularam a
expressão de MnSOD na fase aguda da infecção. Corroborando esse achado,
camundongos C57BL/6 infectados com a cepa CA-1 (isolada de um paciente com
CCC) apresentaram elevada expressão de RNAm de MnSOD no músculo
esquelético e baço após 30 dias de infecção, enquanto camundongos deficientes da
expressão de TNF-α apresentaram redução significativa da expressão de MnSOD
(CASTANOS-VELEZ et al., 1998). Isso sugere que a infecção aguda modula
positivamente a expressão de MnSOD e que essa modulação é dependente de
TNF-α. A MnSOD é uma enzima anti-oxidante ativada tanto por TNF-α como por
IFN-γ (WONG e GOEDDEL, 1988; WONG et al., 1989) e está aumentada em
modelos animais de insuficiência cardíaca (YANG et al., 2003). Além disso,
camundongos deficientes de MnSOD morrem após 10 dias de vida de
anormalidades cardíacas como dilatação do ventrículo esquerdo, afilamento das
paredes do ventrículo e fibrose endocárdica (LI et al., 1995). É possível que o
aumento da expressão de MnSOD no miocárdio de animais com sintomas de fase
aguda da infecção por T. cruzi seja decorrente de uma resposta compensatória do
Discussão
150
tecido ao estresse oxidativo, causado pelo intenso parasitismo e infiltrado
inflamatório. Já foi demonstrado que o estresse oxidativo desencadeia a ativação de
defesas anti-oxidantes (HALIWELL E GUTTERIDGE, 2000). O intenso parasitismo
ativa células fagocíticas, como os macrófagos, que irão produzir ROS, que
estimulam a produção de enzimas anti-oxidantes.
O aumento da expressão do gene protetor de apoptose (A20) no miocárdio
dos animais sintomáticos quando comparados com os assintomáticos (Figura 11)
sugere que a expressão de A20 poderia estar relacionada à gravidade da
miocardite aguda induzida pelo T. cruzi. Para apoiar essa hipótese, nossos
resultados mostraram também que a expressão de A20 esteve correlacionada
positivamente com a expressão de IL-10, TNF-α e iNOS. O gene A20 é ativado pelo
NFκB via TNF-α/TNFR1 (HEYNINCK e BEYAERT, 2005) e regula a ativação de
NFκB, impedindo a amplificação da resposta inflamatória (COOPER et al., 1996;
BEYAERT et al., 2000). Camundongos deficientes de A20 apresentam inflamação
exacerbada em diversos órgãos, caquexia e hipersensibilidade ao LPS e TNF-α e
as células desses animais são mais suscetíveis à apoptose induzida por TNF-α
(LEE et al., 2000). Esses resultados mostram a importância do A20 na regulação de
respostas inflamatórias induzidas pelo TNF-α. É possível que o aumento de A20 no
miocárdio de animais sintomáticos seja decorrente da elevada produção de TNF-α.
Podemos especular que, em fases mais tardias, a expressão de A20 poderia
controlar a ação deletéria do TNF-α.
É possível que o desenvolvimento de sintomas de fase aguda, aliado à
ausência de controle da parasitemia e conseqüentemente intenso parasitismo
cardíaco, miocardite e seus mediadores, contribua para a morte dos animais
suscetíveis à infecção aguda. Nesta linha, podemos hipotetizar que um subgrupo de
Discussão
151
animais que consegue controlar precocemente o parasitismo periférico escapa dos
sintomas clínicos e da morte na fase aguda, o que não ocorreria no subgrupo que
não consegue esse controle e que permite a disseminação do parasitismo. Em
outras palavras, nossos resultados sugerem que um subgrupo de animais consegue
controlar a disseminação do parasitismo, resultando em menor recrutamento de
células inflamatórias para o local da lesão. Conseqüentemente, a produção local de
mediadores inflamatórios, tais como citocinas e genes ativados por citocinas,
também seria menos intensa. Com isso, podemos hipotetizar que esse é o
subgrupo de animais que consegue sobreviver à fase aguda, podendo ou não
desenvolver a cardiomiopatia típica da fase crônica, após alguns meses. Por outro
lado, no subgrupo de animais com elevado parasitismo cardíaco associado à
presença de sintomas de fase aguda, podemos especular que outros fatores (por
exemplo, polimorfismos genéticos) contribuam para a falta de controle do
parasitismo periférico, e para conseqüente disseminação do parasita por diversos
órgãos, incluindo o coração. No coração, o elevado parasitismo leva ao aumento do
recrutamento de células inflamatórias, desencadeando uma intensa resposta
inflamatória local que se autoperpetua através da produção descontrolada e
exacerbada de citocinas inflamatórias. Em contrapartida, a expressão de genes
protetores ativados por citocinas inflamatórias (A20 e MnSOD), aliada à elevada
expressão de citocinas anti-inflamatórias (Figuras 10 e 11), sugere que a produção
exacerbada de citocinas inflamatórias poderia ativar as vias de proteção celular que,
em fases posteriores poderiam regular a sua ação danosa. De maneira resumida, é
possível que o desenvolvimento de sintomas de fase aguda, aliado à ausência de
controle da parasitemia e conseqüentemente intenso parasitismo cardíaco,
miocardite e seus mediadores, contribua para a morte dos animais suscetíveis à
Discussão
152
infecção aguda. Nesta linha, podemos hipotetizar que um subgrupo de animais que
consegue controlar precocemente o parasitismo periférico escapa dos sintomas
clínicos e da morte na fase aguda, o que não ocorreria no subgrupo que não
consegue esse controle e que permite a disseminação do parasitismo.
Para avaliar, no nosso modelo, o papel do TNF-α na fase aguda da infecção,
utilizamos o tratamento com o receptor solúvel p75 humano (Etanercept) para
bloquear a atividade do TNF-α. Inicialmente, observamos que o Etanercept é capaz
de neutralizar a atividade de TNF-α de hamster in vitro e in vivo (Figuras 13 e 14),
mostrando que esta droga é adequada para o bloqueio de TNF-α de hamster.
O aumento significativo do parasitismo sangüíneo e cardíaco após o
tratamento com Etanercept na fase aguda (Figuras 15 e 17), especialmente um
subgrupo de animais assintomáticos, sugere que o bloqueio da atividade de TNF-α
nesta fase facilitou a disseminação do parasitismo sanguíneo e cardíaco em uma
parcela de animais que, possivelmente, apresentariam baixo parasitismo cardíaco.
Esses resultados estão de acordo com dados de elevada parasitemia em
camundongos deficientes de TNFR1 infectados por T. cruzi (CASTANOS-VELEZ et
al., 1998; ALIBERTI et al., 2001). O aumento de parasitismo e a aparente
diminuição de inflamação nos animais infectados e tratados com Etanercept são
consistentes com o papel do TNF-α na migração de células inflamatórias para o
local da lesão (BEN-HORIN e BANK, 2004). É possível que o bloqueio da atividade
de TNF-α tenha diminuído o recrutamento de células inflamatórias para o coração e,
conseqüentemente, diminuído a produção local de mediadores inflamatórios que
iriam controlar o parasitismo. Alternativamente, o bloqueio de TNF-α pode ter
diminuído a atividade microbicida de macrófagos e conseqüentemente, permitido a
disseminação do parasitismo. Em apoio a essa hipótese, camundongos resistentes
Discussão
153
à infecção (C57BL6) apresentam aumento de parasitemia e mortalidade e
diminuição da produção de NO in vitro e in vivo (SILVA et al., 1995).
Nossos resultados referentes à expressão de RNAm (Tabela 3) sugerem que
o tratamento com Etanercept durante a fase aguda da infecção pelo T. cruzi não
alterou a expressão miocárdica de genes ativados por TNF-α (iNOS, MnSOD e
A20). Uma vez que o tratamento com Etanercept não bloqueia IFN-γ, a expressão
de genes ativados por IFN-γ, que também são ativados por TNF-α (como iNOS e
MnSOD) permaneceu inalterada. Além disso, podemos especular que o tratamento
com Etanercept tenha induzido a ativação de vias de sinalização que podem ser
independentes de TNF-α Por outro lado, o tratamento com Etanercept foi realizado
em animais que modulam positivamente a expressão de TNF-α no miocárdio, após
a infecção por T. cruzi, evidenciado pelos níveis aumentados de expressão de
RNAm de TNF-α em relação aos animais não infectados (Figura 19) e pela
presença de numerosas células TNF-α+ no infiltrado inflamatório no miocárdio,
mostrado pela análise imuno-histoquímica (Figura 18). Entretanto, o significativo
aumento de expressão de RNAm de IL-10 no grupo de animais infectados e
tratados com Etanercept, que não apresentaram sintomas de fase aguda (Tabela
5), pode ter sido conseqüência do aumento de parasitismo em função da falta de
atividade de TNF-α. Podemos hipotetizar que um subgrupo de animais que
controlariam o parasitismo cardíaco, de maneira análoga aos animais infectados
não tratados, foram suscetíveis ao tratamento com Etanercept, ou seja, em um
subgrupo de animais o TNF-α seria importante para controlar o parasitismo e em
outro subgrupo, outros mediadores inflamatórios exerceriam esse controle.
Entretanto, a despeito do alto parasitismo, esse subgrupo de animais “resistentes”
permaneceu livre de qualquer sintoma de fase aguda. Com isso, é possível que nos
Discussão
154
animais sensíveis ao tratamento, o bloqueio da atividade de TNF-α aumenta o
parasitismo mas protege os animais de desenvolverem fase aguda sistêmica, por
mecanismos que podem estar relacionados à ausência de atividade de TNF-α. Um
possível mecanismo seria o aumento da expressão de IL-10 ou de outras citocinas
anti-inflamatórias não investigadas no presente estudo. Em apoio a essa hipótese,
camundongos infectados com T. cruzi e tratados com IL-10 recombinante
apresentaram aumento da parasitemia e camundongos deficientes de IL-10
infectados por T. cruzi apresentaram redução do parasitismo cardíaco
(ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996), mas apresentaram menor sobrevida e
desenvolveram uma síndrome de choque tóxico devido ao aumento de TNF-α
(HOLSCHER et al., 2000). Em conjunto, resultados do nosso e de outros grupos
mostram a importância da IL-10 no controle da resposta inflamatória estimulada
pelo T. cruzi.
Para investigar a influência da parasitemia na fase aguda sobre o desfecho
final na fase crônica seria necessário um grupo de animais que tivesse parasitemia
detectável e que sobrevivesse até a fase crônica. No nosso estudo, não foi possível
relacionar esta variável da fase aguda com a evolução da fase crônica, uma vez
que a grande maioria dos animais que apresentaram parasitemia morreram durante
a fase aguda. Dos 5 sobreviventes, dois morreram durante a fase crônica e apenas
três sobreviveram até o final da análise (11 meses PI), mostrando evolução
semelhante à dos animais com parasitemia indetectável. Apesar do número
pequeno de animais, esse resultado sugere que a parasitemia no 13° dia PI parece
não influenciar a progressão da fase crônica. Por outro lado, uma vez que nesse
grupo de animais acompanhados por longo tempo, a parasitemia foi avaliada
apenas no 13° dia PI, não podemos descartar que um possível aumento de
Discussão
155
parasitemia anterior ou posterior a essa data pudesse estar relacionado à
sobrevivência na fase crônica. Nossos resultados anteriores, utilizando o modelo de
infecção com 100.000 ou 35.000 formas sangüíneas da cepa Y em hamsters,
mostraram que, apesar da baixa parasitemia durante a fase aguda (medida após 7,
14 e 21 dias de infecção; BILATE, 2001), a gravidade da cardiomiopatia,
evidenciada pela intensidade de miocardite, fibrose e disfunção ventricular, estava
associada ao maior inóculo (BILATE et al., 2003). De maneira semelhante, dados
de modelo murino mostraram que camundongos A/J infectados com alto inóculo de
cepa Y de T. cruzi apresentaram maior parasitemia na fase crônica e miocardite
mais intensa do que os animais infectados com baixo inóculo (MARINHO et al.,
1999), sugerindo que a carga parasitária está associada ao desenvolvimento de
lesão cardíaca na fase crônica. Entretanto, estudo realizado em área endêmica com
pacientes portadores da doença de Chagas acompanhados por 8 anos mostrou que
a parasitemia na fase aguda não estava relacionada ao desenvolvimento de CCC
(PEREIRA et al., 1992). Nesta linha, já foi mostrada a presença de agregação
familiar de casos de CCC em áreas endêmicas (ZICKER et al., 1990), sugerindo a
participação de fatores genéticos na progressão da doença. As diferenças de
resultados nos estudos com humanos e em animais podem ser explicadas pelo fato
do método utilizado para medir a parasitemia serem distintos. Enquanto nos
estudos com humanos, a parasitemia foi medida por xenodiagnóstico, no estudo
com camundongos, a parasitemia foi medida pelo método semiquantitativo de
subinoculação. Além disso, nos estudos com camundongos, a associação
encontrada foi com a parasitemia na fase crônica, enquanto que, no estudo com
humanos, a parasitemia foi medida durante a fase aguda. No nosso estudo anterior,
não houve associação entre gravidade da CCC e a parasitemia, mas sim com o
Discussão
156
inóculo. Em conjunto, esses resultados sugerem que, além do parasitismo, outros
fatores (genéticos e ambientais) devem contribuir para o desenvolvimento das
lesões cardíacas nos hamsters cronicamente infectados por T. cruzi.
A observação de que os animais que apresentaram disfunção ventricular,
pelo ecocardiograma realizado 8 meses PI, morreram entre 8-10 meses PI (Figura
26) indica que o desenvolvimento de disfunção ventricular durante a fase crônica
inicial (8 meses PI) está associado com mortalidade durante a fase crônica tardia da
infecção por T. cruzi. Este resultado está de acordo com nosso trabalho anterior
onde, utilizando a mesma combinação de cepa de parasita e hospedeiro, o
desenvolvimento de disfunção ventricular precoce por hamsters cronicamente
infectados estava associado ao óbito na fase crônica tardia (BILATE et al., 2003).
Na mesma linha, estudos com pacientes mostraram que a função ventricular é um
bom preditor de sobrevida de pacientes com CCC (MADY et al., 1994; FREITAS et
al., 2005) que e manifestações clínicas precoces estão associadas a um pior
prognóstico em fases mais avançadas da CCC (MADY e NACRUTH, 1995).
Por outro lado, a observação de que apenas 1 de 9 animais infectados
sobreviventes apresentou disfunção ventricular 11 meses PI (Figura 27) contrasta
com nossos resultados anteriores, onde, nesse mesmo período, 100% dos
hamsters infectados desenvolveram disfunção ventricular significativa
acompanhada de dilatação do VE (BILATE et al., 2003). É possível que o inóculo de
parasitas empregado no estudo atual tenha sido mais virulento e agressivo do que o
empregado no estudo anterior e possa ter sido o responsável pelo estabelecimento
precoce de disfunção ventricular (8 meses PI) e aumento da freqüência de óbitos
durante a fase crônica neste estudo. Por outro lado a diferença de suscetibilidade
ao desenvolvimento de cardiomiopatia pode estar relacionada também a fatores
Discussão
157
genéticos e ambientais, já que os hamsters empregados no estudo atual não são
isogênicos. É possível que a ausência de disfunção ventricular significativa 11
meses pós-infecção pode ter sido decorrente de uma diferença de tempo de
progressão para o comprometimento cardíaco: entre 8 e 11 meses PI morreram os
animais mais suscetíveis, com maior grau de acometimento cardíaco, e os
sobreviventes restantes são representados pelos animais resistentes à fase crônica,
com pequeno ou nenhum grau de acometimento cardíaco. Os nossos resultados
podem ser comparados aos estudos longitudinais realizados com indivíduos
infectados por T. cruzi, onde o desenvolvimento de cardiomiopatia em uma parcela
dos pacientes indeterminados pode ocorrer na adolescência, no início da idade
adulta, ou somente a partir dos 50 anos de idade (ESPINOSA et al., 1985).
Apesar da ausência de disfunção ventricular à análise ecocardiográfica, vale
ressaltar que 44% (4/9) dos animais infectados que sobreviveram até o final do
estudo (11 meses PI) apresentaram simultaneamente dilatação do VE e miocardite
(Figura 30). Este resultado sugere que o acometimento cardíaco nesses animais
não foi suficiente para comprometer a função ventricular e levar à morte na fase
crônica. Dilatação do VE e função ventricular ainda preservada são comuns em
pacientes portadores da doença de Chagas (RASSI et al., 2000). Nesta linha, uma
vez que os animais que desenvolveram dilatação apresentaram também miocardite
e dada a correlação positiva entre intensidade de miocardite e dilatação do VE nos
animais cronicamente infectados (Figura 30), podemos sugerir que um subgrupo de
hamsters (7/12) infectados pelo T. cruzi desenvolveu cardiomiopatia semelhante à
CCC humana, enquanto que o restante dos animais não desenvolveu a
cardiomiopatia típica da fase crônica (5/12), lembrando os indivíduos da forma
indeterminada da doença de Chagas. Em humanos, apenas 30% dos indivíduos
Discussão
158
infectados por T. cruzi desenvolvem CCC, que pode variar de leve a grave, de
acordo com função ventricular e alterações eletrocardiográficas. Os 70% restantes
permanecem na forma indeterminada. Dos pacientes que desenvolvem CCC,
apenas 1/3 desenvolve dilatação das câmaras cardíacas e ICC refratária
(MACÊDO, 1982; ROSSI, 1991). Estudo realizado com biópsias endomiocárdicas
de pacientes portadores da doença de Chagas mostrou que a freqüência de
miocardite é maior em pacientes com CCC grave e com dilatação do que nos
pacientes indeterminados ou com CCC leve (HIGUCHI et al., 1987), mostrando o
papel da miocardite na progressão para as formas graves de CCC. Portanto, pode-
se hipotetizar que o dano às fibras cardíacas causado pela miocardite tenha
contribuído para o desenvolvimento de dilatação do VE na fase crônica nos
hamsters infectados por T. cruzi. Por outro lado, a ausência de associação entre
intensidade de miocardite ou grau de dilatação do VE e mortalidade (Figuras 28 e
29) sugere que, neste modelo, outros eventos, que não a inflamação e dilatação
ventricular possam ser decisivos para a evolução ao óbito. Em fases mais
avançadas da doença, a miocardite é substituída por fibrose, o que poderia explicar
porque alguns animais não apresentaram miocardite na data de sacrifício (11
meses PI). No estudo atual, a fibrose cardíaca nos animais cronicamente infectados
não foi quantificada. Porém, nossos resultados anteriores, utilizando o mesmo
modelo experimental, mostraram que os animais infectados por 12 meses
apresentaram fibrose significativamente superior aos animais não infectados
(BILATE et al., 2003).
Na cardiomiopatia dilatada, o desenvolvimento de hipertrofia excêntrica,
caracterizada pela síntese de sarcômeros em série, progride para a dilatação das
câmaras cardíacas devido ao estiramento das fibras cardíacas (HUNTER e CHIEN,
Discussão
159
1999). Nesta linha, já foi mostrado que diversos mediadores inflamatórios, como
TNF-α, IL-1β e MCP-1, podem ativar o programa hipertrófico de cardiomiócitos
(SCHAUB et al., 1997; YOKOYAMA et al., 1997; KOLATTUKUDY et al., 1998;
KUBOTA et al., 1998). Além disso, dados do nosso grupo mostraram que
cardiomiócitos fetais cultivados com IFN-γ e MCP-1 apresentam expressão
aumentada do fator natriurético atrial (ANF) (CUNHA-NETO et al., 2005), gene
envolvido no fenótipo hipertrófico associado à ICC (HUNTER et al., 1999). Na CCC
humana foi observada a expressão aumentada de RNAm de genes induzidos por
IFN-γ no miocárdio (relacionados ou não à resposta inflamatória) e reduzida de
genes reprimidos por esta citocina (relacionados ao metabolismo cardíaco) em
relação ao miocárdio de pacientes CDI (CUNHA-NETO et al., 2005). Esses
resultados sugerem que a sinalização por IFN-γ pode modular diretamente a
expressão gênica de cardiomiócitos, contribuindo para o agravamento do fenótipo
hipertrófico e da ICC. Em conjunto, podemos hipotetizar que, na CCC, a destruição
de fibras cardíacas pela inflamação crônica e seus mediadores (p. ex. IFN-γ e TNF-
α) resultaria em uma resposta hipertrófica que compensaria a perda de
cardiomiócitos. Porém, com o decorrer do processo de inflamação crônica, essa
resposta hipertrófica poderia desencadear a dilatação das câmaras cardíacas.
Para saber se, no nosso modelo, os mediadores inflamatórios influenciam a
gravidade da CCC, avaliamos a expressão miocárdica de citocinas pró- e anti-
inflamatórias, bem como a expressão de genes ativados por citocinas inflamatórias
(Figura 32). A expressão aumentada do gene A20, ativado por TNF-α/NFκB, no
miocárdio de alguns animais que morreram espontaneamente durante a fase
crônica em relação aos sobreviventes (Tabela 11) sugere que a expressão deste
gene está associada ao desfecho final da cardiomiopatia - morte. Podemos
Discussão
160
especular que o aumento de expressão do gene A20 no miocárdio de animais que
morreram espontaneamente durante a fase crônica tenha sido decorrente da
ativação de vias inflamatórias dependentes de TNF-α/NFκB, que também ativam
vias de proteção celular. Nesta linha, a correlação negativa entre a função
ventricular obtida após 8 meses de infecção (associada com morte precoce durante
a fase crônica) e os níveis de expressão de A20 nos animais infectados e a
correlação positiva entre os níveis de expressão de A20 e MnSOD (Tabela 10 e
Figura 33), também considerado um gene protetor ativado por TNF-α (WONG et al.,
1989), sugere a participação de vias de ativação de genes protetores na progressão
da CCC no hamster. Além disso, a correlação positiva entre os níveis de expressão
de IL-10 com a expressão de A20 e MnSOD e a correlação negativa de IL-10 com a
função ventricular analisada 8 meses PI (Tabela 10 e Figura 33) apóiam a hipótese
de que a expressão de genes com função de proteção celular (por exemplo. A20 e
MnSOD) e citocinas com atividade anti-inflamatória (por exemplo, IL-10) na lesão
cardíaca crônica podem ser decorrentes de ativação de mecanismos de
compensação desencadeados pelos próprios mediadores inflamatórios.
Corroborando essa hipótese, biópsias endomiocárdicas de pacientes com rejeição
aguda de enxerto cardíaco apresentaram elevada expressão de genes protetores,
como o A20 (SOUZA et al., 2005). Dados da literatura mostram que, em modelos
animais de hipertrofia cardíaca, ocorre aumento significativo da expressão de
RNAm de A20 no miocárdio, associado a ativação de NFκB e o tratamento de
cardiomiócitos com adenovírus que codifica o A20 preveniu a apoptose induzida por
privação de soro e a resposta hipertrófica induzida por fenilefrina ou endotelina
(estímulos hipertróficos) (COOK et al., 2003). Além disso, camundongos com
miocardite crônica pós-infecção com vírus Coxsackie apresentaram elevada
Discussão
161
expressão de IL-10 no miocárdio (GLUCK et al., 2001). Em conjunto, resultados do
nosso e de outros grupos sugerem a participação de mecanismos anti-inflamatórios
na miocardite crônica.
Por outro lado, a semelhança nos níveis de expressão no miocárdio de
citocinas (TNF-α, IFN-γ, IL-10) e genes ativados por citocinas (iNOS e MnSOD)
entre os animais que morreram espontaneamente durante a fase crônica em
comparação aos sobreviventes (Tabela 11) sugere que tais mediadores não estão
associados à sobrevivência à fase crônica. Além disso, o fato de a expressão
desses mediadores também ter sido semelhante no grupo de animais com
miocardite e dilatação do VE e no grupo sem miocardite ou dilatação do VE (Tabela
12) sugere que os mediadores inflamatórios e anti-inflamatórios avaliados neste
estudo não estão envolvidos na gravidade da CCC do hamster infectado por T.
cruzi. Uma vez que a composição celular do infiltrado linfomononuclear não foi
caracterizada, não podemos descartar a hipótese de que a quantidade de algum
tipo celular predominante poderia estar relacionada tanto à gravidade da doença
quanto à expressão de citocinas e genes ativados por citocinas ou de genes
relacionados à resposta inflamatória não avaliados neste estudo.
Apesar da falta de associação entre as citocinas inflamatórias avaliadas
nesse estudo e a progressão diferencial da CCC nos hamsters infectados pela cepa
Y de T. cruzi, a maioria dos animais apresentou elevada expressão de TNF-α, IFN-γ
e IL-10 em comparação aos animais não infectados (Figura 32). Esse resultado está
de acordo com estudos em humanos que mostraram, por imuno-histoquímica, a
presença abundante de células produtoras de TNF-α, IL-4, e IFN-γ, com predomínio
deste último, no miocárdio de pacientes com CCC grave e miocardite. Em modelos
murinos de infecção crônica por T. cruzi (camundongos C57BL/6 infectados com a
Discussão
162
cepa Colombiana), observou-se elevada expressão de RNAm de TNF-α e IL-10, e
uma menor expressão de IFN-γ, no tecido cardíaco após 60 ou 120 dias de infecção
(TALVANI, et al., 2000). Nesse modelo, a intensidade da miocardite foi maior após
60 dias de infecção e esta era essencialmente focal, enquanto que, após 120 dias
de infecção, a miocardite era leve e difusa. Além disso, em outros modelos murinos
de infecção crônica (camundongos C57BL/6 ou C3H/HeSnJ infectados com a cepa
Brazil ou Sylvio X10/4, respectivamente) foi possível detectar, por imuno-
histoquímica, a presença de numerosas células TNF-α+ após 60, 85, 126 e 210 dias
de infecção, mas não a presença de células expressando IFN-γ, IL-4, ou IL-10 nos
mesmos períodos (ZHANG e TARLETON, 1996). Neste trabalho, a intensidade da
miocardite em ambos os modelos estava correlacionada com o número de células
TNF-α+, sugerindo que TNF-α, mas não IFN-γ, IL-4 e IL-10, está relacionado à
gravidade da miocardite crônica nestes modelos. Em conjunto, nossos resultados e
de outros grupos sugerem a participação das citocinas inflamatórias na progressão
da miocardite crônica pós-infecção pelo T. cruzi. Por outro lado, a presença de
citocinas anti-inflamatórias, também nas lesões cardíacas, sugere que estas
estejam desempenhando um possível papel regulador.
No nosso estudo, a ausência de associação entre a expressão local de
citocinas inflamatórias e gravidade da CCC (miocardite, dilatação e morte)
contrastam com dados da literatura, onde a produção de IFN-γ por células
mononucleares de pacientes com doença de Chagas está associada ao
desenvolvimento de cardiomiopatia (BAHIA-OLIVEIRA et al., 1998; ABEL et al.,
2001; GOMES et al., 2003). Além disso, monócitos de pacientes da forma
indeterminada da doença Chagas apresentaram elevada expressão de IL-10
quando cultivados com T. cruzi, enquanto que monócitos de pacientes com CCC
Discussão
163
apresentaram elevada expressão de TNF-α (SOUZA et al., 2004), mostrando a
contribuição do perfil Th1 na progressão da cardiomiopatia. Entretanto, uma
diferença a ser considerada é que, enquanto no nosso estudo a avaliação dos
mediadores foi realizada no órgão-alvo da doença, os trabalhos que sugerem o
envolvimento das citocinas do perfil Th1 na progressão das lesões cardíacas em
pacientes portadores da doença de Chagas avaliaram a produção/expressão de
citocinas em células da periferia. Com isso, é possível que mecanismos diferentes
estejam operando localmente. Por outro lado, a análise imuno-histoquímica
realizada em biópsias endomiocárdicas ou em necrópsias de pacientes com CCC
mostraram a presença de IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-4 no infiltrado inflamatório (REIS
et al., 1997), sugerindo que tanto citocinas do perfil Th1 como Th2 estão
relacionadas à progressão das lesões cardíacas. Entretanto, nesse trabalho, as
amostras eram provenientes de pacientes com CCC grave e, portanto, não
podemos descartar a possibilidade de que os mesmos mediadores estejam
presentes também no infiltrado inflamatório de pacientes com CCC leve ou
moderada.
Contudo, podemos especular que a correlação entre intensidade de
inflamação e dilatação nos hamsters cronicamente infectados por T. cruzi, assim
como a ausência de relação destas com a sobrevivência à fase crônica da infecção,
estejam associada, se não a uma produção diferenciada de citocinas, a uma
resposta diferencial do miocárdio aos mediadores inflamatórios. Entre os animais
que morreram espontaneamente durante a fase crônica, a intensidade de resposta
do miocárdio aos mediadores inflamatórios pode ter sido maior do que entre os
animais que conseguiram sobreviver até o final do estudo. Outro fator a ser
considerado é a amostra de ventrículo esquerdo utilizada para os estudos de
Discussão
164
histopatologia e expressão de RNAm. Enquanto no primeiro utilizamos a porção
mediana do coração, no segundo utilizamos a ponta do ventrículo esquerdo.
Podemos especular que a intensidade de resposta inflamatória possa ser diferente
em porções distintas do coração.
Devido à heterogeneidade genética desses animais, é possível que
polimorfismos genéticos envolvidos na resposta imune também estejam envolvidos
na progressão diferencial. Nesta linha, dados da literatura já mostraram a
associação de polimorfismos do gene TNF com uma menor sobrevida de pacientes
com CCC grave ou com suscetibilidade ao desenvolvimento de cardiomiopatia
(DRIGO et al., 2005; RODRIGUEZ-PÉREZ et al., 2003). Por outro lado, a hipótese
de que a progressão diferencial esteja relacionada a outros mediadores
inflamatórios ou a mediadores não relacionados à resposta imune não investigados
neste estudo deve ser considerada. Adicionalmente, uma vez que avaliamos a
expressão de RNAm de citocinas e genes ativados por citocinas, é possível que a
ausência de associação com a gravidade da CCC seja decorrente de regulação
pós-transcricional. Já foi mostrado que IL-10, IFN-γ, iNOS e MnSOD apresentam
regulação pós-transcricional de RNAm (MOORE, 2001; HODGE et al., 2002;
COPPOLA et al., 1998; NILAKANTAN et al., 2005). Portanto, apesar de níveis
semelhantes de expressão de RNAm entre animais com ou sem dilatação e
miocardite, é possível que mecanismos pós-transcricionais tenham resultado em
aumento ou diminuição da produção protéica de alguns dos mediadores estudados.
Uma vez que no nosso modelo – hamsters sírios infectados pela cepa Y –
desenvolvem, com o mesmo inóculo de parasitas, tanto a miocardite da fase aguda
como a cardiomiopatia da fase crônica, uma pergunta relevante é se a expressão
de mediadores inflamatórios e anti-inflamatórios é semelhante ou diferente nas
Discussão
165
fases aguda e crônica. A observação de níveis de expressão de RNAm de citocinas
(TNF-α, IFN-γ e IL-10) significativamente menores nos animais cronicamente
infectados do que nos animais agudamente infectados (Tabela 13) está de acordo
com a menor intensidade de miocardite e parasitismo cardíaco na fase crônica em
comparação a fase aguda. Por outro lado, a observação de níveis semelhantes de
expressão dos genes ativados por citocinas inflamatórias tanto nos animais
agudamente infectados como nos cronicamente infectados (Tabela 13) sugere que
a regulação desses genes pode ter sido semelhante nas fases aguda e crônica.
Entretanto, uma vez que esses genes exibem regulação pós-transcricional, a
ausência de diferença pode ter sido decorrente deste mecanismo.
O aumento da disfunção ventricular e dilatação do VE, evidenciados pela
análise ecocardiográfica, nos animais infectados e tratados com Etanercept em
relação aos infectados não tratados (Figura 35) sugere que o tratamento com 2,5
mg/Kg de Etanercept 2x/semana durante 70 dias da fase crônica da infecção
agravou a CCC avaliada 11 meses PI. Vale ressaltar que os efeitos deletérios do
Etanercept sobre a cardiomiopatia não podem ser atribuídos à cardiotoxicidade do
medicamento, já que animais não infectados e tratados pelo mesmo período se
comportaram de maneira semelhante aos controles não tratados em todos os
parâmetros analisados (Figuras 34, 35 e 36). Uma vez que o TNF-α está envolvido
na resposta imune contra o T. cruzi (SILVA et al., 1995; ALIBERTI et al., 2001) e
que pacientes com CCC imunossuprimidos após transplante cardíaco apresentam
reativação da doença (ALMEIDA et al., 1996; BOCCHI et al., 2005), a causa do
agravamento da cardiomiopatia durante o período de tratamento com Etanercept
poderia ter sido a reagudização da doença de Chagas no hamster cronicamente
infectado. Entretanto, observamos que, entre os animais infectados e tratados com
Discussão
166
Etanercept, não houve aumento de parasitismo cardíaco (Figura 38) em relação aos
animais infectados não tratados. Portanto, o tratamento com Etanercept não
interferiu significativamente no controle do parasitismo na fase crônica da infecção.
A possibilidade de que a piora da função ventricular fosse secundária a deposição
de imunocomplexos Etanercept – anti-Etanercept no miocárdio foi excluída uma vez
que nenhum dos animais infectados tratados com Etanercept apresentou depósitos
de imunocomplexos IgG no miocárdio (Figura 39).
Nossos dados contrastam com os resultados de ensaios clínicos com número
reduzido de pacientes portadores de ICC (DESWAL et al., 1999; FICHTLSCHERER
et al., 2001; BOZKURT et al., 2001) e de modelos experimentais de ICC no rato e
cão (LI et al., 2002; MOE et al., 2004, respectivamente) onde o tratamento com 0,4-
0,5mg/Kg de Etanercept resultou em melhora da função ventricular. Além disso, um
estudo realizado com 15.739 pacientes mostrou que a prevalência e incidência de
ICC foram significativamente menores nos pacientes com artrite tratados com 25
mg de Etanercept em relação aos pacientes tratados com outras terapias para
artrite reumatóide (WOLFE e MICHAUD, 2004). Por outro lado, ensaios clínicos
realizados nos Estados Unidos e na Europa com 1500 pacientes mostraram que o
uso do Etanercept não acarretou melhora dos sintomas clínicos da ICC (MANN,
2002). Além disso, pacientes com esclerose múltipla tratados com anticorpo
monoclonal anti-TNF-α ou com receptor p55 solúvel de TNF-α (Lenercept)
apresentaram piora da doença (VAN OOSTEN et al., 1996; SCHWID e
NOSEWORTHY, 1999), sugerindo um papel protetor dessa citocina na esclerose
múltipla.
Alguns autores sugerem que a sinalização por TNF-α seja importante para a
manutenção da homeostase do coração (KURRELMEYER et al., 2000). Esses
Discussão
167
autores mostraram que em modelos de infarto em camundongos deficientes da
expressão de TNFR1/TNFR2 ocorre aumento significativo da área de infarto e
apoptose de cardiomiócitos. Nessa linha, é possível que o efeito benéfico do
Etanercept ocorra em condições de elevada produção de TNF-α, onde este
tratamento serviria para bloquear o excesso de TNF-α presente, mantendo os níveis
homeostáticos dessa citocina. Como exemplo, camundongos tratados com 2 mg/Kg
de Etanercept apresentaram melhora da sobrevida e da função miocárdica em
modelo de endotoxemia induzida por LPS (PENG et al., 2003), onde a injeção de
LPS resulta em aumento substancial dos níveis de TNF-α plasmático e miocárdico
(KADOKAMI et al., 2001; PENG et al., 2003). Os níveis de TNF-α estimulados por
doses altas de LPS são muito superiores aos níveis encontrados em pacientes com
ICC (KADOKAMI et al., 2001; MOCELIN et al., 2005). Em conjunto os resultados
benéficos na artrite reumatóide (WOLFE e MICHAUD, 2004) e indiferentes na ICC
(MANN, 2002) ou deletérios em hamsters cronicamente infectados por T. cruzi
(Figuras 35 e 36), sugerem que existe especificidade de doença e órgão alvo
quanto ao efeito benéfico do bloqueio da atividade de TNF-α, que pode estar
relacionado a um efeito homeostático da citocina.
Para investigar o efeito do bloqueio de TNF-α/LT-α sobre os mediadores pró-
e anti-inflamatórios produzidos no miocárdio, avaliamos a expressão de RNAm de
citocinas e genes ativados por citocinas inflamatórias no miocárdio dos animais
infectados e tratados com Etanercept. O aumento da expressão de IL-10 no grupo
de animais que permaneceram assintomáticos nos experimentos de fase aguda
(Tabela 5) e no grupo que sobreviveu até os 11 meses no experimento de fase
crônica (Tabela 15) sugere que o TNF-α pode ter controlado a expressão de IL-10.
Em apoio a essa hipótese, células esplênicas de camundongos infectados pela
Discussão
168
cepa Y de T. cruzi e tratados com anticorpo neutralizante anti-TNF-α durante a fase
aguda apresentaram elevada produção espontânea de IL-10 em comparação aos
animais não tratados (ABRAHAMSOHN e COFFMAN, 1996). Nesse trabalho, o
cultivo de células esplênicas de animais infectados na presença de anti-TNF-α
também resultou em aumento da produção de IL-10. Uma vez que apenas uma
parcela dos animais infectados tratados exibiu aumento da expressão de IL-10, é
possível especular que fatores genéticos estejam envolvidos neste aumento. Nesta
linha, vários polimorfismos do gene da IL-10, especialmente na região promotora, já
foram descritos em humanos (MOORE et al., 2001). Além disso, a despeito do
conhecido papel anti-inflamatório da IL-10, dados na literatura mostram que esta
citocina também pode exercer efeito pró-inflamatório em alguns processos
patológicos (MOCELLIN et al., 2003). Deste modo, considerando a piora da função
ventricular após o tratamento com Etanercept na fase crônica associada ao
aumento da expressão de IL-10, é possível que essa citocina tenha contribuído para
o agravamento das lesões cardíacas.
A observação de diminuição significativa da expressão de RNAm de iNOS
em uma parcela dos animais infectados e tratados com Etanercept é (Tabela 14)
consistente com dados da literatura que mostram que a produção de TNF-α ativa a
expressão de iNOS (SILVA et al., 1995). Entretanto, outros estudos mostram que a
elevada expressão de iNOS está associada a disfunção cardíaca em modelos
animais e em pacientes com ICC (FINKEL et al., 1992; DEBELDER et al., 1993;
FUNAKOSHI et al., 2002; HARE, 2003; CHAMPION, 2003). Na doença de Chagas,
os níveis elevados de TNF-α no soro de pacientes com CCC mas não IND se
correlacionam positivamente com os níveis séricos de NO e negativamente com os
níveis séricos de glutationa peroxidase e superóxido dismutase (SOD), enzimas
Discussão
169
envolvidas nas vias anti-oxidantes (PÉREZ-FUENTES et al., 2003). Esses
resultados sugerem que a produção aumentada de NO, estimulada pela exposição
crônica ao TNF-α, seria a responsável pela diminuição da ativação do sistema anti-
oxidante, que acaba por aumentar o estresse oxidativo, podendo contribuir para o
agravamento da disfunção cardíaca tanto na CCC como nas outras cardiomiopatias.
Por outro lado, alguns autores também sugerem que a produção de NO no coração
pode ter efeitos benéficos. Camundongos deficientes de eNOS, cuja expressão é
constitutiva em cardiomiócitos, desenvolvem uma síndrome semelhante à
insuficiência cardíaca (BAROUCH et al., 2002). Além disso, camundongos
deficientes de IFN-γ apresentam miocardite auto-imune induzida por miosina mais
intensa do que camundongos normais e essa piora estava relacionada a diminuição
da expressão de iNOS no miocárdio (ERIKSSON et al., 2001), sugerindo um papel
protetor da iNOS no processo inflamatório miocárdico. Em apoio a essa hipótese, já
foi relatado o aumento da expressão gênica da iNOS no tecido cardíaco de
pacientes com CDI, e este aumento estava correlacionado positivamente com
melhor função ventricular (THOENES et al., 1996). Em conjunto, esses resultados
sugerem que, na ICC, o NO pode ter ação benéfica ou deletéria sobre a função
miocárdica. Portanto, no nosso estudo, é possível hipotetizar que a diminuição
significativa da expressão de iNOS pode ter contribuído para o agravamento da
disfunção ventricular e dilatação do VE nos animais infectados e tratados com
Etanercept. Sabendo-se que o TNF-α modula a expressão de inúmeros genes
(SULLIVAN, 2003) é possível que os efeitos biológicos observados nesse estudo
tenham sido decorrentes da modulação da expressão de outros mediadores
inflamatórios, ou de mediadores não relacionados à resposta imune, mas
envolvidos na manutenção da função cardíaca. Alem disso, uma vez que o
Discussão
170
Etanercept não bloqueia TNF-α de membrana (KIRCHNER et al., 2004), este
poderia agir sobre outras células-alvo ou até mesmo exercer efeito autócrino,
compensando a ausência de atividade de TNF-α circulante.
Em conjunto, nossos resultados mostraram que, com uma única cepa de
parasita (cepa Y) e um hospedeiro geneticamente heterogêneo (hamster sírio) foi
possível recapitular o espectro da evolução da doença de Chagas humana, que
exibe diferentes padrões de progressão nas fases aguda e crônica (RASSI et al.,
2000; PRATA, 2001). Com esse modelo, foi possível estudar, utilizando o mesmo
esquema experimental, a indução e resolução da miocardite e a evolução da
cardiomiopatia crônica. Na fase aguda, o parasitismo cardíaco parece determinar os
níveis de expressão miocárdica de citocinas como TNF-α e IL-10 e genes ativados
por TNF-α e IFN-γ, como iNOS. Durante a fase aguda, o baixo parasitismo e a
menor expressão de citocinas no miocárdio dos animais assintomáticos sugere que
estes foram capazes de controlar o parasitismo antes da sua disseminação pelos
tecidos. Na fase crônica, embora níveis significativos de citocinas estejam presentes
no miocárdio e a inflamação local esteja envolvida na progressão da cardiomiopatia
chagásica crônica para a forma dilatada, esses fatores parecem não ser
determinantes para a morte dos animais cronicamente infectados. Isto indica que
mecanismos inflamatórios têm importante papel patogênico na evolução da
cardiomiopatia crônica pelo T. cruzi, porém não são suficientes para levar à morte.
Esse resultado sugere que outros mecanismos imunológicos ou cardiovasculares
não investigados nesse estudo podem ter contribuído para o desfecho final – morte.
Conclusões
171
7 CONCLUSÕES
• A infecção de hamsters sírios geneticamente heterogêneos com a cepa Y de
T. cruzi permitiu recapitular o espectro da evolução da doença de Chagas
humana. Com este modelo, foi possível estudar, utilizando o mesmo
esquema experimental, a indução e resolução da miocardite e a evolução da
cardiomiopatia crônica;
• Na fase aguda, o parasitismo cardíaco parece determinar os níveis de
expressão miocárdica de citocinas como TNF-α e IL-10 e genes ativados por
TNF-α e IFN-γ, como iNOS. A ausência de parasitismo e citocinas no
miocárdio dos animais assintomáticos sugere que estes foram capazes de
controlar o parasitismo antes da sua disseminação pelos tecidos;
• O aumento significativo do parasitismo sangüíneo e cardíaco após o
tratamento com Etanercept durante a fase aguda sugere que o bloqueio da
atividade de TNF-α facilitou a disseminação do parasitismo sangüíneo e
cardíaco;
• O desenvolvimento de disfunção ventricular 8 meses PI esteve associado
com mortalidade durante a fase crônica da infecção por T. cruzi;
• A correlação entre a disfunção ventricular analisada 8 meses PI e níveis de
expressão de IL-10 e A20 na fase crônica (8-11 meses PI), bem como o
aumento da expressão de A20 no miocárdio de animais que morreram
Conclusões
172
espontaneamente durante a fase crônica, sugere que esses mediadores
estão envolvidos na progressão da CCC no hamster infectado por T. cruzi;
• O tratamento com Etanercept durante a fase crônica da infecção por T. cruzi
agravou a cardiomiopatia chagásica crônica, por mecanismos possivelmente
relacionados ao aumento da expressão de IL-10 e diminuição da expressão
de iNOS;
• Na fase crônica, embora níveis significativos de citocinas estivessem
presentes no miocárdio e a intensidade da inflamação cardíaca estivesse
envolvida na progressão da cardiomiopatia para a forma dilatada, esses
fatores parecem não ter sido determinantes para a morte dos animais
cronicamente infectados.
Referências
173
REFERÊNCIAS
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Anexos
188 Anexo A. Dados individuais de animais controles não infectados do experimento de fase aguda
Id Peso Peso % perda animais inicial (g) final (g) peso
4F88 152 167 -9,87 5446 139 166 -19,42 49BF 139 155 -11,51 6 E96 141 185 -31,21 2CC8 151 175 -15,89 804B 161 176 -9,32
Id = identificação
Anexos
189 Anexo B. Dados individuais dos animais infectados por T. cruzi por 21 dias
Id Fase Título IgG Peso Peso %
perda % área % Ag ninhos/ TNF-α A20 IFN-γ IL-10 MnSOD IL-4 iNOS
Animal aguda* anti-T. cruzi
inicial (g)
final (g) peso inflamação
T. cruzi mm2 ER ER ER ER ER ER ER
78A7 ausente 25600 151 158 -4,64 6,091 0,0025 0,56 5,75 1,91 140,49 75,26 0,99 19,38 0,37 8B99 presente 12800 175 116 33,71 0,600 0,02 1,60 10,41 8,40 77,81 142,54 1,02 11,02 1,65 9918 presente 3200 181 113 37,57 0,302 0,11 1,02 24,17 23,00 44,80 184,79 1,64 6,71 3,05 99C7 presente 6400 146 100 31,51 1,112 0,15 2,33 19,11 29,25 156,64 366,01 2,10 17,58 4,55 A98E ausente 12800 161 166 -3,11 1,392 0,006 0,00 2,45 1,05 12,95 11,42 0,68 31,45 2,09 A805 ausente 12800 163 165 -1,23 2,216 0,025 0,33 2,46 1,24 11,12 21,37 0,27 9,42 1,43 956C presente 25600 164 105 35,98 1,292 0,016 0,27 6,75 6,70 81,48 200,54 1,04 17,22 1,31 6E71 ausente 6400 157 154 1,91 2,872 0,016 0,00 5,15 2,60 0,67 41,72 0,54 4,39 0,81 A105 presente 6400 193 133 31,09 3,174 0,13 3,41 4,58 1,03 67,01 150,51 1,22 12,84 0,22 A540 ausente 25600 175 179 -2,29 1,304 0,00027 0,00 1,33 0,08 27,83 28,01 0,51 20,65 0,12 SEM presente 12800 164 133 18,90 3,141 0,276 1,67 31,39 21,96 160,32 347,35 0,97 31,68 7,90 738F ausente 6400 175 190 -8,57 2,615 0,0075 0,14
Id, identificação de cada animal. * Após 21 dias de infecção, os animais foram analisados quanto a presença ou ausência de sintomas de fase aguda. ER, expressão relativa de RNAm.
Anexos
190 Anexo C. Dados individuais dos animais infectados com T. cruzi e tratados com Etanercept durante fase aguda da infecção.
Id Fase Título IgG Peso Peso % perda % Ag ninhos/ TNF-α iNOS A20 MnSOD IFN-γ IL-10
Animal
aguda anti-T. cruzi inicial (g) final (g) peso T. cruzi mm2 ER ER ER ER ER ER
7E13 presente 1600 158 110 30,38 1,43 16,89 46,18 7,56 56,08 4,15 213,98 1652,86A500 presente 6400 156 102 34,62 0,137 4,27 9,04 5,23 9,78 1,07 46,34 142,89 A20B presente 12800 149 103 30,87 0,44 6,67 2,28 1,32 2,61 0,61 15,79 155,93 A3BE presente 6400 138 119 13,77 0,135 1,06 2,07 0,48 0,91 0,40 34,08 50,64 9036 presente 12800 164 110 32,93 0,17 5,24 9,59 6,63 16,51 1,70 89,87 387,02 853D ausente 12800 141 131 7,09 0,02 0,33 5,58 1,76 3,03 0,77 120,79 143,68 7550 ausente 12800 151 153 -1,32 0,0344 0,44 5,30 0,24 3,15 0,91 138,65 179,61 727C ausente 12800 136 140 -2,94 0,055 1,47 4,91 1,46 3,89 0,58 61,75 54,11 8E16 ausente 3200 145 124 14,48 0,025 1,11 4,98 1,51 3,10 0,68 59,40 105,91 A504 ausente 6400 148 153 -3,38 0,061 1,05 4,93 1,06 1,90 0,62 83,83 127,09 8DB1 presente 1600 152 98 35,53 0,15 1,09 9BAA ausente 12800 145 152 -4,83 0,0193 0
Id, identificação de cada animal. * Após 21 dias de infecção, os animais foram analisados quanto a presença ou ausência de sintomas de fase aguda. ER, expressão relativa de RNAm.
Anexos
191 Anexo D. Dados individuais de animais controles não infectados do experimento de fase crônica
Id peso (g) peso (g) peso (g) óbito DDVE
basal/ DDVE8m/ DDVE11m/ ∆D% ∆D% ∆D% n°cel inflam/ IDVE
animal basal 8 meses PI
11 meses PI peso peso peso basal 8mPI 11mPI mm2
corte1
833E 96 179 4,479 2,85 37,5 8B99 126 210 203 3,571 2,71 2,71 39,77 31,9 40,72 198,3 95DF 101 170 170 4,059 3,00 3,29 52,84 54,3 39,03 70,8 2,40 804B 107 200 186 4,112 2,95 3,33 40,03 39,8 31,22 106,7 7550 105 143 140 3,810 3,36 3,50 47,6 40,3 31,5 73,1 2,11 99C7 102 209 190 3,431 2,25 2,58 49,33 42,7 53,97 956C 91 145 135 4,615 3,03 3,93 50,12 47,6 46,79 1,73 A500 101 154 131 3,366 3,44 4,12 56,11 32,8 30,34 129,5 1,60 7E13 107 200 4,112 2,75 43,71 32,1 9BAA 93 202 191 4,516 2,77 3,25 49,77 40,1 38,85 173,3 2,32 3907 100 172 4,100 3,26 46,35 46,5 8592 116 244 230 3,190 2,79 2,74 51,4 31,1 32,23 50,7 3,09 4BC3 113 255 244 3,363 2,35 2,46 48,91 42,0 38,6 85,6 2,59
Id = identificação, IDVE = índice de dilatação do ventrículo esquerdo; DDVE = diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; D% = fração de encurtamento do ventrículo esquerdo; m = meses; mPI = meses pós-infecção. , morte espontânea.
Anexos
192 Anexo E. Dados individuais dos animais infectados com T. cruzi por 8 a 11 meses.
Id óbito título IgG peso peso 8 peso 11 DDVE DDVE DDVE DD% ∆D% ∆D% n°cel IDVE TNF-α A20 MnSOD iNOS IL-4 IFN-γ IL-10
animal anti-T. cruzi
inicial (g)
meses PI
meses PI inicial 8m 11m inicial 8m 11m inflam ER ER ER ER ER ER ER
998C 25600 98 181 150 3,51 2,82 3,73 45,35 39,70 36,66 199,26 5,90 0,74 1,09 0,69 2,02 0,73 1,17 0,259D1B 6400 102 179 167 4,17 2,74 3,41 34,13 38,10 43,87 169,33 2,00 1,74 1,10 0,85 0,91 1,93 3,73 1,30A757 98 74 3,68 5,81 39,5 34,50 165,00 2,81 0,74 3,48 1,32 0,74 5,06 3,99 8,85727C 12800 117 169 144 3,35 3,37 3,96 41,65 39,70 33,43 343,75 4,87 1,69 0,95 0,72 2,03 3,40 7,80 1,509F5A 102 133 4,21 41,21 136,22 2,88 0,31 0,63 0,67 0,76 4,82 1,99 0,6995F7 116 218 3,55 3,21 49,07 28,00 144,24 4,08 0,89 4,05 1,04 1,05 7,07 1,74 3,20A42D 25600 92 189 168 4,64 2,38 3,21 44,91 38,60 29,08 217,78 3,62 2,64 1,07 1,47 2,43 7,46 11,32 2,01A105 12800 106 180 167 3,90 3,06 3,17 41,11 40,50 30,79 187,50 1,63 3,42 1,84 2,03 2,99 8,09 7,97 1,16A249 12800 96 188 188 4,13 2,93 2,77 46,80 38,90 39,02 136,41 2,43 2,74 1,46 1,10 1,68 5,48 6,33 1,88A20B 6400 99 196 166 5,15 2,81 2,77 39,81 39,50 43,74 266,67 4,45 3,85 1,76 0,93 1,31 5,53 5,45 2,2586 E 4 6400 83 143 145 5,09 3,43 3,93 50,69 39,90 39,17 1,81 0,42 0,78 0,62 3,18 3,10 0,724DE1 99 165 3,97 46,68 75,83 2,01 1,44 2,03 0,87 3,12 1,50 5,29 8E0B 98 161 3,53 3,66 53,95 22,50 176,35 1,82 14,04 14,21 4,86 0,26 2,38 3,26 27,478117 105 199 179 3,83 2,56 36,88 34,30 304,00 3,51 7CD9 12800 101 177 4,20 3,28 48,29 36,20 286,67 3,35 9F9E 127 146 2,94 2,81 44,20 35,60 A805 12800 97 205 146 4,33 2,93 3,97 43,64 32,00 36,5 924E 73 165 5,89 3,82 35,35 25,30 7A1F 88 164 4,53 3,54 42,94 23,20 A748 89 76 3,93 51,66 5945 113 219 3,83 3,06 59,25 32,50 70AB 112 162 3,49 2,65 44,39 41,90
Id = identificação, IDVE = índice de dilatação do ventrículo esquerdo; DDVE = diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo;
D% = fração de encurtamento do ventrículo esquerdo; mPI = meses pós-infecção; ER = expressão relativa. , morte espontânea.
Anexos
193 Anexo F. Dados individuais dos animais infectados com T. cruzi e tratados com Etanercept durante fase crônica da infecção.
Id óbito Título IgG peso peso peso DDVE DDVE DDVE ∆D% ∆D% ∆D% n° cel TNF-α A20 MnSOD iNOS IL-4 IFN-γ IL-10
Animal anti-T. cruzi
inicial (g)
8m PI
11m PI inicial 8m 11 m inicial 8 m 11m inflam ER ER ER ER ER ER ER
738F 3200 111 208 167 2,83 2,98 4,311 57,64 30 9,5 123,8 5,05 1,44 0,41 1,59 9,81 7,61 1,63 9909 12800 107 168 138 3,89 3,45 4,710 56,43 39,5 11,14 210,7 0,68 5,02 0,77 0,39 1,38 1,75 5,10 78A7 6400 89 154 134 4,81 3,64 5,448 48,63 38 12,9 398,2 3,08 1,57 0,88 0,75 2,72 5,35 50,767A63 12800 92 147 148 5,01 3,40 4,054 43,1 40,2 41,1 100,0 3,26 1,60 1,12 1,35 7,43 10,74 1,85 8C6A 1600 95 148 3,56 3,31 54,27 28,9 496,2 2,64 2,05 1,12 1,47 14,27 5,25 6,92 59D8 6400 94 157 4,43 3,38 41,94 41,6 130,4 1,55 7,96 1,65 0,24 3,26 2,47 13,058 E 16 6400 98 135 104 4,48 3,33 6,923 67,64 41,7 21,44 250,5 1,65 3,80 1,08 1,22 2,81 0,94 1,50 7B9C 6400 105 172 153 3,48 2,73 3,529 40,92 47,1 22,5 216,7 0,68 0,34 0,85 0,55 4,34 4,47 6,25 82A6 25600 92 149 124 4,21 3,36 4,435 46,68 39,1 31,21 305,6 1,59 0,47 0,95 0,86 4,03 4,58 2,65 A98E 12800 91 148 114 3,78 2,77 3,596 46,33 50,5 47,7 232,0 1,40 0,87 0,74 0,60 1,29 3,44 3,79 9808 104 131 4,32 5,11 44,54 29,1 9D3E 110 172 3,54 3,90 48,39 20,8 A049 98 163 4,23 3,93 36,74 26
Id = identificação; DDVE = diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; D% = fração de encurtamento do ventrículo esquerdo; mPI = meses pós-infecção; ER = expressão relativa. , morte espontânea.
Anexos
194 Anexo G. Comparação de diferentes medidas avaliadas em animais controles e animais cronicamente infectados pelo T. cruzi Medidas controles infectados n
(controles) n
(infectados) valor p mediana (min-max) mediana (min-max)
DDVE/peso 8 meses PI 2,85 (2,25-3,44) 3,28 (2,38-5,81) 13 43 0,02∗
DDVE/peso 11 meses PI 3,27 (2,46-4,12) 3,41 (2,77-3,97) 10 9 0,31
DSVE/peso 8 meses PI 1,75 (1,29-2,34) 2,05 (1,35-3,78) 13 43 0,002∗
DSVE/peso 11 meses PI 1,99 (1,16-2,82) 2,26(1,57-2,64) 10 9 0,35
D% 8 meses PI 40,10 (31,10-54,30) 35,60 (14,70-50,50) 13 43 0,013∗
D% 11 meses PI 38,85 (30,34-53,97) 36,66 (29,08-43,87) 10 9 0,29
n° cels. inflam./mm2 106,70 (50,70-198,30)
182,00 (75,80-343,80) 9 14 0,005∗
IDVE 2,32 (1,60-3,09) 3,12 (1,63-5,90) 7 14 0,04∗
IDVE = índice de dilatação do ventrículo esquerdo; DDVE = diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE = diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo; D% = fração de encurtamento do ventrículo esquerdo; PI = pós-infecção; ∗p < 0,05, significativo, Teste U de Mann-Whitney.
Anexos
195 Anexo H. Comparação entre diferentes medidas avaliadas em animais sobreviventes e mortos espontaneamente na fase crônica da infecção pelo T. cruzi Medidas sobreviventes mortos n (sobreviventes) n (mortos) valor p
mediana (min-max) mediana (min-max)
DDVE/peso 8 meses PI 2,93 (2,38-3,43) 3,24 (2,56-5,81) 9 10 0,18
DSVE/peso 8 meses PI 1,75 (1,43-2,10) 2,21 (1,54-3,78) 9 10 0,04∗
∆D% 8 meses PI 39,50 (32,00-40,50) 33,40 (22,50-41,90) 9 10 0,01∗
IDVE 3,62 (1,63-5,90) 2,88 (1,82-4,08) 7 7 0,53
n° cels. inflam./mm2 199,30 (136,40-343,80) 165,00 (75,80-304,00) 7 7 0,32
TNF-α (ER) 2,23 (0,74-3,85) 0,89 (0,31-14,05) 8 5 0,22
A20 (ER) 1,09 (0,42-1,84) 3,47 (0,63-14,22) 8 5 0,03∗
MnSOD (ER) 0,89 (0,688-2,035) 1,039 (0,669-4,856) 8 5 0,72
INOS (ER) 1,848 (0,62-2,99) 0,7580 (0,2550-3-125) 8 5 0,28
IFN-γ (ER) 5,89(1,172-11,32) 3,263 (1,743-5,29) 8 5 0,17
IL-10 (ER) 1,4 (0,253-2,249) 6,025 (0,689-27,47) 8 4 0,15
IDVE = índice de dilatação do ventrículo esquerdo; DDVE = diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE = diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo; D% = fração de encurtamento do ventrículo esquerdo; ER = expressão relativa; ∗p < 0,05, significativo, Teste U de Mann-Whitney.
Anexos
196 Anexo I. Comparação entre diferentes medidas avaliadas em animais infectados pelo T. cruzi e infectados tratados com Etanercept Medidas infectados infectados + sTNFR n (infectados) n (infectados + sTNFR) valor p
mediana (min-max) mediana (min-max)
DDVE/peso 8 meses PI 3,06 (2,38-5,81) 3,39 (2,73-5,11) 19 13 0,09
DDVE/peso 11 meses PI 3,41 (2,77-3,97) 4,37 (3,53-6,92) 9 8 0,03∗
DSVE/peso 8 meses PI 2,00 (1,43-3,78) 2,08 (1,35-3,59) 19 13 0,283
DSVE/peso 11 meses PI 2,26(1,57-2,64) 3,48 (1,84-5,48) 9 8 0,03∗
�D% 8 meses PI 36,20 (22,50-41,90) 39,10 (20,80-50,50) 19 13 0,48
�D% 11 meses PI 36,66 (29,08-43,87) 21,97 (9,5-47,70) 9 8 0,03∗
n° cels. inflam./mm2 182,0 (75,8-343,8) 224,4 (100,0-496,2) 14 10 0,5
TNF-�(ER) 1,74 (0,31-14,05) 1,62 (0,68-5,05) 13 10 0,83
A20 (ER) 1,46 (0,42-14,22) 1,584 (0,335-7,963) 13 10 0,88
MnSOD (ER) 0,93 (0,67-4,86) 0,91 (0,41-1,65) 13 8 0,78
INOS (ER) 1,31 (0,26-3,12) 0,80 (0,24-1,59) 13 10 0,04∗
INF-� (ER) 3,99 (1,17-11,32) 4,52 (0,94-10,74) 13 10 0,83
IL-10 (ER) 1,69 (0,25-27,47)) 4,45 (1,50 -50,76) 12 10 0,02∗
DDVE = diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE = diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo; D% = fração de encurtamento do ventrículo esquerdo; ER = expressão relativa; ∗p < 0,05, significativo, Teste U de Mann-Whitney.
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